Artykuł metodologiczny

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 stycznia 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łuski danio pręgowanego oferują wiele zalet do wykorzystania w standardowych laboratoriach do celów dydaktycznych i badawczych. Łuski są łatwe do pobrania bez konieczności eutanazji, regenerują się w ciągu kilku tygodni, są półprzezroczyste i małe, co pozwala na oglądanie ich za pomocą standardowego mikroskopu. Łuski danio pręgowanego są szczególnie przydatne w środowiskach edukacyjnych, ponieważ stanowią wyjątkową okazję dla uczniów do zaangażowania się w praktyczne doświadczenia edukacyjne, szczególnie w zakresie zrozumienia dynamiki komórkowej i metod hodowli in vitro. Głównym celem niniejszego protokołu jest opisanie metody zbierania i utrzymywania łusek danio pręgowanego w hodowli do wykorzystania w różnych badaniach biologicznych przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego. Ponadto protokół szczegółowo opisuje ich zastosowanie w zrozumieniu homeostazy kości poprzez badanie aktywności komórek kostnych zaangażowanych w resorpcję i odkładanie się kości. Zawiera również dodatkowe protokoły dla technik ogólnych, takich jak wizualizacja jąder i komórek apoptotycznych. Protokół hodowli in vitro daje wiarygodne wyniki przy minimalnej ilości odczynników i sprzętu. W niniejszym artykule omówiono korzyści płynące ze stosowania hodowli in vitro łusek danio pręgowanego w celu wspierania badań naukowych i przedstawiono zasoby potrzebne do wspierania ich integracji z placówkami edukacyjnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach danio pręgowany (Danio rerio) stał się cennym organizmem modelowym w różnych dziedzinach nauki, w tym w genetyce, biologii rozwojowej i toksykologii1,2,3. Danio pręgowany to małe tropikalne ryby słodkowodne pochodzące z rzek Azji Południowo-Wschodniej4. Stały się popularnym organizmem modelowym w biologii ze względu na ich łatwą pielęgnację, niewielkie rozmiary, szybki cykl reprodukcyjny i przezroczyste zarodki1. Pozwala to na łatwą obserwację ich wewnętrznego rozwoju, dzięki czemu idealnie nadają się do badania różnych procesów biologicznych w biologii rozwojowej. Danio pręgowany ma genetyczne podobieństwa do ludzi; Około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden odpowiednik danio pręgowanego, co czyni je doskonałym modelem do badania zaburzeń genetycznych i chorób u ludzi5,6. Manipulując określonymi genami u danio pręgowanego, naukowcy mogą uzyskać cenne informacje na temat funkcji i zachowania genów, które można następnie zastosować w badaniach nad zdrowiem człowieka6, edycja genów i tworzenie linii transgenicznych7,8.

Łuski danio pręgowanego regenerują się po usunięciu9,10 i mogą być hodowane przez jeden do trzech dni w podstawowym inkubatorze (bez CO2), podczas gdy są używane do eksperymentów11. Stosowanie łusek danio pręgowanego jest korzystne w podstawowych laboratoriach, ponieważ można je usunąć ze znieczulonych ryb bez konieczności eutanazji. Łuski danio pręgowanego są składnikiem szkieletu skórnego, składającym się przede wszystkim z dwóch warstw: warstwy wewnętrznej, która jest gruba i zbudowana z częściowo zmineralizowanej tkanki utworzonej przez warstwy włókien kolagenowych, oraz warstwy zewnętrznej, która jest wysoce zmineralizowana i zawiera sieć splecionych włókien kolagenowych12,13 (Rysunek 1A-C). Te morfologiczne i komórkowe cechy skali można łatwo zaobserwować pod standardowym mikroskopem złożonym. Te cechy sprawiają, że łuski danio pręgowanego są dobrym modelem do badań komórkowych i molekularnych. Na przykład łuski danio pręgowanego zostały wykorzystane do badania homeostazy kości, w tym aktywności komórek kostnych11,12. Zostały one również wykorzystane do zrozumienia regeneracji tkanek9,14,15, szlaki genetyczne i sygnalizacja14,16, metabolism17, badania mikrobioty18, itd. Danio pręgowany, podobnie jak inne teleosty, jest również bardzo wrażliwy na czynniki środowiskowe, takie jak zanieczyszczenia i toksyny19,20,21,22. W związku z tym łuski ryb są wykorzystywane do badania narażenia na toksyny w populacjach ryb. Te cechy sprawiają, że skale są doskonałym modelem do nauczania uczniów o wpływie czynników środowiskowych na organizmy żywe. Dodatkowo, łuski z transgenicznych linii danio pręgowanego, takich jak Tg(osterix:mCherry) i Tg(runx2a:GFP), mogą dodać kolejny poziom złożoności do eksperymentów studenckich.

