Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66645

⸱

15 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Biology department, Centre Scientifique de Monaco (CSM), 2Institute for Research on Cancer & Aging (IRCAN), CNRS, INSERM, Centre A. Lacassagne, University Côte d’Azur

W tym artykule

Podsumowanie

Zawartość wodoronadtlenku lipidów stanowi najczęściej używany wskaźnik śmierci komórek ferroptotycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach po indukcji ferroptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Interakcja żelaza i tlenu jest integralną częścią rozwoju życia na Ziemi. Niemniej jednak ta wyjątkowa chemia nadal fascynuje i intryguje, prowadząc do nowych przedsięwzięć biologicznych. W 2012 roku grupa z Columbia University uznała tę interakcję za centralne zdarzenie prowadzące do nowego rodzaju regulowanej śmierci komórki zwanej "ferroptozą". Główną cechą ferroptozy jest akumulacja wodoronadtlenków lipidów z powodu (1) dysfunkcyjnej obrony antyoksydacyjnej i/lub (2) przytłaczającego stresu oksydacyjnego, który najczęściej zbiega się ze zwiększoną zawartością wolnego labilnego żelaza w komórce. Zwykle zapobiega temu kanoniczna oś antyferroptotyczna składająca się z transportera cystyny xCT, glutationu (GSH) i peroksydazy GSH 4 (GPx4). Ponieważ ferroptoza nie jest zaprogramowanym typem śmierci komórki, nie obejmuje szlaków sygnałowych charakterystycznych dla apoptozy. Najczęstszym sposobem udowodnienia tego typu śmierci komórki jest użycie lipofilowych przeciwutleniaczy (witaminy E, ferrostatyny-1 itp.), Aby jej zapobiec. Cząsteczki te mogą zbliżać się do uszkodzeń oksydacyjnych w błonie plazmatycznej i detoksykować je. Innym ważnym aspektem w odkrywaniu fenotypu ferroptotycznego jest wykrycie poprzedzającej akumulacji wodoronadtlenków lipidów, do których stosuje się specyficzny barwnik BODIPY C11. Niniejszy manuskrypt pokaże, w jaki sposób ferroptoza może być indukowana w komórkach rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego przy użyciu różnych induktorów: erastyny, RSL3 i donora żelaza. Podobnie zostaną wykorzystane komórki xCT-KO, które rosną w obecności NAC i które ulegają ferroptozie po usunięciu NAC. Charakterystyczny fenotyp "bulgotania" jest widoczny pod mikroskopem świetlnym w ciągu 12-16 godzin od momentu wyzwolenia ferroptozy. Ponadto zostanie zastosowane barwienie BODIPY C11, a następnie analiza FACS w celu wykazania akumulacji wodoronadtlenków lipidów i wynikającej z tego śmierci komórki przy użyciu metody barwienia PI. Aby udowodnić ferroptotyczny charakter śmierci komórki, ferrostatyna-1 zostanie użyta jako specyficzny środek zapobiegający ferroptozie.

