Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Podsumowanie

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Streszczenie

Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia wynaczynienia barwnika, które następuje z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB). Znakowanie tymi barwnikami jest złożonym procesem, na który wpływa kilka czynników, takich jak stężenie barwników we krwi, przepuszczalność naczyń mózgowych, czas wynaczynienia barwnika oraz zmniejszenie stężenia barwnika w tkance w wyniku degradacji i dyfuzji. W modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu narażenie na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) powoduje załamanie BBB w ograniczonym oknie czasowym. Aby określić dokładną sekwencję rozpadu BBB, błękit Evansa i izotiocyjanian fluoresceiny i dekstran fluoresceiny wstrzykiwano myszom donaczyniowo i śródsierdziowo w różnych punktach czasowych w stosunku do ekspozycji na BSW. Następnie zarejestrowano rozkład fluorescencji barwnika w wycinkach mózgu. Różnice w rozkładzie i intensywności między tymi dwoma barwnikami ujawniły czasoprzestrzenną sekwencję rozpadu BBB. Barwienie immunologiczne wycinków mózgu wykazało, że odpowiedzi astrocytarne i mikroglejowe korelowały z miejscami rozpadu BBB. Protokół ten ma szeroki potencjał do zastosowania w badaniach obejmujących różne modele podziału bariery krew-mózg.

Wprowadzenie

Uszkodzenie i dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) są spowodowane ogólnoustrojowymi stanami zapalnymi, infekcjami, chorobami autoimmunologicznymi, urazami i chorobami neurodegeneracyjnymi¹. W łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI) wynikającym z narażenia na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) zaobserwowano istotną korelację między intensywnością BSW a ilością wycieku barwnika fluorescencyjnego z powodu rozpadu BBB^2,3,4. Jedną z godnych uwagi cech rozpadu BBB w mTBI jest to, że rozpoczyna się natychmiast lub w ciągu kilku godzin po ekspozycji na BSW i jest zwykle procesem przejściowym, który trwa około tygodnia, zanim pojawią się opóźnione, przewlekłe zaburzenia neurologiczne^3,5,6,7. Chociaż szczegóły pozostają niejasne, rozpad BBB jest częścią długotrwałej kaskady patologicznej i może również służyć jako czynnik prognostyczny w mTBI⁶. Dlatego ważne jest zrozumienie przestrzennego i czasowego rozkładu rozpadu bariery krew-mózg w mózgu.

Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia rozpadu BBB^3,8. Ponieważ stężenie barwników we krwi oraz wielkość i zakres rozpadu BBB zmieniają się w czasie, należy zachować ostrożność podczas interpretacji obrazów wynaczynienia barwnika. Na przykład brak wynaczynienia barwnika niekoniecznie wskazuje na brak rozpadu BBB. Nie można wykryć podziału BBB przed lub po wzroście stężenia barwnika we krwi. Nawet jeśli barwnik z powodzeniem zgromadził się w miejscu, w którym nastąpił rozpad BBB, mógł zostać utracony z czasem po ustaniu rozkładu. Ogólnie rzecz biorąc, substancje rozpuszczalne w wodzie i biologicznie obojętne są szybko wydalane z moczem⁹. Dlatego, aby ustalić, czy rozpad BBB następuje w określonym czasie, najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się, gdy barwnik fluorescencyjny jest podawany do krwiobiegu na krótki okres bezpośrednio przed utrwaleniem zwierzęcia. W ten sposób należy stosować dostępny w handlu izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran o określonej masie cząsteczkowej.