Podsumowując, korzystając z łusek danio pręgowanego, naukowcy mogą projektować i przeprowadzać eksperymenty w celu zbadania różnych aspektów biologii, od mechanizmów komórkowych po zmiany środowiskowe. Danio pręgowany jest również cennym zasobem w szkolnictwie wyższym, ponieważ może zapewnić praktyczne doświadczenia w projektowaniu eksperymentalnym, gromadzeniu i analizie. Danio pręgowany może być również wykorzystywany w zaawansowanych kursach i programach badawczych w celu zbadania określonych obszarów zainteresowań. W tym artykule opisano protokół korzystania z łusek danio pręgowanego w środowiskach badawczych i edukacyjnych w klasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj protokoły są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i były zatwierdzane corocznie przez komitet ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Saint Mary's / Uniwersytetu Mount Saint Vincent pod numerami protokołów 20-14 i 21-12. Przed wdrożeniem tego protokołu użytkownicy muszą upewnić się, że przestrzegane są federalne i prowincjonalne wytyczne dotyczące wykorzystywania zwierząt w badaniach lub nauczaniu23. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników do hodowli wag

  1. Przygotować pożywkę DMEM z HEPES (10 g proszku DMEM, 5,95 g HEPES, w 1 l wody destylowanej lubdH2O, pH: 6,91), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną - roztwór roboczy (88% pożywka DMEM z HEPES, 10% płodowa surowica bydlęca i 2% penicylina-streptomycyna [5000 jednostek penicyliny i 5 mg streptomycyny na ml] dostosowane do objętości potrzebnej w dniu przeprowadzania eksperymentu.
    UWAGA: Roztwór roboczy musi być codziennie przygotowywany świeży i nie może być przechowywany. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać w niskiej temperaturze (w temperaturze 4 °C lub na lodzie) do czasu użycia.
  3. Podwielokrotność roztworu roboczego pożywki hodowlanej umieścić w pojemnikach, w których zostanie przeprowadzone doświadczenie. W tym przypadku użyto probówek o pojemności 0,2 ml lub płytki 96-dołkowej. Utrzymuj te podwielokrotności na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne.
    UWAGA: Ten roztwór powinien być przygotowany świeży i nie może być przechowywany dłużej niż 1 dzień. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze wszystkimi odczynnikami.

