Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66676

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Streszczenie

Przepuszczalność naczyń jest kluczowym czynnikiem w opracowywaniu terapii zaburzeń związanych z uszkodzonym śródbłonkiem, takich jak dysfunkcja śródbłonka w tętnicach wieńcowych i upośledzona funkcja bariery krew-mózg. Istniejące techniki wytwarzania nie odtwarzają odpowiednio geometrycznej zmienności sieci naczyniowych w ludzkim ciele, co znacząco wpływa na postęp choroby; Co więcej, techniki te często obejmują wieloetapowe procedury produkcyjne, które utrudniają produkcję o wysokiej przepustowości niezbędną do przeprowadzania testów farmakologicznych. W artykule przedstawiono protokół biodruku do tworzenia wielu tkanek naczyniowych o pożądanych wzorach i rozmiarach bezpośrednio na standardowych płytkach sześciodołkowych, pokonując istniejące wyzwania związane z rozdzielczością i wydajnością w technologii biodruku. Ustalono uproszczone podejście do wytwarzania w celu skonstruowania sześciu pustych, przepuszczalnych kanałów w hydrożelu, które następnie wyłożono ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej, tworząc funkcjonalny i dojrzały śródbłonek. Sterowany komputerowo charakter biodruku 3D zapewnia wysoką powtarzalność i wymaga mniejszej liczby ręcznych etapów wytwarzania niż tradycyjne metody. Podkreśla to potencjał VOP jako wydajnej, wysokoprzepustowej platformy do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych i postępów w odkrywaniu leków.

Wprowadzenie

Sieć naczyniowa w całym ludzkim ciele funkcjonuje jako kluczowa bariera transportowa, dynamicznie regulując wymianę cząsteczek i komórek między krwią a otaczającymi tkankami. Regulacja ta jest niezbędna do zapobiegania obrzękom tkanek i umożliwienia selektywnej wymiany składników odżywczych i komórek, wspierając w ten sposób metabolizm tkankowy i homeostazę1. Zmieniona przepuszczalność śródbłonka, czynnik wielu schorzeń, wpływa zarówno na nasilenie choroby, jak i na skuteczność leczenia2. Śródbłonek naczyniowy działa jak selektywna bariera, ułatwiając przenoszenie między naczyniami, tkankami i narządami. Regulacja ta obejmuje kilka mechanizmów, takich jak podstawowe filtrowanie substancji rozpuszczonych i małych cząsteczek, celowe przerwanie bariery naczyniowej oraz wpływ cząsteczek, takich jak prostaglandyny i czynniki wzrostu, na poziom przepuszczalności3.

Kluczowe czynniki w tej regulacji obejmują połączenia komórek śródbłonka, migrację leukocytów oraz funkcjonalność bariery krew-mózg4. Biorąc pod uwagę jego złożoność, proces ten różni się w różnych środowiskach, obejmując różne typy naczyń krwionośnych i wykorzystując różne ścieżki anatomiczne. Zrozumienie biologicznych podstaw przepuszczalności naczyń krwionośnych ma kluczowe znaczenie dla opracowania podejść terapeutycznych w leczeniu stanów związanych z nieprawidłową przepuszczalnością naczyń. Utrzymanie przepuszczalności naczyń ma kluczowe znaczenie dla zdrowia układu naczyniowego i otaczających tkanek; W konsekwencji upośledzenie tej funkcji prowadzi do dysfunkcji śródbłonka, stanu, w którym śródbłonek traci swoją normalną funkcjonalność.

