Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana technika wywoływania zespołu policystycznych jajników u myszy

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66637

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Obstetrics and Gynecology Hospital, Institute of Reproduction and Development, Fudan University, 2Women's Hospital, Key Laboratory of Reproductive Genetics (Ministry of Education), Zhejiang University School of Medicine, 3International Institutes of Medicine, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 4Research Units of Embryo Original Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences (No. 2019RU056), 5State Key Laboratory of Cardiology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wprowadza technikę indukowania modeli zespołu policystycznych jajników (PCOS) u myszy poprzez kontrolowane uwalnianie letrozolu za pomocą mini-pomp. W odpowiednim znieczuleniu minipompa została wszczepiona podskórnie, a PCOS został pomyślnie wywołany u myszy po pewnym czasie od uwolnienia minipompy.

Streszczenie

Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest jedną z głównych przyczyn niepłodności u kobiet. Modele zwierzęce są szeroko stosowane do badania mechanizmów etiologicznych PCOS i do opracowywania powiązanych leków. Mysie modele indukowane letrozolem replikują fenotypy metaboliczne i reprodukcyjne pacjentów z PCOS. Tradycyjna metoda leczenia letrozolem u myszy PCOS wymaga codziennego dawkowania przez pewien okres, co może być pracochłonne i powodować znaczny stres u myszy. Badanie to opisuje prostą i skuteczną metodę wywoływania PCOS u myszy poprzez wszczepienie kontrolowanej minipompy uwalniającej letrozol. Wyprodukowano mini-pompę zdolną do stabilnego, ciągłego uwalniania ilościowej ilości letrozolu i wszczepiono ją podskórnie myszom w znieczuleniu. Badanie to wykazało, że model mysi z powodzeniem naśladował cechy PCOS po implantacji minipompy letrozolu. Materiały i sprzęt użyte w tym badaniu są łatwo dostępne dla większości laboratoriów i nie wymagają specjalnego dostosowywania. Podsumowując, ten artykuł przedstawia unikalną, łatwą do wykonania metodę indukowania PCOS u myszy.

Wprowadzenie

Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest jednym z najczęstszych schorzeń wśród kobiet w wieku rozrodczym1. Dotyka do 18% kobiet na całym świecie i jest główną przyczyną niepłodności kobiet na całym świecie2,3. PCOS charakteryzuje się szeregiem powiązanych ze sobą nieprawidłowości rozrodczych, w tym zaburzonym wydzielaniem gonadotropin, przewlekłym brakiem owulacji, zwiększoną produkcją androgenów i morfologią policystycznych jajników4. Oprócz zaburzeń ginekologicznych, PCOS zwiększa również ryzyko chorób sercowo-naczyniowych5,6. Pomimo dziesięcioleci badań, etiologia PCOS pozostaje niejasna7,8.

Aby uzyskać lepszy wgląd w patogenezę PCOS i opracować nowe terapie, niezwykle ważne jest tworzenie modeli zwierzęcych, które ściśle naśladują ludzką fizjologię9. Obecnie zgłaszane modele PCOS u gryzoni obejmują te wywołane między innymi przez leczenie testosteronem, letrozolem i walerianianem estradiolu. Testosteron wywołuje hiperandrogenemię i jest częściej stosowany jako induktor PCOS u szczurów10. DHEA jest stosowany do wywoływania PCOS u gryzoni, zwiększając poziom testosteronu, LH / FSH (hormon luteinizujący / hormon folikulotropowy) i powodując nieregularne cykle rujowe11. Walerianian estradiolu (EV) jest długo działającym estrogenem, a badania z wykorzystaniem tej metody pokazują, że poziomy hormonów steroidowych płci i gonadotropin różnią się w zależności od podanej dawki EV12,13,14. Letrozol jest niesteroidowym inhibitorem aromatazy15. Leczenie letrozolem wywołuje niecykliczną ruję, zwiększa masę jajników, masę ciała, powiększa adipocyty, maksymalizuje rozwój pęcherzyków i podnosi poziom testosteronu u szczurów16,17. Myszy leczone letrozolem wykazują zwiększoną liczbę mieszków zatokowych i torbieli krwotocznych, a także podwyższone stężenia LH, FSH, estradiolu i progesteronu18,19.