2. Usuwanie łusek z żywych ryb

  1. Przygotuj pojemnik lub zbiornik dla danio pręgowanego o objętości wody około 2 l dla 4-5 dorosłych ryb.
    UWAGA: Typowe parametry wody, które są odpowiednie dla danio pręgowanego, to pH 7,5, temperatura 28,5 °C, przewodność 640-781 μS i 12-12-godzinny cykl ciemnego światła. Upewnij się, że temperatura w zbiorniku jest stale utrzymywana.
  2. Użyj siatki rybackiej, aby złapać 4-5 dorosłych danio pręgowanego i umieść je w przygotowanym powyżej zbiorniku do przechowywania danio pręgowanego.
  3. Przygotuj pojemnik z co najmniej 60 ml wody, w którym ryba zostanie znieczulona.
    UWAGA: Ryba musi mieć możliwość poruszania się w pojemniku i być na tyle głęboka, aby zapobiec jej wyskoczeniu. Pojemnik ten powinien zawierać buforowany 0,01% metanosulfonian trikainy (MS222), który powinien składać się z wody z danio pręgowanego (rozcieńczyć 0,1% MS222, który przygotowuje się z 0,3 g MS222, 615 μl 1 M NaOH w 300 ml systemu wodnego danio pręgowanego, dziesięć razy).
    UWAGA: Osoby przeprowadzające te eksperymenty muszą mieć zgodę instytucjonalnej komisji etyki zwierząt na łapanie, znieczulanie i obchodzenie się z danio pręgowanym. Podobnie, stosowanym środkiem znieczulającym jest niskie stężenie metanosulfonianu trikainy (MS222), który jest substancją chemiczną powszechnie stosowaną w biologii ryb, ale taką, która wymaga odpowiedniego obchodzenia się z nimi, takiego jak odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne/gogle przeciwbryzgowe i fartuch laboratoryjny (więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki MS222).
  4. Przygotować pojemnik do odzysku o tych samych specyfikacjach, co poprzednio użytych w kroku 1 (co najmniej 2 litry wody), w którym ryba zostanie umieszczona po usunięciu łuski. Ten pojemnik powinien mieć wystarczająco dużo miejsca i prawidłowe parametry wody, jak wspomniano powyżej.
  5. Za pomocą siatki ostrożnie przenieś pojedynczego dorosłego ryba danio pręgowanego do pojemnika z 0,01% MS222. Poczekaj, aż ryba będzie całkowicie nieruchoma i będzie miała minimalny ruch operkularny (zwykle trwa to mniej niż 10 minut).
    UWAGA: Cały ten krok jest wykonywany po jednej rybie na raz. Nie należy znieczulać następnej ryby, dopóki łuski nie zostaną pomyślnie usunięte z ryby, z którą się obchodzimy, i dopóki ryba ta nie zostanie przeniesiona do pojemnika do odzysku.
  6. Indywidualnie umieść dorosłego danio pręgowanego na odwróconej szalce Petriego wyłożonej mokrym ręcznikiem papierowym.
  7. Pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą cienkich kleszczy usuń maksymalnie 10-12 łusek z pojedynczej ryby. Łuski są usuwane z bocznej części ryby, gdzie łuski są większe i mają bardziej stały rozmiar w porównaniu z innymi częściami ciała (Ryc. 2). Można użyć obu stron ryby.
    1. Usuwaj łuski pojedynczo, delikatnie pociągając w naturalnym kierunku łuski (tj. w kierunku od przodu do tyłu). Należy to zrobić tak szybko, jak to możliwe.
  8. Umieścić każdą pojedynczą wagę w oddzielnej probówce o pojemności 0,2 ml zawierającej roztwór roboczy pożywki do hodowli wag (przygotowany w kroku 1.1), aby zapobiec degradacji wagi. Alternatywnie można użyć płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Izolacja poszczególnych łusek w oddzielnych probówkach lub studzienkach zapobiega sklejaniu się łusek i umożliwia śledzenie poszczególnych łusek, które mogą być potrzebne do wielu eksperymentów.
  9. Jeśli konkretny eksperyment wymaga obróbki skali, zastosuj ją w tym kroku. Aby zapoznać się z przykładami niektórych protokołów, zapoznaj się z krokami 4 i 5.
  10. Umieścić probówki z wagą w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Pożywkę należy wymieniać co 24 godziny (z roztworem roboczym pożywki hodowlanej). Do opisanych tutaj eksperymentów użyto inkubatora bez emisjiCO2 .
  11. Po usunięciu łuski ostrożnie włóż danio pręgowanego z powrotem do zbiornika rekonwalescencji i monitoruj, aż ruch zostanie wznowiony. Pipeta lub kamień napowietrzający służy do dostarczania powietrza do zbiornika w celu przyspieszenia odzyskiwania.
  12. Po przywróceniu ruchu przywróć danio pręgowanego do zwykłego zbiornika hodowlanego. Pamiętaj, aby trzymać ryby, które były używane, oddzielnie od innych ryb, aby mogły się zregenerować osobno i śledzić, które ryby aktywnie regenerują swoje łuski.
  13. Odczekaj ~2 tygodnie przed ponownym usunięciem łuski z tych samych ryb. Dzięki temu mają czas na naturalną regenerację łusek.

