Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66626

⸱

19 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Streszczenie

System Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) został szeroko zastosowany w celu ułatwienia oddolnego składania syntetycznych komórek. Służy jako gospodarz dla podstawowej maszynerii Centralnego Dogmatu, stojąc jako optymalne podwozie do integracji i montażu różnych sztucznych systemów mimikry komórkowej. Pomimo częstego stosowania tego systemu w produkcji ogniw syntetycznych, stworzenie dostosowanego do potrzeb i solidnego systemu CFPS do konkretnego zastosowania pozostaje nietrywialnym wyzwaniem. W niniejszym artykule metodycznym przedstawiono kompleksowy protokół dla systemu CFPS, rutynowo stosowanego w budowie ogniw syntetycznych. Protokół ten obejmuje kluczowe etapy przygotowania systemu CFPS, w tym ekstrakcję komórkową, przygotowanie matrycy i rutynową optymalizację ekspresji z wykorzystaniem fluorescencyjnego białka reporterowego. Dodatkowo pokazujemy reprezentatywne wyniki, zamykając system CFPS w różnych mikrokompartmentach, takich jak kropelki jednowarstwowe, pęcherzyki z podwójną emulsją i komory umieszczone na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Na koniec wyjaśniamy krytyczne kroki i warunki niezbędne do pomyślnego montażu tych systemów CFPS w różnych środowiskach. Oczekujemy, że nasze podejście ułatwi ustanowienie dobrych praktyk pracy między różnymi laboratoriami w ramach stale rozwijającej się społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając tym samym postęp w dziedzinie rozwoju komórek syntetycznych.

Wprowadzenie

Synteza syntetycznych lub sztucznych komórek stała się bardzo ważnym obszarem badań interdyscyplinarnych, przyciągając duże zainteresowanie ze strony naukowców z różnych dziedzin biologii syntetycznej, chemii i biofizyki. Naukowców tych łączy wspólny cel, jakim jest zbudowanie minimalnej żywej komórki1,2,3. Szybki rozwój tej dziedziny idzie w parze ze znaczącymi postępami w kluczowych technologiach, takich jak manipulacja rekombinowanym DNA4, materiały biomimetyczne5 oraz techniki mikrowytwarzania do kompartmentalizacji6, w tym metoda syntezy białek bez komórek (CFPS)7. Systemy CFPS obejmują niezbędną maszynerię komórkową do transkrypcji i translacji, zapewniając podstawowe ramy dla rozwoju i integracji wielofunkcyjnych sztucznych komórek.

Chociaż techniki CFPS są często używane do składania syntetycznych komórek, opracowanie solidnego i dostosowanego systemu CFPS do składania różnych syntetycznych systemów komórkowych pozostaje złożonym wyzwaniem. Obecnie dostępnych jest wiele systemów CFPS, wywodzących się zarówno z organizmów modelowych prokariotów, jak i eukariontów8, z których każdy specjalizuje się w określonych zastosowaniach w syntezie komórek syntetycznych. Poza ich centralnymi rolami w transkrypcji i translacji, systemy CFPS różnią się między sobą głównymi komponentami i powiązanymi procedurami przygotowania. Te różnice, które obejmują różnice w ekstraktach komórkowych, polimerazach RNA, metodach przygotowania matryc i składzie, są w dużej mierze spowodowane odrębnymi trajektoriami rozwoju realizowanymi przez grupy badawcze, które intensywnie optymalizowały swoje systemy pod kątem maksymalnej wydajności białka.

Wśród różnych składników systemu CFPS, ekstrakt komórkowy jest krytyczną pulą enzymatyczną dla transkrypcji i translacji, a tym samym kluczowym czynnikiem decydującym o wydajności CFPS9. CFPS oparty na Escherichia coli (E. coli) jest najczęściej stosowanym systemem ze względu na jego status najlepiej poznanego organizmu prokariotycznego. Co więcej, grupa badawcza Ueda opracowała w pełni zrekonstruowany system CFPS składający się z indywidualnie oczyszczonych białek i rybosomów, znany jako PURE10, który jest szczególnie odpowiedni do zastosowań wymagających wyraźnego tła. Obecnie nawet systemy CFPS oparte na E. coli są zróżnicowane, zwłaszcza pod względem szczepów źródłowych dla extrac11 i metod przygotowania12,13, polimeraza RNA14,15, źródła energii16,17, oraz systemy buforowe18,19. Do najczęściej używanych szczepów należą pochodne szczepów K12 i B, takie jak A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 i Rossetta223, wraz z ich genetycznie modyfikowanymi odpowiednikami.

