Artykuł metodologiczny

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66631

⸱

8 marca 2024

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

W tym artykule

Podsumowanie

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Streszczenie

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. Proces ten jest kluczowy dla prawidłowego funkcjonowania mózgu, a jego rozregulowanie może skutkować zaburzeniami neurorozwojowymi i psychiatrycznymi po urodzeniu. W rzeczywistości stwierdzono, że wiele genów odpowiedzialnych za te choroby jest zaangażowanych w ten proces, a zatem ujawnienie, w jaki sposób te mutacje wpływają na dynamikę komórkową, jest ważne dla zrozumienia patogenezy tych chorób. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych gleju w wycinkach mózgu uzyskanych z zarodków myszy. Komórki są znakowane białkami fluorescencyjnymi za pomocą elektroporacji in utero, która wizualizuje migrację poszczególnych komórek ze strefy komorowej z wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Co więcej, ten system transferu genów in vivo umożliwia nam łatwe przeprowadzanie eksperymentów z przyrostem lub utratą funkcji na danych genach poprzez koelektroporację ich ekspresji lub wektorów knockdown/knockout. Za pomocą tego protokołu można analizować zachowanie migracyjne i prędkość migracji poszczególnych komórek, informacje, które nigdy nie są uzyskiwane z ustalonych mózgów.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju kory mózgowej, (wierzchołkowy) glej promieniowy w strefie komory ramienia (VZ) wyściełającej komorę boczną wytwarza najpierw neurony, a następnie glejowe komórki progenitorowe z pewnym nakładającym się okresem1. Neurony są również generowane z pośrednich komórek progenitorowych lub podstawnego gleju promieniowego w strefie podkomorowej (SVZ) przylegającej do VZ, z których oba pochodzą z (wierzchołkowego) gleju promieniowego2,3. U myszy promieniste komórki glejowe wytwarzają tylko neurony w dniu embrionalnym (E) 12-14, zarówno neurony, jak i komórki progenitorowe glejowe w E15-16 oraz komórki progenitorowe gleju od E17 wzwyż4. Główna populacja komórek progenitorowych glejowych powstałych w tych stadiach embrionalnych preferencyjnie różnicuje się w astrocyty, chociaż niektóre komórki różnicują się również w oligodendrocyty5. Neurony i progenitorzy astrocytów generowane na tych etapach migrują w kierunku powierzchni mózgu i wchodzą do płytki korowej (przyszła istota szara kory). Migracja neuronów z VZ do płytki korowej zachodzi w wielu fazach. Neurony najpierw przyjmują morfologię wielobiegunową tuż nad strefą akumulacji komórek wielobiegunowych (MAZ), nakładając się na SVZ lub strefę pośrednią, gdzie energicznie rozszerzają i wycofują wiele cienkich procesów i powoli migrują (migracja wielobiegunowa)6,7. Po około 24 godzinach neurony przekształcają się w morfologię dwubiegunową, rozciągając gruby proces wiodący w kierunku powierzchni mózgu i cienki proces końcowy do tyłu, a następnie migrują liniowo w kierunku powierzchni mózgu za pomocą promieniowego procesu rozciągającego się od promieniowego gleju do powierzchni pial jako rusztowanie, co nazywa się trybem lokomocji2,8. Ponieważ neurony w trybie lokomocji zawsze docierają do najbardziej zewnętrznej powierzchni płytki korowej, przechodząc przez swoich poprzedników tuż pod strefą brzeżną, neurony są wyrównane w sposób zależny od daty urodzenia na lewą stronę w płytce korowej9,10,11.

Natomiast progenitorzy astrocytów szybko migrują do strefy pośredniej i płytki korowej, z częstymi zmianami kierunku. To zachowanie migracyjne jest zupełnie inne niż migracja neuronów i nazywa się migracją nieregularną5. Progenitorzy astrocytów migrują również wzdłuż naczyń krwionośnych w procesie zwanym migracją sterowaną naczyniami krwionośnymi. Progenitorzy astrocytów przełączają się między tymi trybami migracji i docierają do płytki korowej5,12. Chociaż umiejscowienie astrocytów nie jest ściśle określone przez ich datę produkcji, zaobserwowano łagodną tendencję wcześnie urodzonych astrocytów do osiedlania się w powierzchownej części płytki korowej5. Co ciekawe, astrocyty, które osadzają się w płytce korowej, są generowane w stadiach embrionalnych i ostatecznie różnicują się w astrocyty protoplazmatyczne, podczas gdy astrocyty generowane po urodzeniu nie migrują aktywnie, pozostają w istocie białej i różnicują się w astrocyty włókniste5. Nie jest jasne, w jaki sposób zachodzi ta zależna od stadium specyfikacja podtypów astrocytów.