3. Utrwalenie łusek

  1. Przemyć wagę trzykrotnie 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przygotowanej z 10x PBS (na 1 l dodać 80 g NaCl, 2 g KCl i 11,2 g Na2HPO4, dodać dH2O aż do 1 L).
  2. Usuń 1x PBS i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na noc w temperaturze 4 °C. Na 100 ml PFA dodać 4 g paraformaldehydu i 0,1 g NaOH, a następnie dodać 1x PBS do 100 ml. Wymieszaj na płycie grzejnej ustawionej na małym ogniu i mieszaj, aż roztwór będzie klarowny, a następnie pozwól roztworowi ostygnąć i ustabilizuj pH do 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 1).
  3. Po utrwaleniu umyj wagę trzykrotnie 200 μl 1x PBS. Przechowywać wagę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: PFA jest szkodliwy. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki. Wszystkie te procesy wymagają odpowiedniego obchodzenia się z nimi, takiego jak odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne/gogle przeciwbryzgowe i fartuch laboratoryjny.

4. Homeostaza kości

UWAGA: Dwie procedury homeostazy kości są opisane poniżej. Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP) i fosforanem alkalicznym (AP) jest zwykle używane do identyfikacji odpowiednio aktywnych osteoklastów i osteoblastów. Osteoklasty resorbują macierz kostną, podczas gdy osteoblasty odkładają macierz kostną. AP jest głównym enzymem uwalnianym przez osteoblasty podczas tworzenia kości, podczas gdy TRAP jest wydzielany przez osteoklasty do kwaśnej przestrzeni między osteoklastem a macierzą kostną, pomagając w rozpadzie i resorpcji kości24,25,26. Protokół ten jest również dostępny w The Danio Pręgowany27 i został wcześniej opublikowany28. Fosfataza alkaliczna jest enzymem wytwarzanym przez wiele typów komórek w ramach procesu metabolicznego. Proces ten nie jest całkowicie specyficzny dla osteoblastów, ale w tkance kostnej jest używany jako marker funkcji osteoblastów.

