Artykuł metodologiczny

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66653

⸱

18 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Streszczenie

Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia wynaczynienia barwnika, które następuje z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB). Znakowanie tymi barwnikami jest złożonym procesem, na który wpływa kilka czynników, takich jak stężenie barwników we krwi, przepuszczalność naczyń mózgowych, czas wynaczynienia barwnika oraz zmniejszenie stężenia barwnika w tkance w wyniku degradacji i dyfuzji. W modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu narażenie na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) powoduje załamanie BBB w ograniczonym oknie czasowym. Aby określić dokładną sekwencję rozpadu BBB, błękit Evansa i izotiocyjanian fluoresceiny i dekstran fluoresceiny wstrzykiwano myszom donaczyniowo i śródsierdziowo w różnych punktach czasowych w stosunku do ekspozycji na BSW. Następnie zarejestrowano rozkład fluorescencji barwnika w wycinkach mózgu. Różnice w rozkładzie i intensywności między tymi dwoma barwnikami ujawniły czasoprzestrzenną sekwencję rozpadu BBB. Barwienie immunologiczne wycinków mózgu wykazało, że odpowiedzi astrocytarne i mikroglejowe korelowały z miejscami rozpadu BBB. Protokół ten ma szeroki potencjał do zastosowania w badaniach obejmujących różne modele podziału bariery krew-mózg.

Wprowadzenie

Uszkodzenie i dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) są spowodowane ogólnoustrojowymi stanami zapalnymi, infekcjami, chorobami autoimmunologicznymi, urazami i chorobami neurodegeneracyjnymi1. W łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI) wynikającym z narażenia na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) zaobserwowano istotną korelację między intensywnością BSW a ilością wycieku barwnika fluorescencyjnego z powodu rozpadu BBB2,3,4. Jedną z godnych uwagi cech rozpadu BBB w mTBI jest to, że rozpoczyna się natychmiast lub w ciągu kilku godzin po ekspozycji na BSW i jest zwykle procesem przejściowym, który trwa około tygodnia, zanim pojawią się opóźnione, przewlekłe zaburzenia neurologiczne3,5,6,7. Chociaż szczegóły pozostają niejasne, rozpad BBB jest częścią długotrwałej kaskady patologicznej i może również służyć jako czynnik prognostyczny w mTBI6. Dlatego ważne jest zrozumienie przestrzennego i czasowego rozkładu rozpadu bariery krew-mózg w mózgu.

Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia rozpadu BBB3,8. Ponieważ stężenie barwników we krwi oraz wielkość i zakres rozpadu BBB zmieniają się w czasie, należy zachować ostrożność podczas interpretacji obrazów wynaczynienia barwnika. Na przykład brak wynaczynienia barwnika niekoniecznie wskazuje na brak rozpadu BBB. Nie można wykryć podziału BBB przed lub po wzroście stężenia barwnika we krwi. Nawet jeśli barwnik z powodzeniem zgromadził się w miejscu, w którym nastąpił rozpad BBB, mógł zostać utracony z czasem po ustaniu rozkładu. Ogólnie rzecz biorąc, substancje rozpuszczalne w wodzie i biologicznie obojętne są szybko wydalane z moczem9. Dlatego, aby ustalić, czy rozpad BBB następuje w określonym czasie, najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się, gdy barwnik fluorescencyjny jest podawany do krwiobiegu na krótki okres bezpośrednio przed utrwaleniem zwierzęcia. W ten sposób należy stosować dostępny w handlu izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran o określonej masie cząsteczkowej.

Niebieski Evans jest powszechnie rozpoznawalnym niebieskim barwnikiem azowym o silnym powinowactwie do albuminy surowicy. Barwnik wykazuje czerwoną fluorescencję po wzbudzeniu zielonym światłem w systemach biologicznych2. Ze względu na swoją obojętną naturę, kompleks albuminy niebieskiej surowicy Evansa pozostaje we krwi do 2 godzin, co czyni go użytecznym znacznikiem 69 kDa do oznaczania regionów z naruszonym BBB przez co najmniej ten czas10,11. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę potencjalne niepewności dotyczące farmakokinetyki i toksyczności Evans blue9. Jednak niedawne badanie wykazało, że niebieski Evans nadal gromadzi się w obszarach, w których BBB jest nieobecny lub zakłócony7. Ta funkcja umożliwiła Evans Blue zarejestrowanie historii rozpadu BBB, podczas gdy FITC-dekstran został użyty do zarejestrowania załamania BBB w określonym punkcie czasowym po ekspozycji na BSW. Chociaż błękit Evansa może być podawany dożylnie lub dootrzewnowo 10, w eksperymentach wrażliwych na czas preferowane jest podawanie dożylne. Badanie to miało na celu zademonstrowanie zastosowania błękitu Evansa i dekstranu FITC do wykrywania czasoprzestrzennego rozkładu rozpadu BBB po ekspozycji na BSW.

