Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów za pomocą centralnego nacięcia rogówki i długiego tunelu do przedniej komory. Ta metoda iniekcji minimalizuje ryzyko wywołania niezamierzonego uszkodzenia tkanki, a tym samym poprawia precyzję i odtwarzalność.

Streszczenie

Wstrzyknięcie dokomorowe jest standardowym sposobem podawania w okulistyce. Zastosowanie iniekcji dokomorowej u gryzoni do celów badawczych jest trudne ze względu na ograniczone wymiary i anatomię oka, w tym małą objętość cieczy wodnistej, krzywiznę soczewki i grubość soczewki. Potencjalne uszkodzenia podczas iniekcji dokomorowych wprowadzają działania niepożądane i zmienność eksperymentalną. Protokół ten opisuje procedurę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów, zapewniającą precyzję i powtarzalność.

Szczury Sprague-Dawley zostały użyte jako modele eksperymentalne. Ponieważ pozycja soczewki u szczurów wystaje do przedniej komory, wstrzykiwanie z obrzeży, jak to ma miejsce u ludzi, jest niekorzystne. Dlatego w centralnej okolicy rogówki tworzy się nacięcie za pomocą ostrza szpilkowego o rozmiarze 31 0,8 mm, aby utworzyć samouszczelniający się tunel do komory przedniej. Nacięcie pod kątem zbliżonym do mieszkania pozwala na stworzenie długiego tunelu, który minimalizuje utratę cieczy wodnistej i spłycenie komory przedniej. Do tunelu wprowadza się nanoigłę o rozmiarze 34 w celu wstrzyknięcia. Umożliwia to penetrację przy minimalnym oporze tarcia i pozwala uniknąć dotykania soczewki. Wstrzyknięcie błękitu trypanowego umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopii szczelinowej obecności barwnika w komorze przedniej i wykluczenie przecieku. Biodostępność do warstwy śródbłonka rogówki wykazuje się przez wstrzyknięcie barwnika Hoechsta, który po wstrzyknięciu zabarwił jądra komórek śródbłonka rogówki.

Podsumowując, ten protokół implementuje procedurę dokładnego wstrzykiwania dokomorowego u szczurów. Procedura ta może być stosowana do dodokomorowego dostarczania różnych leków i związków w eksperymentalnych modelach szczurzych, zwiększając wydajność i powtarzalność badań okulistycznych.

Wprowadzenie

Biodostępność związków podawanych miejscowo na powierzchnię oka jest znacznie ograniczona i zazwyczaj wynosi <5%¹. Związki podawane w formie kropel do oczu są głównie usuwane poprzez drenaż, indukowane łzawienie, wymianę płynu łzowego oraz wchłanianie przez spojówkę. Dodatkowo przenikanie związków przez powierzchnię oka jest silnie ograniczone przez barierę rogówka-spojówkowka^1,2,3. Rogówka składa się z trzech głównych warstw: zewnętrznego nabłonka, środkowej tkanki podrzędnej (stromy) oraz wewnętrznego śródbłonka. Powierzchniowy nabłonek rogówki jest połączony silnymi połączeniami ścisłymi, które tworzą wysoką oporność parakomórkową, stanowiącą główną barierę dla przepuszczalności substancji. Wiele warstw nabłonka dodatkowo ogranicza przenikanie cząsteczek hydrofilowych i dużych cząsteczek przez przestrzenie międzykomórkowe nabłonka rogówki. Po nabłonku następuje stroma, która składa się z włókien kolagenowych i zawiera pory wodne. W przeciwieństwie do nabłonka rogówki, stroma umożliwia przemieszczanie się leków hydrofilowych; jest jednak w dużym stopniu nieprzepuszczalna dla związków lipofilowych^1,2,3. Wspólnie nabłonek i warstwy stromy rogówki stanowią główne bariery tkankowe ograniczające wchłanianie leków. Śródbłonek rogówki nie jest uważany za czynnik ograniczający transport leków.

Alternatywą dla drogi podania przez rogówkę jest droga spojączówkowa. Spojąwka to wielowarstwowy nabłonek pokrywający wewnętrzną stronę powiek oraz przednią część twardówki. Spojąwka charakteryzuje się mniejszą liczbą połączeń szczelnych niż nabłonek rogówki, co pozwala na lepszą przepuszczalność leków hydrofilowych. Jednakże unaczynienie spojąwki prowadzi do systemowego wchłaniania znacznej frakcji podanych cząsteczek, co ponownie znacznie ogranicza biodostępność dostarczanych związków w komorze przedniej^1,2. Efektywnym sposobem na obejście zewnętrznych barier przepuszczalności oka jest podawanie leku bezpośrednio do obszaru zainteresowania. Na przykład wstrzyknięcia doszkieistne są powszechnie stosowane do dostarczania leków do ciała szklistego⁴. Podobnie, wstrzyknięcia do komory przedniej są wykorzystywane do dostarczania substancji do komory przedniej⁵. Osiągnięcie efektywnego stężenia w komorze przedniej ma krytyczne znaczenie w różnych sytuacjach klinicznych, takich jak leczenie infekcji poprzez wstrzyknięcia do komory przedniej antybiotyków czy pooperacyjne leczenie przeciwzapalne w chirurgii zaćmy. Pomimo zalety w postaci poprawionej biodostępności substancji zapewnianej przez wstrzyknięcia do komory przedniej, istnieją poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa, które należy wziąć pod uwagę. Na przykład wstrzyknięcie leku do komory przedniej może wywołać wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego, toksyczny zespół przedniego odcinka oka oraz toksyczny zespół zniszczenia komórek śródbłonka^5,6. Dlatego niezbędne jest dokładne ocenienie w badaniach przedklinicznych skuteczności i bezpieczeństwa leków dostarczanych poprzez wstrzyknięcia do komory przedniej, aby zmaksymalizować efektywność leczenia i zminimalizować potencjalne działania niepożądane u pacjentów.