Początkowo, szczepy E. coli o zmniejszonej aktywności RNazy i proteazy zostały wybrane w celu zwiększenia stabilności mRNA i stabilności nowo zsyntetyzowanych białek rekombinowanych, co doprowadziło do zwiększenia końcowej wydajności białek24. Następnie ekstrakty z E. coli zostały zmodyfikowane tak, aby ułatwić określone modyfikacje potranslacyjne, w tym glikozylację25, fosforylację26 i lipidację27, w celu osiągnięcia powyższych modyfikacji potranslacyjnych. Dodatkowo, szereg dodatków, takich jak molekularne białka opiekuńcze28 i stabilizatory chemiczne, zostały włączone w celu wspomagania fałdowania docelowych białek, przyczyniając się do dywersyfikacji systemów CFPS. Polimeraza RNA T7 bakteriofaga, znana ze swojej wysokiej procesywności, jest głównie stosowana do transkrypcji, chociaż wykorzystano również inne polimerazy, takie jak SP629. Endogenna polimeraza RNA E. coli została przystosowana do prototypowania obwodów genetycznych wykorzystujących czynniki sigma30. Wreszcie, różne prekursory energii31,32,33 oraz różne sole i składniki buforowe19,34,35 są systematycznie optymalizowane w celu zwiększenia wydajności.

Oprócz samego systemu CFPS, metody enkapsulacji, jak również materiały do kompartmentacji są również niezbędne dla udanego montażu komórek syntetycznych. Różne systemy, które zostały opracowane w celu skutecznego enkapsulacji reakcji CFPS, obejmują stabilizowane środkami powierzchniowo czynnymi kropelki wody/oleju, lipidy/polimery i ich hybrydowe pęcherzyki jednowarstwowe (o średnicach od 50 nm do kilku μm), a także dwuwarstwy lipidowe podparte planarnie. Jednak ze względu na zawartość skompleksowanych cząsteczek w systemie CFPS, wskaźnik powodzenia enkapsulacji zależy od konkretnych przypadków, szczególnie w przypadku tworzenia pęcherzyków. Aby poprawić wskaźnik sukcesu i skuteczność enkapsulacji CFPS, opracowano różne chipy do mikropłynów, które ułatwiają tworzenie zarówno kropelek, jak i pęcherzyków36. Niemniej jednak konieczne będzie ustanowienie dodatkowych chipów i urządzeń.

Ten protokół określa system CFPS E. coli wykorzystujący szczep BL21(DE3), który jest powszechnie stosowanym gospodarzem do produkcji białek rekombinowanych. Protokół obejmuje szczegółowe opisy przygotowania ekstraktu komórkowego, przygotowania matrycy i optymalizacji standardowej ekspresji przy użyciu fluorescencyjnego białka reporterowego. Ponadto przedstawiono przykładowe wyniki osiągnięte dzięki zamknięciu systemu CFPS w różnych mikrokompartmentach, w tym w kropelkach jednowarstwowych, podwójnych pęcherzykach emulsyjnych i komorach umieszczonych na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Na koniec wyjaśniamy kluczowe elementy proceduralne i warunki niezbędne do pomyślnego ustanowienia tych systemów WPRyb w różnych kontekstach środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu

  1. Szczep E. coli BL21 (DE3) należy rozprowadzić z wywaru glicerolowego na płytce agarowej Luria Bertani (LB) i inkubować przez co najmniej 15 godzin w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować nocną hodowlę wstępną, zaszczepiając pojedynczą kolonię ze świeżo przygotowanej płytki LB do kolby o pojemności 50 ml pożywki Luria Bertani (LB).
  3. Zaszczepić 5 ml kultury wstępnej w 500 ml pożywki 2xYTPG w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą. Hodować w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem (między 220 obr./min a 250 obr./min) i zbierać komórki, gdy osiągną środkową fazę logarytmiczną (OD600 ~ 3). Następnie umieścić kultury komórkowe w zimnej, lodowatej wodzie na 10 minut i odwirować w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym kroku glukozę w pożywce 2xYTPG można pominąć dla określonych zastosowań9,12.
  4. Zawiesić powstałe w ten sposób osady komórkowe w 35 ml wstępnie schłodzonego buforu A S30, a następnie odwirować w stężeniu 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  5. Powtórz krok 1.4 dwa razy.
    UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
  6. Ponownie zawiesić końcowe granulki w buforze B S30 (np. Użyj 1,1 ml buforu B S30 na 1 g osadu komórkowego) i rozbić komórki przez jedno przejście przez French Press przy 17 000 psi.
    1. Aby korzystać z prasy francuskiej, postępuj zgodnie z instrukcją obsługi i przenieś zawieszenie ogniwa do metalowej komory rozrywającej French Press, upewniając się, że wszystkie elementy są zmontowane, a dolny zawór komory rozrywającej jest zamknięty.
    2. Przenieś zmontowaną komorę zakłóceniową na platformę hydrauliczną i zabezpiecz blokadę bezpieczeństwa.
    3. Włącz pompę hydrauliczną i rozpocznij zakłócenia.
    4. Kontroluj zawór wylotowy, aby zawiesina ogniw wypłynęła z rurki wylotowej do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dostosuj prędkość przepływu, aby zapewnić skuteczne zakłócenia, najlepiej jedna kropla na raz. Utrzymuj ciśnienie powyżej dolnej granicy 15 000 psi.
  7. Powstały lizat odwirować w temperaturze 30 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Powtórzyć wirowanie raz i zebrać supernatant. Dodać 0,3 objętości buforu preinkubacyjnego do zebranego supernatantu i inkubować, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 80 min.
    UWAGA: Użycie bufora preinkubacyjnego może zwiększyć ostateczną wydajność, chociaż donoszono, że pusty spływ (bez bufora preinkubacji) może również poprawić wydajność37,38, co zależy od odpowiedniego szczepu źródłowego.
  8. Otrzymaną mieszaninę należy dializować przez 2 godziny w stosunku do 2 litrów buforu C S30, wymienić raz bufor do dializy na 2 litry świeżego buforu C S30 i dializować przez noc w temperaturze 4 °C39.
    UWAGA: Drugi etap dializy nocnej można skrócić do około 3 godzin.
  9. Zebrać dializowaną próbkę i odwirować w temperaturze 30 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i podwielokrotność do odpowiednich objętości i natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
    UWAGA: Zamrożoną próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej od 6 miesięcy do 1 roku bez utraty wydajności.

2. Polimeraza RNA T7

  1. Przekształć plazmid pAR1219 w BL21(DE3) gwiazdę E. coli kompetentne komórki40.
  2. Zaszczepić 10 ml kultury przez noc w 1 l pożywki LB (zawierającej 100 μg/ml ampicyliny). Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,6-0,8.
  3. Indukcję należy rozpocząć od dodania końcowego stężenia 1 mM IPTG. Indukować komórki przez dodatkowe 5 godzin i zbierać przez odwirowanie w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C przez okres do kilku tygodni.
  4. Ponownie zawiesić granulki komórek w 30 ml buforu A T7 i rozbić komórki przez jedno przejście przez prasę francuską przy 15 000 psi. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 20 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Dodawać siarczan streptomycyny kropla po kropli do supernatantu z poprzedniego etapu, osiągając końcowe stężenie 4% (w/v). Po krótkiej inkubacji na lodzie odwirować w temperaturze 20 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przefiltrować supernatant przez membranę filtracyjną 0,45 μm i załadować przefiltrowaną próbkę do kolumny silnej wymiany anionowej (objętość kolumny 40 ml), która została wstępnie zrównoważona z 10 objętościami kolumny buforu B T7, za pomocą zautomatyzowanego systemu chromatografu cieczowego.
  7. Przemyć załadowaną kolumnę 50 objętościami kolumny buforu B T7 i wymyć próbkę za pomocą 10 objętości kolumny mieszanin buforu C o niskiej zawartości soli (50 mM NaCl) i wysokiej zawartości soli (500 mM), ustanawiając liniowy gradient stężenia NaCl od 50 do 500 mM przy natężeniu przepływu ~3 ml / min41.
  8. Zbierz frakcje pików i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE.
    UWAGA: Polimeraza T7 wykazuje dominujące pasmo przy ~100 kDa, podczas gdy znaczne ilości zanieczyszczeń nadal pojawiają się na żelu SDS-PAGE.
  9. Zebrać frakcje zawierające polimerazę T7 i dializować w 2 litrach buforu C T7 przez noc.
  10. Dodaj glicerol, aby osiągnąć końcowe stężenie 10% i zagęścić powstałą mieszaninę do końcowego stężenia 3-4 mg/ml metodą ultrafiltracji42.
    UWAGA: Jeśli podczas procesu zatężania pojawią się opady, należy je natychmiast przerwać i usunąć osady przez odwirowanie.
  11. Dostosuj stężenie glicerolu do 50%. Podwielokrotność i błyskawiczne zamrożenie próbki ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas.
    UWAGA: Mała porcja może być również przechowywana w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 miesiąc bez utraty wydajności.

