Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

DOI:

10.3791/66676

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przepuszczalność naczyń jest kluczowym czynnikiem w opracowywaniu terapii zaburzeń związanych z uszkodzonym śródbłonkiem, takich jak dysfunkcja śródbłonka w tętnicach wieńcowych i upośledzona funkcja bariery krew-mózg. Istniejące techniki wytwarzania nie odtwarzają odpowiednio geometrycznej zmienności sieci naczyniowych w ludzkim ciele, co znacząco wpływa na postęp choroby; Co więcej, techniki te często obejmują wieloetapowe procedury produkcyjne, które utrudniają produkcję o wysokiej przepustowości niezbędną do przeprowadzania testów farmakologicznych. W artykule przedstawiono protokół biodruku do tworzenia wielu tkanek naczyniowych o pożądanych wzorach i rozmiarach bezpośrednio na standardowych płytkach sześciodołkowych, pokonując istniejące wyzwania związane z rozdzielczością i wydajnością w technologii biodruku. Ustalono uproszczone podejście do wytwarzania w celu skonstruowania sześciu pustych, przepuszczalnych kanałów w hydrożelu, które następnie wyłożono ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej, tworząc funkcjonalny i dojrzały śródbłonek. Sterowany komputerowo charakter biodruku 3D zapewnia wysoką powtarzalność i wymaga mniejszej liczby ręcznych etapów wytwarzania niż tradycyjne metody. Podkreśla to potencjał VOP jako wydajnej, wysokoprzepustowej platformy do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych i postępów w odkrywaniu leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć naczyniowa w całym ludzkim ciele funkcjonuje jako kluczowa bariera transportowa, dynamicznie regulując wymianę cząsteczek i komórek między krwią a otaczającymi tkankami. Regulacja ta jest niezbędna do zapobiegania obrzękom tkanek i umożliwienia selektywnej wymiany składników odżywczych i komórek, wspierając w ten sposób metabolizm tkankowy i homeostazę1. Zmieniona przepuszczalność śródbłonka, czynnik wielu schorzeń, wpływa zarówno na nasilenie choroby, jak i na skuteczność leczenia2. Śródbłonek naczyniowy działa jak selektywna bariera, ułatwiając przenoszenie między naczyniami, tkankami i narządami. Regulacja ta obejmuje kilka mechanizmów, takich jak podstawowe filtrowanie substancji rozpuszczonych i małych cząsteczek, celowe przerwanie bariery naczyniowej oraz wpływ cząsteczek, takich jak prostaglandyny i czynniki wzrostu, na poziom przepuszczalności3.

Kluczowe czynniki w tej regulacji obejmują połączenia komórek śródbłonka, migrację leukocytów oraz funkcjonalność bariery krew-mózg4. Biorąc pod uwagę jego złożoność, proces ten różni się w różnych środowiskach, obejmując różne typy naczyń krwionośnych i wykorzystując różne ścieżki anatomiczne. Zrozumienie biologicznych podstaw przepuszczalności naczyń krwionośnych ma kluczowe znaczenie dla opracowania podejść terapeutycznych w leczeniu stanów związanych z nieprawidłową przepuszczalnością naczyń. Utrzymanie przepuszczalności naczyń ma kluczowe znaczenie dla zdrowia układu naczyniowego i otaczających tkanek; W konsekwencji upośledzenie tej funkcji prowadzi do dysfunkcji śródbłonka, stanu, w którym śródbłonek traci swoją normalną funkcjonalność.

Dysfunkcja śródbłonka jest prekursorem wielu powszechnych chorób u ludzi, w tym nadciśnienia, choroby wieńcowej, cukrzycy i raka5,6,7. Stan ten może objawiać się na kilka sposobów, w tym zmniejszonym rozszerzeniem naczyń krwionośnych, zwiększoną przepuszczalnością naczyń krwionośnych i tendencją do stanu prozapalnego. Ten patologiczny stan jest najwcześniejszym etapem kilku krytycznych problemów sercowo-naczyniowych, takich jak choroba wieńcowa, udar mózgu i choroba tętnic obwodowych8, które nadal są głównymi przyczynami śmiertelności w Stanach Zjednoczonych1. Dysfunkcja śródbłonka wpływa na zdrowie układu sercowo-naczyniowego, a także na barierę krew-mózg (BBB) i odgrywa ważną rolę w postępie różnych zaburzeń neurologicznych. Dysfunkcja może zwiększać przepuszczalność bariery krew-mózg, umożliwiając w ten sposób przenikanie toksyn, patogenów i komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego i przyczyniając się do zaburzeń neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane i infekcje mózgu9.

Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy charakteryzuje się upośledzoną zdolnością śródbłonka do regulowania napięcia naczyniowego i wytwarzania mediatorów rozszerzających naczynia krwionośne, takich jak tlenek azotu, co prowadzi do upośledzenia rozszerzenia naczyń krwionośnych10. Stan ten jest pogarszany przez szlaki wywołane hiperglikemią, takie jak aktywacja kinazy białkowej C i stres oksydacyjny, co znacząco przyczynia się do postępu cukrzycowej choroby naczyniowej11. Co więcej, stwierdzono, że środowisko zapalne zwiększa adhezję komórek nowotworowych do komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, podczas gdy nieszczelny śródbłonek został uznany za główny czynnik przerzutów raka12,13. Stwierdzono, że geometria naczyń krwionośnych ma bezpośredni wpływ na przerzuty raka mózgu. Komórki nowotworowe preferencyjnie przyczepiają się do obszarów o większej krzywiźnie naczyń krwionośnych7. Odkrycie to podkreśla znaczenie geometrii naczyń krwionośnych w przerzutach raka. Co ważniejsze, w stanach takich jak zwłóknienie i rak, zaburzona funkcja bariery śródbłonkowej nie tylko odgrywa rolę w rozwoju choroby, ale także utrudnia skuteczność leczenia, utrudniając odpowiednie dostarczanie leków14. Badania nad przepuszczalnością naczyń krwionośnych mają kluczowe znaczenie dla postępu w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych i oferują wgląd w radzenie sobie z innymi chorobami związanymi z upośledzoną funkcją naczyń krwionośnych.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę przepuszczalności naczyń krwionośnych w zdrowiu i chorobie, wiele badań skupiło się na zbadaniu selektywnej natury bariery śródbłonkowej dla rozwoju terapeutycznego przy użyciu modeli zwierzęcych, obok tradycyjnych platform testowych 2D i 3D in vitro. Modele zwierzęce mają jednak ograniczenia wynikające z różnic gatunkowych i kwestii etycznych, a także wysokich kosztów15,16. Na przykład firma Pfizer w 2004 roku stwierdziła, że w ciągu ostatnich 10 lat wydała ponad 2 miliardy dolarów na opracowanie leków, które wykazały obiecujące efekty w modelach zwierzęcych, ale ostatecznie zawiodły na zaawansowanych etapach testów na ludziach17. Co więcej, tradycyjne modele 2D nie naśladują dokładnie architektury trójwymiarowej (3D) i złożonej struktury geometrycznej kanałów naczyniowych.