Dysfunkcja śródbłonka jest prekursorem wielu powszechnych chorób u ludzi, w tym nadciśnienia, choroby wieńcowej, cukrzycy i raka5,6,7. Stan ten może objawiać się na kilka sposobów, w tym zmniejszonym rozszerzeniem naczyń krwionośnych, zwiększoną przepuszczalnością naczyń krwionośnych i tendencją do stanu prozapalnego. Ten patologiczny stan jest najwcześniejszym etapem kilku krytycznych problemów sercowo-naczyniowych, takich jak choroba wieńcowa, udar mózgu i choroba tętnic obwodowych8, które nadal są głównymi przyczynami śmiertelności w Stanach Zjednoczonych1. Dysfunkcja śródbłonka wpływa na zdrowie układu sercowo-naczyniowego, a także na barierę krew-mózg (BBB) i odgrywa ważną rolę w postępie różnych zaburzeń neurologicznych. Dysfunkcja może zwiększać przepuszczalność bariery krew-mózg, umożliwiając w ten sposób przenikanie toksyn, patogenów i komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego i przyczyniając się do zaburzeń neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane i infekcje mózgu9.

Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy charakteryzuje się upośledzoną zdolnością śródbłonka do regulowania napięcia naczyniowego i wytwarzania mediatorów rozszerzających naczynia krwionośne, takich jak tlenek azotu, co prowadzi do upośledzenia rozszerzenia naczyń krwionośnych10. Stan ten jest pogarszany przez szlaki wywołane hiperglikemią, takie jak aktywacja kinazy białkowej C i stres oksydacyjny, co znacząco przyczynia się do postępu cukrzycowej choroby naczyniowej11. Co więcej, stwierdzono, że środowisko zapalne zwiększa adhezję komórek nowotworowych do komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, podczas gdy nieszczelny śródbłonek został uznany za główny czynnik przerzutów raka12,13. Stwierdzono, że geometria naczyń krwionośnych ma bezpośredni wpływ na przerzuty raka mózgu. Komórki nowotworowe preferencyjnie przyczepiają się do obszarów o większej krzywiźnie naczyń krwionośnych7. Odkrycie to podkreśla znaczenie geometrii naczyń krwionośnych w przerzutach raka. Co ważniejsze, w stanach takich jak zwłóknienie i rak, zaburzona funkcja bariery śródbłonkowej nie tylko odgrywa rolę w rozwoju choroby, ale także utrudnia skuteczność leczenia, utrudniając odpowiednie dostarczanie leków14. Badania nad przepuszczalnością naczyń krwionośnych mają kluczowe znaczenie dla postępu w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych i oferują wgląd w radzenie sobie z innymi chorobami związanymi z upośledzoną funkcją naczyń krwionośnych.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę przepuszczalności naczyń krwionośnych w zdrowiu i chorobie, wiele badań skupiło się na zbadaniu selektywnej natury bariery śródbłonkowej dla rozwoju terapeutycznego przy użyciu modeli zwierzęcych, obok tradycyjnych platform testowych 2D i 3D in vitro. Modele zwierzęce mają jednak ograniczenia wynikające z różnic gatunkowych i kwestii etycznych, a także wysokich kosztów15,16. Na przykład firma Pfizer w 2004 roku stwierdziła, że w ciągu ostatnich 10 lat wydała ponad 2 miliardy dolarów na opracowanie leków, które wykazały obiecujące efekty w modelach zwierzęcych, ale ostatecznie zawiodły na zaawansowanych etapach testów na ludziach17. Co więcej, tradycyjne modele 2D nie naśladują dokładnie architektury trójwymiarowej (3D) i złożonej struktury geometrycznej kanałów naczyniowych.

Wraz z postępem w technologiach biofabrykacji, szeroko zakrojone wysiłki zostały skierowane na wytwarzanie kanałów naczyniowych przy jednoczesnym podsumowaniu architektury 3D. Kanały naczyniowe w mikroskali mogą być skutecznie wytwarzane w mikroprzepływowych chipach przy użyciu miękkiej litografii, oferując w ten sposób przewagę analizy w czasie rzeczywistym18,19. Alternatywne metody, takie jak odlewanie hydrożelowe lub owijanie arkuszy komórkowych wokół formy lub trzpienia, mogą być stosowane do tworzenia wolnostojących konstrukcji rurowych o pożądanej średnicy20,21. Metody te mają jednak ograniczenia; Na przykład chipy mikroprzepływowe są ograniczone do konfiguracji mikrokanałowych, a odlewanie hydrożelu wokół formy nie odwzorowuje skutecznie wielu geometrii.