  1. Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP)
    1. Umieść każdą stałą skalę w probówce o pojemności 0,2 ml lub płytce 96-dołkowej z 200 μldH2O. Umyj łuski, dodając i usuwając około 150 μldH2O przez 15 minut trzy razy. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 2).
    2. Wyjmij łuski z probówki lub studzienki o pojemności 0,2 ml i umieść je w nowej probówce zawierającej 200 μl 50 ml buforu winianu. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      1. Na 100 mM buforu winianu przygotuj szklany pojemnik, dodaj 2,3 g kwasu winowego i wymieszaj go z 0,2 M buforem octanowym (pH 5,5) do 100 ml roztworu. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 50 mM buforu winianu, dodać równe objętości dH2O i 100 mM buforu winianu. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 3 i tabela 4).
    3. Wyjąć bufor winianu z probówki i dodać 200 μl roztworu substratu TRAP. Próbki należy inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki pozostają w ciemności.
      1. Przygotuj pojemnik z ciemnego szkła i dodaj 30 ml 100 ml buforu winianu, 1 ml heksazotyzowanego roztworu PRS (chlorowodorku pararozaniliny) i 2 ml roztworu substratu enzymatycznego. Dobrze wymieszać.
        UWAGA: Tego roztworu nie można przechowywać; Podczas używania trzymaj go w ciemności w temperaturze pokojowej. Roztwory potrzebne do przygotowania roztworu substratu TRAP znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabele 5-9).
    4. Usunąć roztwór substratu TRAP i umyć łuski, dodając i usuwając około 150 μl dH2O przez 15 minut, trzy razy.
    5. Wyjmij łuski z probówki i umieść je w nowej probówce lub studzience z 200 μl 80% glicerolu (na 100 ml zmieszaj 80 ml glicerolu z 20 ml dH2O) owinięte w folię aluminiową, aby uniknąć blaknięcia i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    6. Aby uwidocznić łuski pod mikroskopem, użyj wgłębienia lub wklęsłego szkiełka.
  2. Barwienie fosforanem alkalicznym (AP)
    1. Umieść każdą ustaloną skalę w probówce o pojemności 0,2 ml lub 96-dołkowej płytce z 200 μldH 2O i umyj je, dodając i usuwając około 150 μldH 2O przez 15 minut, trzy razy. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 2).
    2. Usunąć łuski z probówek lub studzienek o pojemności 0,2 ml i umieścić je w nowej probówce zawierającej 200 μl buforu tris-maleinianu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      1. Do tego buforu przygotuj szklany pojemnik i dodaj 0,605 g buforu tris i 0,55 g kwasu maleinowego. Dodaj dH2O do 25 ml i dobrze wymieszaj. Ustabilizować do pH 8,3. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 10).
    3. Usunąć bufor tris-maleinianu z probówki i dodać 200 μl roztworu substratu AP. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki pozostają w ciemności.
      1. Do tego roztworu przygotuj pojemnik z ciemnego szkła, dodaj 8 mg soli diazoniowej i wymieszaj go z 0,1 ml fosforanu naptol-AS-TR w N,N-dimetyloformamidzie i 10 ml buforu tris-maleinianu (pH 8,3), dobrze wymieszaj. Przygotuj ten roztwór na świeżo. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1 (tabela 11).
    4. Usunąć roztwór substratu AP i umyć łuski, dodając i usuwając 200 μl dH2O przez 15 minut, trzy razy.
    5. Wyjmij łuski z probówki i umieść je w nowej probówce lub studzience z 200 μl 80% glicerolu owiniętymi w folię aluminiową, aby uniknąć blaknięcia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Aby zobrazować łuski za pomocą mikroskopu, umieść je na szkiełku wklęsłym lub wgłębieniowym.
      UWAGA: Większość odczynników stosowanych w barwieniu TRAP i AP może być szkodliwa. Zapoznaj się z kartą charakterystyki dla każdej substancji chemicznej. Wszystkie te procedury wymagają odpowiedniego obchodzenia się z nimi, takiego jak odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne/gogle przeciwbryzgowe i fartuch laboratoryjny.

5. Wizualizacja dynamiki komórek w łuskach danio pręgowanego

UWAGA: Szereg metod barwienia może być użyty do wizualizacji różnic między skalami i do oznaczania komórek w skali (Rysunek 3B). Na przykład poniżej przedstawiono metody barwienia jąder i lizosomów w komórkach skali.