Wraz z postępem w technologiach biofabrykacji, szeroko zakrojone wysiłki zostały skierowane na wytwarzanie kanałów naczyniowych przy jednoczesnym podsumowaniu architektury 3D. Kanały naczyniowe w mikroskali mogą być skutecznie wytwarzane w mikroprzepływowych chipach przy użyciu miękkiej litografii, oferując w ten sposób przewagę analizy w czasie rzeczywistym18,19. Alternatywne metody, takie jak odlewanie hydrożelowe lub owijanie arkuszy komórkowych wokół formy lub trzpienia, mogą być stosowane do tworzenia wolnostojących konstrukcji rurowych o pożądanej średnicy20,21. Metody te mają jednak ograniczenia; Na przykład chipy mikroprzepływowe są ograniczone do konfiguracji mikrokanałowych, a odlewanie hydrożelu wokół formy nie odwzorowuje skutecznie wielu geometrii.

Wraz z pojawieniem się technologii biodruku 3D22, możliwe stało się replikowanie złożonych geometrii poprzez precyzyjne osadzanie różnych materiałów hydrożelowych na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)23,24. Niektóre metody biodruku, takie jak te wykorzystujące koncentrycznie ułożone dysze, np. koncentryczne i trójosiowe25,26, nie mogą tworzyć rozwidlonych rur; Jednak złożone struktury można osiągnąć za pomocą metod tworzenia wzorców ofiarnych27. Wykazano, że żadna z tych metod biodruku nie umożliwia wysokoprzepustowego modelowania in vitro, co jest kluczowym wymogiem dla badań farmakologicznych w odkrywaniu leków. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wydajnego wytwarzania śródbłonkowych kanałów naczyniowych z efektywną kontrolą wymiarów.

Ustaliliśmy proste podejście, używając dostępnych na rynku płytek sześciodołkowych, w połączeniu z metodą wzorowania ofiarnego, w której biodrukarka wytwarza kanały naczyniowe o pożądanych rozmiarach i wzorach w hydrożelu ECM. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wysiane w celu endotelializacji tych kanałów i oceny funkcjonalności śródbłonka za pomocą testu przepuszczalności. Taka konstrukcja umożliwia perfuzję bez pompy, tworząc zbiorniki mediów po obu stronach kanału i wykorzystuje przepływ napędzany grawitacją za pomocą powszechnie używanego kołyska 2D do naśladowania dynamicznej kultury. Takie podejście eliminuje potrzebę stosowania pomp perystaltycznych i ułatwia skalowalność tej platformy dla zastosowań o wysokiej przepustowości. Sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D usprawnia również proces produkcji, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia błędów podczas produkcji. Model VOP jest obiecujący jako cenne narzędzie do badań farmakologicznych w procesie odkrywania leków.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie kodu G dla biodrukarki

  1. Aby wygenerować i zwizualizować ścieżkę drukowania, odwiedź internetowe narzędzie do symulacji G-code (np. NCviewer).
  2. Kliknij ikonę Nowy plik w interfejsie, aby utworzyć nowy plik G-code.
  3. Wygeneruj ścieżkę drukowania, ręcznie zapisując polecenia G-code dla kanału protektorowego i komory krzemowej. Użyj wymiarów standardowej płytki sześciodołkowej jako odniesienia do tworzenia geometrii.
    UWAGA: Użyty tutaj kod G jest oparty na kodzie komputerowego sterowania numerycznego (CNC). Funkcje każdego polecenia są podane w tabeli uzupełniającej S1. Format płytki sześciodołkowej został wybrany ze względu na jego kompatybilność z dostępnymi na rynku czytnikami mikropłytek i zestawami mikroskopowymi oraz jego zdolność do przyjmowania odpowiednich ilości pożywki w celu wspomagania dojrzewania śródbłonka, minimalizując w ten sposób potrzebę częstej wymiany podłoża. Ten protokół produkcyjny może być również dostosowany do użytku z innymi standardowymi płytkami studzienkowymi.
  4. Po zakończeniu G-code kliknij ikonę Zapisz plik w interfejsie, aby pobrać plik z rozszerzeniem .nc.nc.
    UWAGA: Do wygenerowania ścieżek drukowania można użyć dowolnego innego dostępnego algorytmu generowania G-code. Geometrią kanału naczyniowego można manipulować w tym kodzie G.

2. Przygotowanie farb ofiarnych i silikonowych

UWAGA: Źródła dla wszystkich materiałów używanych w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Połącz dwa rodzaje polimerów silikonowych, SE1700 i polidimetylosiloksan (PDMS), w stosunku 10:2. Dodaj utwardzacz każdego polimeru w stosunku 10:1, polimer do utwardzacza.
  2. Użyj miksera planetarnego, aby dokładnie wymieszać i odgazować mieszaninę polimerów przy 2,000 obr./min.
  3. Za pomocą szpatułki przenieś zmieszany polimer silikonowy do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml. Odwirować załadowaną strzykawkę o stężeniu 400 × g przez 3 minuty w temperaturze 5 °C, aby zapewnić jednolitą konsystencję i uniknąć pęcherzyków powietrza podczas drukowania.
    UWAGA: Tusz komorowy należy zużyć w ciągu 2 godzin po dodaniu utwardzaczy, aby zapewnić optymalną jakość druku. Przechowywać strzykawkę w temperaturze 5°C podczas przygotowywania do drukowania. Proces ten pomaga spowolnić utwardzanie atramentu, co w przeciwnym razie może zmienić parametry drukowania.
  4. Zważyć Pluronic F-127 (PF127) w celu przygotowania 40% (w/v) roztworu podstawowego PF127 w wodzie destylowanej.
  5. Mieszać roztwór PF127 w mikserze planetarnym przez 3 minuty w temperaturze 400 × g, aby uzyskać jednorodność. Przechowywać homogenizowaną mieszaninę w temperaturze 4 °C do całkowitego rozpuszczenia PF127.
  6. Przygotować roztwór podstawowy trombiny o stężeniu 1000 jednostek/ml w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco.
    UWAGA: Roztwór podstawowy trombiny należy przechowywać w podwielokrotnościach o objętości 100 μl, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.
  7. Przed drukowaniem należy przygotować farbę protektorową, mieszając trombinę w rozcieńczeniu 1:10 z PF127 do końcowego stężenia roboczego 36% (w/v) dla PF127 i 100 jednostek/ml dla trombiny. Aby przygotować 1 ml tuszu protektorowego, zmieszaj 100 μl roztworu podstawowego trombiny z 900 μl roztworu podstawowego PF127.
    UWAGA: Podczas przygotowywania tuszu protektorowego do drukowania pojedynczej płyty, całkowita objętość 1 ml jest więcej niż wystarczająca.