Obecnie, główne metody modelowania PCOS wywołanego letrozolem obejmują podawanie doustne i wstrzyknięcie podskórne, które wymagają powtarzania codziennego dawkowania20,21,22. Metody te są czasochłonne i pracochłonne, a powtarzające się podawanie prawdopodobnie powoduje znaczny stres u zwierząt23. Chociaż niektóre badania używają granulek letrozolu 24,25, produkty te muszą być dostosowane i są drogie. W tym raporcie opisano technikę indukowania PCOS u myszy za pomocą minipompek. Ta metoda jest prosta, oszczędza czas i wykorzystuje narzędzia i sprzęt chirurgiczny, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Fudan. Wykorzystano tu samice myszy C57BL/6J w wieku 4 tygodni. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mini-pompy

  1. Weź letrozol w proszku (50 mg) przechowywany w oryginalnej butelce do opakowania, odwiruj proszek letrozolu w butelce o sile 300 x g przez 5 s (w temperaturze pokojowej), a następnie otwórz nakrętkę.
  2. Powoli dodać 625 μl DMSO do proszku letrozolu za pomocą pipety i dobrze wymieszać, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 8 mg/100 μl, co daje łącznie 625 μl.
    UWAGA: W przypadku stosowania innego rozmiaru opakowania proszku letrozolu, należy wcześniej obliczyć wymaganą objętość DMSO, aby skonfigurować roztwór podstawowy. Proszek letrozolu, DMSO i inne pokrewne związki muszą być sterylnego gatunku. Końcówki do pipet, probówki i inne powiązane elementy powinny być sterylne lub wysterylizowane przed użyciem.
  3. Policz liczbę wymaganych myszy zgodnie z projektem eksperymentalnym.
  4. Za pomocą pipety należy pobrać całkowitą wymaganą ilość roztworu podstawowego letrozolu, w zależności od wymaganej liczby myszy, i powoli wstrzyknąć ją do probówki wirówkowej.
    UWAGA: 4-tygodniowe myszy do 8-tygodniowej ekspozycji zostały wybrane do wywołania modelu myszy PCOS. Całkowita dawka letrozolu wynosi 8 mg na każdą mysz, co wymaga wszczepienia dwóch kolejnych pompek (jedna pompka uwalnia się przez 4 tygodnie), tj. 4 mg/4 tygodnie na pompkę. Jak wspomniano w kroku 1.2, stężenie roztworu podstawowego letrozolu wynosi 8 mg/100 μl. Do przygotowania pomp potrzeba 50 μl roztworu podstawowego dla każdej pompy, jak obliczono poniżej: łącznie 4 mg letrozolu podzielone przez 8 mg/100 μl.
  5. Pobrać równą ilość PEG300, dodać go do roztworu letrozolu i dobrze wymieszać (można go odpowiednio zawirować).
  6. Przygotować roztwór nośnika kontrolnego dla grupy kontrolnej (50 μl DMSO + 50 μl PEG300 dla każdej pompy bez letrozolu).
  7. Przygotować odpowiednią liczbę sterylnych probówek wirówkowych zgodnie z liczbą wymaganych pomp; dla każdej pompy należy przygotować jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml.
  8. Narysuj sól fizjologiczną za pomocą strzykawki i dodaj 5 ml soli fizjologicznej do każdej probówki wirówkowej. Następnie zakryj probówki wirówkowe i umieść je na stojaku na probówki do dalszego użycia.
  9. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek, wyjmij minipompki w żądanej ilości i umieść je na czystym, sterylnym blacie lub pojemniku.
  10. Delikatnie ściśnij kciukiem i palcem wskazującym nasadkę pasującą do korpusu pompy, a drugą ręką przytrzymaj korpus pompy.
  11. Powoli kilkakrotnie szturchnij port napełniania pompy cienką rurką przymocowaną do nasadki (Rysunek 1B).
    UWAGA: Jeśli nie jest zatkany, płyn może nie przepływać swobodnie w rurce po napełnieniu.
  12. Weź igłę pasującą do pompki i sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml. Przymocuj igłę do strzykawki i dokręć ją (Rysunek 1C).
  13. Ostrożnie i powoli narysuj końcowy roztwór letrozolu skonfigurowany powyżej za pomocą nowo zmontowanej strzykawki (Rysunek 1D).
    UWAGA: Aspiracja roztworu letrozolu musi odbywać się powoli i równomiernie. Szybkie zasysanie może powodować powstawanie pęcherzyków powietrza, które mogą wpływać na późniejsze wstrzyknięcie roztworu leku.
  14. Wstrzyknąć roztwór letrozolu do minipompy.
    1. Ostrożnie ściśnij mini-pompkę jedną ręką tak, aby stała pionowo, a drugą ręką przytrzymaj wspomnianą strzykawkę o pojemności 1 ml i powoli włóż ją na sam dół pompy (Rysunek 1E).
      UWAGA: Jeśli igła nie zostanie włożona na dno pompy, płyn w pompie może łatwo bulgotać podczas wstrzykiwania, co wpłynie na późniejsze uwalnianie leku przez pompę.
    2. Następnie powoli wstrzyknąć skonfigurowany roztwór; wstrzyknięcie można zauważyć, gdy otwór pompy lekko bąbelkuje.
    3. Wstrzykiwać wolniej, gdy objętość wstrzykniętego wstrzykiwania zbliża się do 90 μl. Po całkowitym napełnieniu pompy (około 100 μl) należy wyjąć strzykawkę.
    4. Ostrożnie włóż nakrętkę do korpusu pompy i dokręć ją; w tym momencie wyleje się niewielka ilość roztworu. Ostrożnie go wytrzyj.
  15. Weź pompę załadowaną lekiem, z wylotem skierowanym do góry (koniec z nakrętką), weź wcześniej przygotowaną probówkę wirówkową i całkowicie zanurz pompę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (Rysunek 1F). Następnie zakryj probówkę wirówkową i umieść ją na stojaku na probówki.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zanieczyścić pompy podczas całego procesu.
  16. Po wykonaniu wszystkich minipomp umieść wszystkie probówki wirówkowe w termostacie o temperaturze 37 °C na 48 godzin.

