Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66663

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Streszczenie

Gałka oczna gryzonia jest potężnym narzędziem do badania patomechanizmów wielu chorób okulistycznych, takich jak jaskra, retinopatia nadciśnieniowa i wiele innych. Eksperymenty przedkliniczne umożliwiają naukowcom zbadanie skuteczności nowych leków, opracowanie nowych metod leczenia lub poszukiwanie nowych patomechanizmów zaangażowanych w początek lub postęp choroby. Badanie histologiczne dostarcza wielu informacji niezbędnych do oceny efektów przeprowadzonych eksperymentów i może ujawnić zwyrodnienia, przebudowę tkanek, infiltrację i wiele innych patologii. W badaniach klinicznych rzadko kiedy istnieje szansa na uzyskanie tkanki oka nadającej się do badania histologicznego, dlatego badacze powinni skorzystać z możliwości, jaką daje badanie gałek ocznych od gryzoni. W pracy przedstawiono protokół przygotowania histologicznego przekrojów gałek ocznych gryzoni. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów i składa się z następujących etapów: (i) pobranie gałki ocznej, (ii) zachowanie gałki ocznej do dalszej analizy, (iii) przetwarzanie tkanki w parafinie, (iv) przygotowanie preparatów, (v) barwienie hematoksyliną i eozyną, (vi) ocena tkanki pod mikroskopem świetlnym. Dzięki proponowanej metodzie siatkówkę można łatwo zobrazować i szczegółowo ocenić.

Wprowadzenie

Gałka oczna to struktura przypominająca kulę, stanowiąca narząd wzroku. Wnętrze gałki ocznej można podzielić na dwa segmenty: odcinek przedni, który obejmuje rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, soczewkę, komorę przednią i komorę tylną oraz odcinek tylny, który obejmuje ciało szkliste, siatkówkę, naczyniówkę, twardówkę, głowę nerwu wzrokowego. Przednia komora znajduje się między rogówką a tęczówką1,2. Tęczówka jest okrągłą strukturą z otworem pośrodku zwanym źrenicą. Na styku rogówki i tęczówki znajduje się kąt drenażu, w którym wyspecjalizowany system beleczków odprowadza ciecz wodnistą z gałki ocznej do układu żylnego. Tylna komora jest ograniczona przez tęczówkę, ciało rzęskowe i soczewkę, a także więzadła wieszadłowe, które utrzymują soczewkę na miejscu. Za soczewką znajduje się ciało szkliste, które jest największą strukturą gałki ocznej. Ciało szkliste przylega do siatkówki i stabilizuje swoje położenie. Siatkówka jest otoczona przez naczyniówkę i twardówkę1. Anatomia gałki ocznej jest podsumowana w Rysunek 1.

Ściana gałki ocznej składa się z trzech warstw. Najbardziej zewnętrzną warstwą jest twardówka, która chroni gałkę oczną przed urazami i utrzymuje jej kształt. Na przednim biegunie gałki ocznej twardówka zamienia się w przezroczystą rogówkę. Pod twardówką znajduje się struktura naczyniowa zwana błoną naczyniową oka, której podstawową funkcją jest odżywianie struktur oka. Błona naczyniowa tworzy błonę naczyniówkową, a w obrębie bieguna przedniego ciało rzęskowe i tęczówka1. Najbardziej wewnętrzną warstwą jest siatkówka, która jest wysoce wyspecjalizowaną strukturą oka, składającą się z neuronów, komórek glejowych i komórek nabłonka barwnikowego. Neurony siatkówki obejmują komórki fotoreceptorowe (pręciki i czopki), komórki poziome, komórki dwubiegunowe, komórki amakrynowe i komórki zwojowe siatkówki (RGC). Komórki te są zorganizowane w złożone warstwy, a ich rolą jest odbieranie i przetwarzanie bodźców świetlnych2,3. Komórki glejowe siatkówki składają się z komórek Müllera, astrocytów i mikrogleju, które są obecne we wszystkich warstwach siatkówki. Wiele funkcji komórek glejowych obejmuje odżywianie neuronów, wspieranie bariery krew-siatkówka, strukturalne wsparcie neuronów w celu utrzymania warstwowej struktury siatkówki, regulację metabolizmu neuronów, wydzielanie biologicznie aktywnych białek regulujących funkcjonowanie, wzrost i przeżycie neuronów oraz regulację procesów immunologicznych w siatkówce4. Komórki nabłonka barwnikowego tworzą najbardziej zewnętrzną warstwę siatkówki i działają jako bariera między naczyniówką a fotoreceptorami. Komórki te regulują dwukierunkowy transport produktów przemiany materii i składników odżywczych, a także chronią siatkówkę przed nadmiernymi uszkodzeniami wywołanymi światłem poprzez pochłanianie energii świetlnej i neutralizację wytwarzanych przez światło reaktywnych form tlenu5.