Wprowadzenie

Ferroptosis to nowo kontekstualizowany, zależny od reaktywnych form tlenu (ROS) typ śmierci komórkowej1. Oprócz ROS, żelazo odgrywa kluczową rolę w tym typie śmierci komórki, stąd nazwa2. Ostatnim i wykonawczym etapem ferroptozy jest katalizowana żelazem akumulacja uszkodzeń oksydacyjnych lipidów w błonie plazmatycznej, która ostatecznie prowadzi do naruszenia integralności błony i selektywnej przepuszczalności, a ostatecznie do śmierci komórki przez bulgotanie. Zdarzenie hydroperoksydacji lipidów jest zjawiskiem występującym naturalnie; Jednak jego rozprzestrzenianiu się przez błonę komórkową zapobiega obrona antyoksydacyjna komórki. Głównym graczem w tym kontekście jest peroksydaza glutationowa 4 (GPx4) w białku Se, która może zbliżyć się do błony i przekształcić wodoronadtlenki lipidów w ich mniej toksyczne pochodne alkoholowe3. Moc redukcyjna GPx4 jest głównie, ale nie wyłącznie, dostarczana przez glutation (GSH), tripeptyd złożony z aminokwasów endogennych: glicyny, glutaminianu i cysteiny. Aminokwasem ograniczającym szybkość biosyntezy GSH jest cysteina4. Chociaż cysteina jest klasyfikowana jako aminokwas endogenny, jej zapotrzebowanie może łatwo przekroczyć jej wewnętrzną produkcję w komórkach o wysokiej proliferacji (takich jak komórki rakowe). W związku z tym został przeklasyfikowany do grupy aminokwasów półegzogennych. Niezbędny import cysteiny odbywa się głównie poprzez system Xc-, który pozwala na import utlenionej (dominującej) formy cysteiny (inaczej cystyny) kosztem eksportu glutaminianu5. System Xc- składa się z podjednostki transportowej niezależnej od Na+, zależnej od Cl, znanej jako xCT, oraz podjednostki opiekuńczej, znanej jako CD98. Do niedawna właściwości antyferroptotyczne osi xCT-GSH-GPx4 były postrzegane jako unikalne i niepowtarzalne6. Jednak w 2019 roku opisano alternatywny szlak antyferroptozowy, składający się z ubichinolu (koenzymu Q10) i jego enzymu regeneracyjnego - białka supresorowego ferroptozy 1 (FSP1), 7,8. Wkrótce potem doniesiono o kolejnym systemie detoksykacji wodoronadtlenku lipidów z udziałem cyklohydrolazy GTP-1/tetrahydrobiopteryny (GCH1/BH4)9. Niemniej jednak centralna rola osi xCT-GSH-GPx4 w zapobieganiu ferroptozie wydaje się nie być kwestionowana.

W ciągu ostatniej dekady, ferroptoza była intensywnie badana w różnych typach nowotworów, wykazując duży potencjał jako strategia przeciwnowotworowa (recenzowane przez Lei et al.10). Ponadto doniesiono, że komórki rakowe wykazujące wysoką oporność na konwencjonalne chemioterapeutyki i/lub skłonność do przerzutów są zaskakująco wrażliwe na induktory ferroptozy, takie jak inhibitory GPx411,12,13. Jednak w kontekście nowotworów mózgu potencjał induktorów ferroptotycznych pozostaje w dużej mierze niedostatecznie zbadany. Podczas gdy ten rodzaj śmierci komórki jest ściśle związany z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu14i chorobami neurodegeneracyjnymi15, jego potencjał w kontekście guzów mózgu jest głównie ograniczony do glejaka, najczęstszego złośliwego nowotworu czaszkowo-mózgowego (sprawdzone przez Zhuo et al.16). Z drugiej strony, wrażliwość rdzeniaka zarodkowego, najczęstszego złośliwego nowotworu mózgu u dzieci i głównej przyczyny śmiertelności w dzieciństwie, na induktory ferroptozy pozostaje w dużej mierze niezbadana. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, istnieje niewiele recenzowanej literatury łączącej ferroptozę z rdzeniakiem zarodkowym. Niemniej jednak niektóre badania wykazały, że żelazo odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu, proliferacji i potencjale rakotwórczym komórek macierzystych raka (CSC) zarówno rdzeniaka, jak i glejaka17,18, potencjalnie czyniąc je bardziej podatnymi na indukcję ferroptozy. Jest to szczególnie istotne, ponieważ rdzeniak zarodkowy jest znany z subpopulacji CSC, czyli komórek inicjujących/rozmnażających nowotwór, które wydają się być w dużej mierze odpowiedzialne za chemooporność guza, rozprzestrzenianie się i nawroty19.