2. Przygotowanie do operacji i znieczulenie

  1. Przygotuj i wysterylizuj wszystkie wymagane narzędzia w dniu operacji, w tym kleszcze, hemostatyki, nożyczki chirurgiczne, uchwyty do igieł i wchłanialne szwy chirurgiczne 4-0.
  2. Przed użyciem aparatu do znieczulania izofluranem (Rysunek 2B) dokładnie sprawdź, czy połączenie rurociągu jest prawidłowe i upewnij się, że rurociąg jest nienaruszony i nie przecieka.
  3. Odkręć nakrętkę uszczelniającą napełnianie parownika aparatu do znieczulenia, a następnie powoli dodaj środek znieczulający.
  4. Utrzymuj poziom znieczulenia między górną a dolną granicą oznaczoną na aparacie anestezjologicznym.
  5. Przekształć przełącznik zaworu trójdrogowego, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest podłączony do skrzynki indukcyjnej znieczulenia.
  6. Otwórz pompę powietrza i parownik, a następnie dostosuj stężenie izofluranu do indukcji znieczulenia (zwykle 3%-4%).
  7. Odczekaj około 1 minuty, aż środek znieczulający wypełni pudełko indukcyjne, następnie włóż mysz do pudełka indukcyjnego i poczekaj na pełne znieczulenie (proces ten trwa około 2-3 minut).
  8. Sprawdź, czy myszy są odpowiednio znieczulone, delikatnie przechylając pudełko. Jeśli myszy zostaną przewrócone na drugą stronę i nie wykazują oznak powrotu do pozycji leżącej, indukowane jest znieczulenie.