Siatkówkę można podzielić na dziesięć warstw: (i) nabłonek barwnikowy siatkówki, (ii) warstwa segmentu fotoreceptora (pręciki i czopki), (iii) zewnętrzna błona ograniczająca (ELM), (iv) zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL), (v) zewnętrzna warstwa splotowata (OPL), (vi) wewnętrzna warstwa jądrowa (INL), (vii) wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), (viii) warstwa komórek zwojowych (GCL), (ix) warstwa włókien nerwowych siatkówki (RNFL), oraz (x) wewnętrzna membrana ograniczająca (ILM)2. Jądrzaste warstwy siatkówki obejmują ONL, INL i GCL, podczas gdy warstwy z połączeniami synaptycznymi między komórkami obejmują OPL i IPL6. Jądra pręcików i czopków tworzą ONL, a ich aksony rozciągają się do OPL, gdzie łączą się z dendrytami komórek dwubiegunowych i poziomych. W INL znajdują się poziome, dwubiegunowe i amakrynowe jądra komórkowe. W obrębie IPL zakończenia aksonów komórek dwubiegunowych i amakrynowych łączą się z dendrytami RGC. W obrębie GCL RGC stanowią większość ciał komórkowych, ale można tam również znaleźć niektóre zwichnięte komórki amakrynowe. Aksony RGC tworzą RNFL i dalej - nerw wzrokowy7,8,9.

Wiele chorób okulistycznych, takich jak neurodegeneracyjne zaburzenia siatkówki, prowadzi do nieodwracalnej i nieuleczalnej ślepoty10. Wzrok jest uważany za jeden z najważniejszych zmysłów11, a trwała ślepota znacznie obniża jakość życia pacjenta. Aby lepiej zrozumieć patomechanizmy wielu chorób, szeroko przeprowadza się badania przedkliniczne z wykorzystaniem kultur komórkowych lub modeli zwierzęcych. Badania przedkliniczne z wykorzystaniem zwierząt doświadczalnych dają możliwość oceny patomechanizmów leżących u podstaw chorób oczu oraz opracowania nowych strategii terapeutycznych. Choroby oczu można modelować zarówno u dużych zwierząt (małpy, krowy, psy i koty), jak i u małych zwierząt (króliki, szczury, myszy i danio pręgowane). Wykorzystanie większych zwierząt pozwala na lepszy dostęp do oka ze względu na jego wielkość. Z kolei eksperymenty przeprowadzone na gryzoniach, ze względu na ich stosunkowo szybki rozród, pozwalają na hodowlę szczepów wsobnych charakteryzujących się podatnością na niektóre choroby12,13.

