Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Ferroptosis to nowo kontekstualizowany, zależny od reaktywnych form tlenu (ROS) typ śmierci komórkowej¹. Oprócz ROS, żelazo odgrywa kluczową rolę w tym typie śmierci komórki, stąd nazwa². Ostatnim i wykonawczym etapem ferroptozy jest katalizowana żelazem akumulacja uszkodzeń oksydacyjnych lipidów w błonie plazmatycznej, która ostatecznie prowadzi do naruszenia integralności błony i selektywnej przepuszczalności, a ostatecznie do śmierci komórki przez bulgotanie. Zdarzenie hydroperoksydacji lipidów jest zjawiskiem występującym naturalnie; Jednak jego rozprzestrzenianiu się przez błonę komórkową zapobiega obrona antyoksydacyjna komórki. Głównym graczem w tym kontekście jest peroksydaza glutationowa 4 (GPx4) w białku Se, która może zbliżyć się do błony i przekształcić wodoronadtlenki lipidów w ich mniej toksyczne pochodne alkoholowe³. Moc redukcyjna GPx4 jest głównie, ale nie wyłącznie, dostarczana przez glutation (GSH), tripeptyd złożony z aminokwasów endogennych: glicyny, glutaminianu i cysteiny. Aminokwasem ograniczającym szybkość biosyntezy GSH jest cysteina⁴. Chociaż cysteina jest klasyfikowana jako aminokwas endogenny, jej zapotrzebowanie może łatwo przekroczyć jej wewnętrzną produkcję w komórkach o wysokiej proliferacji (takich jak komórki rakowe). W związku z tym został przeklasyfikowany do grupy aminokwasów półegzogennych. Niezbędny import cysteiny odbywa się głównie poprzez system Xc-, który pozwala na import utlenionej (dominującej) formy cysteiny (inaczej cystyny) kosztem eksportu glutaminianu⁵. System Xc- składa się z podjednostki transportowej niezależnej od Na+, zależnej od Cl, znanej jako xCT, oraz podjednostki opiekuńczej, znanej jako CD98. Do niedawna właściwości antyferroptotyczne osi xCT-GSH-GPx4 były postrzegane jako unikalne i niepowtarzalne⁶. Jednak w 2019 roku opisano alternatywny szlak antyferroptozowy, składający się z ubichinolu (koenzymu Q10) i jego enzymu regeneracyjnego - białka supresorowego ferroptozy 1 (FSP1), ^7,8. Wkrótce potem doniesiono o kolejnym systemie detoksykacji wodoronadtlenku lipidów z udziałem cyklohydrolazy GTP-1/tetrahydrobiopteryny (GCH1/BH4)⁹. Niemniej jednak centralna rola osi xCT-GSH-GPx4 w zapobieganiu ferroptozie wydaje się nie być kwestionowana.

W ciągu ostatniej dekady, ferroptoza była intensywnie badana w różnych typach nowotworów, wykazując duży potencjał jako strategia przeciwnowotworowa (recenzowane przez Lei et al.¹⁰). Ponadto doniesiono, że komórki rakowe wykazujące wysoką oporność na konwencjonalne chemioterapeutyki i/lub skłonność do przerzutów są zaskakująco wrażliwe na induktory ferroptozy, takie jak inhibitory GPx4^11,12,13. Jednak w kontekście nowotworów mózgu potencjał induktorów ferroptotycznych pozostaje w dużej mierze niedostatecznie zbadany. Podczas gdy ten rodzaj śmierci komórki jest ściśle związany z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu¹⁴i chorobami neurodegeneracyjnymi¹⁵, jego potencjał w kontekście guzów mózgu jest głównie ograniczony do glejaka, najczęstszego złośliwego nowotworu czaszkowo-mózgowego (sprawdzone przez Zhuo et al.¹⁶). Z drugiej strony, wrażliwość rdzeniaka zarodkowego, najczęstszego złośliwego nowotworu mózgu u dzieci i głównej przyczyny śmiertelności w dzieciństwie, na induktory ferroptozy pozostaje w dużej mierze niezbadana. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, istnieje niewiele recenzowanej literatury łączącej ferroptozę z rdzeniakiem zarodkowym. Niemniej jednak niektóre badania wykazały, że żelazo odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu, proliferacji i potencjale rakotwórczym komórek macierzystych raka (CSC) zarówno rdzeniaka, jak i glejaka^17,18, potencjalnie czyniąc je bardziej podatnymi na indukcję ferroptozy. Jest to szczególnie istotne, ponieważ rdzeniak zarodkowy jest znany z subpopulacji CSC, czyli komórek inicjujących/rozmnażających nowotwór, które wydają się być w dużej mierze odpowiedzialne za chemooporność guza, rozprzestrzenianie się i nawroty¹⁹.