3. Przygotowanie bufora

  1. Przygotować zgodnie z tabelą 1 na dzień przed użyciem.

4. Projektowanie i przygotowanie szablonu

  1. Sklonuj interesujący nas gen do wektora opartego na promotorze T7 lub wygeneruj liniowy produkt PCR zawierający interesujący gen.
    UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby zapoznać się z zasadami projektowania.
  2. Przygotuj plazmid z nocnej hodowli za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu.
    UWAGA: Zalecamy wybór zestawu plazmidowego, który zawiera etap wytrącania izopropanolu, a następnie procedurę mycia 70% etanolem.
  3. Rozpuścić wysuszone DNA w małej objętości ultraczystej wody do stężenia od 200 μg/ml do 500 μg/ml, oznaczonego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  4. Opcjonalnie: Bezpośrednia ekspresja białek z produktów liniowego PCR.
    UWAGA: W takim przypadku potrzebny jest etap oczyszczania PCR.

5. Optymalizacja Mg2+ i K+

  1. Przygotować mieszankę wzorcową do badania przesiewowego stężeniaMg2+, jak wskazano w tabeli 2, lub do badania przesiewowego stężenia K+, jak wskazano w tabeli 3.
  2. Przenieś mieszankę wzorcową do pojedynczych probówek do mikrofuge lub 96-dołkowej płytki w kształcie litery V.
  3. Odpipetować dokładną objętość roztworów podstawowych Mg2+ lub K+ do pojedynczych probówek do mikrofuge lub 96-dołkowej płytki w kształcie litery V i zakończyć reakcje CFPS ultraczystą wodą. Inkubować reakcje przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: Jeśli używasz 96-dołkowej płytki w kształcie litery V, uszczelnij płytkę plastikową osłoną, aby zapobiec parowaniu.
  4. Wyjąć 2 μl mieszaniny reakcyjnej i przenieść do czarnej 96-dołkowej płytki w celu pomiaru fluorescencji za pomocą czytnika płytek.
    UWAGA: Używamy czytnika płytek fluorescencyjnych o następującej konfiguracji: wzbudzenie/emisja: 485/528, Wzmocnienie: 50, Wysokość odczytu: 7,00 mm. Trzeba by jednak dostroić czytnik płytek, aby wygenerować określoną krzywą kalibracyjną przy użyciu oczyszczonych białek fluorescencyjnych.