Po drugie, badanie przedstawiło technikę zamrażania wycinków mózgu po zaobserwowaniu fluorescencji rozpadu BBB i przygotowaniu cieńszych plastrów odpowiednich do procedur immunohistochemicznych. Zastosowanie glicerolu jako podłoża montażowego i krioprotektantu upraszcza proces immunohistochemiczny. Porównując obrazy rozpadu BBB z obrazami z immunohistochemii, czasoprzestrzenny rozkład rozpadu BBB można skorelować z reakcją tkankową tej samej próbki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach, ustanowionymi przez National Defense Medical College (Tokorozawa, Japonia). Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w National Defense Medical College (nr zatwierdzenia 23011-1). W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 8 tygodni i o masie ciała 19-23 g. Jak pokazano na Rysunek 1, pojedyncze wstrzyknięcie niebieskiego Evansa i perfuzja FITC-dekstranu zostały przeprowadzone w różnych punktach czasowych w stosunku do pojedynczej ekspozycji BSW. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Znieczulenie

UWAGA: Jest to zmodyfikowany protokół, który zwiększa ilość medetomidyny o 2,5 razy w porównaniu z oryginalnym protokołem one12. Dawki chlorowodorku medetomidyny, midazolamu i butorfanolu wynosiły odpowiednio 0,75 mg/kg, 4 mg/kg i 5 mg/kg mc.

  1. Przygotować mieszaninę chlorowodorku medetomidyny (75 μg/ml), midazolamu (400 μg/ml) i butorfanolu (500 μg/ml) w soli fizjologicznej.
  2. Mieszaninę podawać dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy (10 μl/g)13.
  3. Po około 5-10 minutach sprawdź wystarczające znieczulenie, obserwując brak szczypania ogona i odruchów wycofywania pedałów.
  4. Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu.

2. Ekspozycja BSW

UWAGA: W tym badaniu użyto wewnętrznej rurki szokowej14.

  1. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
  2. Ustaw mysz w odległości 5 cm od końca wyjściowego rurki amortyzatora, upewniając się, że jej oś ciała jest równoległa do osi rurki, ale nie wyrównana z nią.
  3. Dostarczyć do głowicy pojedynczą ekspozycję BSW ze szczytowym nadciśnieniem 25 kPa.
    UWAGA: Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu. Regularnie monitoruj stan leczonej myszy. Jeśli zaobserwuje się oznaki niepokoju, takie jak trudności z karmieniem lub piciem, garbienie się lub przedłużający się nienormalny wygląd bez oznak powrotu do zdrowia, należy poddać mysz eutanazji i przedwcześnie zakończyć eksperyment. Należy unikać podawania leków przeciwbólowych, ponieważ mogą one potencjalnie wpływać na odpowiedź glejową.

3. Niebieski zastrzyk Evansa do żyły ogonowej

UWAGA: Niebieski roztwór Evansa powinien być podawany dożylnie bez znieczulenia. W obecności znieczulenia barwnik często nie wnika wystarczająco do organizmu, prawdopodobnie z powodu obniżonego ciśnienia krwi i temperatury ciała13. Niebieski Evans podawano w dawce 100 mg/kg.

  1. Przygotuj niebieski roztwór Evansa (4% w/v w soli fizjologicznej) w mikroprobówce, a następnie zwiruj i przechowuj w ciemności przed użyciem.
  2. Wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej (2,5 μl/g)13.

