Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia wynaczynienia barwnika, które następuje z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB). Znakowanie tymi barwnikami jest złożonym procesem, na który wpływa kilka czynników, takich jak stężenie barwników we krwi, przepuszczalność naczyń mózgowych, czas wynaczynienia barwnika oraz zmniejszenie stężenia barwnika w tkance w wyniku degradacji i dyfuzji. W modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu narażenie na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) powoduje załamanie BBB w ograniczonym oknie czasowym. Aby określić dokładną sekwencję rozpadu BBB, błękit Evansa i izotiocyjanian fluoresceiny i dekstran fluoresceiny wstrzykiwano myszom donaczyniowo i śródsierdziowo w różnych punktach czasowych w stosunku do ekspozycji na BSW. Następnie zarejestrowano rozkład fluorescencji barwnika w wycinkach mózgu. Różnice w rozkładzie i intensywności między tymi dwoma barwnikami ujawniły czasoprzestrzenną sekwencję rozpadu BBB. Barwienie immunologiczne wycinków mózgu wykazało, że odpowiedzi astrocytarne i mikroglejowe korelowały z miejscami rozpadu BBB. Protokół ten ma szeroki potencjał do zastosowania w badaniach obejmujących różne modele podziału bariery krew-mózg.
Wprowadzenie
Uszkodzenie i dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) są spowodowane ogólnoustrojowymi stanami zapalnymi, infekcjami, chorobami autoimmunologicznymi, urazami i chorobami neurodegeneracyjnymi1. W łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI) wynikającym z narażenia na fale uderzeniowe wywołane wybuchem (BSW) zaobserwowano istotną korelację między intensywnością BSW a ilością wycieku barwnika fluorescencyjnego z powodu rozpadu BBB2,3,4. Jedną z godnych uwagi cech rozpadu BBB w mTBI jest to, że rozpoczyna się natychmiast lub w ciągu kilku godzin po ekspozycji na BSW i jest zwykle procesem przejściowym, który trwa około tygodnia, zanim pojawią się opóźnione, przewlekłe zaburzenia neurologiczne3,5,6,7. Chociaż szczegóły pozostają niejasne, rozpad BBB jest częścią długotrwałej kaskady patologicznej i może również służyć jako czynnik prognostyczny w mTBI6. Dlatego ważne jest zrozumienie przestrzennego i czasowego rozkładu rozpadu bariery krew-mózg w mózgu.
Barwniki fluorescencyjne są używane do określenia stopnia rozpadu BBB3,8. Ponieważ stężenie barwników we krwi oraz wielkość i zakres rozpadu BBB zmieniają się w czasie, należy zachować ostrożność podczas interpretacji obrazów wynaczynienia barwnika. Na przykład brak wynaczynienia barwnika niekoniecznie wskazuje na brak rozpadu BBB. Nie można wykryć podziału BBB przed lub po wzroście stężenia barwnika we krwi. Nawet jeśli barwnik z powodzeniem zgromadził się w miejscu, w którym nastąpił rozpad BBB, mógł zostać utracony z czasem po ustaniu rozkładu. Ogólnie rzecz biorąc, substancje rozpuszczalne w wodzie i biologicznie obojętne są szybko wydalane z moczem9. Dlatego, aby ustalić, czy rozpad BBB następuje w określonym czasie, najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się, gdy barwnik fluorescencyjny jest podawany do krwiobiegu na krótki okres bezpośrednio przed utrwaleniem zwierzęcia. W ten sposób należy stosować dostępny w handlu izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran o określonej masie cząsteczkowej.