6. Hermetyzacja

  1. kropelka
    1. Przygotować olej fluorowany zawierający środki powierzchniowo czynne (2% PFPE-PEG w HFE7500) lub roztwór oleju lipidowo-mineralnego, rozpuszczając lipidy w oleju mineralnym (patrz krok 6.2.1)
    2. Przygotować całkowitą objętość 100 μl reakcji CFPS, łącząc odpowiednie odczynniki 2-18 z tabeli 4. Dodać reakcję CFPS do 500 μl wcześniej przygotowanego oleju w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie energicznie nacierać probówkę o stojak na probówki 50x, aby powstały drobne kropelki (woda w oleju). Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C, aby przeprowadzić reakcję.
      UWAGA: Proste układy mikroprzepływowe mogą być również używane do generowania jednorodnych kropel43.
  2. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV)
    1. Przygotowanie roztworu oleju lipidowo-mineralnego
      1. Dodać 57 μl chloroformu do szklanej fiolki o pojemności 4 ml, a następnie dodać 18 μl lipidów 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicerol-3-fosfocholiny (POPC) o stężeniu 25 mg/ml, aby utworzyć roztwór lipidów chloroformu, uzyskując końcowe stężenie 8 mM (użyć innych lipidów o podobnych stężeniach końcowych).
        UWAGA: Ten etap mieszania miał na celu zapewnienie jednorodnego mieszania różnych lipidów.
      2. Odparowywać chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut, a następnie dalej odparowywać w próżni przez 1 godzinę.
      3. Powstałe suche lipidy rozpuścić w 1 500 μl oleju mineralnego, osiągając końcowe stężenie 400 μM. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Tworzenie międzyfazowej warstwy lipidowej
      1. Dodać 500 μl roztworu zewnętrznego (patrz Tabela 5) do probówki o pojemności 1,5 ml i powoli nałożyć 250 μl roztworu oleju lipidowo-mineralnego na wierzch roztworu zewnętrznego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utworzyć stabilną międzyfazową warstwę lipidową.
    3. Przygotowanie roztworu wewnętrznego
      1. Wymieszać wszystkie odczynniki z Tabeli 6, aby utworzyć roztwór wstępny i trzymać go na lodzie do czasu użycia. Uzupełnij roztwór wewnętrzny, dodając T7RNAP, ekstrakt S30 i matrycę DNA do roztworu prewewnętrznego jako odczynniki 16-18 wymienione w tabeli 4.
        UWAGA: Zwiększenie stężenia sacharozy w kapsułkach powyżej 250 mM może zahamować translację bez komórek44.
    4. Powstawanie GUV
      1. Dodać 50 μl roztworu wewnętrznego do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl oleju lipidowo-mineralnego, szybko pipetować w górę i w dół i energicznie wirować.
      2. Pozostawić probówkę na lodzie na 10 minut i powoli dodać 20 μl mieszaniny emulsji do górnej części fazy olejowej w probówce o pojemności 1,5 ml z kroku 6.2.2.
      3. Wirować przy 800 × g (przy prędkości wirowania od 100 × g do 1000 × g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i obserwować tworzenie się GUV na dnie probówki.
        UWAGA: Można zastosować wyższą prędkość wirowania właściwego; jednak można by wziąć pod uwagę, że prędkość wirowania może wpływać na rozmiar formowanych GUVs45.
      4. Usuń górną fazę olejową.
      5. Ostrożnie zassać 30 μl GUV na dnie probówki. Inkubować zebrane GUV w temperaturze 30 °C.
        UWAGA: Optymalna temperatura inkubacji różni się dla różnych białek.
      6. Użyj konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM) do monitorowania ekspresji białek fluorescencyjnych.
  3. Obsługiwana dwuwarstwa lipidowa (SLB)
    1. Przygotowanie komór SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe, dodając siedem kropli kwasu siarkowego i dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować reagenty na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 45 minut; Dokładnie spłucz ultraczystą wodą.
      2. Zmontować komorę do rekonstytucji, umieszczając wyciętą probówkę z mikrofugą o pojemności 0,5 ml na oczyszczonych szkiełkach nakrywkowych za pomocą kleju optycznego utwardzonego pod lampą ultrafioletową (365 nm) przez 10 minut, aby utworzyć komorę reakcyjną.
    2. Formacja SLB
      1. Rozpuścić 80% mol% 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC), 19,95% mol% 1,2-dioleoilo-sn-glicerolu-3-fosfo-L-seryny (DOPS) i 0,05% mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina = DOPE), wymieszać z chloroformem, wysuszyć pod łagodnym przepływem azotu i odkurzać przez 1 godzinę w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.
      2. Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy w buforze A SLB, uzyskując końcowe stężenie lipidów 4 mg/ml.
      3. Odwiruj i poddaj sonicyjnie otrzymane próbki, aż staną się klarowne.
      4. Rozcieńczyć 4 mg/ml SUV 130 μl buforu A SLB, przenieść 75 μl zawiesiny do wstępnie uformowanych komór reakcyjnych i inkubować na bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 1 min. Dodać 150 μl buforu A SLB do komory reakcyjnej w celu dalszej inkubacji przez 2 min.
      5. Przemyć komorę 2 ml buforu B SLB (bufor SLB A bez MgCl2) przed wymianą buforu na bufor C S30 z 0,4% (w/v) BSA dla reakcji CFPS, pozostawiając 100 μl buforu wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu powstałego SLB.
      6. Usunąć resztki buforu C S30 i ostrożnie dodać mieszaninę reakcyjną CFPS do komory SLB. Inkubować komorę w temperaturze 30 °C i monitorować ekspresję pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dla każdej nowej partii ekstraktu komórkowego i polimerazy RNA T7 zaleca się przeprowadzenie podstawowego screeningu stężeń zarówno Mg2+, jak i K+, aby zapewnić optymalne działanie systemu CFPS. Fluorescencja białka superfolder GFP może służyć jako wskaźnik ogólnej wydajności systemu CFPS w różnych warunkach, co przedstawiono na Rysunku 1A,B. Dodatkowo, na Rysunku 1C pokazano równoległe porównanie wydajności systemu CFPS w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt przedstawia zmodyfikowany system syntezy białek bezkomórkowych (CFPS) przeznaczony do stosowania w różnych mikrokompartmentach na syntetycznych platformach komórkowych, w tym kropelkach wody w oleju, GUV i SLB. Wykorzystaliśmy standardowy szczep gospodarza z rekombinowaną ekspresją białka E. coli, BL21 (DE3), jako ekstrakt źródłowy do budowy syntetycznych systemów komórkowych skoncentrowanych na białkach. Podejście to pozwoliło uzyskać około 0,5 mg/ml białka w różnych przedziałach. Podczas g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