3. Implantacja mini-pompy letrozolu

  1. Załóż maskę chirurgiczną i sterylne rękawiczki.
  2. Wyjmij wstępnie znieczulone myszy z pudełka indukcyjnego i nałóż krem do depilacji na tył myszy, a następnie odczekaj 1 minutę. Delikatnie zetrzyj krem do depilacji i włosy mokrą gazą.
  3. W tym samym czasie zmień przełącznik zaworu trójdrogowego, aby upewnić się, że przepływ powietrza z parownika aparatu anestezjologicznego jest podłączony do maski anestezjologicznej i wyreguluj stężenie konserwacyjne (zwykle 2%).
  4. Po odwłosieniu przytrzymaj mysz dominującą ręką i umieść jej głowę/nos w masce anestezjologicznej.
  5. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału.
    UWAGA: Wszystkie zabiegi ze znieczuleniem muszą być wykonywane przy użyciu filtrów gazowych wyposażonych w tabletki z węglem aktywnym, a zabieg powinien być wykonywany w dygestorium.
  6. Zamocuj mysz w pozycji leżącej na płycie operacyjnej i nałóż smar do oczu na oba oczy.
  7. Nałóż trzykrotnie waciki z jodonem na odsłoniętą skórę (Rysunek 2C). Następnie należy wstrzyknąć meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg.
  8. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez ponowne uszczypnięcie palca u nogi. Następnie, w linii środkowej tyłu szyi, faworyzując skórę po stronie bezwłosej, podnieś skórę kleszczami i wykonaj nacięcie około 0,5 cm z boku skalpelem lub nożyczkami chirurgicznymi (Ryc. 2D).
  9. Następnie otwórz naskórek pod nacięciem i uzyskaj do niego dostęp za pomocą hemostatu lub uchwytu na igłę, aby uwolnić skórę, robiąc miejsce na mini-pompę (około 2 cm od nacięcia) (Ryc. 2E).
  10. Wyjmij pompę z soli fizjologicznej w probówce wirówkowej za pomocą sterylnych kleszczyków, z otwartym końcem pompy skierowanym w dół i bądź gotowy do podskórnego włożenia pompy myszom (Rysunek 2F).
  11. Zacisnąć jedną stronę nacięcia skóry kleszczami i wepchnąć pompę do przestrzeni podskórnej. Przy wchodzeniu do pompy nie powinno być oporu. Po wejściu do środka użyj palców, aby lekko i delikatnie ścisnąć pompę do środka tak daleko, jak to możliwe (Rysunek 1G).
  12. Ostrożnie zszyj miejsce nacięcia za pomocą szwów chirurgicznych 4-0 (Rysunek 2H).
    UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić korpusu pompy podskórnej podczas szycia.
  13. Po zszyciu należy dwukrotnie zdezynfekować skórę w miejscu operowanym za pomocą wacików jodoforowych.

4. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Po zabiegu delikatnie przenieś myszy z materaca używanego podczas znieczulenia na suchy, czysty materac. Upewnij się, że myszy znajdują się w ciepłym i cichym otoczeniu.
  2. Uważnie monitoruj stan myszy, taki jak głębokość i częstotliwość ich oddechów.
  3. Obserwuj zachowanie myszy, gdy ich mobilność zaczyna wracać do normy. Na koniec upewnij się, że mogą stać i chodzić bez żadnych oczywistych nienormalnych zachowań, takich jak zawroty głowy lub nieskoordynowane ruchy.
  4. Po wyzdrowieniu myszy delikatnie przenieś je do wcześniej przygotowanych klatek. Umieść sterylną galaretkę i jedzenie na dnie klatki, aby myszy mogły się pożywić.
    UWAGA: Rozciąganie pola operacyjnego może uniemożliwić myszom łatwe picie i jedzenie we wczesnym okresie pooperacyjnym, dlatego na dnie klatki należy umieścić galaretkę i jedzenie.
  5. Meloksykam należy wstrzykiwać podskórnie w dawce 2 mg/kg mc. (co 24 godziny przez pierwsze 3 dni po zabiegu). Po 8 tygodniach leczenia letrozolem (tj. dwóch kolejnych implantacji minipompy) przetestuj modele myszy.

Wyniki

Protokół eksperymentalny oraz niektóre krytyczne etapy przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Poziomy testosteronu w surowicy przedstawiono na Rysunku 3A. Myszy leczone letrozolem za pomocą minipomp (zwane dalej myszami LTZ) wykazały znacznie podwyższone poziomy testosteronu w surowicy w porównaniu z samicami myszy kontrolnych. Tymczasem analiza histologiczna jajników wykazała, że u myszy LTZ wystąpiły jajniki policystyczne ze znacznym zmniejszeniem liczby ciał żółtych (Rysunek 3B,C), co wskazuje na anowulację. Ponadto myszy LTZ wykazywały znaczną acykliczność cyklu rujowego w porównaniu z samicami myszy kontrolnych (Rysunek 3D). Ocena masy ciała wykazała, że myszy LTZ były cięższe od myszy kontrolnych (Rysunek 3E). Wyniki testu tolerancji glukozy oraz obliczenia AUC wykazały, że u myszy LTZ rozwinęła się nietolerancja glukozy w porównaniu z myszami kontrolnymi (Rysunek 3F,G). Oznaczenie lipidów w surowicy wykazało, że u myszy LTZ nastąpiła zmiana profilu lipidowego surowicy w porównaniu z myszami kontrolnymi (Rysunek 3H).

