Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.

Streszczenie

Doświadczenie zmysłowe węchu we wczesnym okresie życia powoduje dramatyczną przebudowę kłębuszków synaptycznych w mózgu młodocianych Drosophila, która jest empirycznie zależna od dawki, ograniczona czasowo i przejściowo odwracalna tylko w krótkim, dobrze zdefiniowanym okresie krytycznym. Kierunkowość przebudowy połączeń synaptycznych obwodów mózgu jest określana przez specyficzny zapach działający na klasę receptorów respondenta węchowych neuronów czuciowych. Ogólnie rzecz biorąc, każda klasa neuronów wyraża tylko jeden receptor zapachowy i unerwia pojedynczy węchowy kłębuszek synaptycznych. W modelu genetycznym Drosophila pełny wachlarz kłębuszków węchowych został precyzyjnie zmapowany na podstawie reakcji na zapach i wyników behawioralnych. Środek zapachowy maślanu etylu (EB) aktywuje neurony receptora Or42a unerwiające kłębuszki VM7. W krytycznym okresie wczesnego życia doświadczenia z EB napędzają zależną od dawki eliminację synaps w węchowych neuronach czuciowych Or42a. Czasowe okresy ekspozycji na dozowany zapach EB pozwalają na badanie zależnego od doświadczenia przycinania połączeń obwodowych w mózgu młodocianych. Obrazowanie pod mikroskopią konfokalną kłębuszków synaptycznych płata czułkowego odbywa się za pomocą markerów transgenicznych sterowanych receptorem Or42a, które zapewniają ilościowe określenie liczby synaps i objętości unerwienia. Zaawansowany zestaw narzędzi genetycznych Drosophila umożliwia systematyczną analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych pośredniczących w przebudowie obwodów mózgowych.

Wprowadzenie

Przebudowa obwodów mózgowych u młodych osobników we wczesnym okresie życia stanowi ostatnią szansę na duże zmiany w połączeniach synaptycznych, aby dopasować się do bardzo zmiennego, nieprzewidywalnego środowiska, w którym rodzi się zwierzę. Jako najliczniejsza grupa zwierząt, owady dzielą ten ewolucyjnie zachowany, fundamentalny mechanizm przebudowy okresu krytycznego¹. Okresy krytyczne otwierają się wraz z nadejściem bodźca sensorycznego, wykazują odwracalne zmiany obwodu w celu optymalizacji łączności, a następnie zamykają się, gdy siły stabilizacyjne opierają się dalszej przebudowie². Owady są szczególnie zależne od węchowych informacji sensorycznych i wykazują dobrze zdefiniowany węchowy okres krytyczny. Drosophila stanowi doskonały model genetyczny do badania tego zależnego od doświadczenia okresu krytycznego w mózgu młodocianego. Doświadczenie odorantu w ciągu pierwszych kilku dni po eklozji powoduje uderzające zmiany łączności obwodów w indywidualnie zidentyfikowanych kłębuszkach synaptycznych ^3,4. Kierunek przebudowy zależy od konkretnego doświadczenia z wejściowym odorantem. Niektóre substancje zapachowe powodują wzrost objętości kłębuszka synaptycznego na kilka dni po ekklonizacji (DPE)^3,5,6,7, podczas gdy inne substancje zapachowe powodują szybką eliminację synaps w krytycznym okresie 0-2 DPE, co skutkuje zmniejszeniem objętości unerwienia^8,9,10. W szczególności, doświadczenie z zapachem maślanu etylu (EB) napędza zależne od dawki przycinanie synaptyczne neuronów receptora węchowego Or42a tylko w tym krytycznym okresie wczesnego życia⁸. Eliminacja synaps jest całkowicie odwracalna poprzez modulację dopływu zapachu EB w okresie krytycznym, ale staje się trwała po zamknięciu okresu krytycznego. To zależne od doświadczenia węchowego przycinanie synaptyczne stanowi cenny system eksperymentalny do wyjaśnienia czasowo ograniczonych mechanizmów leżących u podstaw przebudowy obwodów mózgu u młodych ludzi.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół używany do indukowania i analizowania zależnego od doświadczenia EB przycinania synaptycznego węchowych neuronów czuciowych receptora Or42a we wczesnym okresie życia. Pokazujemy, że zakończenia synaptyczne Or42a w płacie anteny kłębuszków nerkowych VM7 mogą być specyficznie znakowane przez transgeniczne kierowanie markerem mCD8::GFP na uwięzi błonowej, albo bezpośrednio połączonym z promotorem Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ lub przy użyciu systemu wyrażeń binarnych Gal4/UAS (Or42a-Gal4 sterujący UAS-mCD8::GFP)¹². Poszczególne synapsy neuronów Or42a mogą być podobnie znakowane za pomocą ukierunkowanej transgenicznej ekspresji markerów presynaptycznej strefy aktywnej połączonych z szeregiem znaczników fluorescencyjnych (np. Bruchpilot::RFP)⁸ lub sygnału o dużej gęstości elektronów do analiz synaps ultrastrukturalnych (np. miniSOG-mCherry)⁸. Zakończenia synaptyczne Or42a można obrazować za pomocą kombinacji laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że przycinanie kłębuszków synaptycznych Or42a jest zależne od dawki EB, skalując się do stężenia doznania zapachowego w czasie. Procentowa zawartość substancji zapachowej EB rozpuszczonej w oleju mineralnym używanym jako nośnik może być różna, podobnie jak czas trwania ekspozycji na środek zapachowy u zwierząt w stadium rozwoju. Na koniec pokazujemy metody stosowane do analizy zakresu przycinania kłębuszków synaptycznych poprzez pomiar intensywności i objętości fluorescencji unerwienia VM7. Liczbę synaps można również określić ilościowo, licząc znakowane punkty synaptyczne i mierząc parametry ultrastruktury synaptycznej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej⁸. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół jest potężnym podejściem, które umożliwia systematyczną analizę zarówno komórkowych, jak i molekularnych mechanizmów pośredniczących w przycinaniu połączeń synaptycznych obwodu węchowego Drosophila w młodzieńczym okresie krytycznym. Ogólna konfiguracja ekspozycji na zapach opisana w tym badaniu została wykorzystana w poprzednich badaniach z wykorzystaniem innych zapachów i oznaczaniem innych kłębuszków nerkowych^3,7.