Wraz z pojawieniem się technologii biodruku 3D22, możliwe stało się replikowanie złożonych geometrii poprzez precyzyjne osadzanie różnych materiałów hydrożelowych na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)23,24. Niektóre metody biodruku, takie jak te wykorzystujące koncentrycznie ułożone dysze, np. koncentryczne i trójosiowe25,26, nie mogą tworzyć rozwidlonych rur; Jednak złożone struktury można osiągnąć za pomocą metod tworzenia wzorców ofiarnych27. Wykazano, że żadna z tych metod biodruku nie umożliwia wysokoprzepustowego modelowania in vitro, co jest kluczowym wymogiem dla badań farmakologicznych w odkrywaniu leków. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wydajnego wytwarzania śródbłonkowych kanałów naczyniowych z efektywną kontrolą wymiarów.

Ustaliliśmy proste podejście, używając dostępnych na rynku płytek sześciodołkowych, w połączeniu z metodą wzorowania ofiarnego, w której biodrukarka wytwarza kanały naczyniowe o pożądanych rozmiarach i wzorach w hydrożelu ECM. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wysiane w celu endotelializacji tych kanałów i oceny funkcjonalności śródbłonka za pomocą testu przepuszczalności. Taka konstrukcja umożliwia perfuzję bez pompy, tworząc zbiorniki mediów po obu stronach kanału i wykorzystuje przepływ napędzany grawitacją za pomocą powszechnie używanego kołyska 2D do naśladowania dynamicznej kultury. Takie podejście eliminuje potrzebę stosowania pomp perystaltycznych i ułatwia skalowalność tej platformy dla zastosowań o wysokiej przepustowości. Sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D usprawnia również proces produkcji, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia błędów podczas produkcji. Model VOP jest obiecujący jako cenne narzędzie do badań farmakologicznych w procesie odkrywania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie G-kodu dla biodrukarki

  1. Aby wygenerować i zwizualizować ścieżkę druku, należy skorzystać z internetowego narzędzia do symulacji G-kodu (np. NCviewer).
  2. Kliknij ikonę New File w interfejsie, aby utworzyć nowy plik G-kodu.
  3. Wygeneruj ścieżkę druku, ręcznie wpisując polecenia G-kodu dla kanału poświęcalnego oraz komory krzemowej. Jako punkt odniesienia przy tworzeniu geometrii należy przyjąć wymiary standardowej płytki 6-dołkowej.
    UWAGA: G-kod użyty w tej procedurze opiera się na kodzie sterowania numerycznego (CNC). Funkcje poszczególnych poleceń przedstawiono w Supplemental Table S1. Format płytki 6-dołkowej wybrano ze względu na kompatybilność z komercyjnymi czytnikami mikro płytek i układami mikroskopowymi oraz możliwość pomieszczenia odpowiednich objętości pożywki niezbędnych do dojrzewania śródbłonka, co minimalizuje konieczność częstych wymian medium. Ten protokół wykonania można również dostosować do innych standardowych płytek wielodołkowych.
  4. Po zakończeniu pisania G-kodu kliknij ikonę Save File w interfejsie, aby pobrać plik z rozszerzeniem .nc.
    UWAGA: Do generowania ścieżek druku można użyć każdego innego dostępnego algorytmu generowania G-kodu. Geometrię kanału naczyniowego można modyfikować w tym G-kodzie.

2. Przygotowanie tuszy do komór krzemowych i warstw poświęcalnych

UWAGA: Źródła wszystkich materiałów użytych w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