Wrażliwość na indukcję ferroptozy jest zazwyczaj badana poprzez pomiar zawartości/akumulacji wodoronadtlenku lipidów, co może, ale nie musi prowadzić do śmierci komórki. Najczęściej stosowanymi induktorami ferroptozy są: (1) erastyna, inhibitor transportera xCT ²⁰, (2) RSL3, inhibitor enzymu GPx4 ², i/lub (3) donory żelaza, takie jak cytrynian żelazoamoniowy (FAC)²¹. Zawartość wodoronadtlenku lipidów ocenia się za pomocą sondy selektywnej BODIPY 581/591 C11²², która ma maksima wzbudzenia i emisji przy 581/591 nm w stanie zredukowanym. Po interakcji i utlenieniu przez wodoronadtlenki lipidów, sonda przesuwa swoje maksima wzbudzenia i emisji do 488/510 nm. Zazwyczaj znaczny wzrost zawartości wodoronadtlenku lipidów poprzedza ferroptotyczną śmierć komórki. Ponieważ ferroptoza nie jest zaprogramowaną śmiercią komórki, nie ma molekularnej kaskady sygnalizacyjnej prowadzącej do jej wykonania. Dlatego jedynym sposobem, aby to potwierdzić, jest monitorowanie zawartości wodoronadtlenku lipidów i stosowanie specyficznych inhibitorów tego typu śmierci komórek, takich jak ferrostatyna 1²³. Ferrostatyna 1 jest lipofilowym przeciwutleniaczem, który może przenikać do przedziału lipidowego komórki i detoksykować wodoronadtlenki lipidów, zapobiegając w ten sposób zdarzeniom ferroptotycznym.

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone przy użyciu linii komórkowych rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego (WT) DAOY, które były hodowane w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS. Linia komórkowa z delecją xCT była utrzymywana w tych samych warunkach, z eksperymentami przeprowadzonymi w pożywkach uzupełnionych 1 mM N-acetylocysteiną (NAC). Komórki były regularnie badane pod kątem mykoplazmy przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do wykrywania mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i były hodowane do 10. pasażu.

1. Zbieranie i wysiewanie komórek

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnych technik aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. Komórki rdzeniaka zarodkowego DAOY są przylegające, co oznacza, że wszystkie nieprzyłączone komórki można wyrzucić przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez Ca²⁺ i Mg²⁺.

1. Wziąć naczynie bulionowe (szalka Petriego, średnica 100 mm) z komórkami i usunąć pływające komórki i pożywkę z płytki za pomocą aspiratora.
2. Dodaj 5-10 ml PBS do naczynia, umyj dno okrężnymi ruchami naczynia, a następnie wyjmij PBS z talerza za pomocą aspiratora.
3. Dodaj 1 ml trypsyny (10x rozcieńczenie) do naczynia. Inkubować płytkę do momentu, gdy delikatne stukanie w płytkę spowoduje usunięcie komórek. Weź 10 ml pożywki hodowlanej DMEM uzupełnionej 8% FBS i mechanicznie zbierz komórki z naczynia.
4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
5. Weź 500 μl zawiesiny komórek i umieść ją w kuwecie do liczenia. Policz liczbę komórek na ml zawiesiny komórek. W tym badaniu wykorzystano automatyczny licznik komórek (patrz tabela materiałów).
6. Oblicz objętość niezbędną do pobrania z zawiesiny komórek, aby mieć 1 000 000 komórek.
7. Weź 6-dołkową płytkę i dodaj obliczoną objętość zawiesiny komórek do każdej studzienki, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnioną 8% FBS do 2 ml w każdym dołku.