Protokół

1. Ekspozycja na substancje zapachowe

1. Za pomocą cienkiego pędzla posortuj 40-50 zwierząt w stadium rozwojowym jako ciemne poczwarki pharate (90+ h po poczwarzeniu w temperaturze 25 °C) do fiolek z polistyrenu Drosophila o wymiarach 25 mm x 95 mm zawierających standardowy pokarm z melasy z mąki kukurydzianej (Rysunek 1A).
2. Umieść drobną siatkę drucianą ze stali nierdzewnej na końcu fiolek Drosophila, aby zatrzymać muchy, a jednocześnie umożliwić dobry przepływ powietrza. Zabezpiecz nasadki z siatki drucianej przyklejoną przezroczystą folią z boku fiolek Drosophila.
3. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml umieść 1 ml 100% oleju mineralnego (kontrola nośnika) lub rozpuść środek zapachowy na bazie maślanu etylu (EB) w oleju mineralnym w innej probówce, aby uzyskać pożądane stężenie (np. 15% (150 μL) lub 25% (250 μL)).
4. Umieść probówki do sterowania pojazdem lub mikrowirówki do nawaniania w pozycji pionowej w hermetycznym pojemniku Glasslock o pojemności 3700 ml. Za pomocą taśmy zakotwicz rurki bezpiecznie w środku komór nawaniających razem z fiolkami Drosophila (Rysunek 1B).
5. Umieścić szczelnie zamknięte komory kontrolne nośnika i komory nawaniacza EB zawierające etapowe fiolki poczwarek Drosophila pharate w wilgotnym (70%) inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (25 °C) w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności.
6. Usuń nowo zamknięte muchy po 4 godzinach ekspozycji w komorze nawaniającej i szybko przenieś 20-25 much do świeżych fiolek Drosophila w komorach ze świeżo przygotowanym środkiem zapachowym (Rysunek 1A,B). Wyrzuć niezamknięte poczwarki.
7. Muchy należy przechowywać w szczelnych komorach nawaniających w inkubatorach przez łącznie 24 godziny. Aby uzyskać dłuższe dozowanie środka zapachowego, należy co 24 godziny szybko przenosić muchy do nowych fiolek Drosophila w świeżo przygotowanych komorach zapachowych.
8. Znieczulenie muszek w stadium rozwojowym poprzez zanurzenie ich w naczyniu z 70% etanolem na 1 minutę w ramach przygotowań do natychmiastowego wypreparowania mózgu i przetworzenia immunocytochemicznego.

2. Sekcja mózgu

1. Oznacz fiolki jako kontrolne nośnika (tylko 100% oleju mineralnego) lub narażone na EB (% EB) poprzez etykietowanie i utrzymuj te oznaczenia przez cały czas trwania sekcji mózgu i późniejszego przetwarzania. Przetwórz 10-20 zwierząt dla każdego genotypu/stanu zapachowego.
2. Za pomocą kleszczy przenieś pojedynczą znieczuloną muchę do małego naczynia ze świeżo przygotowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)¹³. Zanurz muchę w PBS i kontynuuj pełną sekcję mózgu z muchą całkowicie zanurzoną.
3. Z cienkimi (#4) zaostrzonymi kleszczami w obu rękach, połóż muchę brzuszną stroną do góry i chwyć górną część klatki piersiowej jednym kleszczem, a głowę pod trąbką drugimi kleszczami. Uważaj, aby nie przeniknąć do mózgu.
4. Zdejmij głowę z reszty ciała, delikatnie pociągając obiema rękami w przeciwnych kierunkach. Głowa powinna łatwo odczepić się od klatki piersiowej; pozostawić odizolowaną głowę do rozwarstwienia (Rysunek 1C).
5. Wsuń kleszcze używane wcześniej do chwytania klatki piersiowej pod przeciwną stronę trąbki. Zacznij delikatnie ciągnąć naskórek egzoszkieletu w przeciwnych kierunkach, tak aby rozerwał się między oczami, odsłaniając mózg.
6. Podczas ciągnięcia płaty wzrokowe mózgu mogą oddzielić się wraz z egzoszkieletem. Aby temu zapobiec, użyj powolnego, stałego pociągnięcia dwoma kleszczami podczas usuwania naskórka egzoszkieletu (Rysunek 1C, środek).
7. Kontynuuj usuwanie naskórka egzoszkieletu z głowy. Upewnij się, że wszystkie części egzoszkieletu zostały usunięte. Usuń wszelkie tkanki przyczepione do mózgu, w tym ciało tłuszczowe i wystającą tchawicę.
8. Aby zapobiec przywieraniu, przepłukać końcówkę pipety P20 środkiem PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Natychmiast po rozbiorze przenieś mózgi do roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu (PFA) + 4% sacharozy) w zaślepionej probówce (Rysunek 1C,D).