  1. Połącz dwa rodzaje polimerów silikonowych, SE1700 i polidimetylosiloksan (PDMS), w stosunku 10:2. Dodaj czynnik sieciujący dla każdego polimeru w stosunku 10:1 (polimer do czynnika sieciującego).
  2. Użyj mieszadła planetarnego, aby dokładnie wymieszać i odgazować mieszaninę polimerową przy 2 000 rpm.
  3. Za pomocą szpatułki przenieś wymieszany polimer silikonowy do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mL. Odwiruj napełnioną strzykawkę przy 400 × g przez 3 min w temperaturze 5 °C, aby zapewnić jednorodną konsystencję i uniknąć pęcherzyków powietrza podczas drukowania.
    UWAGA: Atrament do komory należy zużyć w ciągu 2 h od dodania czynników sieciujących, aby zapewnić optymalną jakość druku. Przechowuj strzykawkę w temperaturze 5 °C podczas przygotowań do drukowania. Proces ten pomaga spowolnić sieciowanie atramentu, co w przeciwnym razie mogłoby zmienić parametry drukowania.
  4. Odważ Pluronic F-127 (PF127), aby przygotować 40% (w/v) roztwór zapasu PF127 w wodzie destylowanej.
  5. Mieszaj roztwór PF127 w mieszadle planetarnym przez 3 min przy 400 × g w celu uzyskania homogeniczności. Przechowuj zhomogenizowaną mieszaninę w temperaturze 4 °C do całkowitego rozpuszczenia PF127.
  6. Przygotuj roztwór zapasu trombiny o stężeniu 1 000 units/mL w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS).
    UWAGA: Przechowuj roztwór zapasu trombiny w aliquotach po 100 µL, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Alikwoty powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez 6 miesięcy.
  7. Przed drukowaniem przygotuj atrament poświęcalny, mieszając trombinę w rozcieńczeniu 1:10 z PF127 do końcowego stężenia roboczego 36% (w/v) dla PF127 i 100 units/mL dla trombiny. Aby przygotować 1 mL atramentu poświęcalnego, zmieszaj 100 µL roztworu zapasu trombiny z 900 µL roztworu zapasu PF127.
    UWAGA: Przy przygotowywaniu atramentu poświęcalnego do wydrukowania pojedynczej płytki objętość całkowita 1 mL jest w zupełności wystarczająca.

3. Proces wytwarzania

  1. Przed rozpoczęciem procesu wytwarzania, poddaj płytkę sześciodołkową działaniu plazmy tlenowej (O2) o mocy 100 watów przez 1 min.
  2. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2, aby przygotować zarówno tusze poświęcalne, jak i silikonowe, upewniając się, że tusze są wolne od pęcherzyków powietrza i homogenicznie wymieszane w celu zapewnienia spójności drukowania. Ostrożnie wprowadź tusze do głowicy biodrukarki. Ustaw temperaturę głowicy biodrukarki na 37 °C dla tuszu poświęcalnego i 5 °C dla tuszu silikonowego.
  3. Zamocuj stożkową dyszę z podwójnym gwintem 22 G do strzykawki z silikonem. W przypadku tuszu poświęcalnego dobierz rozmiar dyszy zgodnie z pożądaną średnicą kanału.
    UWAGA: W tym przypadku zademonstrowano trzy rozmiary dysz: 18 G, 20 G i 22 G. Optymalne parametry drukowania, w tym ciśnienie drukowania i prędkość głowicy, zostały przedstawione w Tabeli 1.
  4. Wgraj odpowiedni G-kod i naciśnij funkcję servo ready w interfejsie oprogramowania biodrukarki przez 3 s. Umieść płytkę na stole w punkcie startowym G-kodu i kliknij start, aby rozpocząć proces drukowania.
    UWAGA: Zazwyczaj wytwarzanie jednej płytki zawierającej sześć komór zajmuje około 1 h i 10 min. Krok 3.4, obejmujący wgranie i wykonanie G-kodu, może się różnić w zależności od użytej biodrukarki. Upewnij się, że podczas korzystania z biodrukarki zachowane są warunki sterylne, aby uniknąć kontaminacji.
  5. Przykryj płytkę pokrywką i przenieś ją do nawilżonego inkubatora CO2 w temperaturze 37 °C na 72 h, aby utwardzić silikonowe komory.
    UWAGA: Chociaż utwardzanie silikonu może przebiegać wolniej wewnątrz inkubatora, płytki nie wolno umieszczać w suchej suszarce.