Eksperyment kontrolowanego uwalniania leku z ekstrakcją rozpuszczalnika, filtracją strzykawkową, zdjęcia zestawu laboratoryjnego.
Rysunek 1: Materiały i krytyczne etapy przygotowania minipompy. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca przygotowanie minipomp z letrozolem. (B) Minipompę odblokowano za pomocą cienkiej rurki przymocowanej do zakrętki. (C) Igłę dopasowaną do pompy przymocowano do końcówki igłowej strzykawki 1 mL. (D) Roztwór letrozolu zasysano powoli, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. (E) Roztwór letrozolu wstrzykiwano powoli od samego dna pompy. (F) Wypełnione pompy zamknięto zakrętkami i przechowywano w roztworze soli fizjologicznej z końcem zakrętki skierowanym do góry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do operacji zwierzęcych w celu podawania gazu anestetycznego i implantacji minipompy; przedstawiono kroki procedury.
Rycina 2: Materiały i kluczowe etapy implantacji pomp u myszy w celu indukcji PCOS. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca implantację minipomp z letrozolem. (B) Sprzęt do anestezji: pompa powietrzna, aparat do znieczulania, komora indukcyjna i filtry gazowe. (C) Zanarkotyzowane myszy zostały unieruchomione i wysterylizowane. (D) Cięcie o długości 0,5 cm w pobliżu linii środkowej grzbietu. (E) Skóra została odsunięta, aby zrobić miejsce na wprowadzenie minipompy. (F) Minipompę wyjęto z soli fizjologicznej za pomocą czystej i sterylnej pęsety. (G) Minipompę zaimplantowano pod wcześniej odsuniętą skórą. (H) Skórę zamknięto szwami 4-0. (I) Pozwolono myszy po implantacji na regenerację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ PCOS na poziom testosteronu w surowicy, ciałażółte, fazę cyklu; wykresy i obrazy histologiczne do analizy.
Rysunek 3: Charakterystyka fenotypów rozrodczych i metabolicznych w modelach mysich z wszczepionymi minipompami z letrozolem. (A) Poziomy testosteronu w osoczu myszy leczonych LTZ były znacząco wyższe niż u myszy kontrolnych (n = 9 zwierząt na grupę). (B) Analiza histologiczna jajników. Strzałka wskazuje ciałażółte. Pasek skali: 1 mm. (C) Liczba ciałżółtych w wskazanych grupach (n = 9 zwierząt na grupę). (D) Myszy LTZ wykazały acykliczność w porównaniu z samicami myszy kontrolnych. (E) Masa ciała we wskazanych grupach (n = 10 zwierząt na grupę). (F,G) Wyniki testu tolerancji glukozy we wskazanych grupach (n = 8 zwierząt na grupę). (H) Poziomy lipidów w surowicy we wskazanych grupach (n = 8 zwierząt na grupę). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. AUC oznacza pole pod krzywą; E, faza ruja; LDL-C, cholesterol lipoprotein niskiej gęstości; HDL-C, cholesterol lipoprotein wysokiej gęstości; P, faza proestrus; M/D, faza metestrus/diestrus; TC, cholesterol całkowity; oraz TG, trójglicerydy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Raport ten przedstawia prosty protokół indukcji PCOS u myszy przy użyciu łatwo dostępnych materiałów. Mysi model PCOS jest niezbędny do badania mechanizmów PCOS i badań przesiewowych leków26. Spośród dostępnych metod indukowania modeli PCOS u myszy, indukcja letrozolu jest jedną z najczęściej stosowanych. Stosowanie letrozolu może rozwijać i utrzymywać stan hiperandrogenny poprzez hamowanie konwersji testosteronu do estradiolu lub zwiększanie syntezy testosteronu27. Mysi model indukowany letrozolem wykazuje podobieństwa metaboliczne i reprodukcyjne do pacjentów z PCOS28. Jednak konwencjonalne techniki leczenia letrozolem w mysim modelu PCOS wymagają codziennego karmienia doustnego lub wstrzykiwania leku letrozolowego myszom przez 21 dni lub dłużej 29,30. Długotrwała, ciągła alokacja leków z czasowym dawkowaniem karmienia lub wstrzykiwania jest czasochłonna i pracochłonna, a wielokrotne podawanie leków może być notorycznie stresujące dla myszy, wprowadzając czynniki nieeksperymentalne wpływające na wyniki modelu23,31. Chociaż niektóre badania PCOS na szczurach i myszach wykorzystują wszczepialne granulki letrozolu28,32, stosowane produkty muszą być dostosowane i mogą nie być dostępne w odpowiednim czasie. W obecnym badaniu zaproponowano technikę wszczepiania minipomp letrozolu w celu wywołania PCOS u myszy. Metoda jest prosta, oszczędza czas i wykorzystuje narzędzia i sprzęt chirurgiczny łatwo dostępne w większości laboratoriów.