3. Immunocytochemia mózgu

1. Unieruchom mózg przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z rotacją od końca do końca. Trzymając mózg w probówce, odpipetuj i odpowiednio zutylizuj niebezpieczny utrwalacz. Szybko umyj stałe mózgi 3x za pomocą PBS (Rysunek 1D).
2. Mózgi często można znaleźć utknięte w nasadce rurek po obróceniu. Aby zapobiec przypadkowej utracie mózgu, która stanowi stałe zagrożenie we wszystkich transferach, podczas pipetowania płynów należy używać mikroskopu preparacyjnego.
3. Przygotowując się do znakowania przeciwciałami, zablokuj utrwalone mózgi na 1 godzinę w RT w PBST + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,5% normalnej surowicy koziej (NGS) ze stałą rotacją końca końca (Rysunek 1D).
4. Usunąć blok i inkubować mózgi z wybranym pierwszorzędowym przeciwciałem odpowiednio rozcieńczonym w PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Inkubować mózgi przez noc (14-16 godzin) w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją.
   UWAGA: Przykładowe użyte przeciwciała: szczurzy anty-CadN (rozcieńczenie 1:50)¹⁴ do oznaczania kłębuszków synaptycznych i kurczaka anty-GFP (1:1000)⁸ do oznaczania Or42a-mCD8::GFP (Rysunek 1D).
5. Odpipetować przeciwciało pierwotne. Myj mózgi 3x po 20 minut za pomocą PBST. Inkubować mózgi z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w PBST z 0,2% BSA + 0,1% NGS przez 2 godziny w RT ze stałą rotacją.
   UWAGA: Alternatywnie, inkubować mózgi przez noc (14-16 godzin) w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciała w PBST 0,2% BSA + 0,1% NGS; Zastosowano tu przeciwciała drugorzędowe: 488 kozich anty-kurczaków (1:250) i 546 kozich antyszczurów (1:250).
6. Odpipetować przeciwciała drugorzędowe. Myj mózgi 3x po 20 minut za pomocą PBST. Na koniec myj mózgi przez 20 minut za pomocą PBS (Rysunek 1D).
7. Przygotować szklane szkiełka mikroskopowe (75 mm x 25 mm), dodając do szkiełka dwa cienkie paski dwustronnej taśmy klejącej w odległości ~25 mm od siebie. Zapewnia to przekładkę, aby uniknąć zmiażdżenia mózgu.
8. Odpipetować ~10-15 μL medium montażowego między dwoma paskami taśmy, aby zamontować mózgi. Za pomocą końcówki pipety P20 wstępnie przepłukanej PBST, przenieś oznaczone mózgi na szkiełko mikroskopowe (Rysunek 1E).
9. Po przeniesieniu mózgów użyj cienkiego pędzla, aby je wyrównać, upewniając się, że płaty czułków są skierowane do góry. Poszukaj strony, która ma łukowaty garb, który będzie zawierał płaty czułków.
10. Gdy mózgi są już odpowiednio zorientowane, przykryj je szklanym szkiełkiem nakrywkowym (nr 1.5H), upewniając się, że szkiełko nakrywkowe jest dobrze przymocowane do taśmy. Następnie wypełnij boki szkiełka nakrywkowego dodatkowym medium montażowym (Rysunek 1E).
11. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia, a następnie przechowuj je w lodówce do późniejszego obrazowania.

4. Obrazowanie konfokalne

1. Zaślep wszystkie preparaty mózgowe zarówno na genotyp, jak i warunki doświadczenia przed obrazowaniem, oznaczając szkiełko zakodowaną etykietą w celu późniejszego odkodowania.
2. Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzonym w oleju 63x. Używamy mikroskopu Zeiss 510 META na wszystkich pokazanych tutaj obrazach (Rysunek 1F).
3. Użyj odpowiednich linii laserowych dla zastosowanych fluoroforów. W tym przypadku użyj lasera Argon 488 i HeNe 543 do obrazowania kłębuszków synaptycznych płata antenowego i węchowych neuronów czuciowych Or42a (Rysunek 2).
4. Określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów, najlepiej zachowując wzmocnienie dla obu kanałów <750 i przesunięcie ≈0. Ma to na celu zapewnienie optymalnego stosunku sygnału do szumu przy jednoczesnym ograniczeniu tła.
5. Umieść obrazowanie w centrum mózgu. Podczas obrazowania kłębuszki VM7 znajdują się proksymalnie do otworu pozostawionego w środku mózgu po usunięciu przełyku podczas sekcji (Rysunek 2A).
   UWAGA: Kłębuszki nerkowe VM7 zawsze będą znajdować się blisko otworu przełyku. Jednak dokładna lokalizacja i rozmiar różnią się nieznacznie w zależności od sekcji mózgu i różnic w narastaniu, więc weź to pod uwagę podczas obrazowania.
6. Wybierz rozdzielczość obrazowania i grubość warstwy optycznej. W tym przypadku używana jest rozdzielczość 1024 x 1024 z grubością warstwy Z-stack wynoszącą 0,37 μm.
7. Wykonaj całą konfokalną projekcję stosu Z przez płat antenowy, zapewniając uchwycenie pełnego unerwienia neuronu Or42a kłębuszków nerkowych VM7.