W modelach zwierzęcych możliwe jest wyłuszczenie, które umożliwia przeprowadzenie szczegółowego badania histopatologicznego gałki ocznej, z oceną drobnych patologii, które pojawiają się w poszczególnych strukturach oka podczas rozwoju choroby - badanie, które może być bardzo rzadko wykonywane u ludzi. Ocena histopatologiczna jest niezwykle cennym narzędziem podczas badania patomechanizmów zaburzeń narządu wzroku. W opublikowanym piśmiennictwie opisy metodyki badania histologicznego gałek ocznych są bardzo ograniczone, brakuje też przewodników krok po kroku, co utrudnia odtworzenie go przez osoby początkujące. Badanie to ma na celu przedstawienie prostej i zwięzłej metody przygotowania preparatów histologicznych i oceny siatkówki szczura i myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji. Gałki oczne wykorzystane w tym badaniu uzyskano od zwierząt włączonych do eksperymentu przeprowadzonego na podstawie zatwierdzenia badania o numerze WAW2/122/2020 wydanego przezII Lokalną Komisję Etyczną Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Nasz protokół został opracowany na podstawie badań myszy w wieku od 11 do 44 tygodni oraz szczurów w wieku 6, 12 i 16 tygodni.

1. Przygotowanie gałek ocznych myszy

UWAGA: Ten protokół przedstawia metodę przygotowania fragmentów gałek ocznych myszy i został opracowany przy użyciu gałek ocznych pobranych od: samic myszy C57Bl/6 w wieku 11 tygodni (średnia waga 21 g), samic myszy C57Bl/6 w wieku 44 tygodni (średnia waga 25 g), samic DBA/2 myszy w wieku 11 tygodni (średnia waga 21,5 g), oraz samice myszy DBA/2 w wieku 44 tygodni z jaskrą (średnia waga 25 g).