Zidentyfikowano rosnącą liczbę genów odpowiedzialnych za migrację neuronów, w tym te odpowiedzialne za zaburzenia neurorozwojowe i psychiatryczne13,14. Dlatego tak ważne jest wyjaśnienie wpływu mutacji w tych genach na zachowanie migrujących neuronów. Jak wcześniej wspomniano, migracja neuronów zachodzi w wielu fazach. Obserwacje poklatkowe mogą bezpośrednio określić fazę, na którą główny wpływ ma wpływ (wyjście z cyklu komórkowego, przejście wielobiegunowo-dwubiegunowe, prędkość migracji lokomocji itp.). Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw specyfikacji, migracji i pozycjonowania astrocytów pozostają w dużej mierze nieznane. Biorąc pod uwagę, że astrocyty odgrywają kluczową rolę w synaptogenezie15 i tworzeniu bariery krew-mózg podczas rozwoju mózgu16, wady rozwojowe astrocytów mogą prowadzić do zaburzeń neurorozwojowych. Badania poklatkowe na progenitorach astrocytów mogą wyjaśnić te mechanizmy molekularne i ich związek z chorobami psychicznymi.

Ten protokół zapewnia metodę obserwacji poklatkowej komórek pochodzących z kory VZ. Podobny protokół wideo do obserwacji migracji neuronów został już opublikowany17. Tutaj opisujemy metodę zarówno dla migrujących neuronów, jak i progenitorów astrocytów. Aby oznaczyć te komórki białkami fluorescencyjnymi, takimi jak zielone i czerwone białka fluorescencyjne (GFP i RFP), mieszaniny plazmidów zawierające odpowiednie składniki są wprowadzane do kory VZ przez elektroporację in utero na odpowiednich etapach18,19,20,21. Zmanipulowane zarodki są usuwane w pożądanych stadiach, a mózgi są krojone i wykorzystywane do obserwacji poklatkowych za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego. Za pomocą tej metody można zbadać prędkość, kierunek migracji i inne zachowania, które nigdy nie są rozwiązywane za pomocą ustalonych próbek mózgu. Stosowanie elektroporacji in utero, wektorów ekspresji i knockdown/knockout może być łatwo przenoszone jednocześnie z fluorescencyjnymi wektorami białkowymi, co umożliwia nam prowadzenie badań nad wzmocnieniem i utratą funkcji określonych genów.

Protokół

Obecne badanie zostało przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Badań Rozwojowych, Centrum Niepełnosprawności Rozwojowej Aichi (#2019-013) i Uniwersytetu Keio (A2021-030). Ciężarne myszy ICR (typu dzikiego) zostały uzyskane komercyjnie (patrz Tabela Materiałów). Aby zaobserwować związek między migrującymi komórkami a naczyniami krwionośnymi, wykorzystano myszy Flt1-DsRed, w których komórki śródbłonka wyrażają DsRed22. Samce myszy Flt1-DsRed skrzyżowano z samicami myszy ICR (obie myszy były w wieku 8-24 tygodni). Wszystkie zwierzęta były trzymane i manipulowane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) do momentu pobrania próbek. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Elektroporacja in utero