5. Pomiary synaptyczne

1. Załaduj obraz z zaślepionym genotypem/kondycją na Fidżi (1.54f). Podziel kanały linii laserowej, klikając Obraz > Kolor > Podziel kanały.
2. W węchowym kanale czuciowym Or42a określ, które wycinki zawierają unerwienie Or42a, przewijając cały stos Z, identyfikując, gdzie zaczyna się i kończy fluorescencja.
3. Utwórz projekcję wycinków sumy zawierającą tylko wycinki zawierające unerwienie neuronu Or42a, klikając Stosy obrazów > > Z Projektuj > Sumuj wycinki i wprowadzając żądany zakres.
4. Na Fidżi kliknij narzędzie Lasso na górnym pasku, aby prześledzić kontur unerwienia neuronu Or42a w kłębuszkach nerkowych VM7, traktując każde kłębuszki nerkowe po stronie mózgu niezależnie (Rysunek 3).
5. Pomnóż obwód przez liczbę plasterków stosu Z i grubość każdego plasterka, aby uzyskać objętość unerwienia kłębuszka synaptycznego VM7. Aby określić ilościowo liczbę synaps, narzędzie find maxima może być używane wraz z makrem find maxima stacks do liczenia punktów synaps w zaznaczonym regionie^8,15.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje przebieg pracy dla zależnej od doświadczenia węchowego, krytycznej ekspozycji na zapach i metod obrazowania mózgu. Protokół rozpoczyna się od dopasowania wiekowego ciemnych poczwarek pharate bezpośrednio przed eklozją (Ryc. 1A). Poczwarki umieszcza się w komorach nawaniających na 4 godziny, a następnie nowo zamknięte dorosłe osobniki umieszcza się w świeżych fiolkach w komorze kontrolnej pojazdu lub dozowanej EB (Rysunek 1B). Zazwyczaj wystawiamy się na działanie środka zapachowego przez 24 godziny, chociaż możliwy jest dowolny czas. Po ekspozycji na substancję zapachową sekcja mózgu rozpoczyna się od usunięcia głowy z klatki piersiowej, a następnie usunięcia egzoszkieletu naskórka za pomocą cienkich kleszczy (Rysunek 1C). Wyizolowany mózg jest oczyszczany z wszelkich powiązanych tkanek, które mogłyby zakłócać obrazowanie, a następnie natychmiast utrwalany w 4% paraformaldehydzie i 4% sacharozie w PBS. Krótka poprawka trwająca 30 minut jest wystarczająca dla dobrej integralności tkanki mózgowej. Protokół immunocytochemiczny rozpoczyna się od 1-godzinnego bloku (np. BSA, NGS), nocnej inkubacji w przeciwciałach pierwszorzędowych (np. Anty-GFP, -CadN), a następnie krótkiej 2-godzinnej inkubacji w przeciwciałach drugorzędowych (Figura 1D). Oznaczone mózgi są montowane na szklanych szkiełkach pod uszczelnionymi szkiełkami nakrywkowymi z powierzchnią grzbietową mózgu do góry, aby uzyskać najlepsze zobrazowanie płatów czułków (Ryc. 1E). Należy zauważyć, że wszystkie próbki są ślepe zarówno na genotyp, jak i warunki doświadczenia, oznaczając szkiełko zakodowanym oznaczeniem do późniejszego dekodowania. Laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny z 63-krotnym obiektywem zanurzonym w oleju służy do obrazowania centralnych płatów czułków mózgowych (Ryc. 1F). Linie laserowe optymalne dla zastosowanych fluoroforów są wybierane (np. Argon 488 i HeNe 543) w celu zobrazowania unerwienia węchowego neuronu czuciowego Or42a VM7 w kontekście otaczających kłębuszków nerkowych.

Ważne jest, aby wybrać optymalne wzmocnienie, przesunięcie, rozdzielczość obrazowania i grubość warstwy optycznej, aby uchwycić całą projekcję stosu Z unerwienia neuronu Or42a w kłębuszkach nerkowych VM7. Wszystkie genotypy i warunki doświadczenia, które mają być porównane, są obrazowane przy identycznych ustawieniach mikroskopu. Stosy Z są przetwarzane za pomocą oprogramowania ImageJ, a zmiany zależne od doświadczenia oceniane są głównie na podstawie objętości unerwienia^7,14. Istnieją dwa sposoby obliczania pomiarów objętościowych. Obszar unerwienia oblicza się plasterek po wycinku za pomocą funkcji lasso ImageJ, a następnie mnoży każdą wartość przez grubość każdego wycinka (μm)^8,9. Drugi wykorzystuje sumę wycinków Z i mnoży liczbę wycinków stosu Z przez grubość plasterka w celu określenia średniej objętości. Obie metody dają spójne wyniki. Oprócz pomiarów objętości, intensywność fluorescencji można również ocenić za pomocą projekcji maksymalnej intensywności VM7 glomeruli¹⁶. Ważona suma wszystkich pikseli jest oceniana za pomocą projekcji maksymalnej warstwy sumy ImageJ, przy czym liczba pikseli na każdym poziomie intensywności jest sumowana w celu obliczenia ogólnej intensywności^8,9. Tło można odjąć, określając ilościowo obszar pozakłębuszkowy o identycznej wielkości. Ta metoda odejmowania jest bardziej czasochłonna, ale dokładniejsza, ponieważ uwzględnia różne poziomy znakowania przeciwciał tła w każdej próbce mózgu, aby uzyskać bardziej reprezentatywną kwantyfikację wartości intensywności fluorescencji unerwienia. Pomiary intensywności są wykonywane w typowym zakresie 18-30 warstw optycznych (0,37 μm/plasterek) w stosie Z, uśrednionych dla każdego brain¹⁶. W prawie wszystkich przypadkach pomiary intensywności i objętości fluorescencji unerwienia dają spójne wyniki.