Niebieski Evans jest powszechnie rozpoznawalnym niebieskim barwnikiem azowym o silnym powinowactwie do albuminy surowicy. Barwnik wykazuje czerwoną fluorescencję po wzbudzeniu zielonym światłem w systemach biologicznych². Ze względu na swoją obojętną naturę, kompleks albuminy niebieskiej surowicy Evansa pozostaje we krwi do 2 godzin, co czyni go użytecznym znacznikiem 69 kDa do oznaczania regionów z naruszonym BBB przez co najmniej ten czas^10,11. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę potencjalne niepewności dotyczące farmakokinetyki i toksyczności Evans blue⁹. Jednak niedawne badanie wykazało, że niebieski Evans nadal gromadzi się w obszarach, w których BBB jest nieobecny lub zakłócony⁷. Ta funkcja umożliwiła Evans Blue zarejestrowanie historii rozpadu BBB, podczas gdy FITC-dekstran został użyty do zarejestrowania załamania BBB w określonym punkcie czasowym po ekspozycji na BSW. Chociaż błękit Evansa może być podawany dożylnie lub dootrzewnowo ¹⁰, w eksperymentach wrażliwych na czas preferowane jest podawanie dożylne. Badanie to miało na celu zademonstrowanie zastosowania błękitu Evansa i dekstranu FITC do wykrywania czasoprzestrzennego rozkładu rozpadu BBB po ekspozycji na BSW.

Po drugie, badanie przedstawiło technikę zamrażania wycinków mózgu po zaobserwowaniu fluorescencji rozpadu BBB i przygotowaniu cieńszych plastrów odpowiednich do procedur immunohistochemicznych. Zastosowanie glicerolu jako podłoża montażowego i krioprotektantu upraszcza proces immunohistochemiczny. Porównując obrazy rozpadu BBB z obrazami z immunohistochemii, czasoprzestrzenny rozkład rozpadu BBB można skorelować z reakcją tkankową tej samej próbki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach, ustanowionymi przez National Defense Medical College (Tokorozawa, Japonia). Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w National Defense Medical College (nr zatwierdzenia 23011-1). W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 8 tygodni i o masie ciała 19-23 g. Jak pokazano na Rysunek 1, pojedyncze wstrzyknięcie niebieskiego Evansa i perfuzja FITC-dekstranu zostały przeprowadzone w różnych punktach czasowych w stosunku do pojedynczej ekspozycji BSW. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Znieczulenie

UWAGA: Jest to zmodyfikowany protokół, który zwiększa ilość medetomidyny o 2,5 razy w porównaniu z oryginalnym protokołem one¹². Dawki chlorowodorku medetomidyny, midazolamu i butorfanolu wynosiły odpowiednio 0,75 mg/kg, 4 mg/kg i 5 mg/kg mc.

1. Przygotować mieszaninę chlorowodorku medetomidyny (75 μg/ml), midazolamu (400 μg/ml) i butorfanolu (500 μg/ml) w soli fizjologicznej.
2. Mieszaninę podawać dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy (10 μl/g)¹³.
3. Po około 5-10 minutach sprawdź wystarczające znieczulenie, obserwując brak szczypania ogona i odruchów wycofywania pedałów.
4. Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu.

2. Ekspozycja BSW

UWAGA: W tym badaniu użyto wewnętrznej rurki szokowej¹⁴.

1. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
2. Ustaw mysz w odległości 5 cm od końca wyjściowego rurki amortyzatora, upewniając się, że jej oś ciała jest równoległa do osi rurki, ale nie wyrównana z nią.
3. Dostarczyć do głowicy pojedynczą ekspozycję BSW ze szczytowym nadciśnieniem 25 kPa.
   UWAGA: Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu. Regularnie monitoruj stan leczonej myszy. Jeśli zaobserwuje się oznaki niepokoju, takie jak trudności z karmieniem lub piciem, garbienie się lub przedłużający się nienormalny wygląd bez oznak powrotu do zdrowia, należy poddać mysz eutanazji i przedwcześnie zakończyć eksperyment. Należy unikać podawania leków przeciwbólowych, ponieważ mogą one potencjalnie wpływać na odpowiedź glejową.

3. Niebieski zastrzyk Evansa do żyły ogonowej

UWAGA: Niebieski roztwór Evansa powinien być podawany dożylnie bez znieczulenia. W obecności znieczulenia barwnik często nie wnika wystarczająco do organizmu, prawdopodobnie z powodu obniżonego ciśnienia krwi i temperatury ciała¹³. Niebieski Evans podawano w dawce 100 mg/kg.