  1. Przygotuj buforowany przez HEPES roztwór soli fizjologicznej (HBS), dodając równą objętość autoklawowanej wody do dostępnych w handlu 2x HBS.
  2. Istnieją dwie opcje środków znieczulających: izofluran (inhalacja) i MMB (wstrzyknięcie). W przypadku stosowania MMB należy go przygotować w następujący sposób. Dodać 0,75 ml medetomidyny (1 mg/ml), 2 ml midazolamu (5 mg/ml) i 2,5 ml butorfanolu (5 mg/ml) w 19,75 ml autoklawizowanej wody23,
    UWAGA: Ten roztwór znieczulający staje się mniej aktywny w ciągu 2 miesięcy. Przechowywać w temperaturze 4 °C z osłoną świetlną.
  3. Przygotować roztwór atipamezolu. Rozcieńczyć 0,75 ml atipamezolu (5 mg/ml) w 24,25 ml wody w autoklawie.
  4. Przygotować 0,2% (w/v) roztwór Fast Green w wodzie autoklawowanej. Sterylizować za pomocą filtra (wielkość porów 0,22 μm).
  5. Przygotuj plazmid za pomocą konwencjonalnego zestawu do oczyszczania plazmidu opartego na lizie alkalicznej i oczyszczaniu kolumnowym23 zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Rozpuścić oczyszczony plazmid ze 100 ml kultury bakterii w 30-50 μl HBS w celu przygotowania zapasu plazmidu (3-5 μg/μL) (plik uzupełniający 1).
    1. Wymieszaj i rozcieńcz zapasy plazmidów z HBS i dodaj 1/10 objętości 0,2% Fast Green, aby zabarwić wstrzykiwacz. Składniki i końcowe stężenia plazmidów określa się zgodnie z ich przeznaczeniem (tabela 1).
  6. Wykonaj mikropipety, przeciągając szklane kapilary za pomocą ściągacza do pipet.
    UWAGA: Końcówkę pipety przecina się ukośnie za pomocą cienkich kleszczy. Średnica zewnętrzna końcówki wynosi około 70 μm. Oznacz mikropipety w odstępach co 2 μl, odsysając 2 μl wody.
  7. Wstrzyknąć środek znieczulający MMB w dawce 10 μl/g masy ciała dootrzewnowo ciężarnej myszy w odpowiednim stadium (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    UWAGA: Stadia zarodkowe, które mają być manipulowane, powinny być określone zgodnie z celem. Do oznaczania przyszłych neuronów piramidowych II/III odpowiedni jest E14.5. Aby oznaczyć przodków glejowych, należy wykonać elektroporację na E15-16. Alternatywnie, myszy można znieczulić przez inhalację izofluranu (1%-2%).
  8. Po głębokim znieczuleniu myszy umieść ją na ciepłym talerzu w temperaturze 38 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że mysz nie reaguje na ściskanie ogona.
    9. Po usunięciu sierści wokół pola operacyjnego za pomocą kremu do depilacji, zdezynfekuj obszar operacyjny kilka razy okrężnymi ruchami zarówno peelingiem na bazie jodu, jak i 70% alkoholem. Wykonaj nacięcie skóry o długości 2 cm wzdłuż linii środkowej od poziomu 2. najbardziej wysuniętej do tyłu pary sutków z przodu, a następnie 2 cm nacięcie linii środkowej w ścianie brzucha wzdłuż kresy białej (Rysunek 1A).
  9. UWAGA: W trakcie nacinania ściany brzucha należy ją lekko unieść drobnymi kleszczami, aby nie przeciąć narządów wewnętrznych.
  10. Umieść sterylny plastikowy arkusz na skórze, a na nim kawałek sterylnej bibułki (Rysunek 1A). Utwórz otwór w środku, aby odsłonić obszar operacyjny.
    UWAGA: Sterylny arkusz z tworzywa sztucznego i sterylną bibułkę umieszcza się po wykonaniu nacięcia, ponieważ do ustawienia nacięcia wymagane jest szerokie pole widzenia, odnoszące się do położenia sutków.
  11. Zwilż papier sterylnym PBS, uważnie obserwuj rogi macicy od nacięcia i wyciągnij róg macicy przez otwory w plastikowym arkuszu i papierze.
  12. Za pomocą mikropipety dołączonej do zespołu rurki aspiratora wstrzyknij 1 μl mieszanki plazmidowej do lewej lub prawej bocznej komory przez ścianę macicy za pomocą ciśnienia wydechowego (Rysunek 1A).
    UWAGA: Alternatywnie plazmid można wstrzyknąć za pomocą mikroiniektora.
  13. Ściśnij główkę zarodka elektrodą typu pęseta i zastosuj impulsy elektroniczne za pomocą elektroporatora (35 V dla E14-16, 50 V dla E17, 50 ms impulsy kwadratowe w odstępach 450 ms, 5 razy) (Rysunek 1A).
    UWAGA: Nie ściskaj mocno główki zarodków, ponieważ spowoduje to uszkodzenie zarodków. Rzeczywisty prąd powinien wynosić 40-70 mA.
  14. Umieść róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.
  15. Zszyj ścianę brzucha za pomocą jedwabnej nici 5-0.
  16. Roztwór atipamezolu należy stosować dootrzewnowo w dawce 10 μl/g masy ciała.
  17. Zszyj skórę za pomocą nici jedwabnej 5-0.
    UWAGA: Skórę można zamknąć za pomocą automatycznego klipu.
  18. Trzymaj manipulowane myszy na ciepłym talerzu przez co najmniej 30 minut. Myszy zaczną poruszać się w klatce.
    UWAGA: Zabieg elektroporacji in utero (od kroków 1.7 do 1.16) powinien być wykonany w ciągu 30 minut. Typowy czas pracy to 20 min.

2. Przygotowanie plastrów

UWAGA: Świeżość plastrów jest kluczem do sukcesu tego eksperymentu. Plastry należy przygotować (z kroków 2.5-2.12) w ciągu 2 godzin.