Modele zwierzęce są niezastąpione w badaniach przedklinicznych służących do analizy nowych metod leczenia. Małe gryzonie, takie jak myszy i szczury, są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami laboratoryjnymi do tych celów. Zwierzęta te wykazują liczne podobieństwa do ludzkiej anatomii i fizjologii, dostarczając cennych informacji. Ponadto ich stosowanie jest korzystne ekonomicznie ze względu na niewielki rozmiar, łatwość utrzymania, krótki okres ciąży oraz zdolność do wydawania na świat licznego potomstwa⁷.

Mimo powszechnego wykorzystywania małych gryzoni w modelach chorób oczu, ich specyficzne wymiary oraz anatomia oka stanowią istotne wyzwanie podczas manipulacji eksperymentalnych. Na przykład procedury takie jak zastrzyki do komory przedniej, które u ludzi są stosunkowo proste, stają się technicznie wymagające u myszy i szczurów. Trudności te wynikają z czynników takich jak mała objętość cieczy wodnistej, stosunkowo duża i nieelastyczna soczewka oraz utrudniające dostęp położenie i krzywizna soczewki w oczach gryzoni (Rysunek 1)⁸. Wyzwania te zwiększają ryzyko uszkodzeń podczas wstrzykiwań do komory przedniej u gryzoni, co prowadzi do potencjalnych skutków niepożądanych i wprowadza zmienność eksperymentalną, która może wpłynąć na ważność wniosków z badania. W naszych badaniach z powodzeniem opracowaliśmy procedurę bezpiecznego wstrzykiwania do komory przedniej u szczurów. Technika ta polega na utworzeniu w rogówce długiego, płaskiego, samouszczelniającego się tunelu prowadzącego do komory przedniej. Metoda ta nie tylko zapewnia precyzję, ale także zwiększa powtarzalność eksperymentalną, rozwiązując problemy związane z technikami wstrzykiwania u małych gryzoni.

Rycina 1: Schematyczne przedstawienie cech anatomicznych przedniego odcinka oka szczura i człowieka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Doświadczenia opisane w protokole zostały zatwierdzone przez National Permit Committee - for animal science i są zgodne z deklaracją ARVO dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad okulistyką i wzrokiem. W niniejszym badaniu wykorzystano samice szczurów linii Sprague-Dawley w wieku 8-10 tygodni, które przebywały w cyklach światło-ciemność 12/12 h. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przygotować mieszankę anestetyczną ketaminy (80 mg/kg masy ciała w 0,8 mL) i ksylazyny (4 mg/kg masy ciała w 0,2 mL) i wstrzyknąć ją w jednej dawce doprzewnowo, aby poddać szczury znieczuleniu.
2. Wstrzyknąć przeciwbólową buprenorfinę (0,03 mg/kg) w jednej dawce doprzewnowo.
3. Zastosować miejscowe znieczulenie okulistyczne 0,4% oksybuprokainy do obu oczu.

2. Tworzenie samouszczelniającego się tunelu rogówkowego

1. Ustabilizuj oko, przytrzymując górną część twardówki w linii środkowej w pionie, obok połączenia rogówkowo-twardówkowego, za pomocą chirurgicznych pęset okulistycznych.
2. Pod mikroskopem chirurgicznym wprowadź sterylną igłę z ostrzem typu stiletto o rozmiarze 31 G i średnicy 0,8 mm w paracentralny obszar rogówki w linii środkowej w pionie (powyżej centrum źrenicy), w pozycji płaskiej, pod kątem jak najbliższym poziomowi (Rysunek 2).
3. W tej pozycji przebij rogówkę, aby wykonać nacięcie i utworzyć długi tunel (2-3 mm), aż do penetracji centralnego obszaru przedniej komory. Unikaj dotykania soczewki (Rysunek 2).
   UWAGA: Prawidłowo wykonany tunel nie spowoduje wycieku cieczy wodnistej ani spłycenia przedniej komory.
4. Zastosuj miejscowo 0,3% ofloxacin oraz 0,1% dexamethasone w oku poddanym iniekcji.
5. Przeprowadź badanie w lampie szczelinowej w następujący sposób:
   1. Oceń głębokość przedniej komory oka poddanego iniekcji w porównaniu do oka niepoddanego iniekcji.
      UWAGA: Głębokość powinna być zbliżona.
   2. Oceń stan soczewki w oku poddanym iniekcji w porównaniu do oka niepoddanego iniekcji.
      UWAGA: Soczewka powinna być przejrzysta. Przymglanie może świadczyć o uszkodzeniu soczewki podczas procedury chirurgicznej.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie kąta i położenia ostrza oraz nacięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Opcja 1: Wstrzykiwanie błękitu trypanowego do komory przedniej w celu oceny prawidłowości wstrzyknięcia do komory przedniej