2. Leczenie komórek

UWAGA: Kontrola i zabiegi są przeprowadzane w trzech egzemplarzach. Grupy są następujące: Kontrola (DMSO), 1 μM erastyny, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatyny 1, 1 μM erastyny + 2 μM Ferrostatyny 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatyny 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatyny 1. Do eksperymentu potrzebne są cztery płytki 6-dołkowe, jak wskazano w tabeli 1). Szczegóły handlowe wszystkich niezbędnych odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. 24 godziny po wysiewie dodaj odpowiedni zabieg do dołka z komórkami.
2. Pozostawić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

3. Barwienie wodoronadtlenków lipidów w leczonych komórkach za pomocą sondy BODIPY 581/591 C11

UWAGA: Roztwór podstawowy sondy lipidowej specyficznej dla wodoronadtlenku jest przygotowywany w DMSO w stężeniu 1 mM. Podwielokrotności roztworu podstawowego przechowuje się w temperaturze -20 °C w nieprzezroczystych probówkach. Do barwienia należy przygotować roztwór roboczy sondy o wielkości 2 μM w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS.

1. 6 godzin po zabiegu obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym (powinno być widoczne zaokrąglenie komórek).
2. Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
   Za pomocą aspiratora usuń pożywkę i pływające (martwe) komórki.
3. Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.
4. Dodać 2 ml roztworu roboczego sondy (2 μM stężenie końcowe w DMEM uzupełnione FBS).
5. Pozostaw naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 30 minut w ciemności (płytki można zawinąć w folię aluminiową).

4. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w leczonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w ciemności (brak świateł w okapie z przepływem laminarnym).

1. Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
   Za pomocą aspiratora usuń roztwór barwiący.
2. Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.
3. Powtórz krok mycia jeszcze raz i odessaj pozostały PBS ze studni za pomocą aspiratora.
4. Dodać 150 μl dostępnego w handlu odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę spowoduje przemieszczenie komórek. Weź 250 μl buforu FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) i mechanicznie zbierz komórki z dołków.
5. Przenieś komórki do odpowiedniej (wcześniej oznaczonej) rurki FACS z nasadką filtra. Umieść probówkę z komórkami na lodzie w ciemności do czasu przeprowadzenia analizy (analizę należy przeprowadzić w ciągu godziny po barwieniu).
   UWAGA: Konfiguracja i kalibracja maszyny FACS zależą od używanej maszyny (patrz Tabela materiałów).
6. Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptoza w DAOY - wodoronadtlenki lipidów).
7. W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (FITC).
8. W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.
9. Dodaj nowy wykres - histogram, z FITC-A na osi y i skalą logarytmiczną.
10. Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę. Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.

5. Barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny (PI) podczas leczenia

UWAGA: Projekt eksperymentu jest dokładnie taki sam jak w przypadku pomiaru wodoronadtlenku lipidów (patrz krok 1 i krok 2).

1. 24 godziny po wysiewie wyjmij naczynia z inkubatora i umieść je w okapie z przepływem laminarnym.
2. Zebrać pożywkę (z martwymi komórkami) w probówce o pojemności 15 ml.
3. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie zbierz PBS do probówki z odpowiednią pożywką.
4. Dodać 200 μl trypsyny (10x rozcieńczenie) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę usunie komórki. Użyj odpowiednich pożywek + PBS, aby zebrać komórki ze studzienek.
5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora.
6. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS i umieścić go na lodzie do czasu analizy.
7. Tuż przed analizą dodać roztwór PI (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 2 μg/ml.

6. Analiza martwych komórek metodą cytometrii przepływowej 24 godziny po zabiegu

UWAGA: Ustawienia maszyny FACS i kalibracja są wykonywane jak wcześniej wskazano (patrz krok 4).

1. Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptosis in DAOY - śmierć komórki).
2. W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (PE).
3. W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.
4. Dodaj nowy wykres - histogram, z PE-A na osi y i skalą logarytmiczną.
5. Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę.
6. Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.

7. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach DAOY xCT-/- za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: komórki xCT^-/- zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem²⁴.

1. W tym eksperymencie należy wysiać komórki, jak wskazano w kroku 2, ale zamiast zabiegu, uzupełnij pożywkę 1 mM NAC przez noc.
2. Następnego dnia utrzymuj NAC w jednej grupie i usuń go z drugiej.
3. Przeprowadzić analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów metodą cytometrii przepływowej dokładnie w taki sam sposób, jak opisano w kroku 6.