  1. Barwienie DAPI do wizualizacji jąder komórkowych
    UWAGA: DAPI służy do oznaczania jąder wszystkich komórek poprzez znakowanie DNA. DAPI jest markerem fluorescencyjnym, który silnie wiąże się z regionami wzbogaconymi o adeninę i tyminę w sekwencjach DNA.
    1. Przed użyciem DAPI upewnij się, że łuski są utrwalone w 4% paraformaldehydzie (krok 3). Myć wagę 200 μl 1x PBS przez 5 minut po utrwaleniu.
    2. Przygotować roztwór roboczy DAPI w rozcieńczeniu 1:10 w następujący sposób. Zmieszaj 1 μl DAPI z 9 μl 1x PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 10 μl.
    3. Po przygotowaniu roztworu DAPI za pomocą kleszczyków lub plastikowej pipety umieść wagę na wklęsłym szkiełku, usuń nadmiar PBS i dodaj około 10 μl przygotowanego roztworu DAPI.
      UWAGA: DAPI natychmiast zabarwi skalę, dzięki czemu można ją uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 352-402 nm i długości fali emisji 417-477 nm. DAPI zabarwi wszystkie jądra komórkowe na jasnoniebieski kolor. Aby zobaczyć całą skalę w polu widzenia, zastosowano obiektyw 4x. Pojedyncze barwione jądra są widoczne przy użyciu obiektywu 20x.
    4. Policz liczbę jąder wybarwionych DAPI, aby określić liczbę komórek w skali.
  2. Barwienie apoptotyczne do wizualizacji śmierci komórki w żywych próbkach
    UWAGA: Barwniki fluorescencyjne mogą być używane do oznaczania komórek apoptozy. Na przykład zastosowany tutaj protokół markerów fluorescencyjnych jest przeznaczony dla środowisk kwaśnych i może być używany do znakowania i śledzenia organelli kwaśnych, takich jak lizosomy. Wzrost liczby tych organelli jest skorelowany ze zwiększoną śmiercią komórek. Tę plamę należy nakładać na nieutrwalone łuski, które są albo świeżo pobrane, albo były hodowane przez okres do 2 dni.
    1. Przygotować roztwór barwienia fluorescencyjnego do śledzenia apoptozy zgodnie z instrukcjami producenta, używając pożywki hodowlanej jako rozcieńczalnika.
      UWAGA: Stężenie barwnika fluorescencyjnego może się drastycznie zmienić w zależności od zastosowanej metody apoptozy. Zapoznaj się z protokołem handlowym dla wybranej plamy, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zalecanych stężeń.
    2. Ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną z każdej 0,2 ml probówki lub studzienki z 96-dołkowej płytki, jeśli łuski były wcześniej hodowane.
    3. Dodać tyle fluorescencyjnego roztworu barwiącego, aby pokryć całą skalę (około 50 μl).
    4. Przykryj wszystkie probówki folią aluminiową, aby uniknąć blaknięcia i pozostaw na 30 minut.
    5. Usuń fluorescencyjny roztwór barwiący z probówek lub studzienek.
    6. Próbki należy przemywać, dodając 200 μl 1x PBS do probówek lub studzienek przez 5 minut.
    7. Usunąć PBS i dodać 200 μl 4% PFA do probówek lub studzienek, aby utrwalić próbki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    8. Przemywać próbki, dodając 200 μl 1x PBS do probówek lub studzienek przez 5 minut.
    9. Przenieś wagę do nowej probówki o pojemności 0,2 ml lub studzienki i dodaj 200 μl świeżego 1x PBS. Przykryj te rurki/studzienki folią aluminiową, aby uniknąć blaknięcia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    10. Aby uwidocznić skale za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, użyj szkiełka wklęsłego lub wklęsłego oraz odpowiedniego filtra. Zastosowany tutaj sygnał fluorescencyjny ma maksimum wzbudzenia i emisji 577-590 nm. Barwienie fluorescencyjne pokazuje komórki apoptotyczne zawierające lizosomy w kolorze czerwonym.
    11. Policz liczbę barwionych komórek, aby określić liczbę komórek ulegających apoptozie.
      UWAGA: Folia aluminiowa jest używana podczas barwienia i przechowywania, aby uniknąć blaknięcia. Próbki można przechowywać w ciemności przez kilka godzin, a nawet dni, w zależności od użytego barwnika fluorescencyjnego. Aby przechowywać próbki fluorescencyjne przez dłuższy czas, należy użyć protokołu utrwalania i montażu, który jest zgodny z barwieniem fluorescencyjnym. Wszystkie barwienia fluorescencyjne zostały uwidocznione za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o co najmniej 20-krotnym powiększeniu. Zastosowany filtr był następujący: dla DAPI 417-477 nm; do śledzenia apoptozy 577-590 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno, ten protokół hodowli skalowej został wykorzystany do badania homeostazy kości11. Łuski mogą przetrwać w pożywce hodowlanej przez co najmniej 2 dni. Liczbę komórek apoptotycznych analizowano w każdym dniu hodowli, maksymalnie do trzech dni, licząc znakowane komórki. Wyniki te wykazały, że liczba komórek apoptotycznych znacznie wzrosła w trzecim dniu hodowli, co wskazuje, że czas hodowli powinien być ograniczony do dwóch dni przy użyciu opisanej tutaj metody.