We wszystkich modalnościach pomiarowych, reprezentatywne wyniki pozostają niezachwiane; doświadczenie z zapachem EB we wczesnym okresie życia powoduje znaczną utratę unerwienia neuronów Or42a. Kłębuszki VM7 można niezawodnie zidentyfikować na podstawie rozmiaru, kształtu i lokalizacji wśród innych precyzyjnie zmapowanych kłębuszków węchowych płata antenowego (Rysunek 2A) oraz przez ukierunkowaną ekspresję etykiety błony Or42a-mCD8::GFP sprzężoną z znakowaniem kłębuszkowym za pomocą kadheryny antyneuronalnej (CadN; Rysunek 2B). Czasowa ekspozycja na środek nawaniający (olej mineralny) powoduje unerwienie neuronów Or42a nie do odróżnienia od nieleczonego, normalnego zwierzęcia. Mimo to, doświadczenie zapachu EB w ciągu pierwszych kilku dni po eklosji (dpe) powoduje przycinanie kłębuszków synaptycznych (Rysunek 2C). Ten mechanizm przycinania jest całkowicie ograniczony do krótkiego okresu krytycznego we wczesnym okresie życia^8,10. Zazwyczaj używamy teraz 24-godzinnej ekspozycji na substancje zapachowe do oceny przycinania synaptycznego kłębuszków VM7 i wynikającego z tego zmniejszenia objętości unerwienia w mózgu młodocianych Drosophila. 24-godzinna ekspozycja (0-1 dpe) na kontrolę nośnika nawaniającego (olej mineralny) utrzymuje normalne, gęste unerwienie Or42a-mCD8::GFP (zielone) w kłębuszkach synaptycznych VM7 (białe przerywane okręgi) w obu płatach czułkowych półkuli mózgu (Rysunek 2D, po lewej). W uderzającym kontraście, 24-godzinna ekspozycja (0-1 dpe) na 25% nawaniacza EB rozpuszczonego w oleju mineralnym powoduje silne przycięcie unerwienia Or42a-mCD8::GFP (zielony) i utratę objętości kłębuszków synaptycznych (Rysunek 2D, po prawej). Wyniki te są zarówno wizualnie oczywiste, jak i niezmiennie przejrzyste. Jednym z największych atrybutów tego protokołu doświadczenia z odorantami jest przejrzystość wyników obrazowania mózgu, które są również niezwykle podatne na proste ilościowe oznaczanie intensywności i objętości fluorescencji unerwienia.

Główną zaletą tego protokołu doświadczenia z odorantem jest możliwość wykorzystania go do badania ograniczeń czasowych i mechanizmów zależnych od dawki zapachu podczas krytycznego okresu przycinania synaptycznego. W przypadku eliminacji synaps neuronów Or42a przez EB w kłębuszkach nerkowych VM7, mechanizm przebudowy jest przede wszystkim ograniczony do wczesnych osobników młodocianych (0-2 dpe), bez wykrywalnego, zależnego od doświadczenia przycinania synaps w wieku dojrzałym (7-9 dpe), z wyjątkiem niewielkiej modulacji przy najwyższych poziomach ekspozycji na EB⁸. Takie ograniczenie czasowe określa okres krytyczny, a zrozumienie tego mechanizmu czasowego jest ważnym celem. Innym atrybutem tego protokołu jest to, że zależne od doświadczenia przycinanie synaptyczne jest zależne od dawki EB (Rysunek 3). Czasowa ekspozycja na kontrolę nośnika nawaniającego (olej mineralny) z 0% środkiem zapachowym EB powoduje normalne unerwienie neuronów Or42a kłębuszka synaptycznego VM7, który jest nie do odróżnienia od zwierzęcia nieleczonego. Obliczanie trójwymiarowej objętości unerwienia neuronu Or42a pokazuje rozmiar typowy dla normalnego mózgu młodego człowieka (2260^μm3; Rysunek 3A, po lewej). Reprezentatywne wyniki pokazują, że rosnące stężenie substancji zapachowej EB powoduje stopniowo większe przycinanie kłębuszków synaptycznych. Na przykład 24-godzinna ekspozycja (0-1 dpe) na 15% nawaniacza EB powoduje wyraźną i stałą utratę unerwienia (Rysunek 3A, środek). Kwantyfikacja objętości unerwienia 3D wykazuje uderzającą redukcję w porównaniu z kontrolami pojazdu (760^μm3 vs. 2260^μm3). 24-godzinna ekspozycja (0-1 dpe) na 25% nawaniacza EB powoduje jeszcze większą utratę unerwienia (281^μm3; Rysunek 3A, po prawej). Reprezentatywne oceny ilościowe dla tego zakresu stężeń nawochania EB pokazują spójne wyniki dla intensywności fluorescencji (Rysunek 3B) i objętości unerwienia (Rysunek 3C). Ta zależność od dawki pozwala na badanie sposobów zapobiegania przycinaniu synaptycznemu, a także na zwiększenie przycinania przy niższym narażeniu na substancje zapachowe, aby wykazać zwiększoną przebudowę kłębuszków synaptycznych. Niektóre wcześniejsze badania wykazały odwrotny efekt zwiększonej objętości kłębuszków nerkowych przy użyciu innych substancji zapachowych z tym protokołem¹⁰. Narażenie na działanie substancji zapachowej EB w okresie krytycznym zawsze skutkuje uderzającym i łatwo wykrywalnym przycinaniem kłębuszków synaptycznych.