  1. Wyłuszczenie
    1. Użyj małych kleszczy, aby otworzyć powieki. Dociśnij powieki, aby gałka oczna wypadła.
    2. Wypreparuj gałkę oczną z oczodołu, odcinając tkankę za gałką oczną małymi, ostrymi nożyczkami. Po usunięciu gałki ocznej z oczodołu odetnij wystającą tkankę łączną i mięśnie okołogałkowe.
      1. Zaznacz gałki oczne dla lepszej orientacji, na przykład zawiązując mały szew na kikutu ścięgna mięśnia prostego bocznego gałki ocznej, aby zaznaczyć skroniową stronę gałki ocznej.
  2. Utrwalanie tkanek
    1. Umieścić wyłuszczoną gałkę oczną w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i pozostawić na 24 godziny w 4 % roztworze paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS).
    2. Następnie leczyć gałkę oczną przez 24 godziny w 10% roztworze sacharozy, następnie usunąć i umieścić na 24 godziny w 20% roztworze sacharozy, a na koniec usunąć i umieścić na 24 godziny w 30% roztworze sacharozy.
      UWAGA: Przez cały czas trwania procesu utrzymuj gałkę oczną w niskiej temperaturze 4 °C. Należy unikać nakłuć igłą w celu infiltracji sacharozy, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia gałki ocznej.
  3. Zamrażanie i przechowywanie tkanek
    1. Wyjmij gałkę oczną z roztworu sacharozy i osusz ją, delikatnie przecierając ją ręcznikiem papierowym.
    2. Umieścić gałkę oczną w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania.
      UWAGA: W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C gałka oczna może zachować żywotność do 12 miesięcy do czasu późniejszego przetwarzania.
  4. Przygotowanie preparatów
    1. Rozmrozić gałkę oczną w temperaturze pokojowej. Przenieś go z probówki mikrowirówki do kasety i płucz pod bieżącą wodą przez 20 minut, aby wypłukać sacharozy.
    2. Odwodnić gałkę oczną, umieszczając ją w następujących roztworach pod wyciągiem, a następnie wyjmując je z następujących roztworów: 70% roztwór alkoholu etylowego (EtOH) przez 10 min, 80% roztwór EtOH przez 10 min, 96% roztwór EtOH przez 10 min, 99,9% roztwór EtOH przez 10 min i aceton przez 5 min.
    3. Oczyść gałkę oczną, umieszczając ją w ksylenie na 5 minut pod wyciągiem.
    4. Stopić parafinę, umieszczając trochę stałej parafiny w zlewce i umieszczając ją w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na temperaturę wyższą niż temperatura topnienia określona przez producenta parafiny (temperatura topnienia parafiny wynosi od 46 °C do 68 °C). Po całkowitym stopieniu parafiny (czas zależy od ilości użytej parafiny) przenieś gałkę oczną do zlewki z parafiną i trzymaj w cieple w inkubatorze przez 1 godzinę. W ciągu 1 godziny infiltracji parafiny do tkanki należy mieszać parafinę co 10 - 15 min.
      UWAGA: Na tym etapie można użyć procesora tkankowego, który umożliwia infiltrację parafiny podczas mieszania roztworu.
    5. Osadź gałkę oczną w bloku parafiny, jak opisano poniżej.
      1. Otwórz kasetę i zdejmij górną pokrywę. Wybierz metalową formę i wlej niewielką ilość parafiny, aby pokryć spód formy. Wyjmij gałkę oczną z kasety za pomocą kleszczyków i umieść ją na parafinie w formie. Umieść gałkę oczną na boku, aby zapewnić cięcie w płaszczyźnie strzałkowej.
        UWAGA: Ułożenie gałki ocznej na boku (z przednim biegunem po jednej stronie i tylnym biegunem po drugiej) umożliwi cięcie w płaszczyźnie strzałkowej. W ten sposób uzyskane zostaną przekroje przez rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, źrenicę, siatkówkę obwodową i centralną.
      2. Krótko schłodzić formę na płycie chłodzącej ustawionej na -15 °C, aby parafina lekko zastygła i zakotwiczyła tkankę na miejscu. Ostrożnie przykryj tkankę parafiną, a dno kasety uformować blok. Umieść blok na płycie chłodzącej, aby całkowicie zastygł. Następnie wyjmij blok z metalowej formy i umieść bloki parafiny z powrotem na płycie chłodzącej na co najmniej 15 minut, aby ostygły przed cięciem.
    6. Zabezpiecz blok parafiny w mikrotomie. Ustaw mikrotom tak, aby odciął nadmiar parafiny z bloku (ustawiamy go na cięcie 15 μm) i przycinaj aż do środka gałki ocznej. Zmień ustawienia mikrotomu, aby przyciąć cieńsze sekcje (ustawiamy go na cięcie 3,5 μm) i umieść sekcję na szkiełku. W przypadku korzystania z mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną należy usunąć nadmiar wody ze szkiełka za pomocą wilgotnej chusteczki.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie co najmniej 3 przekrojów przez źrenicę. Im mniej doświadczony badacz, tym więcej sekcji powinien uzyskać, aby zapewnić podział na sekcje na poziomie ucznia. Umieść kilka sekcji na jednym slajdzie. Również dla mniej doświadczonych badaczy należy pociąć tkankę grubszą, na przykład na odcinki o grubości 4 μm lub 5 μm. Zastosowanie mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną sprawia, że proces przenoszenia skrawków tkanek na szkiełka jest znacznie łatwiejszy w porównaniu do stosowania mikrotomów bez kąpieli wodnych. Kolejną kwestią, na którą warto zwrócić uwagę, jest to, że obiektyw może być trudny do przecięcia. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanek przez kruchą soczewkę, należy używać wyłącznie ostrych ostrzy mikrotomów przeznaczonych do przecinania twardych tkanek. Rozważ użycie jednego ostrza do przycinania, a drugiego do cięcia sekcji, aby zminimalizować stępienie ostrza.
    7. Umieścić szkiełko w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na 56 °C na 30 minut.
    8. Wyjąć szkiełko z inkubatora i rozpocząć barwienie go hematoksyliną i eozyną (H&E) ręcznie, kolejno wkładając i wyjmując szkiełko do i z następujących roztworów. Zacznij od 7 min ksylenu, 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem) i 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem). Następnie należy dodać 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem).
    9. Umyć w 5 min bieżącą wodą, następnie 2 min hematoksyliną Mayera, 2 min hematoksyliną Mayera (kolejna zlewka z czystym roztworem), 5 min bieżącą wodą, 5 min bieżącą wodą (kolejna, czysta zlewka).
    10. Dodać 1% eozyny przez 2 minuty, a następnie 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen, 1 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem).
      UWAGA: Alternatywnie użyj automatycznego barwienia szkiełek.
    11. Uszczelnij szkiełko za pomocą automatycznej zgrzewarki do suwaków. Tak przygotowany preparat jest gotowy do przechowywania i oceny pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: Alternatywnie, należy wykonać uszczelnienie szkiełkowe ręcznie, nakładając cienką warstwę styropianu na poplamioną tkankę i przykrywając ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Czynności obejmujące PFA, EtOH, aceton i ksylen należy wykonywać pod laboratoryjnym wyciągiem wyciągowym.