4. Przygotowanie hydrożelu i osadzanie kanałów

  1. Przygotować probówkę stożkową o pojemności 50 mL zawierającą 20 mL 1x PBS. Do probówki dodać 0,01 g fenylo-2,4,6-trimetylbenzoylofosfinianu litu (LAP), aby przygotować 0,05% (w/v) roztwór LAP. Mieszać na wstrząsarze Vortex do całkowitego rozpuszczenia proszku.
    UWAGA: Probówkę stożkową należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Roztwór zapasowy LAP przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Do 20 mL roztworu LAP dodać 3 g żelatyny metakrylowej (GelMA) i 0,2 g fibrynogenu, aby uzyskać końcowe stężenie 15% GelMA i 1% fibrynogenu (oznaczane jako GelFib). Umieścić mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać na wstrząsarzu Vortex, aż roztwór zostanie całkowicie rozpuszczony.
  3. Po wykonaniu etapu opisanego w Sekcji 3, dodać 300 µL uprzednio ogrzanego GelFib do każdej komory hydrożelowej, aby zatopić wzór poświęcalny. Szybko sieciować GelMA światłem ultrafioletowym (UV) o długości fali 405 nm i natężeniu 85 mW/cm2 przez 120 s. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich pozostałych studni.
    UWAGA: Fibrynogen sieciuje szybko w kontakcie ze wzorem poświęcalnym zawierającym trombinę. Zaleca się dodawanie hydrożelu i przeprowadzanie sieciowania UV oddzielnie dla każdej studni, aby uniknąć niepożądanego żelowania GelMA w temperaturze pokojowej. Ponadto należy zachować warunki sterylne, aby zapobiec kontaminacji podczas procesu utwardzania UV.
  4. Dodać 1 mL DPBS po każdej stronie kanału naczyniowego w każdej studni i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez 15 min, aby upłynnić PF127.
  5. Po 15 min odessać DPBS i powtórzyć krok 4.5 trzykrotnie, aby całkowicie wypłukać PF127.
  6. Przed wprowadzeniem komórek do kanałów, perfundować kanały medium DMEM F12 zawierającym 1% Matrigel przez 30 min, aby zwiększyć adhezję komórek.

5. Hodowla HUVEC

  1. Podgrzej medium do wzrostu komórek śródbłonka (ECGM) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. W tym czasie wyjmij fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami HUVEC ze zbiornika z azotem, delikatnie poluzuj zakrętkę fiolki, a następnie ponownie ją dokręć, aby usunąć azot z gwintów. Natychmiast rozmroź komórki, zanurzając fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 min, dbając o to, aby wewnątrz fiolki pozostała niewielka ilość lodu. Przepłucz fiolkę 70% etanolem, aby zapobiec kontaminacji.
    UWAGA: Podczas wyjmowania komórek ze zbiornika z azotem należy nosić okulary ochronne. Zakrętka fiolki musi znajdować się powyżej poziomu wody podczas tego procesu.
  3. Przygotuj probówkę stożkową 15 mL zawierającą 5 mL podgrzanego medium ECGM. Za pomocą mikropipety ostrożnie przenieś rozmrożone komórki z fiolki do probówki stożkowej. Aby upewnić się, że żadne komórki nie pozostały w fiolce, dodaj 1 mL świeżego podgrzanego medium do kriofiolki, przepłucz jej wnętrze i przenieś pozostałe komórki do probówki stożkowej.
  4. Wirowaj probówkę stożkową przy 200 × g przez 3 min, aby uzyskać osad komórkowy. Odlej nadsącz, resuspenduj komórki w 10 mL świeżego medium, przenieś komórki do kolby T75 i umieść kolbę w inkubatorze CO2 z wilgotną atmosferą w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten krok jest istotny, aby poprzez wirowanie usunąć dimetylosulfotlenek obecny w medium do mrożenia w kriofiolce.
  5. Wymieniaj medium co drugi dzień, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji.