Rysunek 1: Schemat badań ekspozycji na substancje zapachowe w mózgu młodocianych Drosophila. (A) Ciemne poczwarki Pharate (90+ h po przepoczwarzeniu w temperaturze 25 °C) zbiera się i umieszcza w komorach zapachowych. W warunkach nawaniania dopuszcza się 4 godziny na ekluzję, a następnie młode muchy przenosi się do świeżej fiolki. (B) Muchy w tym samym wieku dzielą się na warunki kontroli pojazdu (100% oleju mineralnego) lub maślanu etylu (EB; % v/v w oleju mineralnym). Drobna siatka druciana (wstawka) umożliwia dostęp do nawaniaczy. Muchy są zwykle wystawiane na działanie promieni słonecznych przez dodatkowe 20 godzin, co daje łącznie 24 godziny ekspozycji, 0-1 dzień po eklosji (dpe). (C) Muchy są preparowane poprzez usunięcie najpierw głowy, a następnie cienkie kleszcze są używane do delikatnego usunięcia egzoszkieletu naskórka i wyizolowania młodocianego mózgu. Odizolowany mózg jest oczyszczony ze wszystkich otaczających tkanek i wystającej tchawicy. (D) Izolowane mózgi są unieruchamiane, blokowane, a następnie sekwencyjnie inkubowane w przeciwciałach pierwszorzędowych i drugorzędowych. Zakres stosowanych przeciwciał zazwyczaj obejmuje ogólną sondę błonową w celu ujawnienia płata antenowego, kłębuszków synaptycznych i specyficzną sondę błonową dla węchowych neuronów czuciowych Or42a. (E) Znakowane mózgi umieszcza się w podłożu montażowym na szklanym szkiełku mikroskopowym z przekładkami z taśmy pod szczelnie zamkniętym szkiełkiem nakrywkowym. Prawidłowa orientacja mózgu (powierzchnia grzbietowa do góry) ma kluczowe znaczenie dla optymalnego obrazowania płatów czułkowych. (F) Mózgi są obrazowane za pomocą skaningowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie próbki są ślepe na genotyp i warunki doświadczenia przed obrazowaniem i późniejszymi analizami ilościowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zależne od doświadczenia zapachu przycinanie kłębuszków synaptycznych w okresie krytycznym. (A) Kłębuszki węchowe płata czułka (AL) są precyzyjnie odwzorowane. Pokazano kilka reprezentatywnych kłębuszków synaptycznych. Klasa węchowych neuronów czuciowych (OSN) receptora Or42a specyficznie unerwia kłębuszki VM7. (B) Neurony oznaczone znakiem GFP (zielone) gęsto unerwiają sparowane kłębuszki VM7 po lewej (L) i prawej (R) stronie mózgu, z znakowaniem przeciwciałami N-kadheryny (CadN) wszystkich kłębuszków synaptycznych AL (magenta). Linka muchowa to w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Schematyczne graficzne przedstawienie unerwienia Or42a OSN kłębuszków synaptycznych VM7 w warunkach kontroli nośnika (100% olej mineralny; po lewej) i ekspozycji na maślan etylu (% EB v/v w oleju mineralnym; po prawej) w okresie krytycznym dla młodocianych. Przycinanie unerwienia zależne od doświadczenia występuje tylko w przypadku ekspozycji na EB we wczesnym okresie życia, z eliminacją synaps i utratą aksonów, co skutkuje zmniejszeniem objętości unerwienia. (D) Reprezentatywne obrazy konfokalne unerwienia Or42a OSN sparowanych kłębuszków synaptycznych VM7 (przerywane białe okręgi konturowe; Or42a-mCD8::GFP, zielony) po kontroli pojazdu olejowego (po lewej) i 25% ekspozycji EB (po prawej) przez 24 godziny (0-1 dpe). Doświadczenie z zapachem EB napędza przycinanie synaptyczne i utratę objętości unerwienia. Ten zależny od doświadczenia mechanizm jest ograniczony czasowo i przejściowo odwracalny tylko w dobrze zdefiniowanym węchowym okresie krytycznym w ciągu pierwszych kilku dni po eklozji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja intensywności i objętości fluorescencji unerwienia krwionośnych kłębuszków synaptycznych EB zależnej od dawki. (A) Or42a-mCD8::Unerwienie oznaczone GFP w kłębuszku synaptycznym VM7 (zielonym) wystawionym od 0-1 dpe na kontrolę oleju mineralnego nośnika nawaniającego (0% EB, po lewej), 15% EB (w środku) lub 25% EB (po prawej). Poniżej: Te same obrazy z zarysowanym unerwieniem kłębuszkowym (białe kółka) i obliczoną 3-wymiarową objętością unerwienia. Kontrola pojazdu ma unerwienie kłębuszków synaptycznych VM7 przez neurony Or42a, które jest nie do odróżnienia od nieleczonych zwierząt. Doświadczenia z okresu krytycznego z 15% ekspozycją na nagłą substancję zapachową EB skutkują oczywistym przycinaniem kłębuszków synaptycznych, z 66% spadkiem objętości unerwienia trójwymiarowego w tym przypadku. Ekspozycja na wyższy poziom 25% EB powoduje większe przycinanie, z prawie 90% utratą objętości kłębuszków synaptycznych w tym przypadku. W ten sposób można wyobrazić sobie przycinanie zależne od dawki wraz ze wzrostem doznań zapachowych. (B) Reprezentatywne wyniki intensywności fluorescencji znakowanej Or42a-mCD8::GFP w kłębuszkach synaptycznych VM7 wystawionych od 0-1 dpe na kontrolę nośnika nawaniającego (olej, zielony), 15% EB (środek, pomarańczowy) lub 25% EB (po prawej,). (C) Reprezentatywne wyniki trójwymiarowych objętości unerwienia kłębuszków nerkowych VM7 w tych samych krytycznych warunkach narażenia na działanie substancji zapachowych w okresie krytycznym. Wykresy rozrzutu pokazują wszystkie poszczególne punkty danych ze średnią ± SEM. Istotność jest oznaczona jako p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) i p ≤ 0,0001 (****). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół ekspozycji na substancje zapachowe i obrazowania mózgu może być wykorzystany do wiarygodnego indukowania i ilościowego określania zależnego od doświadczenia węchowego przycinania kłębuszków nerkowych węchowych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia. Wcześniejsze badania wykorzystujące ten paradygmat leczenia do zbadania przebudowy obwodu węchowego rozpoczęły ekspozycję na zapach w 2^dobie po eklozji ^3,4,5. W przeciwieństwie do tego, rozpoczynamy ekspozycję na zapach u poczwarek pharate przed dorosłą eklozją i stwierdzamy, że zdecydowana większość przebudowy następuje w ciągu pierwszych 24 godzin po eklozji ^8,9. Tak więc niezbędnym krokiem w tym protokole ekspozycji na zapach jest umieszczenie etapowych ciemnych poczwarek w komorach zapachowych przed eklozją (ryc. 1). Nie chodzi o narażenie poczwarki na zapach jako taki, ale raczej o zapewnienie ekspozycji na zapach natychmiast po eklencji dorosłego osobnika. Wybraliśmy zamkniętych młodocianych osobników dorosłych 4 godziny po inscenizacji, aby zsynchronizować wiek w ciasnym oknie czasowym i uniknąć różnic w czasie ekspozycji na zapach. Ten wcześniejszy interwał doświadczeń jest zgodny z ostatnimi badaniami wykazującymi, że przyzwyczajenie węchu EB zamyka się już po 2 dniach od eklozji¹⁰. Jednak konsekwencje różnic w czasie ekspozycji na nawaniacz w okresie krytycznym (np. 0-1 vs. 1-2 dni) nie zostały dobrze scharakteryzowane. Węchowe neurony czuciowe Or42a selektywnie unerwiają kłębuszki VM7 w płacie antenowym, który można łatwo zidentyfikować na podstawie precyzyjnych map kłębuszków nerkowych i docelowego znakowania unerwienia (np. Or42a-mCD8::GFP; Rysunek 2). Narażenie na zapach EB w okresie krytycznym nie zmienia ekspresji promotora Or42a ani poziomów reporterowych⁸. Czasowa ekspozycja na zapach powoduje sekwencyjną eliminację synaps i utratę unerwienia aksonów z neuronów receptora Or42a. Przycinanie to jest całkowicie odwracalne we wczesnym okresie krytycznym (0-2 dpe), ale nie w wieku dojrzałości dorosłego (7-9 dpe), kiedy zmiany w środowisku zapachowym nie wpływają już na unerwienie. Ścisłe ograniczenie czasowe tego zależnego od doświadczenia sensorycznego mechanizmu jest głównym nierozstrzygniętym pytaniem w tej dziedzinie. Podejmuje się wiele prób ponownego otwarcia krytycznej plastyczności przypominającej okres dojrzałości. Podany tutaj protokół jest potężną drogą do zbadania.