1. Przygotuj niebieski roztwór Evansa (4% w/v w soli fizjologicznej) w mikroprobówce, a następnie zwiruj i przechowuj w ciemności przed użyciem.
2. Wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej (2,5 μl/g)¹³.

4. Perfuzja przezsercowa roztworem FITC-dekstranu i utrwalanie

1. Dodać heparynę do buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w celu uzyskania stężenia 1 U/ml, a następnie dodać FITC-dekstran do heparynizowanego PBS, aby osiągnąć stężenie 3 mg/ml.
2. Przed użyciem należy całkowicie rozpuścić proszek FITC-dekstranu. Aby to zrobić, delikatnie potrząsaj roztworem przez 30 minut lub dłużej. Przed użyciem należy dokładnie sprawdzić, czy nie ma nierozpuszczonego proszku FITC-dekstranu. Jeśli jakieś pozostałości, kontynuuj potrząsanie, aż całkowicie się rozpuści.
3. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
4. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem utrwalania perfuzji za pomocą pompy perystaltycznej^15,16. Najpierw perfuzja z heparynizowanym PBS zawierającym FITC-dekstran przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min. Następnie perfuzję z 10% obojętnym roztworem buforowym formaliny lub 4% paraformaldehydem-PBS przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min, a następnie 8 minut z szybkością 3,5 ml / min.
5. Ostrożnie usuń mózg za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety^15,16. Po rozbiorze, po utrwaleniu mózgu przez noc w tym samym utrwalaczu (tj. 10% roztworze buforowym o neutralnym poziomie formaliny lub 4% paraformaldehydu-PBS) w temperaturze 4 °C.
6. Następnego dnia należy wymienić utrwalacz na PBS.

5. Przetwarzanie tkanki mózgowej

UWAGA: Nawet jeśli utrwalanie perfuzji jest zakończone, błękit Evansa i FITC-dekstran mogą rozproszyć się w buforze. Dlatego procedury prowadzące do kroku 6.8 powinny zostać zakończone w ciągu tygodnia po utrwaleniu perfuzji. Dodatkowo należy unikać wystawiania próbki na działanie światła.

1. Przygotować 24-dołkową płytkę z 500 μl 20% glicerolu w buforze fosforanowym (PB; pH 7,4) w każdym dołku.
2. Za pomocą krajalnicy do mózgu pokrój mózg na 12 plasterków, każdy o grubości 1 mm.
3. Przenieść każdą cząstkę do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
4. Zastąpić roztwór 50% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
5. Na koniec zastąp roztwór 100% glicerolem. W celu natychmiastowej obserwacji mikroskopowej należy odstawić plastry na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przechowywać je w temperaturze 4 °C. Plastry będą teraz półprzezroczyste i gotowe do obserwacji mikroskopowej.

6. Pomiar fluorescencji wynaczynienia barwnika

UWAGA: Skuteczność etykietowania fluorescencyjnego różni się w zależności od myszy. Dlatego intensywność fluorescencji musi zostać znormalizowana. Wartości fluorescencji są wyrażane w stosunku do wartości w obrębie gigantokomórkowego jądra siatkowatego (GRN), ponieważ ten obszar jest minimalnie dotknięty leczeniem BSW.

1. Dodaj 500 μl glicerolu na dno naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
2. Przenieś plasterek do roztworu glicerolu i przykryj jego powierzchnię szkłem nakrywkowym.
3. Usuń nadmiar glicerolu z krawędzi szkła nakrywkowego.
4. Zmierz intensywność fluorescencji wycinka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
5. Po pomiarze mikroskopowym włóż plasterek z powrotem do studzienki.
6. Powtórz pomiar dla wszystkich 12 plasterków.
7. Dodać 500 μl PB do każdego dołka i przechowywać 24-dołkową płytkę w temperaturze 4 °C przez noc; następnego dnia plastry zostaną nasycone 50% glicerolem-PB.
8. Zastąpić roztwór 30% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
9. Wykonaj procedury opisane w kroku 7 w ciągu kilku tygodni.