Wrażliwość na indukcję ferroptozy jest zazwyczaj badana poprzez pomiar zawartości/akumulacji wodoronadtlenku lipidów, co może, ale nie musi prowadzić do śmierci komórki. Najczęściej stosowanymi induktorami ferroptozy są: (1) erastyna, inhibitor transportera xCT 20, (2) RSL3, inhibitor enzymu GPx4 2, i/lub (3) donory żelaza, takie jak cytrynian żelazoamoniowy (FAC)21. Zawartość wodoronadtlenku lipidów ocenia się za pomocą sondy selektywnej BODIPY 581/591 C1122, która ma maksima wzbudzenia i emisji przy 581/591 nm w stanie zredukowanym. Po interakcji i utlenieniu przez wodoronadtlenki lipidów, sonda przesuwa swoje maksima wzbudzenia i emisji do 488/510 nm. Zazwyczaj znaczny wzrost zawartości wodoronadtlenku lipidów poprzedza ferroptotyczną śmierć komórki. Ponieważ ferroptoza nie jest zaprogramowaną śmiercią komórki, nie ma molekularnej kaskady sygnalizacyjnej prowadzącej do jej wykonania. Dlatego jedynym sposobem, aby to potwierdzić, jest monitorowanie zawartości wodoronadtlenku lipidów i stosowanie specyficznych inhibitorów tego typu śmierci komórek, takich jak ferrostatyna 123. Ferrostatyna 1 jest lipofilowym przeciwutleniaczem, który może przenikać do przedziału lipidowego komórki i detoksykować wodoronadtlenki lipidów, zapobiegając w ten sposób zdarzeniom ferroptotycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone przy użyciu linii komórkowych rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego (WT) DAOY, które były hodowane w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS. Linia komórkowa z delecją xCT była utrzymywana w tych samych warunkach, z eksperymentami przeprowadzonymi w pożywkach uzupełnionych 1 mM N-acetylocysteiną (NAC). Komórki były regularnie badane pod kątem mykoplazmy przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do wykrywania mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i były hodowane do 10. pasażu.

1. Zbieranie i wysiewanie komórek

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnych technik aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. Komórki rdzeniaka zarodkowego DAOY są przylegające, co oznacza, że wszystkie nieprzyłączone komórki można wyrzucić przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez Ca2+ i Mg2+.

  1. Wziąć naczynie bulionowe (szalka Petriego, średnica 100 mm) z komórkami i usunąć pływające komórki i pożywkę z płytki za pomocą aspiratora.
  2. Dodaj 5-10 ml PBS do naczynia, umyj dno okrężnymi ruchami naczynia, a następnie wyjmij PBS z talerza za pomocą aspiratora.
  3. Dodaj 1 ml trypsyny (10x rozcieńczenie) do naczynia. Inkubować płytkę do momentu, gdy delikatne stukanie w płytkę spowoduje usunięcie komórek. Weź 10 ml pożywki hodowlanej DMEM uzupełnionej 8% FBS i mechanicznie zbierz komórki z naczynia.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  5. Weź 500 μl zawiesiny komórek i umieść ją w kuwecie do liczenia. Policz liczbę komórek na ml zawiesiny komórek. W tym badaniu wykorzystano automatyczny licznik komórek (patrz tabela materiałów).
  6. Oblicz objętość niezbędną do pobrania z zawiesiny komórek, aby mieć 1 000 000 komórek.
  7. Weź 6-dołkową płytkę i dodaj obliczoną objętość zawiesiny komórek do każdej studzienki, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnioną 8% FBS do 2 ml w każdym dołku.

2. Leczenie komórek

UWAGA: Kontrola i zabiegi są przeprowadzane w trzech egzemplarzach. Grupy są następujące: Kontrola (DMSO), 1 μM erastyny, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatyny 1, 1 μM erastyny + 2 μM Ferrostatyny 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatyny 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatyny 1. Do eksperymentu potrzebne są cztery płytki 6-dołkowe, jak wskazano w tabeli 1). Szczegóły handlowe wszystkich niezbędnych odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. 24 godziny po wysiewie dodaj odpowiedni zabieg do dołka z komórkami.
  2. Pozostawić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Barwienie wodoronadtlenków lipidów w leczonych komórkach za pomocą sondy BODIPY 581/591 C11

UWAGA: Roztwór podstawowy sondy lipidowej specyficznej dla wodoronadtlenku jest przygotowywany w DMSO w stężeniu 1 mM. Podwielokrotności roztworu podstawowego przechowuje się w temperaturze -20 °C w nieprzezroczystych probówkach. Do barwienia należy przygotować roztwór roboczy sondy o wielkości 2 μM w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS.