Kroki krytyczne i rozwiązywanie problemów
Ważne jest, aby zwrócić uwagę na kilka kluczowych kroków, aby osiągnąć optymalne wyniki podczas praktykowania tej metody. Po pierwsze, przed użyciem odblokuj pompę za pomocą cienkiej rurki przymocowanej do pasującej nasadki. Wcześniejsze doświadczenia wskazują, że zatkana pompa może zakłócać ładowanie i uwalnianie leku. Dodatkowo, każdy krok w konfiguracji roztworu letrozolu musi być wykonany z należytą starannością, aby upewnić się, że końcowy roztwór jest dokładnie w pożądanym stężeniu. Podczas całego procesu montażu pompy należy zwrócić uwagę, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Ponadto konieczne są staranne korekty przed i w trakcie znieczulenia, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie dla myszy eksperymentalnych i zminimalizować niekorzystny wpływ znieczulenia na operowane myszy.

Zalety i ograniczenia
Metoda opisana w tym badaniu ma kilka zalet: (1) oszczędza czas i pozwala na ciągłe uwalnianie letrozolu po implantacji pompy; (2) pozwala uniknąć stresu związanego z wielokrotnym podawaniem leków zwierzętom doświadczalnym i minimalizuje wpływ czynników nieeksperymentalnych na wyniki modelowania; (3) niezbędne materiały, narzędzia chirurgiczne i sprzęt są powszechnie dostępne w większości laboratoriów; (4) metoda skutecznie indukuje fenotypy PCOS u myszy. Jednak metoda ta ma również ograniczenia: (1) znieczulenie i zabieg chirurgiczny wymagane do implantacji minipompy może powodować podrażnienie myszy, a obecność minipompy pod skórą może zaburzać ich aktywność; (2) Na skuteczność tej metody modelowania może mieć wpływ zanieczyszczenie lub uszkodzenie korpusu pompy podczas procesu. Opierając się na doświadczeniu autorów, skrupulatne wykonanie kroków protokołu może prowadzić do wysokiego wskaźnika sukcesu w indukowaniu mysiego modelu PCOS.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (granty 2021YFC2700701), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 82088102, 82071731, 82171613, 8227034, 81601238), Fundusz Innowacji Chińskiej Akademii Nauk Medycznych dla Nauk Medycznych (grant 2019-I2M-5-064), Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (granty 21Y11907600), Miejską Komisję Zdrowia i Planowania Rodziny w Szanghaju (grant 20215Y0216), Wspólny program innowacyjny Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (grant 2020CXJQ01), Plan badań klinicznych Centrum Rozwoju Szpitala w Szanghaju (grant SHDC2020CR1008A), Centrum Badań Klinicznych Chorób Ginekologicznych w Szanghaju (grant 22MC1940200), Centrum Badań nad Chorobami Układu Moczowo-Płciowego w Szanghaju (grant 2022ZZ01012), Baza Badawcza Rozrodu i Rozwoju Shanghai Frontiers Science, Komisja Nauki i Technologii Gminy Quzhou (grant 2022K54), Projekt Otwartego Funduszu Kluczowego Laboratorium Genetyki Rozrodu, Ministerstwo Edukacji, Uniwersytet Zhejiang (grant KY2022035) oraz Projekt Otwartego Funduszu Akademii Nauk Medycznych Guangdong (grant YKY-KF202202).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
StrzykawkaBofeng BiotechBD3008411ML (sterylna)
Probówka wirówkowaBiological Hope1850-K15ML (sterylna)
PipetaEppendorf3123000268-A100μ L-1000μ L (sterylna)
PipetaTopPette701010100810μ L-100μ L (sterylny)
Letrozol w proszkuSigmaL6545-50MGLeki o podstawowym działaniu (sterylne)
PEG (poli(glikol etylenowy))SolarbioP8250Używany do rozpuszczania (sterylny)
Sterylny fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej BiosharpBL158AMini-pompa do przechowywania
Pompy osmotyczneALZET1004Przechowywanie letrozolu i przedłużone uwalnianie (sterylne)
DimetylosulfotlenekBiosharpBS087Używany do rozpuszczania (sterylnego)
Maszyna do znieczulenia małych zwierzątRWD R500IPUżywany do znieczulenia
Izofluran RWD20071302Używany do znieczulenia
HemostatykiBiosharpBS-HF-S-125Narzędzie chirurgiczne
NożyczkiBiosharpBS-SOR-S-100PInstrument chirurgiczny
Uchwyt igłyShangHaiJZJ32010Narzędzie chirurgiczne
KleszczeRWD F12028Instrument chirurgiczny
Igła i wchłanialny szew 4-0JINGHUANCR413Instrument chirurgiczny
Waciki powidonowo-jodoweSingleLadyGB26368-2010Dezynfekcja skóry
Krem do depilacjiZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701 Środek do depilacji zwierząt laboratoryjnych
Rękawice nitryloweBiosharpBC040-LUżywany do operacji aseptycznych
Sterylna gazaZHENDEBA69087Służy do wycierania płynów
C57BL/6J MyszyShanghai Model Organisms CenterN/AWiek: 4 tygodnie
Smar do oczu zwierząt BAITESHF021153Używany do smaru do oczu myszy
Meloksykam do wstrzykiwańMEIDAJIAR21064-21Stosowany do analgezji myszy (sterylny)