4. Perfuzja przezsercowa roztworem FITC-dekstranu i utrwalanie

  1. Dodać heparynę do buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w celu uzyskania stężenia 1 U/ml, a następnie dodać FITC-dekstran do heparynizowanego PBS, aby osiągnąć stężenie 3 mg/ml.
  2. Przed użyciem należy całkowicie rozpuścić proszek FITC-dekstranu. Aby to zrobić, delikatnie potrząsaj roztworem przez 30 minut lub dłużej. Przed użyciem należy dokładnie sprawdzić, czy nie ma nierozpuszczonego proszku FITC-dekstranu. Jeśli jakieś pozostałości, kontynuuj potrząsanie, aż całkowicie się rozpuści.
  3. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
  4. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem utrwalania perfuzji za pomocą pompy perystaltycznej15,16. Najpierw perfuzja z heparynizowanym PBS zawierającym FITC-dekstran przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min. Następnie perfuzję z 10% obojętnym roztworem buforowym formaliny lub 4% paraformaldehydem-PBS przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min, a następnie 8 minut z szybkością 3,5 ml / min.
  5. Ostrożnie usuń mózg za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety15,16. Po rozbiorze, po utrwaleniu mózgu przez noc w tym samym utrwalaczu (tj. 10% roztworze buforowym o neutralnym poziomie formaliny lub 4% paraformaldehydu-PBS) w temperaturze 4 °C.
  6. Następnego dnia należy wymienić utrwalacz na PBS.

5. Przetwarzanie tkanki mózgowej

UWAGA: Nawet jeśli utrwalanie perfuzji jest zakończone, błękit Evansa i FITC-dekstran mogą rozproszyć się w buforze. Dlatego procedury prowadzące do kroku 6.8 powinny zostać zakończone w ciągu tygodnia po utrwaleniu perfuzji. Dodatkowo należy unikać wystawiania próbki na działanie światła.

  1. Przygotować 24-dołkową płytkę z 500 μl 20% glicerolu w buforze fosforanowym (PB; pH 7,4) w każdym dołku.
  2. Za pomocą krajalnicy do mózgu pokrój mózg na 12 plasterków, każdy o grubości 1 mm.
  3. Przenieść każdą cząstkę do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  4. Zastąpić roztwór 50% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  5. Na koniec zastąp roztwór 100% glicerolem. W celu natychmiastowej obserwacji mikroskopowej należy odstawić plastry na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przechowywać je w temperaturze 4 °C. Plastry będą teraz półprzezroczyste i gotowe do obserwacji mikroskopowej.

6. Pomiar fluorescencji wynaczynienia barwnika

UWAGA: Skuteczność etykietowania fluorescencyjnego różni się w zależności od myszy. Dlatego intensywność fluorescencji musi zostać znormalizowana. Wartości fluorescencji są wyrażane w stosunku do wartości w obrębie gigantokomórkowego jądra siatkowatego (GRN), ponieważ ten obszar jest minimalnie dotknięty leczeniem BSW.

  1. Dodaj 500 μl glicerolu na dno naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
  2. Przenieś plasterek do roztworu glicerolu i przykryj jego powierzchnię szkłem nakrywkowym.
  3. Usuń nadmiar glicerolu z krawędzi szkła nakrywkowego.
  4. Zmierz intensywność fluorescencji wycinka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  5. Po pomiarze mikroskopowym włóż plasterek z powrotem do studzienki.
  6. Powtórz pomiar dla wszystkich 12 plasterków.
  7. Dodać 500 μl PB do każdego dołka i przechowywać 24-dołkową płytkę w temperaturze 4 °C przez noc; następnego dnia plastry zostaną nasycone 50% glicerolem-PB.
  8. Zastąpić roztwór 30% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
  9. Wykonaj procedury opisane w kroku 7 w ciągu kilku tygodni.