  1. Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanksa z Ca2+ i Mg2+; HBSS(+). Dodać 5 ml CaCl2 (14 g/l, w autoklawie) i 5 ml MgSO 4,7H2O (20 g / l, w autoklawie) do 500 ml HBSS (-). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem rozpuścić roztwór z 95% gazemO2 + 5% CO2 przez 5 minut na lodzie.
  2. Przygotuj pożywkę hodowlaną. Potrzebne jest co najmniej 2,5 ml / naczynie. Dodaj 2 ml płodowej surowicy bydlęcej, 25 μl L-glutaminy (200 mM), 200 μl B27 (50x), 50 μl penicyliny + streptomycyny (10 K jednostek/ml i 10 mg/ml) do 8 ml pożywki neurobazalnej.
  3. Przygotuj 3% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia. Porować 50 ml HBSS (+), a następnie dodać 1,5 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia i autoklawować. Rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej i utrzymuj ją w temperaturze 50 °C w inkubatorze łaźni wodnej przed użyciem.
  4. Dodaj 1,9 ml pożywki hodowlanej do szklanego naczynia podstawowego. Ostrożnie umieść na nim wkładkę do hodowli komórkowej, aby nie uwięzić bańek powietrznych pod filtrem, a następnie dodaj 500 μl pożywki hodowlanej na filtr (Rysunek 1B). Umieść go na lodzie.
  5. Po znieczuleniu manipulowanych myszy poprzez inhalację 5% izofluranu, należy je poświęcić przez zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) w odpowiednich stadiach, które należy obserwować.
    UWAGA: Dwa dni (48 godzin) i 3 dni po elektroporacji w E14.5 są odpowiednie do obserwacji odpowiednio przejścia wielobiegunowo-bipolarnego i trybu lokomocji.
  6. Wyjmij zarodki i umieść je na szalce Petriego z zimnym PBS.
  7. Selekcjonować zarodki na podstawie ekspresji GFP lub innych białek fluorescencyjnych pod mikroskopem.
  8. Po ścięciu głowy embrionów, wypreparuj mózgi6 pod mikroskopem preparacyjnym i trzymaj je w zimnym HBSS(+).
  9. Wlej stopiony 3% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia do kriomoldu (patrz Tabela materiałów), a następnie włóż do niego mózgi i kilkakrotnie je zwiń. Umieść go w temperaturze pokojowej, aż agaroza całkowicie zastygnie, a następnie umieść go na lodzie.
  10. Pokrój mózgi koronalnie na grubość 350 μm za pomocą wibrującego mikrotomu (patrz Tabela Materiałów).
  11. Ułóż plastry na filtrze (maksymalnie 6 plasterków na filtr).
  12. Pobrać pożywkę hodowlaną z wnętrza i na zewnątrz kubka filtracyjnego (łącznie 600 μl). Na tym etapie plastry są prasowane i mocowane na filtrze. Po 5 minutach dodać 100 μl pożywki hodowlanej do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej.

3. Obrazowanie poklatkowe

  1. Utrzymuj komorę hodowlaną zamontowaną na stoliku odwróconego laserowego mikroskopu skanującego w temperaturze 37 °C za pomocą grzałki komory lub osłony otaczającej mikroskop co najmniej 30 minut przed obrazowaniem, aby zapobiec dryftowi Z. Dostarczyć nawilżony gaz 5% CO2 + 40% O2 do komory hodowlanej.
  2. Ustaw naczynie hodowlane z plastrami przygotowanymi powyżej w komorze hodowlanej.
  3. Korzystając z obiektywu o dużej odległości roboczej 20x (NA = 0,45), uzyskuj około 10 obrazów stosu Z z krokami co 5 μm co 15-30 minut przez 24 godziny
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie zmotoryzowanego stolika XY. Dzięki temu możemy uzyskiwać obrazy z wielu pól obiektywnych. Zazwyczaj w jednym eksperymencie poklatkowym uzyskujemy 10-20 obrazów z różnych pól obiektywnych.

4. Analiza obrazowa

  1. Konwertuj obrazy XYZT na XYT przez maksymalne rzutowanie osi Z za pomocą ImageJ lub innego oprogramowania.
    UWAGA: Jeśli plasterki przesunęły się podczas obserwacji, dostosuj położenie komórek na obrazach za pomocą StackRed, wtyczki ImageJ, z funkcją transformacji Rigid Body (patrz Tabela materiałów).
  2. Śledź trajektorię GFP lub innych komórek fluorescencyjnych dodatnich pod względem białek ręcznie lub automatycznie. Ręczne i automatyczne śledzenie można wykonać za pomocą odpowiednio MTrackJ24 i TrackMate25,26 (wtyczki ImageJ). Automatyczne śledzenie za pomocą TrackMate jest wydajne w analizowaniu wielu komórek w bezstronny sposób. Jednak ręczne śledzenie za pomocą MTrackJ pozostaje przydatne do dokładnego śledzenia poszczególnych komórek.