Bibliografia

  1. Dapas, M., Dunaif, A. Deconstructing a syndrome: Genomic insights into PCOS causal mechanisms and classification. Endocr Rev. 43 (6), 927-965 (2022).
  2. Teede, H., et al. Anti-müllerian hormone in PCOS: A review informing international guidelines. Trends Endocrinol Metab. 30 (7), 467-478 (2019).
  3. Joham, A. E., et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (9), 668-680 (2022).
  4. Pan, J. X., et al. Aberrant expression and DNA methylation of lipid metabolism genes in PCOS: A new insight into its pathogenesis. Clin Epigenetics. 10, 6(2018).
  5. Gao, L., et al. Calcitriol attenuates cardiac remodeling and dysfunction in a murine model of polycystic ovary syndrome. Endocrine. 52 (2), 363-373 (2016).
  6. Gao, L., et al. Polycystic ovary syndrome fuels cardiovascular inflammation and aggravates ischemic cardiac injury. Circulation. 148 (24), 1958-1973 (2023).
  7. Rosenfield, R. L., Ehrmann, D. A. The pathogenesis of polycystic ovary syndrome (PCOS): The hypothesis of PCOS as functional ovarian hyperandrogenism revisited. Endocr Rev. 37 (5), 467-520 (2016).
  8. Wang, F., et al. Alternative splicing of the androgen receptor in polycystic ovary syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (15), 4743-4748 (2015).
  9. Noroozzadeh, M., Behboudi-Gandevani, S., Zadeh-Vakili, A., Ramezani Tehrani, F. Hormone-induced rat model of polycystic ovary syndrome: A systematic review. Life Sci. 191, 259-272 (2017).
  10. Tyndall, V., et al. Effect of androgen treatment during foetal and/or neonatal life on ovarian function in prepubertal and adult rats. Reproduction. 143 (1), 21-33 (2012).
  11. Jang, M., et al. Oriental medicine Kyung-ok-ko prevents and alleviates dehydroepiandrosterone-induced polycystic ovarian syndrome in rats. PLoS One. 9 (2), e87623(2014).
  12. Brawer, J. R., Munoz, M., Farookhi, R. Development of the polycystic ovarian condition (PCO) in the estradiol valerate-treated rat. Biol Reprod. 35 (3), 647-655 (1986).
  13. Mirabolghasemi, G., Kamyab, Z. Changes of the uterine tissue in rats with polycystic ovary syndrome induced by estradiol valerate. Int J Fertil Steril. 11 (1), 47-55 (2017).
  14. Li, X., et al. Amitriptyline plays important roles in modifying the ovarian morphology and improving its functions in rats with estradiol valerate-induced polycystic ovary. Arch Pharm Res. 42 (4), 344-358 (2019).
  15. Mamounas, E. P., et al. Use of letrozole after aromatase inhibitor-based therapy in postmenopausal breast cancer (NRG oncology/NSABP B-42): A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 88-99 (2019).
  16. Deveci, H. S., et al. Histological evaluation of rat larynx in experimental polycystic ovary syndrome model. Eur Arch Otorhinolaryngol. 269 (8), 1945-1950 (2012).
  17. Du, D. F., Li, X. L., Fang, F., Du, M. R. Expression of anti-müllerian hormone in letrozole rat model of polycystic ovary syndrome. Gynecol Endocrinol. 30 (12), 885-889 (2014).