7. Kriosekcja i immunohistochemia

  1. Przygotować 24-dołkową płytkę, dodając 1000 μl mieszaniny równych objętości pożywki do zamrażania tkanek i 30% glicerolu-PB do dołka 1. Następnie dodaj 1000 μl pożywki do zamrażania tkanek do dołka 2.
  2. Przenieś plasterek do dołka 1 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Przenieś plasterek do dołka 2 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  4. Szybko zamroź plasterek z izopentanem za pomocą suchego lodu, uważając, aby nie zgiąć plasterka. Przechowywać plastry w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
  5. Kriosekcja plastra do grubości 6 μm. Po wysuszeniu na szkiełku mikroskopowym przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C.
  6. W celu pobrania antygenu17, zanurz skrawki w 10 mM cytrynianu sodu (pH 6,0), podgrzej raz do 100 °C, a następnie utrzymuj w temperaturze 98 °C przez 1 godzinę.
  7. Dokładnie umyj sekcje w wodzie destylowanej. Wycinki są teraz gotowe do barwienia immunohistochemicznego.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia przebieg czasowy wtryskiwania barwnika w odniesieniu do początku BSW, przy maksymalnym nadciśnieniu wynoszącym 25 kPa. W protokole „Post” roztwór błękitu Evansa podano do naczyń krwionośnych 2 h przed perfuzją FITC-dekstranem, którą przeprowadzono 6 h, 1 dzień, 3 dni oraz 7 dni po ekspozycji na BSW. W protokole „Pre” roztwór błękitu Evansa wstrzyknięto bezpośrednio przed ekspozycją na BSW. W protokole „Post” oczekuje się, że stężenie błękitu Evansa osiągnie maksimum około 2 h przed utrwaleniem perfuzyjnym, natomiast w protokole „Pre” powinno ono osiągnąć maksimum w czasie ekspozycji na BSW (Rysunek 1B). Stężenie FITC-dekstranu w naczyniach krwionośnych mózgu utrzymywano na stałym poziomie przez 2 min podczas perfuzji.

Barwienie błękitem Evansa wykazało, że rozpad BBB rozpoczął się w ciągu 6 h i trwał do 7 dni po ekspozycji na BSW (Rysunek 2A). Warto zauważyć, że rozpad BBB nie nastąpił natychmiast po ekspozycji na BSW, ponieważ w 3 h w protokole „Pre” nie stwierdzono wysięku barwnika błękitu Evansa (Rysunek 2B). Co zaskakujące, długoterminowe barwienie błękitem Evansa wskazało na jego charakter kumulacyjny w protokole „Pre” (Rysunek 2B)7.

Zastosowanie dwóch różnych barwników, z których każdy został wprowadzony w odstępach co najmniej 2 h, pozwoliło na zbadanie zmian czasowych w integralności BBB poprzez porównanie ich dystrybucji. Rysunek 3 przedstawia obrazy fluorescencyjne skrawków, które wykazały istotną różnicę w dystrybucji błękitu Evansa i FITC-dekstranu.

Zaobserwowano liczne punkty intensywnej fluorescencji (hotspots) o różnych rozmiarach. Choć niektóre z nich były na tyle jasne, że plasowały się wśród 0,1% najjaśniejszych pikseli, wiele z nich było zaledwie nieco jaśniejszych od otaczających tkanek. Rozbieżność między barwnikami sugeruje, że w tym odstępie czasu nastąpiły zmiany. Punkty wykazujące jedynie fluorescencję błękitu Evansa wskazywały na trwający rozkład bariery krew-mózg (BBB) w momencie wstrzyknięcia błękitu Evansa, który został następnie naprawiony przed wstrzyknięciem FITC-dekstranu. Z kolei punkty wykazujące wyłącznie fluorescencję FITC-dekstranu sugerowały, że przerwanie BBB nastąpiło pomiędzy wstrzyknięciem obu barwników. Wreszcie, punkty wykazujące fluorescencję obu barwników wskazywały na ciągły rozkład BBB przez cały okres wstrzykiwań.

Rycina 4A przedstawia liczbę punktów zapalnych (hotspots) dodatnich dla błękitu Evansa (w tym zarówno punktów dodatnich tylko dla błękitu Evansa, jak i podwójnie dodatnich dla błękitu Evansa/FITC-dekstranu), FITC-dekstranu (w tym zarówno punktów dodatnich tylko dla FITC-dekstranu, jak i podwójnie dodatnich dla błękitu Evansa/FITC-dekstranu) lub dla obu barwników (tylko punkty podwójnie dodatnie dla błękitu Evansa/FITC-dekstranu). W protokole „Pre” w 3 h zaobserwowano liczne punkty dodatnie tylko dla FITC-dekstranu. W 6 h i 1 dób w protokole „Post” wykryto punkty dodatnie zarówno tylko dla błękitu Evansa, jak i tylko dla FITC-dekstranu. Jednak w 3 i 7 dobach w protokole „Post” punkty te były w przeważającej mierze dodatnie dla obu barwników. Wyniki te sugerują, że rozszczelnienie bariery krew-mózg (BBB) nastąpiło w 3 h, uległo przebudowie do 1 doby i utrzymywało się do 7 dób po ekspozycji na BSW (Rycina 4B). Co istotne, stopień rozszczelnienia BBB miał tendencję do zmniejszania się do 7 doby, jak wspomniano wcześniej.

