Protokół demonstruje metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żył wrotnych i żyły głównej dolnej od myszy w celu oceny produkcji i absorpcji metabolitów mikrobiologicznych jelit.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Produkty mikrobiologiczne jelit są znane z tego, że działają zarówno lokalnie w jelicie, jak i są wchłaniane do krążenia, gdzie ich działanie może rozciągać się na wiele odległych układów narządów. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) to jedna z klas metabolitów wytwarzanych przez drobnoustroje jelitowe podczas fermentacji niestrawnego błonnika pokarmowego. Obecnie uznaje się, że są one ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do tego, jak mikrobiom jelitowy wpływa na układy narządów pozajelitowych poprzez oś jelito-płuca, jelita-mózg i inne osie jelita-narządy w całym organizmie gospodarza. SCFA są wchłaniane z jelita grubego, przez tkankę jelitową, do żyły wrotnej (PV). Następnie przechodzą przez wątrobę i są zużywane w różnych narządach, takich jak mózg, mięśnie, tkanka tłuszczowa i płuca. SCFA najłatwiej jest zmierzyć w wydalanym materiale kałowym, jednak dokładniejsze pomiary uzyskano z zawartości kału wewnątrz okrężnicy. W tym miejscu proponujemy, że pobieranie próbek PV i krążącego ogólnoustrojowo osocza jednego pacjenta może być preferowane do badania absorpcji, transportu i ogólnoustrojowych poziomów SCFA u myszy. Przedstawiamy nową technikę efektywnego pobierania krwi z PV i żyły głównej dolnej (IVC), która pozwala na pobranie stosunkowo dużych ilości krwi z krążenia wrotnego i ogólnoustrojowego. Osiąga się to poprzez podwiązanie PV, co pozwala na rozszerzenie lub powiększenie PV, gdy zasypuje się z żył krezkowych, które do niego spływają. Stosując tę metodę, udało nam się poprawić wskaźnik udanego pobrania, a także całkowitą ilość pobranej krwi (do 0,3 ml z IVC i 0,5 ml z PV).
Wprowadzenie
Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) to główna klasa metabolitów wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową. Ich kluczowa rola w interakcji między mikrobiomem jelitowym a innymi odległymi narządami1 została poparta badaniami opisującymi, w jaki sposób modulują stan zapalny, sygnalizują przez dedykowane receptory i służą jako substraty w metabolizmie komórkowym2,3,4,5. Ostatnie prace naszej grupy sugerują, że SCFA są kluczowymi in vivo regulatorami stanu zapalnego tonu immunologicznego płuc in vivo poprzez oś jelito-płuca6,7. Dodatkowe raporty opisywały ich funkcjonalny wpływ na metabolizm za pośrednictwem osi jelitowo-mózgowej8,9. Ogólnie rzecz biorąc, wpływ SCFA na fizjologię i patologię gospodarza jest aktywnie i intensywnie badany przez liczne grupy badawcze zajmujące się szerokim zakresem procesów chorobowych.
Octan (C2), propionian (C3) i maślan (C4) są głównymi SCFA i są generowane przez mikrobiotę jelitową poprzez fermentację błonnika pokarmowego w jelicie ślepym i jelicie grubym. Wszystkie trzy SCFA mogą być również otrzymywane bezpośrednio z diety, a tylko octan może być również wytwarzany przez komórki ssaków. SCFA są wchłaniane w okrężnicy i są częściowo wykorzystywane przez komórki nabłonka jelitowego (jako źródło energii, do miejscowej modulacji immunologicznej tkanek i do wspierania utrzymania bariery jelitowej). Są one również transportowane do żyły wrotnej przez układ żylny krezki10. Maślan jest spożywany głównie przez nabłonek jelitowy, propionian przez wątrobę11,12, a octan działa na tkanki mięśniowe i tłuszczowe po wejściu do krążenia obwodowego13,14.