7. Kriosekcja i immunohistochemia

1. Przygotować 24-dołkową płytkę, dodając 1000 μl mieszaniny równych objętości pożywki do zamrażania tkanek i 30% glicerolu-PB do dołka 1. Następnie dodaj 1000 μl pożywki do zamrażania tkanek do dołka 2.
2. Przenieś plasterek do dołka 1 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
3. Przenieś plasterek do dołka 2 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
4. Szybko zamroź plasterek z izopentanem za pomocą suchego lodu, uważając, aby nie zgiąć plasterka. Przechowywać plastry w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
5. Kriosekcja plastra do grubości 6 μm. Po wysuszeniu na szkiełku mikroskopowym przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C.
6. W celu pobrania antygenu¹⁷, zanurz skrawki w 10 mM cytrynianu sodu (pH 6,0), podgrzej raz do 100 °C, a następnie utrzymuj w temperaturze 98 °C przez 1 godzinę.
7. Dokładnie umyj sekcje w wodzie destylowanej. Wycinki są teraz gotowe do barwienia immunohistochemicznego.

Wyniki

Rysunek 1A pokazuje przebieg czasowy wtrysku barwnika w stosunku do początku BSW, przy szczytowym nadciśnieniu 25 kPa. W protokole "Post" niebieski roztwór Evansa podawano donaczyniowo 2 godziny przed perfuzją FITC-dekstranu, którą prowadzono 6 godzin, 1 dzień, 3 dni i 7 dni po ekspozycji na BSW. W protokole "Pre" niebieski roztwór Evansa został wstrzyknięty bezpośrednio przed ekspozycją na BSW. W protokole "Post" oczekuje się, że stężenie błękitu Evansa osiągnie maksimum około 2 godziny przed utrwaleniem perfuzji, podczas gdy w protokole "Pre" oczekuje się, że osiągnie maksimum w czasie ekspozycji na BSW (Rysunek 1B). Stężenie FITC-dekstranu w naczyniach mózgowo-krwionośnych utrzymywało się na stałym poziomie przez 2 minuty podczas perfuzji.

Niebieskie oznaczenie Evansa pokazało, że awaria BBB rozpoczęła się w ciągu 6 godzin i trwała do 7 dni po ekspozycji na BSW (Rysunek 2A). Warto zauważyć, że rozpad BBB nie nastąpił natychmiast po ekspozycji na BSW, ponieważ nie było wynaczynienia niebieskiego barwnika Evansa po 3 godzinach w protokole "Pre" (Rysunek 2B). Co zaskakujące, długoterminowe oznaczanie kolorem niebieskim Evansa wskazało na jego skumulowany charakter w protokole "Pre" (Rysunek 2B)⁷.

Użycie dwóch różnych barwników, każdy wprowadzany w odstępach czasu co 2 godziny lub więcej, pozwoliło na zbadanie czasowych zmian integralności BBB poprzez porównanie ich rozkładu. Rysunek 3 pokazuje obrazy fluorescencyjne wycinków, które wykazały znaczącą różnicę w rozmieszczeniu niebieskiego Evansa i dekstranu FITC.

Zaobserwowano liczne punkty fluorescencji o różnych rozmiarach. Chociaż niektóre hotspoty były wystarczająco jasne, aby znaleźć się wśród górnych 0,1% pikseli, wiele z nich było tylko nieznacznie jaśniejszych niż otaczające tkanki. Rozbieżność między barwnikami sugeruje, że zmiany zaszły w tym przedziale. Hotspoty wykazujące tylko niebieską fluorescencję Evansa wskazywały na trwający rozpad BBB w momencie wstrzyknięcia niebieskiego Evansa, który został później naprawiony przez wstrzyknięcie FITC-dekstranu. W przeciwieństwie do tego, hotspoty wykazujące tylko fluorescencję FITC-dekstranu sugerowały, że między dwoma wstrzyknięciami barwnika doszło do zakłócenia BBB. Wreszcie, hotspoty wykazujące fluorescencję z obu barwników wskazywały na ciągły rozpad BBB przez cały okres iniekcji.