Wyniki

Komórki glejowe radialne w pallialnej VZ produkują wyłącznie neurony do E14, a neurony oraz komórki glejowe w dniach E15 i E16. Aby jednocześnie obserwować zachowania migracyjne neuronów i komórek glejowych, oznakowano je odpowiednio za pomocą wzmocnionego GFP (EGFP) i RFP, wykorzystując promotor specyficzny dla neuronów, promotor Tα127, oraz ludzki promotor białka włókienstwa kwaśnego gleju (hGFAP)28, który jest aktywowany preferencyjnie w astrocytach. Progenitory astrocytów powtarzają podziały komórkowe podczas migracji, co prowadzi do rozcieńczenia plazmidu w komórkach. Aby tego uniknąć, zastosowano system wektorów transpozonalnych składający się z plazmidu donora (pPB) i wektora ekspresyjnego transpozazy (pCAG-hyPBase)29,30. Użyty tutaj plazmid donorowy (pPB-CAG-LNL-RFP) posiada kasetę loxP-neo-loxP (LNL) i wykazuje ekspresję RFP zależną od rekombinazy Cre. Myszy ICR (typ dziki; WT) poddano elektroporacji wskazanymi plazmidami w Ryc. 2A w dniu E15, a skrawki przygotowano 3 dni później. W tym okresie pierwsza kohorta neuronów EGFP+ dotarła do powierzchni płyty kory (Ryc. 2B), lecz wiele neuronów EGFP+ wciąż migrowało. Obserwację time-lapse prowadzono przez 24 h. Podczas tej obserwacji neurony z grubym wypustkiem prowadzącym migrowały liniowo w kierunku powierzchni mózgu ze stosunkowo stałą prędkością w płycie kory (19,54 ± 6,21 µm/h, średnia ± odchylenie standardowe, 70 komórek). Trajektorie migracji śledzono automatycznie za pomocą oprogramowania TrackMate (magenta linie w Ryc. 2B). W tym samym polu widzenia obiektywu uwidoczniono progenitory astrocytów za pomocą RFP (Ryc. 2C). Ponieważ promotor hGFAP jest aktywny również w komórkach glejowych radialnych w późnych stadiach embrionalnych, niektóre neurony pochodzące z tych glejów radialnych również wykazują ekspresję RFP (niebieskie strzałki w Ryc. 2B,C). Neurony te są prawie zawsze przetransfekowane wektorem ekspresyjnym EGFP. W związku z tym progenitory astrocytów zidentyfikowano jako komórki pojedynczo pozytywne dla RFP. 

W przeciwieństwie do neuronów, progenitorzy astrocytów migrują szybko i chaotycznie, często zmieniając kierunek w obrębie strefy pośredniej i płytki korowej (migracja nieregularna)5. Migrację progenitorów astrocytów śledzono ręcznie za pomocą oprogramowania MTrackJ (linie purpurowe na Rysunku 2C), co wykazało ich wysoką ruchliwość (88,37 ± 33,61 µm/h, 5 komórek). Aby zbadać relację między progenitorami astrocytów a naczyniami krwionośnymi, zastosowano myszy Flt1-DsRed, które wykazują ekspresję DsRed, białka RFP, w komórkach śródbłonka. W tym doświadczeniu progenitorzy astrocytów mieli być identyfikowani wyłącznie za pomocą EGFP. W tym celu opracowano system rDIO5, w którym ekspresja EGFP zależna od hGFAP-Cre może zostać wyeliminowana w neuronach poprzez wykorzystanie aktywacji innego zestawu rekombinazy DNA i jej sekwencji rozpoznawczej (Dre-rox) zależnej od promotora Dcx (wczesnego promotora specyficznego dla neuronów)31 (Rysunek 2D, sekwencja pPB-CAG-rDIO-EGFP znajduje się w Pliku uzupełniającym 1)32,33. System rDIO wprowadzono do myszy Flt1-DsRed w dniu E15 za pomocą elektroporacji in utero, a skrawki przygotowano 24 h później. W rezultacie zaobserwowano, że EGFP-dodatnie progenitorzy astrocytów aktywnie migrowali wzdłuż naczyń krwionośnych (migracja kierowana naczyniami krwionośnymi)5 (Rysunek 2E).