3. Proces produkcji

  1. Przed rozpoczęciem procesu produkcyjnego należy potraktować sześciodołkową płytkę plazmą tlenową (O2) o mocy 100 watów przez 1 minutę.
  2. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2, aby przygotować zarówno atrament protektorowy, jak i silikonowy, upewniając się, że atramenty są wolne od pęcherzyków i jednorodnie wymieszane w celu uzyskania spójnego drukowania. Ostrożnie załaduj atramenty do głowicy drukującej biodrukarki. Ustaw temperaturę głowicy biodrukarki na 37 °C dla tuszu protektorowego i 5 °C dla tuszu silikonowego.
  3. Przymocuj stożkową dyszę 22 G z podwójnym gwintem do silikonowej strzykawki. W przypadku tuszu ofiarnego wybierz rozmiar dyszy zgodnie z żądaną średnicą kanału.
    UWAGA: Tutaj zademonstrowaliśmy trzy rozmiary dysz: 18 G, 20 G i 22 G. Optymalne parametry drukowania, w tym ciśnienie drukowania i prędkość głowicy drukującej, przedstawiono w Tabeli 1.
  4. Załaduj żądany kod G i naciśnij funkcję gotowości serwomechanizmu w interfejsie oprogramowania biodrukarki przez 3 sekundy. Umieść płytkę na stoliku w punkcie początkowym kodu G i kliknij start, aby rozpocząć proces drukowania.
    UWAGA: Zazwyczaj wyprodukowanie jednej płyty zawierającej sześć komór zajmuje około 1 godziny i 10 minut. Krok 3.4, obejmujący załadowanie i wykonanie kodu G, może się różnić w zależności od konkretnej używanej biodrukarki. Upewnij się, że podczas korzystania z biodrukarki zachowane są sterylne warunki, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  5. Nałożyć pokrywkę na płytkę i przenieść płytkę do nawilżonego inkubatora CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny w celu utwardzenia komór krzemowych.
    UWAGA: Chociaż utwardzanie krzemu może odbywać się w wolniejszym tempie wewnątrz inkubatora, płytki nie wolno umieszczać w suchym piekarniku.

4. Przygotowanie hydrożelu i osadzanie kanału

  1. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 20 ml 1x PBS. Umieścić 0,01 g fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) w stożkowej probówce, aby uzyskać 0,05% (w/v) roztwór LAP. Mieszaj go aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.
    UWAGA: Owiń stożkową rurkę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. Przechowywać roztwór podstawowy LAP w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 3 g metakrylanu żelatyny (GelMA) i 0,2 g fibrynogenu do 20 ml roztworu LAP, aby uzyskać końcowe stężenie 15% GelMA i 1% fibrynogenu (określane jako GelFib). Umieścić mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać wirowo, aż roztwór całkowicie się rozpuści.
  3. Po wytworzeniu zgodnie z opisem w sekcji 3 dodać 300 μl wstępnie podgrzanego GelFib do każdej komory hydrożelowej, aby osadzić wzór ofiarny. Szybko sieciuj GelMA światłem ultrafioletowym (UV) o długości fali 405 nm o natężeniu 85 mW/cm2 przez 120 s. Powtórz tę procedurę dla wszystkich innych studzienek.
    UWAGA: Fibrynogen sieciuje się szybko w kontakcie ze wzorem ofiarnym zawierającym trombinę. Zalecamy dodanie hydrożelu i wykonanie sieciowania UV indywidualnie dla każdej studzienki, aby uniknąć niepożądanego żelowania GelMA w temperaturze pokojowej. Dodatkowo należy zachować sterylne warunki, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas procesu utwardzania UV.
  4. Dodać po 1 ml DPBS z każdej strony kanału naczyniowego w każdym dołku i utrzymywać płytkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu skroplenia PF127.
  5. Po 15 minutach odessać DPBS i powtórzyć krok 4.5 3x, aby całkowicie umyć PF127.
  6. Przed wprowadzeniem komórek do kanałów, należy perfaktorować DMEM F12 zawierający 1% Matrigel przez 30 minut przez kanały, aby zwiększyć przyczepienie komórek.

5. Kultura HUVEC

  1. Podgrzewać pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka (ECGM) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. W międzyczasie wyjmij fiolkę z kriokonserwowanymi HUVEC ze zbiornika azotu, delikatnie poluzuj nakrętkę fiolki, a następnie dokręć ją ponownie, aby uwolnić azot z gwintów. Natychmiast rozmrozić komórki, zanurzając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty, upewniając się, że wewnątrz fiolki pozostała niewielka ilość lodu. Przepłukać fiolkę 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    UWAGA: Podczas pobierania komórek ze zbiornika azotu należy nosić okulary ochronne. Podczas tego procesu nakrętka fiolki musi być utrzymywana powyżej poziomu wody.
  3. Przygotuj stożkową rurkę o pojemności 15 ml zawierającą 5 ml wstępnie podgrzanego EKGM. Za pomocą mikropipety ostrożnie przenieść rozmrożone komórki z fiolki do stożkowej probówki. Aby upewnić się, że żadne komórki nie pozostały w tyle, dodaj 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do kriowialu, przepłucz wnętrze i przenieś pozostałe komórki do stożkowej probówki.
  4. Odwirować stożkową probówkę o masie 200 × g przez 3 minuty, aby uzyskać osad komórkowy. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 10 ml świeżej pożywki, przenieść komórki do kolby T75 i umieścić kolbę w inkubatorze z wilgotnością CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby usunąć dimetylosulfotlenek obecny w pożywce zamrażającej w kriowiale poprzez wirowanie.
  5. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80-90% zbieżności.

6. Endotelializacja kanałów

  1. Rozgrzej ECGM, DPBS, roztwór neutralizujący trypsynę i kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (TE) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Przy 90% zbiegu przepłukać komórki w kolbie T75 z 10 ml DPBS, dodać 1 ml 0,25% TE do kolby i inkubować przez 3 minuty.
  3. Delikatnie postukaj w boki kolby i dodaj 5 ml roztworu neutralizującego trypsynę, aby zneutralizować TE. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Użyj 5 ml świeżego ECGM, aby zebrać pozostałe komórki i dodać je do stożkowej probówki.
  4. Odwirować stożkową probówkę o masie 250 × g przez 3 minuty, aby zebrać osad komórkowy.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżego roztworu EKGM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i powtórz krok 6.4, aby uzyskać osad komórkowy. Ponownie zawiesić 3 miliony komórek w 90 μl świeżego ECGM.
  6. Przed wprowadzeniem zawiesiny komórek do kanału, należy na krótko odessać kanał, aby oczyścić lumen.
    UWAGA: Unikaj długotrwałego zasysania kanału, aby uniknąć uszkodzenia jego integralności.
  7. Delikatnie załaduj kanał zawiesiną komórkową o gęstości wysiewu 0,5 miliona komórek na studzienkę. Za pomocą mikropipety dodaj ~15 μl tej zawiesiny do napełnienia kanału.
    UWAGA: Gęstość wysiewu może się różnić w zależności od wielkości kanału. Gęstość ta jest zoptymalizowana dla kanału drukowanego z dyszą 20 G i średnicą wewnętrzną około 900 μm.
  8. Umieść płytkę płasko w inkubatorze na 2 godziny. Następnie odwróć płytkę do 180°, utrzymując ją w płaskiej pozycji przez kolejne 2 godziny.
  9. Po 4 godzinach umyj kanał DPBS, aby usunąć nieprzylegające i martwe komórki. Dodaj 2 ml świeżego ECGM do każdej studzienki (po 1 ml z każdej strony kanału). Rozpocznij dynamiczną hodowlę na bujaczku pod kątem 10° i 5 obr./min, ustawiając płytkę na bujaku tak, aby kanały były równoległe do kierunku kołysania. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
    UWAGA: Hodowla dynamiczna poprawia wymianę pożywki między zbiornikami i kanałami oraz pomaga komórkom namnażać się w ciągu nocy.