Kompleksowa ocena produkcji, absorpcji i aktywności funkcjonalnej SCFA wymaga wiedzy na temat poziomów SCFA w świetle okrężnicy, w krążeniu wrotnym i krwi obwodowej. Można to osiągnąć poprzez pobranie krwi z żyły wrotnej (PV) i krążenie ogólnoustrojowe jednocześnie lub sekwencyjnie u tego samego zwierzęcia. Ponieważ SCFA są niestabilne15, pomiar ich poziomu w wydalonych granulkach kału może nie odzwierciedlać dokładnie poziomów w okrężnicy. Ponadto, w porównaniu z pomiarami zawartości okrężnicy, poziom SCFA obecnych w PV może dokładniej odzwierciedlać sumę netto poziomów w stanie stacjonarnym wchłoniętych przez gospodarza w porównaniu z nierównymi poziomami wytwarzanymi przez mikrobiom jelitowy na całej długości okrężnicy11. Te poziomy PV SCFA mogą być zatem bardziej istotne i odpowiednie do badania wpływu SCFA na fizjologię i patologię gospodarza poza lokalnymi skutkami w jelicie.
Aby przeprowadzić skoordynowane i prawie równoczesne pobieranie PV i krwi krążącej ogólnoustrojowo, przepona powinna pozostać nienaruszona, aby utrzymać prawidłowe krążenie krwi i wspierać spontaniczne oddychanie. Dlatego żyła główna dolna (IVC) stanowi idealne miejsce do uzyskania krwi z krążenia ogólnoustrojowego podczas pobierania krwi PV. Ta krew IVC może być również wykorzystywana do innych celów, takich jak pomiar krążących cytokin w celu oceny ogólnoustrojowego stanu zapalnego.
Obecnie, tylko kilka metod pobierania krwi zarówno z krążenia ogólnoustrojowego, jak i PV zostało zgłoszonych u większych gryzoni16,17. Konwencjonalne metody, które wymagają kaniulacji naczyń krwionośnych u szczurów, są technicznie trudne do wykonania u myszy. Ponadto maksymalna ilość krwi pobrana tymi metodami wynosi zwykle nie więcej niż 0,3 ml18.
W tym artykule prezentujemy nowatorską metodę, która upraszcza proces podwójnego pobierania krwi od mysiego IVC, a następnie PV u tego samego zwierzęcia. Unikalną cechą metody jest podwiązanie PV w pobliżu wnęki wątroby tuż przed pobraniem próbki krwi PV. Takie podejście może rozszerzyć wymiary PV, co znacznie poprawia wskaźnik sukcesu, a także zwiększa maksymalną objętość krwi do zebrania do 0,5 ml.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie kroki w tej procedurze nieprzetrwania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Użyto płci i szczepu myszy płci męskiej C57BL/6J (o wadze 25-35 g i w wieku 12-15 tygodni). Można również stosować żeńskie i/lub inne standardowe szczepy myszy.
1. Znieczulenie
- Wytrzyj dolną połowę brzucha myszy wacikami z 70% etanolu. Podać znieczulenie, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie tribromoetanolu (250-400 mg / kg). Można również zastosować znieczulenie ketaminą/ksylazyną lub izofluranem. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
- Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) dootrzewnowo w celu znieczulenia.
UWAGA: Buprenorfina jest wymagana ze względu na ból związany z zabiegiem laparotomii.
2. Laparotomia
- Umieść znieczuloną mysz na powierzchni operacyjnej (z poduszką grzewczą pod spodem) w pozycji leżącej. Przymocuj wszystkie kończyny myszy na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy. Upewnij się, że odpowiednia głębokość znieczulenia została osiągnięta przez uszczypnięcie palca u nogi bez odruchu wycofania pedału.
- Podnieś skórę i wykonaj podłużne nacięcie nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż linii środkowej od pępka do wyrostka mieczykowatego i doogonowo w kierunku podstawy brzucha (zewnętrznego narządu płciowego).
- Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej nożyczkami preparacyjnymi bez perforacji lub uszkodzenia jelit, przepony lub wątroby.
- Rozszerz pole operacyjne, wykonując nacięcie poprzeczne na całej długości (wydłużające szerokość brzucha) nożyczkami po obu stronach pępka.
- Przesuń jelito grube i cienkie na prawą stronę chirurga za pomocą czystej gazy nasączonej ciepłym PBS, aby odsłonić IVC poniżej.
3. Przygotowanie ligatury do PV
- Delikatnie manipuluj segmentami jelita w polu operacyjnym za pomocą bawełnianego wacika, aby zlokalizować PV u nasady krezki.