Opisana tutaj łatwość ekspozycji na substancje zapachowe i protokół obrazowania mózgu pozwalają na szeroką dostępność i szerokie możliwości adaptacji. Początek, zakończenie i czas trwania ekspozycji na zapach są całkowicie zależne od uznania badacza, aby umożliwić ukierunkowane badania krytycznych właściwości okresowych, odwracalności przebudowy i ponownego otwarcia krytycznej plastyczności podobnej do okresu. Podobnie, siłą doświadczenia zapachowego można łatwo manipulować w celu zbadania zależnego od dawki przycinania kłębuszków synaptycznych (ryc. 3). Co ważne, badania, w których stosuje się niższe stężenia EB (np. 15% EB) można wykorzystać do testowania manipulacji, które mogłyby zwiększyć tempo lub zakres przebudowy kłębuszków synaptycznych. Na przykład wyniki mogą wykazać, że przycinanie synaptyczne przy niższych poziomach EB (np. 15%) jest nie do odróżnienia od wyższych poziomów EB (np. 25%). W przypadku różnych manipulacji wyniki można porównać ze stałym unerwieniem kontroli nośnika odorantu i silnym przycinaniem kłębuszków synaptycznych zachodzącym przy 25% EB (ryc. 3). Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że narażenie na działanie substancji zapachowej całkowicie zależy od lotności rozpuszczonego środka zapachowego. Zmienne czynniki, takie jak temperatura i wilgotność względna, wpływają na skuteczność ekspozycji na nazapach⁸. Zagęszczenie much w komorach nawaniających może również potencjalnie wpływać na narażenie na substancje zapachowe, na przykład poprzez produkcję substancji zapachowych pochodzących z much. Zalecana jest gęstość nie większa niż 20-25 much na fiolkę. Stężenie odorantu wymagane do wywołania bardzo silnego przycinania kłębuszków synaptycznych jest prawdopodobnie wyższe niż to, co jest zwykle doświadczane w naturze^10,17. Techniki obrazowania o znacznie wyższej rozdzielczości byłyby wymagane do oceny eliminacji synaps przy niższych stężeniach substancji zapachowych. Jednak obecny protokół pozwala na spójne i wiarygodne badania szeregu manipulacji.