7. Ocena dojrzałości śródbłonka

  1. Podgrzewać ECGM i DPBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut i odczynniku Cell Counting Kit-8 (CCK8) w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować roztwór roboczy CCK8, mieszając 100 μl odczynnika CCK8 z 1 ml świeżego ECGM dla każdej studzienki. Podczas pracy na płytkę/6 kanał przygotuj 600 μl odczynnika CCK8, łącząc go z 6 ml świeżego ECGM.
  3. Usuń pożywkę wzrostową przez odsysanie i przepłucz kanały DPBS. Dodać 1 ml roztworu roboczego CCK8 do każdej studzienki i pozostawić płytkę płasko w inkubatorze przez 30 minut. Następnie rozpocznij hodowlę dynamiczną na bujaku zgodnie z opisem w kroku 6.9 i kontynuuj ten proces przez następne 3 godziny.
  4. Po 3 godzinach usunąć zawartość z każdej studzienki, przechylając płytkę na bok, i przenieść ją na nową płytkę sześciodołkową. Przepłukać kanały DPBS i dodać świeżą pożywkę.
    UWAGA: Przykryj płytkę folią aluminiową do czasu pomiaru absorbancji. Utrzymuj stałą objętość odczynnika we wszystkich studzienkach, aby zapewnić jednolite odczyty. Podczas pipetowania należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić dokładność odczytów gęstości optycznej.
  5. Po delikatnym potrząsaniu płytką przez 15 s w celu zapewnienia równomiernego wymieszania kolorów, za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję przy 450 nm.
  6. Powtórz tę procedurę w określonych odstępach czasu. Oblicz średnią gęstość optyczną dla każdego punktu czasowego i narysuj krzywą wzrostu w oprogramowaniu do tworzenia wykresów. Krzywa ta wskazuje względne dojrzewanie śródbłonka w czasie.

8. Test przepuszczalności

  1. Usuń pożywkę z jednego dołka będącego przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: W przypadku testu przepuszczalności zaleca się przetwarzanie każdej studzienki osobno, aby zapobiec wysychaniu innych kanałów, co może zmienić ich przepuszczalność naczyniową.
  2. Przygotować 6 ml 0,1 mg/ml roztworu dekstranu sprzężonego z FITC, rozpuszczając 70 kDa dekstranu FITC w DPBS.
    UWAGA: Przygotować roztwór podstawowy dekstranu FITC o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając 100 mg dekstranu FITC w 5 ml DPBS. Po delikatnym zawirowaniu roztworu, podaczuj 500 μl do probówek o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Podwielokrotności te mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Przed przeprowadzeniem testu należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia roboczego 0,1 mg/ml.
  3. Umieść płytkę mocno na stoliku mikroskopu i wyreguluj powiększenie obiektywu w trybie kontrastu fazowego, aby zapewnić wyraźną widoczność ścianki kanału w obszarze zainteresowania, wraz z żelem znajdującym się w pobliżu, w polu view.
    UWAGA: Aby uzyskać skuteczną ocenę przepuszczalności, staraj się zmaksymalizować obszar żelu otaczający obszar zainteresowania w polu view; Ten aspekt ma kluczowe znaczenie dla dokładnego monitorowania transportu dekstranu.
  4. Po ustawieniu ostrości na żądanym obszarze zmień tryb z kontrastu fazowego na tryb fluorescencji. Na karcie akwizycji obrazu dodaj FITC do kanału szerokokątnego i uzyskaj obraz przed dodaniem roztworu dekstranu, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Następnie dodaj 1 ml roztworu roboczego dekstranu FITC po jednej stronie kanału i pozwól roztworowi spłynąć w kierunku drugiej strony studni, napędzany różnicą ciśnień hydrostatycznych.
  5. Pobieraj obrazy w określonych odstępach czasu - częściej dla kanałów o wysokiej przepuszczalności i rzadziej dla tych o mniejszej przepuszczalności.

9. Pomiar intensywności fluorescencji w ImageJ

  1. W oprogramowaniu do analizy obrazu ImageJ zmierz intensywność w początkowym punkcie czasowym (It1), średnią intensywność zaobserwowaną w późniejszym punkcie czasowym (It2) oraz intensywność spowodowaną szumem tła (Ib), jak opisano poniżej. Użyj równania (1), aby obliczyć współczynnik przepuszczalności (Pd). T1 i t2 odnoszą się do początkowych i późniejszych punktów czasowych akwizycji obrazu.
    figure-protocol-1 (1)
    1. Uruchom program ImageJ i otwórz obraz uzyskany w początkowym punkcie czasowym.
    2. Ustaw skalę w ImageJ. Przechodzenie do pozycji Analizuj | Ustaw skalę. Wprowadź znaną skalę i jednostkę miary.
    3. Wybierz narzędzie prostokąta i narysuj prostokąt nad obszarem żelu, w którym wymagany jest pomiar intensywności fluorescencji.
    4. Przechodzenie do pozycji Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i upewnij się, że zaznaczona jest wartość Mean gray (Średnia wartość szarości).
      UWAGA: Ta opcja mierzy średnią intensywność w wybranym obszarze. Inne parametry można dobrać w zależności od potrzeb dla danej analizy.
    5. Mając nadal zaznaczony obszar, przejdź do pozycji Analizuj | Zmierz lub po prostu naciśnij M. Poczekaj, aż otworzy się okno wyników, pokazujące średnią intensywność fluorescencji i wszelkie inne wybrane parametry.
    6. Wykonaj trzy pomiary i oblicz średnią wartość intensywności fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym.
    7. Powtórzyć tę procedurę dla obrazów zarejestrowanych w kolejnym punkcie czasowym t2, jak również dla obrazów wykonanych przed dodaniem roztworu dekstranu w celu obliczenia intensywności fluorescencji w późniejszym punkcie czasowym, w celu wyznaczenia fluorescencji tła.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma VOP, charakteryzująca się elastycznością w zakresie rozmiaru i wzoru, została wykonana z wielogłowicowym systemem biodruku. Kanały, zarówno puste, jak i zdolne do perfuzji, zostały zasiane HUVEC, aby ułatwić śródbłonek, a następnie oceniono je za pomocą testu przepuszczalności (Figura 1A). Aby zademonstrować wieloskalową zdolność produkcyjną tej metody, wydrukowaliśmy trzy różne konfiguracje: prostą, rozwidloną i zawiłą (Rysunek 1B). Dzięki prostemu podejściu do wytwarzania, sześć pustych, przepuszczalnych kanałów naczyniowych osadzonych w matrycy hydrożelowej może być wytwarzanych wewnątrz standardowej płytki sześciodołkowej. Kanały te mogą być następnie endotelializowane za pomocą HUVEC (Rysunek 2A). Komórki szybko przyczepiają się i namnażają się, pokrywając powierzchnię światła kanału naczyniowego ( Rysunek 2B). Komórki przylegające zarówno do dolnej, jak i górnej powierzchni światła wykazują równomierny rozkład wewnątrz światła (rysunek uzupełniający S1).