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg obserwacji time-lapse komórek znakowanych metodą elektroporacji in utero. (A) Znieczulona mysz w odpowiednim stadium ciąży; otwarta jama brzuszna. Pole operacyjne przykryte jest sterylną folią i sterylnymi arkuszami papieru. Po odsłonięciu rogów macicy do embrionów wstrzyknięto 1 µL mieszaniny plazmidów, a następnie przyłożono impulsy elektryczne. Ścianę brzucha i skórę zaszyto, a myszy poddane zabiegowi umieszczono z powrotem w klatce. (B) Skrawki przygotowane z elektroporowanych mózgów umieszczono na filtrze wkładki do hodowli komórkowej (maksymalnie 6 skrawków) w szalce z przeszklonym dnem. Szalki z przeszklonym dnem zawierające skrawki zamontowano w komorze inkubacyjnej. Ten system time-lapse posiada akrylową osłonę pokrywającą cały mikroskop w celu utrzymania temperatury 37 °C. Komora inkubacyjna, do której doprowadzany jest nawilżony gaz mieszany, jest wyposażona w stoлик mikroskopowy znajdujący się wewnątrz osłony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Obserwacje time-lapse neuronów i progenitorów astrocytów. (A) Metoda różnicowego znakowania neuronów (EGFP, zielony) i progenitorów astrocytów (RFP, czerwony) oraz reprezentatywny obraz skrawka przygotowanego 2 dni po elektroporacji w 2 h od rozpoczęcia obrazowania time-lapse (po prawej). (B,C) Obrazy time-lapse komórek EGFP+ (B) i RFP+ (C) w tym samym polu widzenia obiektywu pokazanym na obrazie (A)-prawo od 2 h do 21 h obserwacji. (B) Trajektorie migrujących komórek EGFP+ wykryte automatycznie za pomocą oprogramowania TrackMate przedstawiono kolorem magenta. (C) Trajektorie komórek RFP+ zostały wyrysowane ręcznie przy użyciu oprogramowania MTrackJ. Komórki podwójnie dodatnie EGFP/RFP, które uważa się za neurony, są wskazane niebieskimi strzałkami. (D) Strategia znakowania progenitorów astrocytów z wykorzystaniem systemu rDIO w embrionach myszy Flt1-DsRed. (E) Reprezentatywny wynik migracji prowadzonej przez naczynia krwionośne. Komórka (strzałka) wysunęła wiodący wypustek (grot strzałki) i migrowała wzdłuż naczynia krwionośnego wykazującego ekspresję DsRed (magenta) w kierunku powierzchni oponowej. CP; blaszka kory. IZ; strefa pośrednia. VZ; strefa komorowa. Paski skali: 200 µm (A–C), 50 µm (E). Rycina została zaadaptowana z Tabata H. et al.5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Neurony (warstwy II/III)Progenitory astrocytówSystem rDIO
(znakowanie specyficzne dla astrocytów)
pCAG-EGFP0.5 µg/µLpPB-CAG-LNL-EGFP0.5 µg/µLpPB-CAG-rDIO-EGFP0.5 µg/µL
lub Ta1-EGFP (bardziej specyficzny dla neuronów)0.5 µg/µLhGFAP-Cre0.75 µg/µLhGFAP-Cre0.75 µg/µL
pCAG-hyPBase0.5 µg/µLpDcx-Dre0.5 µg/µL
pCAG-hyPBase0.5 µg/µL

Tabela 1: Reprezentatywne składniki mieszaniny plazmidów dla każdego celu. Wektory EGFP można zastąpić równoważnymi wektorami RFP lub innymi wektorami ekspresyjnymi białek fluorescencyjnych. Do znakowania progenitorów astrocytów stosuje się system wektorów transpozonowych. Wektory pPB to wektory transpozonowe PiggyBac służące do integracji z genomem. pCAG-hyPBase jest wektorem ekspresyjnym transpozazy PiggyBac. LNL to kaseta loxP-neo-loxP do ekspresji zależnej od Cre. rDIO-EGFP to kaseta on/off ekspresji EGFP zależna od Cre-loxP i Dre-roxP. Aby zaobserwować fenotyp gain-of-function lub loss-of-function pożądanych genów, można dodać wektory ekspresyjne lub wektory knockdown w stężeniu 1 µg/µL. Stężenie tych wektorów należy dostosować w każdym przypadku.

Plik uzupełniający 1: Sekwencje plazmidów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten wprowadził metodę obserwacji poklatkowej komórek pochodzących z pasma paliakalnego (korowego) VZ. Aby oznaczyć migrujące komórki z VZ, zastosowaliśmy elektroporację w macicy, w której poszczególne komórki były wyraźnie znakowane wyższym stosunkiem sygnału do szumu niż w przypadku znakowania za pośrednictwem wektora wirusowego. Stosując elektroporację in utero, każdy rodzaj wektora w dowolnej kombinacji może być łatwo wprowadzony do promieniowych komórek glejowych (nerwowych komórek macierzystych) w żywych zarodkach. Neurony i komórki progenitorowe glejowe mogą być selektywnie znakowane przy użyciu różnych promotorów. Ponieważ liczba kopii plazmidów wprowadzonych przez elektroporację in utero jest wysoka, badania wzmocnienia i utraty funkcji można łatwo przeprowadzić przez koelektroporację wektorów ekspresyjnych GFP i różnych wektorów związanych z genami będącymi przedmiotem zainteresowania, takich jak wektory ekspresyjne i wektory knockdown/knockout. Co więcej, elektroporacja in utero może być wykorzystana do wprowadzenia wektorów plazmidowych do VZ różnych obszarów mózgu innych niż korowy VZ, co pozwala nam obserwować migrację innych typów komórek, takich jak neurony hamujące, progenitory oligodendrocytów z wyniosłości zwojowych 34,35,36 i neurony piramidowe hipokampa 37.