  1. 6 godzin po zabiegu obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym (powinno być widoczne zaokrąglenie komórek).
  2. Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
    Za pomocą aspiratora usuń pożywkę i pływające (martwe) komórki.
  3. Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.
  4. Dodać 2 ml roztworu roboczego sondy (2 μM stężenie końcowe w DMEM uzupełnione FBS).
  5. Pozostaw naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut w ciemności (płytki można zawinąć w folię aluminiową).

4. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w leczonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w ciemności (brak świateł w okapie z przepływem laminarnym).

  1. Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
    Za pomocą aspiratora usuń roztwór barwiący.
  2. Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.
  3. Powtórz krok mycia jeszcze raz i odessaj pozostały PBS ze studni za pomocą aspiratora.
  4. Dodać 150 μl dostępnego w handlu odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę spowoduje przemieszczenie komórek. Weź 250 μl buforu FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) i mechanicznie zbierz komórki z dołków.
  5. Przenieś komórki do odpowiedniej (wcześniej oznaczonej) rurki FACS z nasadką filtra. Umieść probówkę z komórkami na lodzie w ciemności do czasu przeprowadzenia analizy (analizę należy przeprowadzić w ciągu godziny po barwieniu).
    UWAGA: Konfiguracja i kalibracja maszyny FACS zależą od używanej maszyny (patrz Tabela materiałów).
  6. Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptoza w DAOY - wodoronadtlenki lipidów).
  7. W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (FITC).
  8. W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.
  9. Dodaj nowy wykres - histogram, z FITC-A na osi y i skalą logarytmiczną.
  10. Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę. Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.

5. Barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny (PI) podczas leczenia

UWAGA: Projekt eksperymentu jest dokładnie taki sam jak w przypadku pomiaru wodoronadtlenku lipidów (patrz krok 1 i krok 2).

  1. 24 godziny po wysiewie wyjmij naczynia z inkubatora i umieść je w okapie z przepływem laminarnym.
  2. Zebrać pożywkę (z martwymi komórkami) w probówce o pojemności 15 ml.
  3. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie zbierz PBS do probówki z odpowiednią pożywką.
  4. Dodać 200 μl trypsyny (10x rozcieńczenie) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę usunie komórki. Użyj odpowiednich pożywek + PBS, aby zebrać komórki ze studzienek.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS i umieścić go na lodzie do czasu analizy.
  7. Tuż przed analizą dodać roztwór PI (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 2 μg/ml.

6. Analiza martwych komórek metodą cytometrii przepływowej 24 godziny po zabiegu

UWAGA: Ustawienia maszyny FACS i kalibracja są wykonywane jak wcześniej wskazano (patrz krok 4).

  1. Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptosis in DAOY - śmierć komórki).
  2. W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (PE).
  3. W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.
  4. Dodaj nowy wykres - histogram, z PE-A na osi y i skalą logarytmiczną.
  5. Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę.
  6. Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.

7. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach DAOY xCT-/- za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: komórki xCT-/- zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem24.

  1. W tym eksperymencie należy wysiać komórki, jak wskazano w kroku 2, ale zamiast zabiegu, uzupełnij pożywkę 1 mM NAC przez noc.
  2. Następnego dnia utrzymuj NAC w jednej grupie i usuń go z drugiej.
  3. Przeprowadzić analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów metodą cytometrii przepływowej dokładnie w taki sam sposób, jak opisano w kroku 6.