M. Y. dziękuje za dofinansowanie z Podyplomowego Programu Badań i Innowacji w Prowincji Jiangsu, Chiny (Grant No. KYCX22_2803). L.K. jest wdzięczny za wsparcie Badań Nauk Przyrodniczych Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach (Grant nr 17KJB180003), Fundacji Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Normalnego Jiangsu w Chinach (Grant nr 17XLR037), Priorytetowego Programu Akademickiego Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach oraz programu Jiangsu Specially-Appointed Professor w Chinach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (sól sodowa)(DOPS)Avanti840035P
1,4 ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)Avanti850457P
3,5-cykliczny AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
Probówki 50 mlEppendorfProbówki Eppendorf BioBased
50% nadtlenek wodoruSigma-Aldrich
Sigma-AldrichA6283
Proszek agarowySigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Mieszane komórkiMerckMilliporeUFSC05001
Octan amonu (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininaSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Przegroda Kolba ErlenmeyeraShuniu250 mL, 1000 ml
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)10711454001
Probówki Eppendorf Eppendorf3810X
Stojak na probówki wirówkoweEppendorf0030119819
System obrazowania chemiluminescencji i epifluorescencjiUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (LSM)Szkiełka do komoryLSM 780
CountessThermo Fisher ScientificC10283
Szkiełko nakrywkoweThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
kinaza kreatynowa (CK)Roche10127566001
Fosforan kreatyny (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Naczynie hodowlaneHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytydyna 5'-trifosforanowa sól disodowa (CTP)aladynaC101487
membrana dializyWidmoStandardowe rurki RC MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Elektrogrzewczy kultywator stojącyInstrument YihengDHP-9602
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Biosharp
Czytnik płyt fluorescencyjnychBioTekSynergy 2
Olej fluorowanySuzhou CChip instrument naukowy2%HFE7500
Kwas folinowySigma-Aldrich47612
Prasa francuskaG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlukozaSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminaSigma-AldrichG5792
GlicerolSigma-AldrichG5516
GlicynaSigma-AldrichG7126
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IzoleucynaSigma-AldrichI5281
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LizynaSigma-AldrichL5501
Tetrahydrat octanu magnezu (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MetioninaSigma-AldrichM8439
MikrowirówkaEppendorf5424 R
Olej mineralnySigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Wirówka wielofunkcyjnaEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
i Pomiary UV białekIMPLEN NanoPhotometer N60
Zestaw NucleoBond Xtra Maxi do plazmidu klasy transfekcyjnej DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96-dołkowe płytki polistyrenoweSigma-AldrichP8616
Termocykler do PCREppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
FenyloalaninaSigma-AldrichP8740
Fosfoenolopirulat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Glikol polietylenowy 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Octan potasu (KOAc)Sigma-AldrichP5708
Chlorek potasu ( KCl)Sigma-AldrichP9541
Glutaminian potasu (K-glutaminian)Sigma-AldrichG1501
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Kinaza pirogronianowa (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
WytrząsarkaZhichushakersZQZY-AF8
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SacharozaaladynS112226
Kwas siarkowySigma-Aldrich339741
Filtry strzykawkoweJinteng0,45 i mu; m
ProbówkaShuniu20 ml
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptonSigma-AldrichT7293
TryptofanSigma-AldrichT8941
TyrozynaSigma-AldrichT8566
UTP Sól trisodowa (UTP)U100365
Pompa próżniowa z cyrkulacyjnym systemem wodnymZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Mieszalniki VortexKylin-BellVortex QL-861
System oczyszczania wodyMerckMilliporeDirect ultraczysta woda (typ 1)
Ekstrakt drożdżowySigma-Aldrich70161
β-merkaptoetanolSigma-Aldrich444203
Octan 516813 Probówka wirówkowa Roche zliczania komórek ZEISS 1100027Kwas nukleinowy

Bibliografia

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Montaż oddolnyinżynieria białekurządzenia mikroprzepływowewspierana dwuwarstwa lipidowagigantyczne pęcherzyki jednowarstwowefluorescencyjne białko reporteroweprzygotowanie ekstraktu komórkowegomikroskopia konfokalna
Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.