Po zakończeniu eksperymentów dotyczących ekstrawasacji barwnika przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne skrawków7. Skan obrazów immunohistochemicznych konsekwentnie porównywano ze skanami ekstrawasacji barwnika, co potwierdziło, że efekt przenoszenia substancji fluorescencyjnych był praktycznie pomijalny7. Jak pokazano na Rysunku 5, skupiska reaktywnych astrocytów były ściśle powiązane z miejscami rozpadu BBB. Dalsze obserwacje wykazały, że aktywowana i ameboidalna mikroglia wystąpiła obok reaktywnych astrocytów 3 dni po ekspozycji na BSW.

Harmonogram protokołu dla FITC-dekstranu i błękitu Evansa; analiza stężenia barwnika we krwi, schemat eksperymentalny.
Rycina 1: Schemat eksperymentalny. (A) Przebieg czasowy eksperymentu. Roztwór błękitu Evansa wstrzykiwano dożylnie po ekspozycji na BSW (protokół „Post”) lub bezpośrednio przed nią (protokół „Pre”), natomiast FITC-dekstran podawano drogą perfuzji transkardialnej przez 2 min przed utrwaleniem. (B>) Przewidywane stężenia błękitu Evansa i FITC-dekstranu w naczyniach krwionośnych odpowiednio w protokołach „Post” i „Pre”. BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny. Rycina zaadaptowana z Nishii et al.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący stosunki fluorescencji Evans Blue przed i po leczeniu; analiza danych statystycznych.
Rycina 2: Porównanie intensywności fluorescencji w przekrojach mózgu. Intensywność fluorescencji 0,1% najjaśniejszych pikseli w mózgu została oceniona we wszystkich 12 przekrojach i porównana pomiędzy warunkami „po” (A) i „przed” (B). Wskazano zmienność i istotność różnic. xxx oznacza p < 0,001; xxxx oznacza p < 0,0001 (wartości p z testu F). *p < 0,05; ****p < 0,0001 (analiza wariancji z testem post hoc wielokrotnych porównań Dunnetta). Rycina ta została zaadaptowana z pracy Nishii i wsp.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przepuszczalność bariery krew-mózg, błękit Evansa i FITC-dekstran, obrazy fluorescencyjne przekrojów mózgu.
Rysunek 3: Rozpad BBB zaobserwowany w różnych punktach czasowych przy użyciu podwójnego znakowania błękitem Evansa i FITC-dekstranem. Przedstawiono obrazy błękitu Evansa (magenta), FITC-dekstranu (zielony) oraz obrazy nałożone. Protokoły wstrzykiwania barwników znajdują się po lewej stronie. Niektóre obszary o wysokiej intensywności (hotspots) wykazały przeważającą fluorescencję błękitu Evansa (strzałka) lub FITC-dekstranu (groty strzałek). Gwiazdki wskazują sploty naczyniowe i powiązane naczynia. BBB, bariera krew-mózg; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; CVO, organy okołokomorowe trzeciej komory. Pasek skali: 1 mm. Rysunek opracowano na podstawie pracy Nishii et al.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza fluorescencji, błękit Evansa, FITC-dekstran, wykres przeciekania barwnika, wyniki eksperymentalne.