Płytka została umieszczona w nawilżanym inkubatorze na 3 dni, aby umożliwić utwardzenie tuszu silikonowego, jednocześnie zapewniając, że wzór ofiarny pozostał wolny od wysuszenia (Rysunek 3A). Aby ocenić przepływ przez te kanały, wprowadzono zielone mikrogranulki, które wykazały, że kanały są skutecznie przepuszczalne (film uzupełniający S1). Średnica kanałów zmieniała się od 558 ± 38 μm do 1094 ± 45 μm poprzez zmianę rozmiaru dyszy z 22 G na 18 G podczas drukowania wzorów ofiarnych. Dodatkowo, konfiguracja geometryczna kanałów została zmodyfikowana poprzez modyfikację kodu G biodrukarki (Plik uzupełniający 1), aby umożliwić drukowanie splątanych i rozwidlonych wzorów (Rysunek 3B).

Czas sieciowania za pomocą UV został zoptymalizowany do 120 s, co wspiera efektywną proliferację komórek (Rysunek uzupełniający S2). Ten czas sieciowania zaowocował bardziej fizjologicznie odpowiednim środowiskiem, które sprzyja proliferacji komórek śródbłonka, prawdopodobnie ze względu na zrównoważone właściwości mechaniczne i porowatość hydrożelu, ułatwiając lepsze przyłączanie komórek i późniejszą proliferację. HUVEC skutecznie rozmnażały się na powierzchni światła i wykazywały morfologię podobną do bruku w 5 dniu po wysianiu. Dojrzewanie śródbłonka oceniano za pomocą testu CCK8 przeprowadzonego w dniach 1, 3 i 5 (Figura 4A,B). Dojrzewanie śródbłonka zweryfikowano za pomocą barwienia immunologicznego dla CD31 5 dni po wysiewie komórek, co wykazało lokalizację CD31 w ścisłych połączeniach (Ryc. 4D).

Aby ocenić funkcję barierową śródbłonka, przeprowadziliśmy perfuzję roztworu dekstranu o stężeniu 70 kDa przez kanały w 5 dniu dojrzewania. Dla porównania wybrano kanał kontrolny bez śródbłonka (goły). Śródbłonkowy kanał wykazywał minimalne zmiany fluorescencji w obrębie okołonaczyniowego obszaru żelu w czasie, co sugeruje, że śródbłonek skutecznie utrzymywał swoją funkcję barierową. Jednak gołe kanały wykazywały wzrost fluorescencji w okołonaczyniowym obszarze żelu, co wskazuje na wyższą przepuszczalność ze względu na brak śródbłonka (Rysunek 4C i Figura 4E).

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie drukowanych kanałów naczyniowych i ich konfiguracji. (A) Schemat wytwarzania, śródbłonka i oceny przepuszczalności drukowanych kanałów naczyniowych. (B) Schemat trzech konfiguracji zademonstrowanych tą metodą: prostej, rozwidlonej i splątanej. Skrót: VOPs = naczynia na talerzu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Harmonogram produkcji druku wzoru ofiarnego i komory krzemowej, a także śródbłonka kanału naczyniowego. (A) Ilustracja przedstawia pojedynczą studzienkę płyty studzienki, a AA' odnosi się do widoku wzdłuż płaszczyzny przekroju poprzecznego. (B) Reprezentatywne obrazy etapów biorących udział w procesie wytwarzania. Podziałka = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Skróty: GelFib = 15% metakrylanu żelatyny i 1% fibrynogenu w 0,05% w/v roztworze fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu; HUVEC = Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Naczynia na talerzu. (A) Obrzydliwy obraz naczyń na płycie po wydrukowaniu wzoru ofiarnego i komory silikonowej. (B) Demonstracja wieloskalowego wytwarzania kanałów naczyniowych o różnych konfiguracjach i rozmiarach, perfundowanych zielonymi mikrogranulkami. Podziałka = 200 μm (kanały proste), 1 000 μm (kanały faliste i rozwidlone). Skróty: ID = średnica wewnętrzna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Kanały naczyniowe oraz ich dojrzewanie i przepuszczalność śródbłonka. (A) Mikroskopowe obrazy fluorescencyjne kanałów naczyniowych w dniach 1, 3 i 5 po wysiewie zielonymi fluorescencyjnymi HUVEC, pokazujące proliferację i morfologię bruku HUVEC w 5 dniu. (B) Dojrzewanie śródbłonka oceniano za pomocą testu CCK-8 w dniach 1, 3 i 5 po wysiewie komórek. (C) Test przepuszczalności śródbłonka (śródbłonek +) i gołe (śródnabłonek -) kanały naczyniowe. (D) Reprezentatywne obrazy barwienia CD31 ilustrują lokalizację CD31 w ciasnych połączeniach w 5 dniu. (E) Kwantyfikacja przepuszczalności dyfuzyjnej. Podziałka = 200 μm (A, C, D). Skróty: HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej; GFP = białko zielonej fluorescencji; GFP HUVEC = HUVEC z GFP; CCK-8 = zestaw do liczenia komórek 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt.
TuszParametry drukowania
Manometr dyszyTemperatura (°C)Ciśnienie powietrza (kPa)Prędkość głowicy (mm/min)
Atrament ofiarnyRozdział 1837Rozdział 40-48200
20
22 Rozdział 22
Tusz silikonowy22 Rozdział 225100

Tabela 1: Parametry drukowania dla farb protektorowych i silikonowych.