6. Endoteliacja kanałów

  1. Podgrzej wstępnie ECGM, DPBS, roztwór neutralizujący trypsynę oraz trypsynę z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (TE) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Przy 90% konfluencji wypłucz komórki w kolbie T75 za pomocą 10 mL DPBS, dodaj do kolby 1 mL 0,25% TE i inkubuj przez 3 min.
  3. Delikatnie opukaj ścianki kolby i dodaj 5 mL roztworu neutralizującego trypsynę, aby zneutralizować TE. Przenieś komórki do stożkowej probówki 15 mL. Użyj 5 mL świeżego ECGM do zebrania pozostałych komórek i dodaj je do probówki stożkowej.
  4. Wiruj probówkę stożkową przy 250 × g przez 3 min, aby uzyskać osad komórkowy.
  5. Odlej nadosad i resuspenduj osad komórkowy w 1 mL świeżego ECGM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i powtórz krok 6.4, aby uzyskać osad komórkowy. Resuspenduj 3 miliony komórek w 90 µL świeżego ECGM.
  6. Przed wprowadzeniem zawiesiny komórkowej do kanału krótko odessaj zawartość kanału za pomocą odkurzacza, aby oczyścić jego światło.
    UWAGA: Unikaj przedłużonego odsysania z kanału, aby nie naruszyć jego integralności.
  7. Delikatnie załaduj kanał zawiesiną komórkową przy gęstości zasiewu 0,5 miliona komórek na studzienkę. Użyj mikropipety, aby dodać ~15 µL tej zawiesiny w celu wypełnienia kanału.
    UWAGA: Gęstość zasiewu może się różnić w zależności od rozmiaru kanału. Gęstość ta jest zoptymalizowana dla kanału wydrukowanego dyszą 20 G o średnicy wewnętrznej około 900 µm.
  8. Umieść płytkę płasko w inkubatorze na 2 h. Następnie odwróć płytkę o 180°, utrzymując ją w pozycji płaskiej przez kolejne 2 h.
  9. Po 4 h przemyj kanał DPBS, aby usunąć nieprzylegające i martwe komórki. Dodaj 2 mL świeżego ECGM do każdej studzienki (1 mL po każdej stronie kanału). Rozpocznij kulturę dynamiczną na wytrząsarce przy kącie nachylenia 10° i prędkości 5 rpm, ustawiając płytkę na wytrząsarce tak, aby kanały były równoległe do kierunku kołysania. Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.
    UWAGA: Kultura dynamiczna usprawnia wymianę pożywki między zbiornikami a kanałami i wspomaga proliferację komórek w nocy.

7. Ocena dojrzewania śródbłonka

  1. Podgrzej ECGM i DPBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min, a odczynik Cell Counting Kit-8 (CCK8) w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotuj roztwór roboczy CCK8, mieszając 100 µL odczynnika CCK8 z 1 mL świeżego ECGM na każdą studzienkę. Przy pracy z płytką 6-kanałową przygotuj 600 µL odczynnika CCK8, łącząc go z 6 mL świeżego ECGM.
  3. Usuń pożywkę wzrostową za pomocą odsysacza i przepłucz kanały DPBS. Do każdej studzienki dodaj 1 mL roztworu roboczego CCK8 i pozostaw płytkę w pozycji poziomej w inkubatorze na 30 min. Następnie rozpocznij hodowlę dynamiczną na wytrząsarce, zgodnie z opisem w kroku 6.9, i kontynuuj ten proces przez kolejne 3 h.
  4. Po 3 h usuń zawartość każdej studzienki, przechylając płytkę na jedną stronę, i przenieś ją do nowej płytki sześciodołkowej. Przepłucz kanały DPBS i dodaj świeżą pożywkę.
    UWAGA: Przykryj płytkę folią aluminiową do momentu pomiaru absorbancji. Zachowaj taką samą objętość odczynnika we wszystkich studzienkach, aby zapewnić jednolitość odczytów. Podczas pipetowania unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą zaburzyć dokładność pomiarów gęstości optycznej.
  5. Po delikatnym potrząśnięciu płytką przez 15 s w celu zapewnienia równomiernego wymieszania barwnika, zmierz absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  6. Powtórz tę procedurę w określonych odstępach czasu. Oblicz średnią gęstość optyczną dla każdego punktu czasowego i wykreśl krzywą wzrostu w oprogramowaniu graficznym. Krzywa ta wskazuje względną maturację śródbłonka w czasie.