  18. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The gut microbiome is altered in a letrozole-induced mouse model of polycystic ovary syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509(2016).
  19. Arroyo, P., Ho, B. S., Sau, L., Kelley, S. T., Thackray, V. G. Letrozole treatment of pubertal female mice results in activational effects on reproduction, metabolism and the gut microbiome. PLoS One. 14 (9), e0223274(2019).
  20. Pyun, B. J., et al. Tetragonia tetragonioides (pall.) Kuntze regulates androgen production in a letrozole-induced polycystic ovary syndrome model. Molecules. 23 (5), 1173(2018).
  21. Patel, R., Shah, G. Insulin sensitizers modulate GNRH receptor expression in PCOS rats. Arch Med Res. 49 (3), 154-163 (2018).
  22. Chaudhari, N., Dawalbhakta, M., Nampoothiri, L. GNRH dysregulation in polycystic ovarian syndrome (PCOS) is a manifestation of an altered neurotransmitter profile. Reprod Biol Endocrinol. 16 (1), 37(2018).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Lee, Y. H., et al. Welsh onion root (Allium fistulosum) restores ovarian functions from letrozole induced-polycystic ovary syndrome. Nutrients. 10 (10), 1430(2018).
  25. Yang, H., et al. Traditional medicine (mahuang-tang) improves ovarian dysfunction and the regulation of steroidogenic genes in letrozole-induced PCOS rats. J Ethnopharmacol. 248, 112300(2020).
  26. Corrie, L., et al. Recent updates on animal models for understanding the etiopathogenesis of polycystic ovarian syndrome. Life Sci. 280, 119753(2021).
  27. Corbin, C. J., Trant, J. M., Walters, K. W., Conley, A. J. Changes in testosterone metabolism associated with the evolution of placental and gonadal isozymes of porcine aromatase cytochrome p450. Endocrinology. 140 (11), 5202-5210 (1999).
  28. Ryan, G. E., Malik, S., Mellon, P. L. Antiandrogen treatment ameliorates reproductive and metabolic phenotypes in the letrozole-induced mouse model of PCOS. Endocrinology. 159 (4), 1734-1747 (2018).
  29. Bhattarai, P., Rijal, S., Bhattarai, J. P., Cho, D. H., Han, S. K. Suppression of neurotransmission on gonadotropin-releasing hormone neurons in letrozole-induced polycystic ovary syndrome: A mouse model. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1059255(2022).
  30. Annie, L., Gurusubramanian, G., Roy, V. K. Inhibition of visfatin by fk866 mitigates pathogenesis of cystic ovary in letrozole-induced hyperandrogenised mice. Life Sci. 276, 119409(2021).
  31. Mcdonald, L. T., et al. Early blood profile of C57BL/6 mice exposed to chronic unpredictable stress. Front Psychiatry. 10, 230(2019).
  32. Torres, P. J., et al. Exposure to a healthy gut microbiome protects against reproductive and metabolic dysregulation in a PCOS mouse model. Endocrinology. 160 (5), 1193-1204 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model mysi PCOSminipompa z letrozolemkontrolowane uwalnianie lekuimplantacja podskórnatestosteron w surowicynietolerancja glukozyhistologia jajnikówzaburzenia metabolicznechoroby układu sercowo-naczyniowego
Zmodyfikowana technika wywoływania zespołu policystycznych jajników u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.