- Używając mikroskopu preparacyjnego do wizualizacji naczyń i innych struktur jamy brzusznej, ostrożnie przełóż szew prolenowy 7-0 za PV w pobliżu wnęki wątroby (między żyłą dwunastnicy a żyłą śledzionową)19, aby był gotowy do podwiązania w kroku 5 (Rysunek 1).
UWAGA: Korzystanie z mikroskopu od tego etapu nie jest obowiązkowe, ale znacznie poprawia ogólny wskaźnik powodzenia zabiegu.
4. Pobieranie próbek krwi z IVC
- Włóż igłę 28G 1/2 cala hemarynizowanej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml do IVC. Zbierz 0,2-0,3 ml próbki krwi.
UWAGA: Jeśli na tym etapie zostanie usunięta zbyt duża ilość krwi, spowoduje to zmniejszenie objętości krwi PV pobranej w kroku 5. - Pozostawić igłę wewnątrz IVC, aby uniknąć krwawienia, które wystąpiłoby po usunięciu.
5. Pobieranie próbek krwi z PV
- Delikatnie zawiąż ligaturę prolenu 7-0 wokół PV; PV powinno rozszerzać się i rozszerzać podczas zasypywania. Włóż igłę 28G 1/2 cala innej heparynizowanej strzykawki insulinowej o pojemności 1 cm3 do PV.
- Odsysaj powoli, aby zebrać do 0,3-0,5 ml krwi z PV. PV może się zapadnąć, ale powinno stopniowo ponownie się rozszerzać wraz z uzupełnianiem krwi z układu żylnego krezki.
6. Przechowywanie próbek
- Usuń igły z IVC i PV po pobraniu krwi.
- Przenieść próbki krwi ze strzykawek do 1,5 ml heparynizowanych probówek eppendorfa i umieścić je na lodzie w celu późniejszego przetworzenia na osocze w celu przechowywania i analizy w razie potrzeby.
- Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego, a następnie zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez UCSF IACUC).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisaną powyżej metodę, możemy sekwencyjnie pobierać próbki krwi z IVC oraz PV od tej samej myszy ze skutecznością przekraczającą 95%. Średnie objętości pobranych próbek krwi wynoszą 0.25 mL dla IVC i 0.35 mL dla PV.
Wykorzystując chromatografię gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GC-MS), zmierzyliśmy stężenie SCFA w kałach, krwi z żyły wrotnej (PV) oraz krwi z żyły głównej dolnej (IVC), co pozwoliło nam prześledzić wchłanianie i transport octanu (C2), propionianu (C3) i maślanu (C4...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano innowacyjną metodę in vivo polegającą na niemal równoczesnym sekwencyjnym pobieraniu próbek krwi z IVC i PV u tej samej myszy doświadczalnej. Metoda ta jest przydatna do pomiaru poziomów produktów wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową, takich jak SCFA, które przechodzą przez krążenie wrotne. Średnia maksymalna objętość krwi, którą można pobrać podczas procedury terminalnej u myszy (o masie 25-30 g) wynosi około 1 ml / mysz, co z kolei stanowi 50% całkowitej objętości krwi krążącej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
AP jest finansowany z nagrody R01 od NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM jest finansowany przez stypendium T32 z NIH oraz przez Trainee/Staff Pilot Awards z UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 Tribromoetanol, 97% (Avertin) | Sigma Aldrich | T48402-25G | Środek znieczulający |
| Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwań 0,3 mg/ml | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Środek przeciwbólowy |
| Kleszcze opatrunkowe | Miltex | 6-100 | Rozwarstwienie |
| Kleszcze Graefe | Roboz | RS-5136 | Sekcja zwłok |
| Hepatyna sodowa 1000 jednostek USP / ml | Hikma | NDC 0641-0391-12 | Strzykawki / probówki do próbek krwi heparynizacja |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Podwiązanie żyły wrotnej |
| Nożyczki | FST | 14058-11 | Rozwarstwienie |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | F.S.T | 91308-12 | Rozwarstwienie |
| Taśma chirurgiczna | 3M Transpore | 1527-1 | Unieruchomienie kończyn myszy |
| U-100 Strzykawka insulinowa 28G1/2 | EXEL | 26027 | Pobieranie próbek krwi |
Bibliografia
- vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
- Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
- den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
- Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
- De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
- Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
- Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
- Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
- Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
- Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
- Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
- Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
- Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
- Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
- Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
- Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
- Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
- Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
- Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
- Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