W badaniach poklatkowych wpływ eksperymentów ze wzmocnieniem i utratą funkcji na zachowanie komórek można ocenić za pomocą oprogramowania TrackMate i MTrackJ. Wiele genów, w tym te odpowiedzialne za zaburzenia neurorozwojowe i niepełnosprawność intelektualną, bierze udział w migracji neuronów. Badania poklatkowe mogą bezpośrednio ujawnić, w jaki sposób te geny regulują zachowanie komórek. W porównaniu z migracją neuronalną, molekularne mechanizmy migracji komórek glejowych nie są dobrze poznane. Metoda ta może ujawnić nie tylko prawidłowy rozwój komórek glejowych, ale także czynniki genetyczne i środowiskowe, które mogą wpływać na rozwój gleju i jego związek z chorobami psychicznymi.

Ograniczeniem tej metody jest to, że nieuchronnie zależy ona od metody hodowli in vitro w plastrach. Co ciekawe, migrujące neurony nie tracą wskazówek kierunkowych do migracji w kierunku powierzchni mózgu, nawet w wycinkach hodowanych in vitro. Śledczy muszą jednak uważać na artefakty. Komórki w pobliżu powierzchni są przymocowane do filtra, a krawędzie plasterków łatwo się odkształcają. Komórki te powinny zostać wyłączone z analizy. Jeśli to możliwe, należy rozważyć przeprowadzenie eksperymentów kontrolnych. Ważne jest, aby pamiętać, że plastry mózgu podsumowują normalny rozwój w ciągu około 24 godzin. W związku z tym należy określić czas przygotowania plastra z elektroporacji tak, aby zdarzenia, które mają być analizowane, wystąpiły w tym oknie czasowym. Aby zaobserwować przejście wielobiegunowo-bipolarne, plastry należy przygotować 2 dni po elektroporacji. Aby przeanalizować migrację w trybie lokomocji, odpowiednie są 3 dni później. Obserwacja migracji sterowanej naczyniami krwionośnymi jest zadaniem trudniejszym niż w przypadku innych eksperymentów. Komórki śródbłonka łatwo ulegają degradacji w plasterkach bez przepływu krwi. Aby zminimalizować degradację naczyń krwionośnych, plastry należy przygotować tak szybko, jak to możliwe i przechowywać w pożywce zawierającej 20% surowicy i 40% gazuO2 . Inne eksperymenty uzupełniające, takie jak analizy histologiczne nieruchomych mózgów lub obrazowanie na żywo in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, mogą wzmocnić obserwacje znalezione w analizach poklatkowych warstw.

Podsumowując, ta metoda jest jedyną opcją obserwacji zachowania komórek przez 24 godziny. Wraz z opracowaniem nowych wektorów plazmidowych zakres zastosowań tej metody będzie się w przyszłości jeszcze bardziej rozszerzał.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Tα1 promotor to prezent od P. Barkera i F.D. Millera. Promotor Dcx to prezent od Q. Lu. hGFAP-Cre był prezentem od Albee Messinga. System wektorów transpozonów PiggyBac został dostarczony przez Instytut Sangera. Myszy Flt1-DsRed zostały dostarczone przez M. Ema (Shiga University). Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI (grant numer JP21K07309 dla H. Tabaty, JP20H05688 i JP22K19365 dla K. Nakajimy) oraz Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds dla K. Nakajimy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zespół rurki aspiratoraDrummond2-040-000
Atipamezole (5 mg / ml)MeijiMepatia
PICM ORG 50
NikonA1RHD25Wyposażony w obiektyw o dużym zasięgu roboczym (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Komora hodowlanaTokkenTK-NBCMP
Elektroporatorna zamówienie NEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Mieszalnik gazówTokkenTK-MIGM01-02
Naczynie ze szklaną podstawąIwaki3910-035Średnica szklanej podstawy wynosi 27 mm
Kapilary szklaneNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
NagrzewnicaTokkenTK-0003HU20Wykonane na zamówienie, w tym kaptur i grzałka
hGFAP-CreAddgene#40591Prezent od Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamina (200 mM)Gibco25030
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaLonza50100
Medetomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MikroiniektorNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/ml)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Pożywka neuropodstawowaGibco21103-049
pCAG-hyPBazaCDNA hyPBazy z pCMV-hyPBazy (dar od Instytutu Sangera) został wprowadzony do dalszego strumienia promotora CAG pCAGGS (prezent od J. Miyazakiego).
pDcx-DrePromotor Dcx z Dcx4kbEGFP70 (prezent od Q. Lu) został wymieniony z promotorem CAG z pCAG-NLS-HA-Dre34 (prezent od Pawła Pelczara, Addgene #51272).
Penicylina + StreptomycynaGibco15140122
Zestaw do oczyszczania plazmiduInvitrogenPureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPKaseta cag-lnl od pCALNL-DsRed (prezent od Connie Cepko, Addgene #13769), a cDNA TurboRFP (Evrogen, FP232) zostały umieszczone w miejscu klonowania pPB-CAG.EBNXN (prezent od Instytutu Sangera).
pPB-CAG-rDIO-EGFPSekwencja zawierająca syntetyczne miejsca rox, syntetyczną kasetę DIO i cDNA EGFP z pEGFP-N1 (Clontech, U55762) w odwrotnym kierunku została wprowadzona do miejsca klonowania pPB-CAG.EBNXN (dar od Instytutu Sangera). Sekwencja jest podana w pliku uzupełniającym.
ŚciągaczNarishigePN-31
StackRedwtyczka do ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Igła do szwówNazmeC-24-521-R No.1koło 1/2, długość 14 mm
Nić do szwówNazmeC-23-B2Jedwab, rozmiar 5-0
Czasowe ciężarne myszy ICR (typu dzikiego)japońskamysz
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Elektroda pęsetowaBEX lub NEPA GeneCUY650P5 
T&alfa; 1-EGFPEGFP cDNA z pEGFP-N1 (Clontech, U55762) wprowadzono do dolnego strumienia T&alfa; 1 promotor w plazmidzie 253 (prezent od P. Barkera i F.D.Millera)
Wibracyjny mikrotomLeica lub ZeissVibrating blade microtome VT1000S lub Hyrax V50.
Autoclip Becton Dickinson 427630 9 mm B27 suplement Gibco 17504-044 Butorfanol (5 mg / ml)Meiji Vetorphale Wkładka do hodowli komórkowej Millipore Mikroskop konfokalny SLC ICR