Niebieski Evans jest powszechnie rozpoznawalnym niebieskim barwnikiem azowym o silnym powinowactwie do albuminy surowicy. Barwnik wykazuje czerwoną fluorescencję po wzbudzeniu zielonym światłem w systemach biologicznych2. Ze względu na swoją obojętną naturę, kompleks albuminy niebieskiej surowicy Evansa pozostaje we krwi do 2 godzin, co czyni go użytecznym znacznikiem 69 kDa do oznaczania regionów z naruszonym BBB przez co najmniej ten czas10,11. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę potencjalne niepewności dotyczące farmakokinetyki i toksyczności Evans blue9. Jednak niedawne badanie wykazało, że niebieski Evans nadal gromadzi się w obszarach, w których BBB jest nieobecny lub zakłócony7. Ta funkcja umożliwiła Evans Blue zarejestrowanie historii rozpadu BBB, podczas gdy FITC-dekstran został użyty do zarejestrowania załamania BBB w określonym punkcie czasowym po ekspozycji na BSW. Chociaż błękit Evansa może być podawany dożylnie lub dootrzewnowo 10, w eksperymentach wrażliwych na czas preferowane jest podawanie dożylne. Badanie to miało na celu zademonstrowanie zastosowania błękitu Evansa i dekstranu FITC do wykrywania czasoprzestrzennego rozkładu rozpadu BBB po ekspozycji na BSW.
Po drugie, badanie przedstawiło technikę zamrażania wycinków mózgu po zaobserwowaniu fluorescencji rozpadu BBB i przygotowaniu cieńszych plastrów odpowiednich do procedur immunohistochemicznych. Zastosowanie glicerolu jako podłoża montażowego i krioprotektantu upraszcza proces immunohistochemiczny. Porównując obrazy rozpadu BBB z obrazami z immunohistochemii, czasoprzestrzenny rozkład rozpadu BBB można skorelować z reakcją tkankową tej samej próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach, ustanowionymi przez National Defense Medical College (Tokorozawa, Japonia). Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w National Defense Medical College (nr zatwierdzenia 23011-1). W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 8 tygodni i o masie ciała 19-23 g. Jak pokazano na Rysunek 1, pojedyncze wstrzyknięcie niebieskiego Evansa i perfuzja FITC-dekstranu zostały przeprowadzone w różnych punktach czasowych w stosunku do pojedynczej ekspozycji BSW. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Znieczulenie
UWAGA: Jest to zmodyfikowany protokół, który zwiększa ilość medetomidyny o 2,5 razy w porównaniu z oryginalnym protokołem one12. Dawki chlorowodorku medetomidyny, midazolamu i butorfanolu wynosiły odpowiednio 0,75 mg/kg, 4 mg/kg i 5 mg/kg mc.
- Przygotować mieszaninę chlorowodorku medetomidyny (75 μg/ml), midazolamu (400 μg/ml) i butorfanolu (500 μg/ml) w soli fizjologicznej.
- Mieszaninę podawać dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy (10 μl/g)13.
- Po około 5-10 minutach sprawdź wystarczające znieczulenie, obserwując brak szczypania ogona i odruchów wycofywania pedałów.
- Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu.
2. Ekspozycja BSW
UWAGA: W tym badaniu użyto wewnętrznej rurki szokowej14.
- Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
- Ustaw mysz w odległości 5 cm od końca wyjściowego rurki amortyzatora, upewniając się, że jej oś ciała jest równoległa do osi rurki, ale nie wyrównana z nią.
- Dostarczyć do głowicy pojedynczą ekspozycję BSW ze szczytowym nadciśnieniem 25 kPa.
UWAGA: Utrzymuj mysz w cieple, dopóki nie wyzdrowieje po znieczuleniu. Regularnie monitoruj stan leczonej myszy. Jeśli zaobserwuje się oznaki niepokoju, takie jak trudności z karmieniem lub piciem, garbienie się lub przedłużający się nienormalny wygląd bez oznak powrotu do zdrowia, należy poddać mysz eutanazji i przedwcześnie zakończyć eksperyment. Należy unikać podawania leków przeciwbólowych, ponieważ mogą one potencjalnie wpływać na odpowiedź glejową.
3. Niebieski zastrzyk Evansa do żyły ogonowej
UWAGA: Niebieski roztwór Evansa powinien być podawany dożylnie bez znieczulenia. W obecności znieczulenia barwnik często nie wnika wystarczająco do organizmu, prawdopodobnie z powodu obniżonego ciśnienia krwi i temperatury ciała13. Niebieski Evans podawano w dawce 100 mg/kg.
- Przygotuj niebieski roztwór Evansa (4% w/v w soli fizjologicznej) w mikroprobówce, a następnie zwiruj i przechowuj w ciemności przed użyciem.
- Wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej (2,5 μl/g)13.
4. Perfuzja przezsercowa roztworem FITC-dekstranu i utrwalanie
- Dodać heparynę do buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w celu uzyskania stężenia 1 U/ml, a następnie dodać FITC-dekstran do heparynizowanego PBS, aby osiągnąć stężenie 3 mg/ml.
- Przed użyciem należy całkowicie rozpuścić proszek FITC-dekstranu. Aby to zrobić, delikatnie potrząsaj roztworem przez 30 minut lub dłużej. Przed użyciem należy dokładnie sprawdzić, czy nie ma nierozpuszczonego proszku FITC-dekstranu. Jeśli jakieś pozostałości, kontynuuj potrząsanie, aż całkowicie się rozpuści.
- Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 1.
- Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem utrwalania perfuzji za pomocą pompy perystaltycznej15,16. Najpierw perfuzja z heparynizowanym PBS zawierającym FITC-dekstran przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min. Następnie perfuzję z 10% obojętnym roztworem buforowym formaliny lub 4% paraformaldehydem-PBS przez 2 minuty z szybkością 4,0 ml / min, a następnie 8 minut z szybkością 3,5 ml / min.
- Ostrożnie usuń mózg za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety15,16. Po rozbiorze, po utrwaleniu mózgu przez noc w tym samym utrwalaczu (tj. 10% roztworze buforowym o neutralnym poziomie formaliny lub 4% paraformaldehydu-PBS) w temperaturze 4 °C.
- Następnego dnia należy wymienić utrwalacz na PBS.
5. Przetwarzanie tkanki mózgowej
UWAGA: Nawet jeśli utrwalanie perfuzji jest zakończone, błękit Evansa i FITC-dekstran mogą rozproszyć się w buforze. Dlatego procedury prowadzące do kroku 6.8 powinny zostać zakończone w ciągu tygodnia po utrwaleniu perfuzji. Dodatkowo należy unikać wystawiania próbki na działanie światła.
- Przygotować 24-dołkową płytkę z 500 μl 20% glicerolu w buforze fosforanowym (PB; pH 7,4) w każdym dołku.
- Za pomocą krajalnicy do mózgu pokrój mózg na 12 plasterków, każdy o grubości 1 mm.
- Przenieść każdą cząstkę do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
- Zastąpić roztwór 50% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
- Na koniec zastąp roztwór 100% glicerolem. W celu natychmiastowej obserwacji mikroskopowej należy odstawić plastry na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przechowywać je w temperaturze 4 °C. Plastry będą teraz półprzezroczyste i gotowe do obserwacji mikroskopowej.
6. Pomiar fluorescencji wynaczynienia barwnika
UWAGA: Skuteczność etykietowania fluorescencyjnego różni się w zależności od myszy. Dlatego intensywność fluorescencji musi zostać znormalizowana. Wartości fluorescencji są wyrażane w stosunku do wartości w obrębie gigantokomórkowego jądra siatkowatego (GRN), ponieważ ten obszar jest minimalnie dotknięty leczeniem BSW.
- Dodaj 500 μl glicerolu na dno naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
- Przenieś plasterek do roztworu glicerolu i przykryj jego powierzchnię szkłem nakrywkowym.
- Usuń nadmiar glicerolu z krawędzi szkła nakrywkowego.
- Zmierz intensywność fluorescencji wycinka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
- Po pomiarze mikroskopowym włóż plasterek z powrotem do studzienki.
- Powtórz pomiar dla wszystkich 12 plasterków.
- Dodać 500 μl PB do każdego dołka i przechowywać 24-dołkową płytkę w temperaturze 4 °C przez noc; następnego dnia plastry zostaną nasycone 50% glicerolem-PB.
- Zastąpić roztwór 30% glicerolem-PB i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny.
- Wykonaj procedury opisane w kroku 7 w ciągu kilku tygodni.
7. Kriosekcja i immunohistochemia
- Przygotować 24-dołkową płytkę, dodając 1000 μl mieszaniny równych objętości pożywki do zamrażania tkanek i 30% glicerolu-PB do dołka 1. Następnie dodaj 1000 μl pożywki do zamrażania tkanek do dołka 2.