Plik uzupełniający 1: Skrypt G-Code zawierający polecenia do drukowania 3D wzoru ofiarnego i komory krzemowej wewnątrz sześciodołkowej płytki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Reprezentatywne obrazy dolnej i górnej powierzchni światła po wysiewie komórek, pokazujące przyczepienie GFP-HUVEC zarówno w dolnej, jak i górnej płaszczyźnie ogniskowej. Podziałka = 200 μm. Skróty: UU' = górna płaszczyzna ogniskowa; LL' = dolna płaszczyzna ogniskowa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Rozprzestrzenianie się GFP-HUVEC w różnych okresach sieciowania z UV (405 nm). Podziałka = 200 μm. Skróty: HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej; GFP = białko zielonej fluorescencji; GFP HUVEC = HUVEC z GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S1: Perfuzja z zielonymi mikrokulkami pokazująca efektywną perfuzję przez proste, splątane i rozwidlone kanały. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Funkcje poleceń G-code i M-code. UWAGA: W kodzie G X, Y i Z wskazują współrzędne ruchu odpowiednio wzdłuż osi X, osi Y i osi Z. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując precyzję, automatyzację i sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D, opracowaliśmy uproszczoną metodę wytwarzania kanałów naczyniowych w standardowych płytkach sześciodołkowych, które zostały wybrane ze względu na ich kompatybilność z komercyjnymi czytnikami mikropłytek i zestawami do obrazowania mikroskopowego. Konstrukcja płyty może pomieścić kanały o wielu rozmiarach i wystarczającą objętość mediów do wzrostu większych kanałów przy jednoczesnym zmniejszeniu niezbędnej częstotliwości zmian mediów. Przyszłe adaptacje tej konstrukcji mogą zostać dostosowane do innych dostępnych na rynku standardowych płytek studziennych, zwiększając w ten sposób przepustowość eksperymentalną i zmniejszając zużycie materiałów.

Platformy mikroprzepływowe często wykorzystują polimer silikonowy o nazwie PDMS ze względu na jego nietoksyczność, przepuszczalność gazów i wysoką przezroczystość28. Jednak niska wierność kształtu PDMS ogranicza jego zastosowanie w biodruku opartym na mikrowytłaczaniu do wytwarzania chipów z wysoką wiernością kształtu. SE170029, inny polimer silikonowy, oferuje większą precyzję w konstruowaniu komór do produkcji tkanek, ale jego wysoka lepkość wymaga większych dysz i znacznego ciśnienia pneumatycznego. Opracowaliśmy mieszankę SE1700 i PDMS, która może być używana z mniejszymi dyszami, umożliwiając w ten sposób produkcję w ograniczonych przestrzeniach z wysoką precyzją i wiernością kształtu. Inne rodzaje polimerów, takie jak polikaprolakton (PCL) lub polietylen octan winylu (PEVA), mogą być również stosowane do drukowania w komorze ze względu na ich wysoką wierność kształtu30.

Kluczowe znaczenie ma również przezroczystość optyczna GelMA31. W przeciwieństwie do innych hydrożeli na bazie ECM - takich jak kolagen, który staje się nieprzezroczysty po usieciowaniu - GelMA zachowuje przezroczystość, umożliwiając w ten sposób analizę komórkową w czasie rzeczywistym w kanałach, nawet gdy rozmiar kanału rośnie. Ten aspekt zapewnia dużą przewagę nad metodami wymagającymi cienkich przekrojów do obserwacji, gdy rozmiar konstrukcji jest zwiększony32. Biodegradowalność GelMA ułatwia wymianę rusztowania ECM na nową, funkcjonalną tkankę w trakcie jej rozpadu, zapewniając w ten sposób niezbędną przestrzeń do wzrostu nowo powstałej tkanki funkcjonalnej33,34. Dodatkowo, jego udowodniona niska cytotoksyczność sprawia, że doskonale nadaje się do zastosowań w inżynierii tkankowej35,36. Doskonałe właściwości mechaniczne GelMA sprawiają, że jest on dobrym kandydatem do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych37. Jego skuteczność w ułatwianiu śródbłonka przewodów naczyniowych za pomocą HUVEC została dobrze udokumentowana38.

Komórki wykorzystane do endotelializacji w tym badaniu, HUVEC, wykazują wysoki wskaźnik sukcesu izolacji i są wyjątkowym modelem do badania szerokiego zakresu chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych39. Jednak podejście to można dostosować do różnych typów komórek śródbłonka, w tym tych pochodzących z tętnic lub bezpośrednio od pacjentów. Ta zdolność adaptacji umożliwia tworzenie specyficznych dla pacjenta modeli tkanki naczyniowej, ułatwiając ocenę indywidualnych reakcji na określone leki.

Ten protokół zawiera kilka krytycznych kroków, o których czytelnicy powinni pamiętać. Po pierwsze, obróbka plazmowa ma kluczowe znaczenie dla modyfikacji charakterystyki powierzchni płytki, w szczególności w celu zwiększenia hydrofilowości, ponieważ większość komercyjnych płyt studziennych jest hydrofobowa. Obróbka plazmowa wprowadza polarne grupy funkcyjne na powierzchnię, poprawiając w ten sposób zdolność wiązania z komorą krzemową i hydrożelem. Po drugie, kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie, ponieważ atrament protektorowy upłynnia się w niższych temperaturach, a atrament silikonowy wymaga niższych temperatur, aby zapobiec przedwczesnemu utwardzaniu, co może utrudniać wytłaczanie atramentu przez dyszę. Po trzecie, dokładne usunięcie wszystkich śladów PF127 ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie pozostałości PF127 mogą niekorzystnie wpływać na procesy komórkowe, na przykład zakłócając adhezję komórek40. Po czwarte, podczas hodowli komórkowej, jeśli komórki osiągną zbieżność przekraczającą 90%, mogą doświadczać stresu z powodu konkurencji o przestrzeń i składniki odżywcze. Stres ten może powodować zmienione zachowanie komórek, zmniejszoną żywotność komórek i modyfikacje mikrośrodowiska komórkowego. Aby utrzymać zdrowie komórek i prawidłową proliferację, zaleca się utrzymywanie kultur poniżej 90% konfluencji. Po piąte, ważne jest, aby utrzymać płytkę płasko wewnątrz inkubatora przed i po odwróceniu, aby uzyskać równomierną adhezję komórek wewnątrz kanału i ostatecznie równomierną śródbłonek. Wreszcie, utrzymanie stałego czasu ekspozycji, intensywności lasera wzbudzenia i ostrości mikroskopu ma kluczowe znaczenie podczas akwizycji obrazu, ponieważ zmiany tych parametrów mogą zmienić intensywność sygnału emisyjnego, potencjalnie wpływając w ten sposób na dokładność wyników.

Nasze podejście pozwala na tworzenie kanałów w wielu konfiguracjach, takich jak proste, rozwidlone i zawiłe wzorce pokazane tutaj. Ta zdolność adaptacji jest niezbędna do odtworzenia różnorodnych geometrii sieci naczyniowych w ludzkim ciele i przewyższa możliwości tradycyjnych metod, takich jak odlewanie hydrożelu wokół formy lub koncentryczne techniki biodruku oparte na dyszach stosowane w strukturach przypominających rurki 30,41,42. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie zapewnia ona okrągłości kanałów, ponieważ wzór ofiarny jest ułożony na płaskiej powierzchni.