Bibliografia

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
  2. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  3. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. P Natl Acad Sci USA. 101 (9), 3196-3201 (2004).
  4. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  5. Tabata, H., et al. Erratic and blood vessel-guided migration of astrocyte progenitors in the cerebral cortex. Nat Commun. 13 (1), 6571(2022).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar Migration: The third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  7. Tabata, H., Kanatani, S., Nakajima, K. Differences of migratory behavior between direct progeny of apical progenitors and basal progenitors in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (9), 2092-2105 (2009).
  8. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of fetal monkey neocortex. J Comp Neurol. 145 (1), 61-83 (1972).
  9. Sekine, K., Honda, T., Kawauchi, T., Kubo, K., Nakajima, K. The outermost region of the developing cortical plate is crucial for both the switch of the radial migration mode and the Dab1-dependent "inside-out" lamination in the neocortex. J Neurosci. 31 (25), 9426-9439 (2011).
  10. Shin, M., et al. Both excitatory and inhibitory neurons transiently form clusters at the outermost region of the developing mammalian cerebral neocortex. J Comp Neurol. 527 (10), 1577-1597 (2019).
  11. Sekine, K., et al. Reelin controls neuronal positioning by promoting cell-matrix adhesion via inside-out activation of integrin α5β1. Neuron. 76 (2), 353-369 (2012).
  12. Morimoto, K., Tabata, H., Takahashi, R., Nakajima, K. Interactions between neural cells and blood vessels in central nervous system development. BioEssays. 230091, (2023).
  13. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Med Mol Morphol. 49 (2), 63-75 (2016).
  14. Ishii, K., Kubo, K., Nakajima, K. Reelin and neuropsychiatric disorders. Front Cell Neurosci. 10, 229(2016).
  15. Bosworth, A. P., Allen, N. J. The diverse actions of astrocytes during synaptic development. Curr Opin Neurobiol. 47, 38-43 (2017).
  16. Tabata, H. Crosstalk between blood vessels and glia during the central nervous system development. Life. 12 (11), 1761(2022).
  17. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. J Vis Exp. (125), e55886(2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient Gene Transfer into the Embryonic Mouse Brain Using in Vivo Electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Fukuchi-Shimogori, T. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  22. Matsumoto, K., et al. Study of normal and pathological blood vessel morphogenesis in Flt1-tdsRed BAC Tg mice. Genesis. 50 (7), 561-571 (2012).
  23. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  24. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Gloster, A., et al. The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growth and regeneration in transgenic mice. J Neurosci. 14 (12), 7319-7330 (1994).
  28. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  29. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. P Natl Acad Sci USA. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Meth. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J Neurosci Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  32. Sauer, B. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32 (20), 6086-6095 (2004).
  33. Hermann, M., et al. Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis. Nucleic Acids Res. 42 (6), 3894-3907 (2014).
  34. Kanatani, S., et al. The COUP-TFII/Neuropilin-2 is a molecular switch steering diencephalon-derived GABAergic neurons in the developing mouse brain. P Natl Acad Sci USA. 112 (36), E4985-E4994 (2015).
  35. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  36. Kanatani, S., Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. COUP-TFII is preferentially expressed in the caudal ganglionic eminence and is involved in the caudal migratory stream. J Neurosci. 28 (50), 13582-13591 (2008).
  37. Kitazawa, A., et al. Hippocampal pyramidal neurons switch from a multipolar migration mode to a novel "climbing" migration mode during development. J Neurosci. 34 (4), 1115-1126 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elektroporacja in uteroznakowanie bia kami fluorescencyjnymihodowla skrawk w m zgumigracja neuronalnaprogenitorzy astrocyt wwyciszanie gen w

Powiązane artykuły