Rysunek 4A przedstawia liczbę punktów aktywnych dodatnich dla niebieskiego Evansa (w tym zarówno podwójnie dodatnich hotspotów Evansa tylko niebieskiego, jak i podwójnie dodatniego niebieskiego Evansa/FITC-dekstranu), FITC-dekstranu (w tym podwójnie dodatnich hotspotów tylko FITC-dekstran i niebieskiego Evansa/FITC-dekstranu) lub obu barwników (tylko podwójnie dodatnie hotspoty niebieskiego Evansa/FITC-dekstranu). W protokole "Pre" po 3 godzinach zaobserwowano liczne hotspoty tylko z dekstranem FITC. Po 6 godzinach i 1 dniu w protokole "Post" wykryto zarówno hotspoty Evansa tylko niebieskie, jak i tylko FITC-dextran. Jednak po 3 dniach i 7 dniach w protokole "Post" punkty zapalne były przeważnie dodatnie dla obu barwników. Wyniki te sugerują, że załamanie BBB nastąpiło po 3 godzinach, zostało przemodelowane w ciągu 1 dnia i utrzymywało się do 7 dni po ekspozycji na BSW (Rysunek 4B). Co ważne, jak wspomniano wcześniej, zakres załamania BBB miał tendencję do zmniejszania się o 7 dni.

Po zakończeniu eksperymentów z wynaczynieniem barwników, przeprowadzono immunohistochemiczne barwienie plastrów⁷. Immunohistochemiczne skany obrazów były konsekwentnie porównywane z tymi z wynaczynień barwnika, potwierdzając, że efekt przeniesienia substancji fluorescencyjnych był praktycznie znikomy⁷. Jak pokazano na Rysunek 5, skupiska reaktywnych astrocytów były ściśle związane z miejscami rozpadu BBB. Dalsze obserwacje wykazały, że aktywowany i ameboidalny mikroglej był obecny wraz z reaktywnymi astrocytami 3 dni po ekspozycji na BSW.