8. Analiza wyników cytometru przepływowego

1. Otwórz dokument .fcs w oprogramowaniu FlowJo (patrz Spis materiałów).
2. Kliknij dwukrotnie na pojedynczy plik, aby otworzyć wszystkie zdarzenia (nie tylko singlety FCS) zarejestrowane w pojedynczej próbce (wykres punktowy SSC-A/FSC-A). Ponieważ ustawienia są takie, że bramkowanie wykonane na maszynie nie jest zachowywane, konieczne jest ponowne utworzenie bramy i nazwanie populacji (np. DAOY WT).
3. Kliknij dwukrotnie na bramkowaną populację, aby otworzyć kolejne okno z histogramem.
4. Zmień oś Y na używany filtr fluorescencyjny (Comp-FITC/PE-A).
5. Zmień oś X na modalną (znormalizuj każdy pik do jego trybu, tj. do % maksymalnej liczby komórek znajdujących się w określonym pojemniku).
6. Skopiuj histogram do edytora układu. Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek, a za każdym razem, gdy nowy histogram zostanie wklejony w edytorze układu, przeciągnij go na poprzedni, aby histogramy zostały nałożone (przesunięcie połowiczne).

Linia komórkowa rdzeniaka zarodkowego DAOY była hodowana w standardowym pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS, aż osiągnęła około 60% konfluencji. W dniu eksperymentu pobrano komórki, a 1 000 000 komórek z każdej studzienki zostało posiażonych na płytkach 6-dołkowych, zgodnie z tabelą 1. Następnego dnia komórki (w trzech egzemplarzach) potraktowano 1 μM erastyny, 0,3 μM RSL3 lub 250 μM FAC. Płytki umieszczono następnie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 6 godzinach obserwowano komórki pod mikroskopem, aby wykryć bulgoczące komórki, jak wskazują strzałki w Rysunek 1. Posłużyło to jako wskaźnik, że lek był skuteczny w indukowaniu ferroptozy, zanim komórki zostały przygotowane do barwienia wodoronadtlenkiem lipidów i późniejszej analizy FACS.

Do wykrywania zawartości wodoronadtlenku lipidów, specyficzny barwnik BODIPY 581/591 C11 został użyty w końcowym stężeniu 2 μM przez 30 min. Ponieważ barwnik ten jest wrażliwy na redoks, konieczne było usunięcie z komórek wszelkich zabiegów i umycie ich wstępnie podgrzanym PBS. Po półgodzinnym barwieniu komórki przemyto dwukrotnie PBS, odłączono za pomocą roztworu do oddzielania komórek i przygotowano do analizy FACS. Dane uzyskane na tym etapie wykazały zwiększoną zieloną fluorescencję barwnika w próbkach traktowanych wszystkimi trzema lekami (Rysunek 2). Jednak najsilniejszy efekt zaobserwowano przy 0,3 μM RSL3 (Rysunek 2B), podczas gdy 1 μM erastyny (Rysunek 2A) i 250 μM FAC (Rysunek 2C) wykazały nieco mniejszy efekt po 6 godzinach leczenia.

Aby ustalić, że wykryta akumulacja wodoronadtlenku lipidów prowadzi do śmierci komórki, w szczególności ferroptozy, przez 24 godziny zastosowano te same zabiegi opisane w Tabeli 1. Do analizy martwych komórek za pomocą cytometrii przepływowej pobrano zarówno komórki, jak i supernatant. Żywe i martwe komórki granulowano przez wirowanie, a następnie ponownie zawieszono w buforze FACS w celu późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Dane przedstawione w Rysunek 3 wykazały, że wszystkie trzy terapie indukowały masową śmierć komórek, której całkowicie zapobiegło zastosowanie inhibitora specyficznego dla ferroptozy, ferrostatyny-1. To wyraźnie potwierdza występowanie śmierci komórek ferroptotycznych po zahamowaniu xCT, hamowaniu GPx4 lub przeciążeniu żelazem w komórkach rdzeniaka.