Istnieje wiele korzyści z tej ekspozycji na substancje zapachowe i protokołu obrazowania mózgu. Drosophila jest niezwykle korzystnym modelem zwierzęcym opartym na obszernym i wyrafinowanym zestawie narzędzi genetycznych, który może być systematycznie wykorzystywany do szerokiego badania interakcji gen-środowisko w krytycznym okresie przebudowy obwodu węchowego. Pokazane tutaj przykłady obejmują transgeniczną linię sterownika Or42a-Gal4, marker błonowy UAS-mCD8::GFP i bezpośrednią fuzję Or42a-mCD8::GFP. Nie ma wyraźnych różnic między przycinaniem kłębuszków synaptycznych za pomocą bezpośredniej fuzji Or42a a metodami pośredniego znakowania Gal4/UAS ^8,9. Sterownik Or42a-Gal4 zapewnia możliwość zarówno manipulowania docelowymi neuronami receptorów węchowych, jak i wizualizacji zależnych od doświadczenia zmian w unerwieniu VM7, podczas gdy bezpośrednia linia fuzji uwalnia binarny system transgeniczny UAS-Gal4 do innych manipulacji ukierunkowanych na komórki. Wiele innych zmutowanych i transgenicznych linii z obszernego zestawu narzędzi Drosophila można wykorzystać do testowania ograniczeń czasowych i mechanizmów zależnych od doświadczenia, w tym identyfikacji komórek pośredniczących w przycinaniu synaptycznym, międzykomórkowych szlaków sygnałowych przekazujących informacje o doświadczeniu węchowym oraz wewnątrzkomórkowej maszynerii wymaganej do docelowej eliminacji synaps. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na systematyczne badanie wielu mechanizmów napędzających zależną od doświadczenia węchowego przebudowę obwodu mózgu. Ten protokół ekspozycji na zapach i obrazowania mózgu może być również wykorzystany do badania krytycznych modyfikacji behawioralnych doświadczeń węchowych specyficznych dla okresu, manipulacji genetycznych i farmaceutycznych, które mogą umożliwić ponowne otwarcie krytycznej plastyczności podobnej do okresu w okresie dojrzałości i innych aspektów plastyczności obwodu węchowego poza przycinaniem kłębuszków synaptycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Do ekspozycji na zapach
Drosophila fiolki	Genesee Scientific	32-110
Maślan etylu	Sigma Aldrich	E15701
Probówki do mikrowirówek	Fisher Naukowy	05-408-129
Olej mineralny	Sigma Aldrich	M3516
Komory zapachowe	Glasslock
Pędzle malarskie	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Siatka druciana	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Etanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Rozcieńczony do 70%
kleszczy	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyd	Mikroskop elektronowy Sciences	157-8	Rozcieńczony do 4%
szalki Petriego	Fisher Scientific	08-757-100B
Solanka buforowana fosforanami	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Rozcieńczona do 1x
sacharozy	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Mikroskop Elektronowy Nauki	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemia
488 kozia anty-kurczak	Invitrogen	A11039
546 kozia antyszczura	Invitrogen	A11081
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A9647
Kurczak anty-GFP	Abcam	13970
Szkiełka nakrywkowe	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Taśma dwustronna	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Mikroskop elektronowy Sciences	17984-25
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Lakier do paznokci	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Niewidoczna
Normalna kozia surowica	Sigma Aldrich	G9023
Szczurze badania rozwojowe anty-CadN	Bank hybrydoma	AB_528121
Mikroskop konfokalny/Analiza
dowolny komputer/laptop
	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Oprogramowanie	Fidżi Fidżi		Wersja 2.14.0/1.54f