Rysunek 1: Projekt eksperymentalny. (A) Przebieg eksperymentu w czasie. Niebieski roztwór Evansa wstrzykiwano dożylnie po (protokół "Post") lub bezpośrednio przed (przed protokołem) ekspozycją na BSW, podczas gdy dekstran FITC był perfuzji przezsercowej przez 2 minuty przed fiksacją. (B) Oczekiwane stężenia błękitu Evansa i dekstranu FITC-dekstranu w naczyniach krwionośnych odpowiednio w protokole "Post" i "Pre". BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny. Ten rysunek został zaadaptowany z Nishii et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Porównanie intensywności fluorescencji w wycinkach mózgu. Intensywność fluorescencji najjaśniejszych 0,1% pikseli w mózgu oceniono we wszystkich 12 warstwach i porównano warunki "Post" (A) i "Pre" (B). Wskazano na zmienność i istotność różnic. xxx oznacza p < 0,001; xxxx oznacza p < 0,0001 (wartości p z testu F). *p < 0,05; p < 0,0001 (analiza wariancji z wielokrotnymi porównaniami Dunnetta post hoc). Ten rysunek został zaadaptowany z Nishii et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Załamanie BBB zaobserwowane w różnych punktach czasowych za pomocą podwójnego znakowania za pomocą niebieskiego Evansa i FITC-dextran. Pokazany jest niebieski Evans (magenta), FITC-dextran (zielony) i scalone obrazy. Protokoły wstrzykiwania barwnika znajdują się po lewej stronie. Niektóre hotspoty wykazywały dominującą fluorescencję błękitu Evansa (strzałka) lub FITC-dekstranu (groty strzałek). Gwiazdki wskazują splot naczyniówkowy i związane z nim naczynia. BBB, bariera krew-mózg; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; CVO, narządy okołokomorowe trzeciej komory. Podziałka: 1 mm. Ten rysunek został zaadaptowany z Nishii et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kwantyfikacja gorących punktów fluorescencji. (A) Liczba punktów zapalnych dodatnich dla koloru niebieskiego Evansa (magenta), dekstranu FITC (zielony) i obu barwników (szary). Zostały one zebrane z obrazów uzyskanych po 3 godzinach w protokole "Pre" oraz z obrazów uzyskanych po 6 godzinach, 1 dniu, 3 dniach i 7 dniach w protokole "Post". Od 3 godzin do 1 dnia znaczna część hotspotów fluorescencyjnych wykazywała niezgodność między barwnikami, podczas gdy od 3 dni do 7 dni takie niedopasowanie prawie nie obserwowano. (B) Schemat podsumowujący przebieg w czasie załamania BBB. Oś pionowa koncepcyjnie reprezentuje intensywność wycieku barwnika z powodu rozpadu BBB. Wzór zygzakowaty od 3 h do 1 dnia wskazuje, że lokalizacja i intensywność wycieku barwnika są w tym okresie niestabilne. FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; BBB, bariera krew-mózg; BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem. Ten rysunek został zaadaptowany z Nishii et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ekspresja GFAP i Iba1 jako markerów odpowiednio dla astrocytów i mikrogleju. Każda kolumna rysunku zawiera obrazy fluorescencyjne wynaczynienia barwnika za pomocą błękitu Evansa lub dekstranu FITC, wraz z obrazami immunohistochemicznymi GFAP lub Iba1. Kolorowy pasek wskazuje znormalizowane intensywności fluorescencji błękitu Evansa i FITC-dekstranu przy użyciu tych w GRN. Protokoły wstrzykiwania barwnika znajdują się po lewej stronie. Wycinek 1 dnia w protokole "Pre" pokazuje fluorescencję zarówno błękitu Evansa, jak i dekstranu FITC, podczas gdy wycinek 3 dni w protokole "Pre" pokazuje tylko fluorescencję niebieskiego Evansa (strzałki). Obszary oznaczone strzałkami na obrazach wynaczynienia barwnika są wyrównane z obrazami immunohistochemicznymi. Groty strzałek wskazują skupiska reaktywnych astrocytów. Poliklonalne przeciwciało GFAP znakowało astrocyty w istocie białej i wokół niej, a także w tkance nerwowej przylegającej do pia mater. W rezultacie astrocyty w obrębie i w pobliżu dcw są oznaczone na tym rysunku. Powiększone obrazy odpowiadające ramce lub strzałce w kolumnie Iba1 są przedstawione we wstawkach. Podziałka: 1 mm i 200 μm odpowiednio dla wynaczynienia barwnika i obrazów immunohistochemicznych. GFAP, kwaśne białko fibrylarne glejowe; Iba1, zjonizowana cząsteczka adaptera wiążąca wapń 1; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem; DCW, głęboka istota biała mózgu. Ten rysunek został zaadaptowany z Nishii et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nowatorska technika podwójnego znakowania z wykorzystaniem błękitu Evansa i dekstranu FITC została wykorzystana do dokładnej wizualizacji dokładnego rozkładu czasoprzestrzennego rozpadu BBB w jednym mózgu. W modelu BSW o niskiej intensywności zaobserwowano zauważalne różnice w zakresie, lokalizacji i stopniu wynaczynienia barwnika w badanych mózgach (ryc. 2 i ryc. 3). Niedopasowania między barwnikami ujawniły, że rozpad BBB rozpoczął się około 3 godziny po ekspozycji na BSW, przy czym znaczna przebudowa nastąpiła w dniu 1 i trwała do dnia 7 (ryc. 4). W ciężkich przypadkach aktywny mikroglej rekrutowano do miejsc rozpadu BBB, a skupiska reaktywnych astrocytów były ściśle związane z tymi obszarami (ryc. 5). Przeprowadzając immunohistochemię na tych samych wycinkach, które są używane do analizy wynaczynienia barwnika, ustalono precyzyjną korelację między reakcjami glejowymi a wynaczynieniem barwnika. Aby uzyskać bardziej szczegółowe dane i analizy, zapoznaj się z Nishii et ^al.7.