Rycina 4: Ilościowe oznaczenie punktów fluorescencji (hotspots). (A) Liczba punktów dodatnich dla błękitu Evansa (magenta), FITC-dekstranu (zielony) oraz obu barwników (szary). Dane zostały zebrane z obrazów uzyskanych po 3 h w protokole „Pre” oraz z obrazów uzyskanych po 6 h, 1 dniu, 3 dniach i 7 dniach w protokole „Post”. Od 3 h do 1 dnia znaczna część punktów fluorescencji wykazywała brak zgodności między barwnikami, natomiast od 3 do 7 dni taka niezgodność była niemal nieobserwowalna. (B) Schemat podsumowujący przebieg czasowy rozpadu BBB. Oś pionowa koncepcyjnie reprezentuje intensywność przeciekania barwnika wynikającą z rozpadu BBB. Zygzakowaty wzór od 3 h do 1 dnia wskazuje, że lokalizacja i intensywność przeciekania barwnika są w tym okresie niestabilne. FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; BBB, bariera krew-mózg; BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem. Rycina została zaadaptowana z Nishii et al.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat obrazowania mózgu z użyciem Evans Blue, FITC-dekstranu, analizy GFAP/Iba1 oraz metody perfuzji-utrwalania.
Rysunek 5: Ekspresja GFAP i Iba1 jako markerów odpowiednio astrocytów i mikrogleju. Każda kolumna rysunku zawiera obrazy fluorescencyjne ekstrawazacji barwnika Evans blue lub FITC-dekstranu wraz z obrazami immunohistochemicznymi GFAP lub Iba1. Pasek kolorów wskazuje znormalizowane intensywności fluorescencji Evans blue i FITC-dekstranu w odniesieniu do tych w obrębie GRN. Protokoły wstrzykiwania barwników przedstawiono po lewej stronie. Przekrój z 1. dnia w protokole „Pre” wykazuje fluorescencję zarówno Evans blue, jak i FITC-dekstranu, natomiast przekrój z 3. dnia w protokole „Pre” wykazuje jedynie fluorescencję Evans blue (strzałki). Obszary wskazane strzałkami na obrazach ekstrawazacji barwnika odpowiadają obrazom immunohistochemicznym. Groty strzałek wskazują skupiska reaktywnych astrocytów. Poliklonalne przeciwciało GFAP oznakowało astrocyty w istocie białej i wokół niej, a także w tkance nerwowej sąsiadującej z oponą miękką. W rezultacie na tym rysunku oznakowano astrocyty wewnątrz i w pobliżu dcw. Powiększone obrazy odpowiadające ramce lub strzałce w kolumnie Iba1 przedstawiono na wstawkach. Paski skali: 1 mm dla obrazów ekstrawazacji barwnika i 200 µm dla obrazów immunohistochemicznych. GFAP, kwaśne białko włókienkowe glejowe; Iba1, cząsteczka adapterowa 1 wiążąca zjonizowany wapń; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; BSW, fale uderzeniowe wywołane wybuchem; dcw, głęboka istota biała mózgu. Rysunek został zaadaptowany z pracy Nishii i wsp.7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nowatorska technika podwójnego znakowania z wykorzystaniem błękitu Evansa i dekstranu FITC została wykorzystana do dokładnej wizualizacji dokładnego rozkładu czasoprzestrzennego rozpadu BBB w jednym mózgu. W modelu BSW o niskiej intensywności zaobserwowano zauważalne różnice w zakresie, lokalizacji i stopniu wynaczynienia barwnika w badanych mózgach (ryc. 2 i ryc. 3). Niedopasowania między barwnikami ujawniły, że rozpad BBB rozpoczął się około 3 godziny po ekspozycji na BSW, przy czym znaczna przebudowa nastąpiła w dniu 1 i trwała do dnia 7 (ryc. 4). W ciężkich przypadkach aktywny mikroglej rekrutowano do miejsc rozpadu BBB, a skupiska reaktywnych astrocytów były ściśle związane z tymi obszarami (ryc. 5). Przeprowadzając immunohistochemię na tych samych wycinkach, które są używane do analizy wynaczynienia barwnika, ustalono precyzyjną korelację między reakcjami glejowymi a wynaczynieniem barwnika. Aby uzyskać bardziej szczegółowe dane i analizy, zapoznaj się z Nishii et al.7.