2. Przygotowanie sekcji gałek ocznych szczura i montażu zjeżdżalni

UWAGA: Ten protokół przedstawia metodę przygotowania skrawków gałek ocznych szczurów i został opracowany przy użyciu gałek ocznych pobranych od: samców szczurów SHR w wieku 6 tygodni (średnia waga 115,5 g), samców szczurów SHR w wieku 12 tygodni z nadciśnieniem tętniczym (średnia waga 262,5 g), samców szczurów WKY w wieku 6 tygodni (średnia waga 143,5 g), samce szczurów WKY w wieku 12 tygodni (średnia waga 265 g), samce szczurów Lewisa w wieku 12 tygodni (średnia waga 310 g) i samce szczurów Lewis w wieku 16 tygodni z indukowaną cukrzycą (średnia waga 259 g).

  1. Wyłuszczenie
    1. Użyj małych kleszczy, aby otworzyć powieki. Naciśnij powieki, aby odsłonić gałkę oczną.
    2. Wypreparuj gałkę oczną z oczodołu, odcinając tkankę za gałką oczną małymi, ostrymi nożyczkami.
      UWAGA: Zaznacz gałki oczne dla lepszej orientacji, na przykład zawiązując mały szew na kikutu ścięgna mięśnia prostego bocznego gałki ocznej, aby zaznaczyć skroniową stronę gałki ocznej.
  2. Utrwalanie tkanek
    1. Umieścić wyłuszczoną gałkę oczną w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostawić na 24 godziny w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS).
    2. Następnie należy traktować gałkę oczną przez 24 godziny w 10% roztworze sacharozy, następnie wyjąć i umieścić na 24 godziny w 20% roztworze sacharozy, a na koniec usunąć i umieścić na 24 godziny w 30% roztworze sacharozy.
      UWAGA: Przez cały czas trwania procesu utrzymuj gałkę oczną w niskiej temperaturze 4 °C. Należy unikać nakłuć igłą w celu infiltracji sacharozy, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia gałki ocznej.
  3. Zamrażanie i przechowywanie tkanek
    1. Wyjmij gałkę oczną z roztworu sacharozy i osusz ją, delikatnie przecierając ją ręcznikiem papierowym.
    2. Umieścić gałkę oczną w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zamrozić ją w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania.
      UWAGA: W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C gałka oczna może pozostać żywa przez okres do 12 miesięcy, aż do przyszłego przetwarzania.
  4. Przygotowanie preparatów
    1. Wyjmij gałkę oczną z zamrażarki i z probówki mikrowirówkowej. Przetnij gałkę oczną na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej ostrym skalpelem. Wyjmij i wyrzuć obiektyw.
      UWAGA: Ten krok najłatwiej wykonać na zamrożonej gałce ocznej, świeżo wyjętej z zamrażarki. Podczas przecinania gałki ocznej soczewka może uszkodzić otaczającą tkankę. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia, używaj bardzo ostrego skalpela i zachowaj ostrożność.
    2. Rozmrozić gałkę oczną w temperaturze pokojowej. Przenieś dwie połówki do kasety i płucz pod bieżącą wodą przez 20 minut, aby wypłukać sacharozy.
    3. Odwodnić gałkę oczną, umieszczając ją w następujących roztworach pod wyciągiem, a następnie wyjmując z nich: 70% roztwór alkoholu etylowego (EtOH) przez 15 min, 80% roztwór EtOH przez 15 min, 96% roztwór EtOH przez 15 min, 99,9% roztwór EtOH przez 15 min i aceton przez 7 min.
    4. Oczyść gałkę oczną, umieszczając ją w ksylenie na 7 minut pod wyciągiem.
    5. Stopić parafinę, umieszczając trochę stałej parafiny w zlewce i umieszczając ją w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na temperaturę wyższą niż temperatura topnienia określona przez producenta parafiny (temperatura topnienia parafiny wynosi od 46 °C do 68 °C). Po całkowitym stopieniu parafiny (czas zależy od ilości użytej parafiny) przenieś gałkę oczną do zlewki z parafiną i trzymaj w cieple w inkubatorze przez 1 godzinę. W ciągu 1 godziny infiltracji parafiny do tkanki należy mieszać parafinę co 10 - 15 min.