Ponieważ dekstran FITC był perfuzjonowany w stałym stężeniu przez identyczny czas bezpośrednio przed utrwaleniem perfuzji, dystrybucja i intensywność barwnika prawdopodobnie dokładnie reprezentują zakres rozpadu BBB w momencie utrwalenia perfuzji. Jednak w poprzednim raporcie wykazano, że fluorescencja FITC-dekstranu jest zwykle słaba w modelu^{BSW 7} o niskiej intensywności. Znakowanie kolorem niebieskim Evansa przez dłuższy czas było korzystne, ponieważ mogło wykryć bardziej subtelne zmiany w podziale BBB (ryc. 2). Jednak ze względu na dłuższy czas etykietowania, może być wymagana ostrożność podczas interpretacji fluorescencyjnych obrazów niebieskiego Evansa. Stężenie błękitu Evansa we krwi było najwyższe bezpośrednio po wstrzyknięciu i stopniowo zmniejszało się w ciągu kilku godzin (ryc. 1)¹¹. Spekuluje się, że intensywność znakowania korelowałaby z ciężkością i czasem trwania rozpadu BBB, a także ze stężeniem błękitu Evansa we krwi; Jednak po naprawie zmniejszyłby się wykładniczo. Wszystkie te czynniki zmieniają się od czasu do czasu i z eksperymentu na drugi. Dlatego nie należy wyciągać wniosków z pojedynczego obrazu wynaczynienia barwnika, a względy statystyczne są zawsze konieczne.

W zależności od celu eksperymentu, interesująca może być zmiana masy cząsteczkowej, a także kombinacji barwników. W tym badaniu zastosowano kombinację Evans Blue i FITC-dekstranu. Po związaniu się z albuminą surowicy, błękit Evansa zachowywał się jak znacznik 69 kDa, a 40-kDa FITC-dekstran zastosowany w tym badaniu wykazywał podobny stopień rozpadu BBB jak niebieski Evans. Czasoprzestrzenny rozkład rozpadu BBB był systematycznie badany przy użyciu kombinacji barwników emitujących różną fluorescencję⁷. W poprzednim badaniu, w którym wykorzystano kombinację błękitu Evansa i fluoresceiny sodu (376 Da), fluoresceina sodu, ze względu na mniejszą masę cząsteczkową, mogła oznaczać szerszy zakres rozpadu BBB po ekspozycji na BSW³. W innych badaniach zastosowano kombinacje błękitu Evansa i dekstranu FITC o większej masie cząsteczkowej w celu porównania zakresu rozpadu BBB^18,19. We wszystkich poprzednich raportach podawano błękit Evansa i FITC-dekstran prawie jednocześnie. Unikalnym aspektem przedstawionego tutaj protokołu jest to, że oba barwniki zostały wprowadzone w różnych punktach czasowych, co pozwala na zbadanie postępu czasowego rozpadu BBB.

Skumulowany charakter błękitu Evansa może okazać się korzystny w różnych modelach podziału BBB. Ponieważ rejestruje historię rozpadu BBB, zrozumienie początku i progresji choroby może być łatwiejsze. Badacze powinni zdawać sobie sprawę z pozytywnych i negatywnych cech barwników i wykorzystywać je w jak najszerszym zakresie⁹. Protokół ten ma szeroki zakres zastosowań dla różnych modeli podziału BBB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% neutralny roztwór buforowy formaliny	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Przeciwciało wtórne z adsorbacją krzyżową przeciw myszym IgG (H+L) kurczaka, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	pożywka do zamrażania tkanek
Domitor	Orion Corporation		medetomidyna
Donkey anty-Rabbit IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-dołkowa polistyrenowa przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowej bez poddanego obróbce, z pokrywką, pakowana indywidualnie, sterylna, 50 sztuk w opakowaniu	CORNING	351147
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran średnia mol wt 40 000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dekstran
Szklana podstawa 27mm (szkło nr 1)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm szklana dolna miska
IX83 Mikroskop odwrócony	OLYMPUS
MAS Hydrofilowe szkiełka mikroskopowe adhezyjne	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami  Szkło nakrywkowe (nr 1)  18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Pompa perystaltyczna	ATTO	SJ-1211 II-H
GRYZOŃ BRAIN MATRIX Dorosła mysz, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	krajalnica do mózgu
Vetorphale	Meiji Zdrowie zwierząt	VETLI5	butorfanol