Biorąc pod uwagę, że trzy leki wykazywały nieco odmienne efekty na akumulację wodoronadtlenku lipidów, prawdopodobnie z powodu różnic w sile działania, zastosowano podejście genetyczne do zbadania pełnej siły działania induktorów ferroptotycznych. Wcześniej uzyskane komórki DAOY xCT-/- (rysunek uzupełniający 1A) hodowano w tych samych pożywkach, co ich odpowiedniki WT, ale z suplementacją NAC. Ta pozytywna selekcja pozwoliła komórkom xCT-/- rosnąć w hodowli. Jednak 6 godzin po usunięciu NAC z pożywki hodowlanej, komórki zaczęły gromadzić wodoronadtlenki lipidów do tego samego poziomu, co komórki WT traktowane RSL3 (Ryc. 4). Podobnie jak w przypadku hamowania farmakologicznego, usunięcie NAC z pożywki wywołało charakterystyczne bulgotanie komórek xCT-/- po 6 godzinach (rysunek uzupełniający 1B).

Rysunek 1: Fenotyp feroptotyczny komórek rdzeniaka. Reprezentatywne mikrofotografie komórek DAOY WT traktowanych (lub nie) przez 6 godzin 1 μM erastyny (ERA), 0,3 μM RSL3 lub 250 μM cytrynianu żelazoamoniu (FAC) w obecności lub bez 2 μM inhibitora ferroptozy Ferrostatiny-1 (Ferro-1). Białe strzałki wskazują okrągłe, "bulgoczące" komórki, wskazujące na fenotyp ferroptotyczny widoczny pod mikroskopem świetlnym. Powiększenie: 20x, wkładki: 40x. Podziałka skali: 50 μm, wstawki: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wodoronadtlenek lipidów jako kluczowy marker ferroptozy w komórkach rdzeniaka. Reprezentatywne dane dotyczące barwienia wodoronadtlenkiem lipidów metodą cytometrii przepływowej w komórkach traktowanych przez 6 godzin (A,B) 1 μM erastyny (ERA), (C,D) 0,3 μM RSL3 lub (E,F) 250 μM cytrynianu żelazoamoniowego (FAC), w obecności lub bez inhibitora ferroptozy 2 μM Ferrostatyny-1 (Ferro-1). (A,C,E) Wykresy punktowe zarejestrowanych zdarzeń; (B,D,F) Histogram przedstawiający zawartość wodoronadtlenku lipidów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ferroptotyczna indukcja śmierci komórki metodą farmakologiczną. Reprezentatywne wykresy punktowe cytometrii przepływowej komórek barwionych jodkiem propidyny po 6 godzinach poddawania działaniu 1 μM erastyny (ERA), 0,3 μM RSL3 lub 250 μM cytrynianu żelazoamonu (FAC), w obecności lub bez 2 μM inhibitora ferroptozy Ferrostatyny-1 (Ferro-1). Bramkowanie oddziela żywe (Q4) i martwe (Q3) populacje komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Indukcja ferroptozy metodą genetyczną. Reprezentatywne dane dotyczące barwienia wodoronadtlenkiem lipidów metodą cytometrii przepływowej w komórkach DAOY WT i xCT-/- po 6 godzinach w obecności lub braku inhibitora ferroptozy 2 μM Ferrostatyny-1 (Ferro-1). Po lewej stronie znajduje się histogram przedstawiający zawartość wodoronadtlenku lipidów. Po prawej stronie znajdują się wykresy kropkowe zarejestrowanych zdarzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Szczegóły leczenia komórek kontrolnych i eksperymentalnych.

Rysunek uzupełniający 1: Śmierć komórek feroptotycznych komórek DAOY xCT-/-. (A) Analiza Western blot poziomu xCT w komórkach DAOY WT i xCT-/- w pożywkach DMEM uzupełnionych lub nie o 2 μM ferlostatyny-1. (B) Reprezentatywne mikrofotografie komórek DAOY xCT-/- w obecności (po lewej) i braku (po prawej) 1mM N-acetylocysteiny przez 6 godzin. Białe strzałki wskazują okrągłe, "bulgoczące" komórki, wskazujące na fenotyp ferroptotyczny widoczny pod mikroskopem świetlnym. Powiększenie: 40x. Podziałka liniowa: 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów w związku z prezentowanym tu badaniem.