      UWAGA: Na tym etapie można użyć procesora tkankowego, który umożliwia infiltrację parafiny podczas mieszania roztworu.
    6. Osadź gałkę oczną w bloku parafiny, jak opisano poniżej.
      1. Otwórz kasetę i zdejmij górną pokrywę. Wybierz metalową formę i wlej niewielką ilość parafiny, aby pokryć spód formy. Wyjmij gałkę oczną z kasety za pomocą kleszczyków i umieść ją na parafinie w formie. Umieść jedną połowę gałki ocznej dnem kubka do góry, a drugą - w dół.
        UWAGA: Ułożenie połówek gałki ocznej z jedną połową dnem miseczki do góry, a drugą - do dołu, umożliwi przecięcie tkanki w płaszczyźnie strzałkowej. W ten sposób uzyskane zostaną przekroje przez rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, źrenicę, siatkówkę obwodową i centralną.
      2. Krótko schłodzić formę na płycie chłodzącej ustawionej na -15 °C, aby parafina lekko zastygła i zakotwiczyła gałkę oczną na miejscu. Ostrożnie przykryj gałkę oczną parafiną i dno kasety, aby utworzyć blok. Umieść blok na płycie chłodzącej, aby całkowicie zastygł. Następnie wyjmij blok z metalowej formy i umieść bloki parafiny z powrotem na płycie chłodzącej na co najmniej 15 minut, aby ostygły przed cięciem.
    7. Zabezpiecz blok parafiny w mikrotomie. Ustaw mikrotom tak, aby odciął nadmiar parafiny z bloku (ustawiamy go na cięcie 15 μm) i przycinaj, aż dotrzesz do środka gałki ocznej. Zmień ustawienia mikrotomu, aby przyciąć cieńsze sekcje (ustawiamy go na cięcie 3,5 μm) i umieść sekcję na szkiełku. Jeśli używasz mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną, usuń nadmiar wody ze szkiełka wilgotną chusteczką.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie co najmniej 3 przekrojów przez źrenicę. Im mniej doświadczony badacz, tym więcej sekcji powinien uzyskać, aby zapewnić podział na sekcje na poziomie ucznia. Umieść kilka sekcji na jednym slajdzie. Również dla mniej doświadczonych badaczy należy pociąć tkankę grubszą, na przykład na odcinki o grubości 4 μm lub 5 μm. Zastosowanie mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną sprawia, że proces przenoszenia skrawków tkanek na szkiełka jest znacznie łatwiejszy w porównaniu do stosowania mikrotomów bez kąpieli wodnych.
    8. Zdjąć szkiełko i rozpocząć barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) ręcznie, kolejno wkładając i wyjmując szkiełko do i z następujących roztworów. Zacznij od 7 min ksylenu, 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem) i 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem). Następnie należy dodać 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem).
    9. Umyć w 5 min bieżącą wodą, następnie 2 min hematoksyliną Mayera, 2 min hematoksyliną Mayera (kolejna zlewka z czystym roztworem), 5 min bieżącą wodą, 5 min bieżącą wodą (kolejna, czysta zlewka).
    10. Dodać 1% eozyny przez 2 minuty, a następnie 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen, 1 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem).
      UWAGA: Alternatywnie użyj automatycznego barwienia szkiełek.
    11. Uszczelnij szkiełko za pomocą automatycznej zgrzewarki do suwaków. Przygotowane preparaty są gotowe do przechowywania i oceny pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: Alternatywnie, należy wykonać uszczelnienie szkiełkowe ręcznie, nakładając cienką warstwę polistyrenowego środka mocującego na poplamioną tkankę i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Czynności obejmujące PFA, EtOH, aceton i ksylen należy wykonywać pod laboratoryjnym wyciągiem wyciągowym.