Po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łuski danio pręgowanego są łatwo dostępnym modelem in vitro do badania wielu różnych procesów biologicznych, które można utrzymać przez okres do 2 dni przy użyciu metody hodowli i inkubatora w celu symulacji ich naturalnego środowiska11. Wagi mają regularny i proporcjonalny rozkład obecnych komórek, co umożliwia naukowcom przeglądanie, liczenie i oznaczanie komórek oraz przeprowadzanie prostych eksperymentów z zakresu biologii komórki przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego. Co w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują personelowi Mount Saint Vincent University Aquatic Facility oraz wszystkim członkom laboratorium Franz-Odendaal Bone Development za zapewnienie niezbędnej opieki nad rybami. Szczególne podziękowania dla Alishy McNeil, Keely A. MacLellan i Shirine Jeradi za pomoc w optymalizacji niektórych protokołów. Badania te były finansowane przez Kanadyjską Agencję Kosmiczną (CSA) [19HLSRM01] oraz Kanadyjską Radę Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 0,2 mlnie dotyczynie dotyczy
37% HCl EMDHX0603-4Do stabilizacji pH i przygotowania PRS
Szkiełko wklęsłen/a/a
DAPIVectashieldH-1200Do wizualizacji jąder komórkowych
Sól diazoniowa (Fast Blue B)SigmaD9805Do roztworu substratu AP
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco Sigma D5523Do pożywek do hodowli wagowych 
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (MS222) Sigma E10521Do przygotowania 0,1% MS222
Surowica bydlęca Sigma F4135Do pożywek do hodowli wagowych 
Mikroskop fluorescencyjnyn/an/a
Lodowaty kwas octowy Rybacy A38 212Do buforu octanowego
GlycerolVWRBDH1172-4LPDo 80% glicerolu - wagi magazynowe
HEPES ThermoFisher 15630106Do pożywek do hodowli na dużą skalę 
Płyta grzejnan/an/d
KCl SigmaP217-10Do przygotowania PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Do lizosomów  wizualizacja
Kwas maleinowySigmaM0375Do buforu tris-maleinianu 
Mikropipetan/an/a
N,N-dimetyloformamidSigma319937Do roztworu substratu AP
N,N-dimetyloformamid Sigma319937do roztworu substratu enzymatycznego
Na2HPO4 EMDSX0720-1Do przygotowania PBS
NaCl Sigma S9888Do przygotowania PBS
NaNO2SigmaS-2252Do 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881Do przygotowania 4% PFA
NaOH Sigma S5881Do utrwalania kamienia i stabilizacji pH
Napthol-AS-TR-phosphateSigmaN6125Do roztworu substratu AP
Napthol-AS-TR-phosphate SigmaN6125Do roztworu substratu enzymatycznego
Chlorowodorek pararozaniliny SigmaP3750Dla PRS
Penicylina-streptomycyna 5000 jednostek penicyliny i 5 mg streptomicyny / mlThermoFisher 15140122Do pożywek do hodowli wagowych 
Środki ochrony indywidualnej (PPE): jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne/gogle przeciwbryzgowe i fartuch laboratoryjny.niedotyczy
nie dotyczy PFA Sigma P6148Do utrwalania kamienia
Octan sodu Sigma S2889Do buforu octanowego Standardowy
mikroskop złożonyn/an/a n/a
Płytka mieszającan/
kwas winowySigmaT6521Do buforu winianu
Baza TrisRoche03 118 142 001Do buforu tris-maleinianu 
na

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Homeostaza ko ciaktywno kom rek kostnychpobieranie usekresorpcja ko cidepozycja kostnamikroskop stereoskopowyzaburzenia rodowiskowe

Powiązane artykuły