1. Napełnić sterylną szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL z tępą igłą 34 G za pomocą 5 µL błękitu trypanu.
   UWAGA: Wstrzykiwanie błękitu trypanu opisano jako sposób oceny skuteczności iniekcji podczas etapów kalibracji lub przygotowania modelu. W warunkach eksperymentalnych strzykawkę można napełnić roztworem wybranego związku.
2. Wprowadzić igłę napełnionej strzykawki przez tunel utworzony w sekcji 2 do komory przedniej.
3. Wstrzyknąć ciecz i przytrzymać igłę w miejscu przez 2-3 s po iniekcji, aż cały płyn zostanie podany.
4. Wyjąć igłę, wycofując ją powoli i delikatnie, aby uniknąć wycieku z tunelu rogówkowego.
5. Zbadać oko za pomocą lampy szczelinowej. Ocenić głębokość komory przedniej, aby wykluczyć jej spłycenie, oraz potwierdzić obecność błękitu trypanu w komorze przedniej.
6. Powtórzyć badanie lampą szczelinową po 24 h, 48 h i 72 h.

4. Opcja 2: Wtryskiwanie Hoechst do komory przedniej w celu oceny biodostępności wstrzykniętego materiału dla warstwy komórek śródbłonka

1. Napiąć 5 µL Hoechst do sterylnej szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL z tępą igłą 34 G.
   UWAGA: Iniekcja Hoechst jest opisana jako sposób oceny biodostępności wstrzykniętego materiału poprzez jego pobieranie przez warstwę komórek śródbłonka i jest przydatna podczas etapów kalibracji lub konfiguracji modelu. W ustawieniach eksperymentalnych strzykawka może być napełniona roztworem wybranego związku.
2. Wprowadzić igłę napełnionej strzykawki przez tunel utworzony w sekcji 2 do przedniej komory oka.
3. Wstrzyknąć preparat i przytrzymać igłę w miejscu przez 2-3 sekundy po iniekcji, aż cały płyn zostanie podany.
4. Wyjąć igłę, wyciągając ją delikatnie i powoli, aby uniknąć wycieku z nacięcia tunelu rogówkowego.
5. Około 15-20 min po iniekcji uśmiercić szczury poprzez domięśniowy wtrysk 500 mg/kg pentobarbitalu sodowego.
6. Wyjąć oba gałki oczne i wyizolować rogówki. Pobrać rogówkę niepoddaną iniekcji jako kontrolę.
7. Zbarwić obie rogówki 0,5% Alizarin Red S zgodnie z instrukcjami producenta w celu zidentyfikowania komórek śródbłonka.
8. Zbadać pod mikroskopem świetlnym w celu obrazowania barwienia komórek śródbłonka alizaryną czerwoną oraz pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu obserwacji barwienia Hoechst, w porównaniu do kontrolnej rogówki niepoddanej iniekcji.

Wyniki

Szczury rasy Sprague Dawley otrzymały do przedniej komory wstrzyknięte 5 µL błękitu trypanowego zgodnie z powyższym protokołem. Badanie w lampie szczelinowej bezpośrednio po iniekcji wykazało zabarwienie komory błękitem trypanowym, co wskazuje, że wstrzyknięty materiał dotarł do przedniej komory (Rycina 3). Ponadto głębokość przedniej komory pozostała niezmieniona, co sugeruje, że iniekcja nie spowodowała wycieku cieczy wodistej ani spłycenia komory.

Dyskusja

Modele badań przedklinicznych powinny zapewniać kontrolowane i powtarzalne środowisko w celu zapewnienia wiarygodności i możliwości zastosowania wyników. W badaniach okulistycznych modele iniekcji do oczu są powszechnie stosowane w różnych aspektach badawczych, począwszy od tworzenia modeli chorób, testowania nowych metod leczenia oraz oceny reakcji tkanek i potencjalnych skutków ubocznych.

Iniekcje dokomorowe służą jako powszechna technika w okulistyce eksperymentalnej, ułatwiając bezpośredni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alizarin Czerwony	Alpha Aesar	042040.5
Buprenorfina	Richter pharma	102047
Deksametazon 0,1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Szklana strzykawka Hamilton 10 μ L	Hamilton Co.
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamina	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
Ofloksacyna 0,3% krople do oczu	Allergan	E92170
Chlorowodorek oksybuprokainy 0,4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
sodowy 200 mg/mL	CTS	N/A
Mikroskop szczelinowy	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
Ostrze szpilkowe 31 G 0,8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
Mikroskop chirurgiczny	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Ksylazyna	Eurovet Zdrowie zwierząt

721711 Pentobarbital 615648