3. Ocena przekrojów gałki ocznej

  1. Skanowanie slajdów
    1. Włóż szkiełko do skanera preparatów histopatologicznych i zeskanuj skrawki w trybie skanowania: 40x. Zapisz obrazy jako pliki cyfrowe o wysokiej rozdzielczości.
  2. Analiza slajdów
    1. Otwórz zeskanowany plik za pomocą oprogramowania do przeglądania obrazów. Znajdź przekroje poprzeczne źrenic i przeanalizuj trzy kolejne sekcje.
    2. Znajdź najgrubszą część siatkówki i powiększ obraz do 20x, naciskając pole powiększenia w prawym górnym rogu i wybierając 20x. Przesuń mysz na poziom wiązu w najgrubszej części siatkówki i naciśnij prawy przycisk myszy, wybierz Adnotacja i Linijka.
    3. Przesuń wskaźnik myszy w stronę programu ILM i kliknij przycisk po lewej stronie. Nazwij pomiar RT i zaznacz pola pokaż tytuł i pokaż długość. W ten sposób zostanie zmierzona grubość siatkówki (RT), a pomiar zostanie pokazany w μm. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2 i Rysunek 3.
    4. Użyj linijki, zmierz grubość każdej warstwy siatkówki, w tym ONL, OPL, INL i IPL, i oznacz je. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4 i Rysunek 5.
    5. Aby policzyć liczbę komórek w GCL, ustal z góry określoną długość siatkówki. Na przykład w przypadku siatkówki myszy użyj jednego odcinka 500 μm, a w przypadku siatkówki szczura użyj pięciu odcinków 100 μm.
    6. Za pomocą linijki zmierz wybraną odległość wzdłuż GCL. Naciśnij prawy przycisk myszy i wybierz Adnotuj > Zapisane > 1x RBC. Kliknij każdą komórkę zidentyfikowaną jako okrągłe, barwione hematoksyliną ciało wzdłuż GCL na określonej długości siatkówki. Policz liczbę zakreślonych komórek. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 6 i Rysunek 7.
    7. Po przeanalizowaniu trzech kolejnych sekcji narysuj średnią ze wszystkich pomiarów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki zastosowaniu przedstawionego protokołu można szczegółowo ocenić anatomię i morfologię konkretnych struktur gałki ocznej. Nasz zespół koncentruje się na badaniu patomechanizmów neurodegeneracji w schorzeniach siatkówki, takich jak jaskra, retinopatia cukrzycowa i retinopatia nadciśnieniowa. Aby ocenić cechy neurodegeneracji siatkówki, przeanalizowano RT (gałka oczna myszy -Rycina 2, gałka oczna szczura -Rycina 3), ONL, OPL, INL i IPL (gałka oczna myszy -