Zaleta konstruowania kanałów w wielu rozmiarach jest kluczem do przezwyciężenia ograniczeń platform mikroprzepływowych, które często są ograniczone do mikrokanałów. To ograniczenie może być wadą w konwencjonalnych testach biochemicznych. Na przykład, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do standardowych testów ekspresji białek, takich jak western blotting, należy połączyć dane wyjściowe z kilku urządzeń mikroprzepływowych. Dodatkowo, gdy powstają puste kanały, hydrożel musi zachować wystarczającą sztywność, aby wytrzymać proces usuwania igły. Nasze podejście wykorzystuje termoodwracalny materiał protektorowy, który staje się płynny, gdy temperatura spada, ułatwiając w ten sposób ten proces bez naruszania integralności żelu. Co więcej, inne termoodwracalne materiały żelujące, takie jak żelatyna43, mogą być również wykorzystywane jako materiały ofiarne w tej metodzie.

Takie podejście umożliwia łatwe dostosowywanie struktur tkankowych na płytce, zapewniając w ten sposób obiecujące narzędzie do badań farmakologicznych w odkrywaniu leków. Metoda ta może ułatwić badania przesiewowe leków poprzez ocenę ich wpływu na przepuszczalność naczyń krwionośnych – kluczowy czynnik w opracowywaniu terapii chorób związanych z dysfunkcją naczyń krwionośnych. Nasz model może być wykorzystany do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych w określonych warunkach, takich jak stan zapalny, oraz do opracowania strategii normalizacji naczyń, co jest istotne w leczeniu różnych chorób związanych z nieprawidłową przepuszczalnością naczyń44, pogłębiając zrozumienie tego procesu i rozwijając potencjalne zastosowania kliniczne45.

Aby ocenić przepuszczalność naczyń krwionośnych, przeprowadziliśmy perfuzję dekstranu o stężeniu 70 kDa przez kanał naczyniowy. Zazwyczaj zdrowy śródbłonek naczyniowy służy jako skuteczna bariera dla cząsteczek dekstranu o tej masie cząsteczkowej46. Jednak w przypadku stanu zapalnego dochodzi do przerwania połączeń ścisłych, co pozwala tym cząsteczkom przeciekać, zwiększając w ten sposób przepuszczalność naczyńkrwionośnych 30. Dodatkowo, znakowany fluorescencyjnie dekstran jest wykorzystywany do oceny dystrybucji leków w zmodyfikowanych tkankach47. Chociaż przepływ dwukierunkowy i ograniczona dynamika przepełnienia sterującego w kanale są ograniczeniami tego modelu, przewidujemy, że użytkownicy końcowi będą mogli dostosować system do swoich wymagań, używając niestandardowych wahaczy do sterowania dynamiką przepływu w kanałach. Adaptacja ta może obejmować wdrożenie bezpompowego przepływu jednokierunkowego48.