8. Analiza przepuszczalności

  1. Usunąć medium z jednego wybranego dołka.
    UWAGA: W przypadku testu przepuszczalności zaleca się przetwarzanie każdego dołka oddzielnie, aby zapobiec wysychaniu pozostałych kanałów, co mogłoby zmienić ich przepuszczalność naczyniową.
  2. Przygotować 6 mL roztworu dekstranu sprzężonego z FITC o stężeniu 0.1 mg/mL poprzez rozpuszczenie dekstranu FITC 70 kDa w DPBS.
    UWAGA: Przygotować roztwór zapasowy dekstranu FITC o stężeniu 20 mg/mL, rozpuszczając 100 mg dekstranu FITC w 5 mL DPBS. Po delikatnym wymieszaniu roztworu na wirówce typu vortex, rozdzielić go na alikwoty po 500 µL do probótek 1.5 mL, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Alikwoty te można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Przed przeprowadzeniem testu rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia roboczego 0.1 mg/mL.
  3. Mocno ustawić płytkę na stoliku mikroskopu i dostosować powiększenie obiektywu w trybie kontrastu fazowego, aby zapewnić wyraczną widoczność ścianki kanału w obszarze zainteresowania oraz znajdującego się w pobliżu żelu w polu widzenia.
    UWAGA: Aby skutecznie ocenić przepuszczalność, należy dążyć do maksymalizacji powierzchni żelu otaczającego obszar zainteresowania w polu widzenia; aspekt ten jest kluczowy dla dokładnego monitorowania transportu dekstranu.
  4. Po ustawieniu ostrości na pożądanym obszarze przełączyć tryb z kontrastu fazowego na fluorescencję. W zakładce image acquisition dodać FITC do widefield channel i wykonać zdjęcie przed dodaniem roztworu dekstranu, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Następnie dodać 1 mL roboczego roztworu dekstranu FITC po jednej stronie kanału i pozwolić roztworowi przepłynąć w stronę drugiej strony dołka, napędzanemu różnicą ciśnień hydrostatycznych.
  5. Wykonuje zdjęcia w określonych odstępach czasu – częściej w przypadku kanałów o wysokiej przepuszczalności i rzadziej w przypadku kanałów o niższej przepuszczalności.