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie histologiczne gałki ocznej myszy i szczura jest potężnym narzędziem w dziedzinie okulistyki eksperymentalnej. Może dostarczyć nowych informacji związanych ze zmianami w strukturach oka w przebiegu chorób okulistycznych, które w przeciwnym razie nie zostałyby zaobserwowane w warunkach klinicznych. Opisane protokoły przedstawiają prostą metodę przeprowadzenia analizy histologicznej siatkówki. Subtelności procedury potrzebnej do przetworzenia tkanek przednich, takich jak rogówka, nie są tutaj opisane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca, w tym szczury, została sfinansowana w ramach projektu CZAS 2 WUM - doskonałość dydaktyczna szansą na rozwój Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego współfinansowanego przez Europejski Fundusz Społeczny w ramach Programu Operacyjnego Wiedza Edukacja Rozwój na lata 2014-2020, numer umowy o dofinansowanie: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Prace, w tym na myszach, zostały przeprowadzone w ramach projektu realizowanego w latach 2020-2022, finansowanego z dotacji na naukę uzyskanej przez Warszawski Uniwersytet Medyczny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton Chempur 
Dumont Pęseta #5, 11cm, 0,05 x 0,01mm KońcówkiWorld Precision Instruments14095małe kleszczyki mikrochirurgiczne
EosinMar-Four4P.05.2001/LRoztwór wodny
Alkohol etylowy 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA. CH
Alkohol etylowy 99,9 %Chempur Ch. ETYL. ALK.99,9%BWSłuży do przygotowania 70% i 80% roztworów EtOH
Glacier - 86 ° C Zamrażarka ultraniskotemperaturowa NU-9483ENuAire13027D0034Temperatura zamarzania - 80 & stopnie; C
Szkiełka szklaneMar-FourMI.15.01673Szlifowane szkiełka szkiełowe z dwustronnym matowym polem do opisu
Leica CV5030 W pełni zautomatyzowane szkiełko nakrywkoweLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automatyczna zgrzewarka do szkiełek 
Hematoksylina MayeraChempur 
Formy z metalową podstawą 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
MicrotomeMar-FourHI. N.35Kąt cięcia 35°
Kaseta do biopsji Micro-TwinMar-FourLN.13874550
Mikrofalowy hybrydowy procesor tkanekMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automatyczna wiatarka do szkiełek 
Skaner slajdów NanoZoomer 2.0-HTHamamatsuC9600Skaner szkiełek histopatologicznych
NDP.view2 Oprogramowanie do przeglądania obrazówHamamatsuU12388-01Oprogramowanie do przeglądania obrazów
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Temperatura topnienia 56 ° C - 58 & C
ParaformaldehydSigma - Aldrich441244-1KGPrzygotuj 4% roztwór w tabletkach PBS
PBSMerck Millipore524650-1EASłuży do przygotowania roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, zgodnie z instrukcjami producenta
Probówki do mikrowirówek Pierce, 1,5 mlThermo Scientific69715
Chłodziarko-zamrażarka EN14000AWElectrolux925032562-00Chłodzenie 4 & stopnie; C
Ostrze skalpelaSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SacharozaChempur 
427720906 Nożyczki sprężynowe SuperCut, 12,5 cm, zakrzywioneWorld Precision Instruments501925zakrzywione, małe nożyczki mikrochirurgiczne
Taśma do automatycznych zgrzewarekMar-FourKP-3020/SMRH001
KsylenChempur Ch. KSYL.5l.METAL.OP 
1110248001246874023803081 Żyletki

Bibliografia

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957(2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394(2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408(2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena siatkówkigałka oczna gryzonigrubość siatkówkibarwienie hematoksyliną i eozynązatapianie w parafiniecięcie mikrotomemwarstwa komórek zwojowychmodele chorób okulistycznychmikroskopia świetlna
Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.