W przyszłości ta metoda wytwarzania może zostać rozszerzona w celu konstruowania złożonych tkanek. Dzięki precyzyjnemu pozycjonowaniu innych typów komórek w pobliżu kanałów naczyniowych można stworzyć przepuszczalne, unaczynione tkanki, pokonując w ten sposób poważne wyzwanie związane z biodrukowaniem tkanek wolumetrycznych. Uważamy również, że metoda ta może zostać zaadaptowana do symulacji innych typów pustych, przepuszczalnych tkanek, takich jak naczynia limfatyczne i jelita, w sposób wysokoprzepustowy do różnych zastosowań biomedycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT, MSIT) [Nie. NRF-2019R1C1C1009606; Nr 2020R1A5A8018367; i Nie. RS-2024-00423107]. Badania te były wspierane przez Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych grantów NRF finansowanych przez MSIT [No. NRF-2022M3A9E4017151 i nr NRF-2022M3A9E4082654]. Prace te były wspierane przez Program Innowacji Technologicznych [nr 20015148] oraz Projekt Alchemik [nr 20012378] finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE, Korea). Prace te były również wspierane przez Koreański Instytut Planowania i Oceny Technologii w Żywności, Rolnictwie i Leśnictwie (IPET) w ramach Programu Technologii Konwergencji Rolnictwa i Żywności na rzecz Rozwoju Siły Roboczej, finansowanego przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wsi (MAFRA) [No. RS-2024-00397026].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlSPLSPL 91010
Strzykawka 10 ml Shinchang Medical
15 ml tubka stożkowaSPL50015
Biodrukarka 3D T& R Biofab3DX-Drukarka
6-dołkowa płytka SPL37206
Szafy bezpieczeństwa biologicznegoCHC LABPCHC-777A2-04, 
Mikroskopy odwrócone Brightfield ZestawLeicaDMi1
(CCK8)GlpBioGK10001
(CCK8)GlpBioGK10001
75TSPL70075
Matryca membrany podstawnej Corning Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR), bez LDEV, 10 mlCorning354230
destylowana
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, KlasaSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a ZestawDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1,1 KG Zestaw DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2 (gotowa do użycia)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipeta(1000,200,100,20,10)eppendorf
Alkohol etylowy 99,9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrynogen z osocza bydlęcegoSigma AldrichF8630-1G
FITC Dekstran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Koraliki fluorescencyjne (1,0 μ m, zielony)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-powder (metakrylan żelatyny) 50 gMateriały 3D 20JT29
- Gibco, Pożywka do zamrażania kultur komórkowych z regeneracji, 50 mlGibco
HUVECs (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej)Oprogramowanie Promocell
ImageJNIH
Thermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 Inkubator
CO2Invitrogen, zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności (dla komórek ssaków)Thermo FisherL3224
Fosforan litowo-fenylowy (2,4,6-trimetylobenzoilo) w proszku Tokoyo Przemysł chemiczny CO.Numer katalogowy: 85073-19-4 
Marienfeld Superior, Pokrywa komory liczeniaMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometr, komora do liczenia komórekMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MikrowirówkaeppendorfWirówka 5920 R
NCViewer.com
Zbiornik azotuWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Laser UVOmnicure EXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)GenDEPOTCA005-010
Mikser planetarnyTHINKY CORPORATION, japoniaARE-310
Maszyna do obróbki plazmowejFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Gotowy bufor, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Szafka do przechowywania odczynnikówZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Mikroskop do obrazowania komórek na żywo w czasie rzeczywistymCarl ZEISS
LodówkaSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D cyfrowyIKA4003000
Scoop-SpatulaCacheBySL-SCO7001-EA
sigma, Trypsyna-EDTA solition, 0,25%Sigma aldrichT4049-100ML
Dodecyl siarczan sodu (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Nasadka na końcówkę lufy strzykawkiFISNAR3051806
Licznik TallyFirma kontrolna  C23-147-050
Dysza stożkowa (18 G)MushashiTPND-18G-U
Dysza stożkowa (22 G)MushashiTPND-22G-U
Dysza stożkowa 20 GMusashiTPND-20G-U
Trombina z osocza bydlęcegoSigma AldrichT7326-1KU
Timer, 4-kanałowyETLSL. Tim3005
Trypan Blue Solution 0,4%Gibco15250061
Roztwór neutralizujący trypsynęPromocellC-41120
UG 24 mL słoik do maści UGYamayunr 3-53
UG 58 mL słoik maści UGYamayuNo. 3-55
Kąpiel wodnaDAIHAN ScientificWB-11
Maszyna do ważeniaSartoriusbce2241-1skr
do liczenia komórek Zestaw do liczenia komórek Kolba do hodowli komórkowych Woda hodowli komórkowych Inkubator powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
  2. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends Mol Med. 27 (4), 314-331 (2021).
  3. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Ups J Med Sci. 120 (3), (2015).
  4. Wautier, J. -L., Wautier, M. -P. Vascular Permeability in Diseases. Int. J. Mol. Sci. 23 (7), (2022).
  5. Higashi, Y., Kihara, Y., Noma, K. Endothelial dysfunction and hypertension in aging. Hypertens Res. 35 (11), (2012).
  6. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med (Lausanne). 8, 798958(2022).
  7. Park, W., Lee, J. -S., Gao, G., Kim, B. S., Cho, D. -W. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 14 (1), 7696(2023).
  8. Sun, H. -J., Wu, Z. -Y., Nie, X. -W., Bian, J. -S. Role of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the link between inflammation and hydrogen sulfide. Front Pharmacol. 10, 1568(2020).
  9. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier.". Front Neurosci. 17, 1047778(2023).
  10. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  11. De Vriese, A. S., Verbeuren, T. J., Van de Voorde, J., Lameire, N. H., Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction in diabetes. Br J Pharmacol. 130 (5), 963-974 (2000).
  12. Wang, K., et al. Inflammatory environment promotes the adhesion of tumor cells to brain microvascular endothelial cells. Front Oncol. 11, 691771(2021).
  13. Tiwary, S., et al. Metastatic brain tumors disrupt the blood-brain barrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of the endothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a. Sci Rep. 8 (1), 8267(2018).
  14. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2 (1), 281-298 (2011).
  15. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC Basic Transl Sci. 4 (7), 845-854 (2019).
  16. Morgan, S. J., et al. Use of animal models of human disease for nonclinical safety assessment of novel pharmaceuticals. Toxicol Pathol. 41 (3), 508-518 (2013).
  17. Rotman, D. Can Pfizer deliver. MIT Technology Review. , Available from: https://www.technologyreview.com/2004/02/01/233321/can-pfizer-deliver/ (2004).
  18. Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
  19. Xu, Z., et al. Design and construction of a multi-organ microfluidic chip mimicking the in vivo microenvironment of lung cancer metastasis. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (39), 25840-25847 (2016).
  20. Strobel, H. A., et al. Assembly of tissue-engineered blood vessels with spatially controlled heterogeneities. Tissue Eng Part A. 24 (19-20), 1492-1503 (2018).
  21. Atchison, L., Zhang, H., Cao, K., Truskey, G. A. A Tissue engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome using human iPSC-derived smooth muscle sells. Sci Rep. 7 (1), 8168(2017).
  22. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  23. Gold, K. A., et al. 3D bioprinted multicellular vascular models. Adv Healthc Mater. 10 (21), 2101141(2021).
  24. Tabriz, A. G., Hermida, M. A., Leslie, N. R., Shu, W. Three-dimensional bioprinting of complex cell laden alginate hydrogel structures. Biofabrication. 7 (4), 045012(2015).
  25. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Adv. Funct. Mater. 27 (33), 1700798(2017).
  26. Cho, W. -W., Ahn, M., Kim, B. S., Cho, D. -W. Blood-lymphatic integrated system with heterogeneous melanoma spheroids via in-bath three-dimensional bioprinting for modelling of combinational targeted therapy. Adv Sci (Weinh). 9 (29), 2202093(2022).
  27. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  28. Polacheck, W. J., Kutys, M. L., Tefft, J. B., Chen, C. S. Microfabricated blood vessels for modeling the vascular transport barrier. Nat Protoc. 14 (5), 1425-1454 (2019).
  29. Li, H., et al. Expanding sacrificially printed microfluidic channel-embedded paper devices for construction of volumetric tissue models in vitro. Biofabrication. 12 (4), 045027(2020).
  30. Gao, G., Park, J. Y., Kim, B. S., Jang, J., Cho, D. Coaxial cell printing of freestanding, perfusable, and functional in vitro vascular models for recapitulation of native vascular endothelium pathophysiology. Adv Healthc Mater. 7 (23), 1801102(2018).
  31. Farasatkia, A., Kharaziha, M., Ashrafizadeh, F., Salehi, S. Transparent silk/gelatin methacrylate (GelMA) fibrillar film for corneal regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 120, 111744(2021).
  32. Duong, V. T., et al. Double-layered blood vessels over 3 mm in diameter extruded by the inverse-gravity technique. Biofabrication. 15 (4), 045022(2023).
  33. Luo, L., et al. Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries. Bioact Mater. 6 (3), 638-654 (2021).
  34. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  35. Wang, Y., et al. Development of a photo-crosslinking, biodegradable GelMA/PEGDA hydrogel for guided bone regeneration materials. Materials. 11 (8), 1345(2018).
  36. Han, Y., et al. Biomimetic injectable hydrogel microspheres with enhanced lubrication and controllable drug release for the treatment of osteoarthritis. Bioact Mater. 6 (10), 3596-3607 (2021).
  37. Bupphathong, S., et al. Gelatin methacrylate hydrogel for tissue engineering applications-a review on material modifications. Pharmaceuticals. 15 (2), 171(2022).
  38. Wu, Z., et al. Microfluidic printing of tunable hollow microfibers for vascular tissue engineering. Adv Mater Technol. 6 (8), 2000683(2021).
  39. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., Jacobo-Albavera, L. Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review. Appl. Sci. 10 (3), 938(2020).
  40. Khattak, S. F., Bhatia, S. R., Roberts, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Eng. 11 (5-6), 974-983 (2005).
  41. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  42. Kim, S. -J., et al. Bioprinting methods for fabricating in vitro tubular blood vessel models. Cyborg Bionic Syst. 4, 0043(2023).
  43. Maji, S., Lee, M., Lee, J., Lee, J., Lee, H. Development of lumen-based perfusable 3D liver in vitro model using single-step bioprinting with composite bioinks. Mater Today Bio. 21, 100723(2023).
  44. Pauty, J., et al. A vascular permeability assay using an in vitro human microvessel model mimicking the inflammatory condition. Nanotheranostics. 1 (1), 103-113 (2017).
  45. van Duinen, V., et al. 96 perfusable blood vessels to study vascular permeability in vitro. Sci Rep. 7 (1), 18071(2017).
  46. Pink, D. B. S., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS ONE. 7 (3), e33760(2012).
  47. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. AAdv Healthc Mater. 12 (18), 2300151(2023).
  48. Zhang, F., Lin, D. S. Y., Rajasekar, S., Sotra, A., Zhang, B. Pump-less platform enables long-term recirculating perfusion of 3D printed tubular tissues. Adv Healthc Mater. 12 (27), 2300423(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D BioprintingVascular Tissue ModelsEndothelial CellsHydrogel ChannelsPerfusable VesselsImmunostaining CD31Blood Vessel Modeling

Powiązane artykuły