Ponieważ dekstran FITC był perfuzjonowany w stałym stężeniu przez identyczny czas bezpośrednio przed utrwaleniem perfuzji, dystrybucja i intensywność barwnika prawdopodobnie dokładnie reprezentują zakres rozpadu BBB w momencie utrwalenia perfuzji. Jednak w poprzednim raporcie wykazano, że fluorescencja FITC-dekstranu jest zwykle słaba w modeluBSW 7 o niskiej intensywności. Znakowanie kolorem niebieskim Evansa przez dłuższy czas było korzystne, ponieważ mogło wykryć bardziej subtelne zmiany w podziale BBB (ryc. 2). Jednak ze względu na dłuższy czas etykietowania, może być wymagana ostrożność podczas interpretacji fluorescencyjnych obrazów niebieskiego Evansa. Stężenie błękitu Evansa we krwi było najwyższe bezpośrednio po wstrzyknięciu i stopniowo zmniejszało się w ciągu kilku godzin (ryc. 1)11. Spekuluje się, że intensywność znakowania korelowałaby z ciężkością i czasem trwania rozpadu BBB, a także ze stężeniem błękitu Evansa we krwi; Jednak po naprawie zmniejszyłby się wykładniczo. Wszystkie te czynniki zmieniają się od czasu do czasu i z eksperymentu na drugi. Dlatego nie należy wyciągać wniosków z pojedynczego obrazu wynaczynienia barwnika, a względy statystyczne są zawsze konieczne.

W zależności od celu eksperymentu, interesująca może być zmiana masy cząsteczkowej, a także kombinacji barwników. W tym badaniu zastosowano kombinację Evans Blue i FITC-dekstranu. Po związaniu się z albuminą surowicy, błękit Evansa zachowywał się jak znacznik 69 kDa, a 40-kDa FITC-dekstran zastosowany w tym badaniu wykazywał podobny stopień rozpadu BBB jak niebieski Evans. Czasoprzestrzenny rozkład rozpadu BBB był systematycznie badany przy użyciu kombinacji barwników emitujących różną fluorescencję7. W poprzednim badaniu, w którym wykorzystano kombinację błękitu Evansa i fluoresceiny sodu (376 Da), fluoresceina sodu, ze względu na mniejszą masę cząsteczkową, mogła oznaczać szerszy zakres rozpadu BBB po ekspozycji na BSW3. W innych badaniach zastosowano kombinacje błękitu Evansa i dekstranu FITC o większej masie cząsteczkowej w celu porównania zakresu rozpadu BBB18,19. We wszystkich poprzednich raportach podawano błękit Evansa i FITC-dekstran prawie jednocześnie. Unikalnym aspektem przedstawionego tutaj protokołu jest to, że oba barwniki zostały wprowadzone w różnych punktach czasowych, co pozwala na zbadanie postępu czasowego rozpadu BBB.

Skumulowany charakter błękitu Evansa może okazać się korzystny w różnych modelach podziału BBB. Ponieważ rejestruje historię rozpadu BBB, zrozumienie początku i progresji choroby może być łatwiejsze. Badacze powinni zdawać sobie sprawę z pozytywnych i negatywnych cech barwników i wykorzystywać je w jak najszerszym zakresie9. Protokół ten ma szeroki zakres zastosowań dla różnych modeli podziału BBB.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Mayumi Watanabe za technikę kriosekcji. Prace te były wspierane przez grant Advanced Research on Military Medicine z Ministerstwa Obrony Japonii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralny roztwór buforowy formalinyFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, RabbitDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, RabbitFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Przeciwciało wtórne z adsorbacją krzyżową przeciw myszym IgG (H+L) kurczaka, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351pożywka do zamrażania tkanek
DomitorOrion Corporationmedetomidyna
Donkey anty-Rabbit IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24-dołkowa polistyrenowa przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowej bez poddanego obróbce, z pokrywką, pakowana indywidualnie, sterylna, 50 sztuk w opakowaniuCORNING351147
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran średnia mol wt 40 000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dekstran
Szklana podstawa 27mm (szkło nr 1)AGC TECHNO GLASS3910-03535 mm szklana dolna miska
IX83 Mikroskop odwróconyOLYMPUS
MAS Hydrofilowe szkiełka mikroskopowe adhezyjneMatsunami GlassMAS-04
Matsunami  Szkło nakrywkowe (nr 1)  18 x 18mmMatsunami GlassC018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Pompa perystaltycznaATTOSJ-1211 II-H
GRYZOŃ BRAIN MATRIX
Dorosła mysz, 30 g, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000Ckrajalnica do mózgu
VetorphaleMeiji Zdrowie zwierzątVETLI5butorfanol

Bibliografia

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model fali uderzeniowej blastuznakowanie błękitem Evansawstrzyknięcie FITC-dekstranumikroskopia fluorescencyjnaprzygotowanie skrawków mózguimmunohistochemiareaktywne astrocytyaktywacja mikrogleju
Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.