8. Analiza wyników cytometru przepływowego

  1. Otwórz dokument .fcs w oprogramowaniu FlowJo (patrz Spis materiałów).
  2. Kliknij dwukrotnie na pojedynczy plik, aby otworzyć wszystkie zdarzenia (nie tylko singlety FCS) zarejestrowane w pojedynczej próbce (wykres punktowy SSC-A/FSC-A). Ponieważ ustawienia są takie, że bramkowanie wykonane na maszynie nie jest zachowywane, konieczne jest ponowne utworzenie bramy i nazwanie populacji (np. DAOY WT).
  3. Kliknij dwukrotnie na bramkowaną populację, aby otworzyć kolejne okno z histogramem.
  4. Zmień oś Y na używany filtr fluorescencyjny (Comp-FITC/PE-A).
  5. Zmień oś X na modalną (znormalizuj każdy pik do jego trybu, tj. do % maksymalnej liczby komórek znajdujących się w określonym pojemniku).
  6. Skopiuj histogram do edytora układu. Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek, a za każdym razem, gdy nowy histogram zostanie wklejony w edytorze układu, przeciągnij go na poprzedni, aby histogramy zostały nałożone (przesunięcie połowiczne).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Linię komórkową medulloblastoma DAOY hodowano w standardowej pożywce DMEM uzupełnionej o 8% FBS, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 60%. W dniu eksperymentu komórki zebrano i wysiano w płytkach 6-dołkowych w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek, zgodnie z Tabela 1Następnego dnia komórki (w trzech powtórzeniach) poddano działaniu albo 1 µM erastyny, 0.3 µM RSL3 lub 250 µM metodą FAC. Następnie płytki umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22Po 6 h komórki obserwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podstawową cechą charakterystyczną ferroptotycznej śmierci komórki jest niekontrolowane nagromadzenie wodoronadtlenków lipidów w błonie komórkowej. To uszkodzenie oksydacyjne może wystąpić w sposób enzymatyczny lub nieenzymatyczny, ale w obu przypadkach reakcja jest zależna od żelaza / katalizowana, co wyjaśnia nazwę tego typu śmierci komórki. Hydroperoksydacja lipidów jest często pośrednio szacowana poprzez pomiar produktów degradacji hydroperoksydacji lipidów, takich jak 4-hydroksy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) lub aldehyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów w związku z prezentowanym tu badaniem.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez rząd Księstwa Monako, jak również przez 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer' (GEMLUC) i Fundację Flavien, która dostarczyła środki na zakup BD FACS Melody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BODIPY 581/591 C11Thermo FisherD3861
Licznik komórekBeckmanCoulter Z1
DMEM średni Gibco10569010
ErastinSigma-AldrichE7781-5MG
Cytrynian żelazoamminiumAcros Organics211842500
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583-25MG
Surowica płodowa (FBS)Dominique Dutcher500105N1N
Cytometr przepływowyBD BiosciencesFACS Melody
Odczynnik do dysocjacji komórek Gibco StemPro AccutaseThermo Fisher11599686
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA7250
Zestaw do wykrywania mykoplazmyInvivoGenrep-pt1
jodek propidynyInvitrogenP3566
RSL3Sigma-AldrichSML2234-25MG
Trypsyna - EDTA 10X - 100 mlDominique DutcherX0930-100

Bibliografia

  1. Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
  2. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
  3. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
  4. Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
  5. Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
  6. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
  7. Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
  8. Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
  9. Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
  10. Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
  11. Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
  12. Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697(2020).
  13. Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
  14. Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).
  15. Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
  16. Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
  17. Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8(2015).
  18. Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
  19. Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
  20. Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523(2014).
  21. Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592(2013).
  22. Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
  23. Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328(2020).
  24. Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
  25. Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
  26. Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
  27. Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
  28. Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503(2018).
  29. Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
  30. Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
  31. Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968(2018).
  32. Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703(2023).
  33. Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).
  34. Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789(2020).
  35. Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Indukcja ferroptozykomórki medulloblastomanadtlenki lipidówzależność od żelazacytometria przepływowabarwienie BODIPY C11mechanizmy śmierci komórkowejnowotworowe komórki macierzystebarwienie jodkiem propidiummikroskopia świetlna
Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.