- Przenieś plasterek do dołka 1 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Przenieś plasterek do dołka 2 i potrząsaj płytką w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Szybko zamroź plasterek z izopentanem za pomocą suchego lodu, uważając, aby nie zgiąć plasterka. Przechowywać plastry w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
- Kriosekcja plastra do grubości 6 μm. Po wysuszeniu na szkiełku mikroskopowym przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C.
- W celu pobrania antygenu17, zanurz skrawki w 10 mM cytrynianu sodu (pH 6,0), podgrzej raz do 100 °C, a następnie utrzymuj w temperaturze 98 °C przez 1 godzinę.
- Dokładnie umyj sekcje w wodzie destylowanej. Wycinki są teraz gotowe do barwienia immunohistochemicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia przebieg czasowy wtryskiwania barwnika w odniesieniu do początku BSW, przy maksymalnym nadciśnieniu wynoszącym 25 kPa. W protokole „Post” roztwór błękitu Evansa podano do naczyń krwionośnych 2 h przed perfuzją FITC-dekstranem, którą przeprowadzono 6 h, 1 dzień, 3 dni oraz 7 dni po ekspozycji na BSW. W protokole „Pre” roztwór błękitu Evansa wstrzyknięto bezpośrednio przed ekspozycją na BSW. W protokole „Post” oczekuje się, że stężenie błękitu Evansa osiągnie maksimum ok...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nowatorska technika podwójnego znakowania z wykorzystaniem błękitu Evansa i dekstranu FITC została wykorzystana do dokładnej wizualizacji dokładnego rozkładu czasoprzestrzennego rozpadu BBB w jednym mózgu. W modelu BSW o niskiej intensywności zaobserwowano zauważalne różnice w zakresie, lokalizacji i stopniu wynaczynienia barwnika w badanych mózgach (ryc. 2 i ryc. 3). Niedopasowania między barwnikami ujawniły, że rozpad BBB rozpoczął się około 3 godziny po ekspo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Mayumi Watanabe za technikę kriosekcji. Prace te były wspierane przez grant Advanced Research on Military Medicine z Ministerstwa Obrony Japonii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% neutralny roztwór buforowy formaliny | FUJIFILM Wako Chemicals | 062-01661 | |
| Anti GFAP, Rabbit | DAKO-Agilent | IR524 | |
| Anti Iba1, Rabbit | FUJIFILM Wako Chemicals | 019-19741 | |
| Przeciwciało wtórne z adsorbacją krzyżową przeciw myszym IgG (H+L) kurczaka, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21200 | |
| Cryo Mount | Muto Pure Chemicals | 33351 | pożywka do zamrażania tkanek |
| Domitor | Orion Corporation | medetomidyna | |
| Donkey anty-Rabbit IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| Falcon 24-dołkowa polistyrenowa przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowej bez poddanego obróbce, z pokrywką, pakowana indywidualnie, sterylna, 50 sztuk w opakowaniu | CORNING | 351147 | |
| Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran średnia mol wt 40 000 | Sigma-Aldrich | FD40S | FITC-dekstran |
| Szklana podstawa 27mm (szkło nr 1) | AGC TECHNO GLASS | 3910-035 | 35 mm szklana dolna miska |
| IX83 Mikroskop odwrócony | OLYMPUS | ||
| MAS Hydrofilowe szkiełka mikroskopowe adhezyjne | Matsunami Glass | MAS-04 | |
| Matsunami Szkło nakrywkowe (nr 1) 18 x 18mm | Matsunami Glass | C018181 | |
| Midazolam Injection 10mg [SANDOZ] | Sandoz | ||
| Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Pompa perystaltyczna | ATTO | SJ-1211 II-H | |
| GRYZOŃ BRAIN MATRIX Dorosła mysz, 30 g, Coronal | ASI INSTRUMENTS | RBM-2000C | krajalnica do mózgu |
| Vetorphale | Meiji Zdrowie zwierząt | VETLI5 | butorfanol |
Bibliografia
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
- Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971(2015).
- Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681(2018).
- Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
- Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232(2014).
- Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
- Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385(2015).
- Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
- Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595(2013).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771(2012).
- Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
- Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807(2011).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
- Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