9. Pomiar intensywności fluorescencji w programie ImageJ

  1. W oprogramowaniu do analizy obrazów ImageJ zmierz intensywność w początkowym punkcie czasowym (IProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.), średnia intensywność zaobserwowana w późniejszym punkcie czasowym (It2), a także intensywność szumu tła (Ib), zgodnie z poniższym opisem. Należy użyć równania (1) w celu obliczenia współczynnika przenikalności (Pd). t1 oraz t2 odnieś się do początkowego i późniejszych punktów czasowych akwizycji obrazów.
    Równanie Pd dla analizy przekazywania ciepła; formuła matematyczna związana z badaniami przewodności cieplnej.        (1)
    1. Uruchom program ImageJ i otwórz obraz pozyskany w początkowym punkcie czasowym.
    2. Ustaw skalę w programie ImageJ. Przejdź do Analiza | Ustawienie skaliWprowadź znaną skalę i jednostkę pomiaru.
    3. Wybierz narzędzie prostokąta następnie narysuj prostokąt na obszarze żelu, w którym wymagany jest pomiar intensywności fluorescencji.
    4. Przejdź do Analiza | Ustawienia pomiarów i upewnij się, że Średnia wartość szarości zostało sprawdzone.
      UWAGA: Ta opcja mierzy średnią intensywność w obrębie wybranego obszaru. W zależności od potrzeb danej analizy można wybrać inne parametry.
    5. Przy zachowaniu zaznaczonego obszaru przejdź do Analizuj | Mierz lub po prostu naciśnij MOdczekać do Wyniki otwarte okno, wyświetlające średnią intensywność fluorescencji oraz wszelkie inne wybrane parametry.
    6. Wykonaj trzy pomiary i oblicz średnią wartość intensywności fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym.
    7. Powtórz tę procedurę dla obrazów zarejestrowanych w kolejnym punkcie czasowym t2oraz zdjęcia wykonane przed dodaniem roztworu dekstranu w celu obliczenia natężenia fluorescencji w późniejszym punkcie czasowym, aby określić fluorescencję tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Platformę VOP, charakteryzującą się elastycznością w zakresie rozmiaru i wzoru, wykonano za pomocą wielogłowicowego systemu biodruku. Kanały, zarówno puste w środku, jak i zdolne do perfuzji, zasiedlono komórkami HUVEC w celu umożliwienia endotelializacji, a następnie oceniono za pomocą testu przepuszczalności (Rysunek 1A). Aby zademonstrować wielkoskalowe możliwości produkcyjne tej metody, wydrukowaliśmy trzy różne konfiguracje: prostą, rozwidloną i skomplikowaną (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystując precyzję, automatyzację i sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D, opracowaliśmy uproszczoną metodę wytwarzania kanałów naczyniowych w standardowych płytkach sześciodołkowych, które zostały wybrane ze względu na ich kompatybilność z komercyjnymi czytnikami mikropłytek i zestawami do obrazowania mikroskopowego. Konstrukcja płyty może pomieścić kanały o wielu rozmiarach i wystarczającą objętość mediów do wzrostu większych kanałów przy jednoczesnym zmniejszeniu niezbędnej częstotliwości zmian m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT, MSIT) [Nie. NRF-2019R1C1C1009606; Nr 2020R1A5A8018367; i Nie. RS-2024-00423107]. Badania te były wspierane przez Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych grantów NRF finansowanych przez MSIT [No. NRF-2022M3A9E4017151 i nr NRF-2022M3A9E4082654]. Prace te były wspierane przez Program Innowacji Technologicznych [nr 20015148] oraz Projekt Alchemik [nr 20012378] finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE, Korea). Prace te były również wspierane przez Koreański Instytut Planowania i Oceny Technologii w Żywności, Rolnictwie i Leśnictwie (IPET) w ramach Programu Technologii Konwergencji Rolnictwa i Żywności na rzecz Rozwoju Siły Roboczej, finansowanego przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wsi (MAFRA) [No. RS-2024-00397026].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlSPLSPL 91010
Strzykawka 10 ml Shinchang Medical
15 ml tubka stożkowaSPL50015
Biodrukarka 3D T& R Biofab3DX-Drukarka
6-dołkowa płytka SPL37206
Szafy bezpieczeństwa biologicznegoCHC LABPCHC-777A2-04, 
Mikroskopy odwrócone Brightfield ZestawLeicaDMi1
(CCK8)GlpBioGK10001
(CCK8)GlpBioGK10001
75TSPL70075
Matryca membrany podstawnej Corning Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR), bez LDEV, 10 mlCorning354230
destylowana
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, KlasaSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a ZestawDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1,1 KG Zestaw DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2 (gotowa do użycia)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipeta(1000,200,100,20,10)eppendorf
Alkohol etylowy 99,9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrynogen z osocza bydlęcegoSigma AldrichF8630-1G
FITC Dekstran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Koraliki fluorescencyjne (1,0 μ m, zielony)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-powder (metakrylan żelatyny) 50 gMateriały 3D 20JT29
- Gibco, Pożywka do zamrażania kultur komórkowych z regeneracji, 50 mlGibco
HUVECs (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej)Oprogramowanie Promocell
ImageJNIH
Thermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 Inkubator
CO2Invitrogen, zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności (dla komórek ssaków)Thermo FisherL3224
Fosforan litowo-fenylowy (2,4,6-trimetylobenzoilo) w proszku Tokoyo Przemysł chemiczny CO.Numer katalogowy: 85073-19-4 
Marienfeld Superior, Pokrywa komory liczeniaMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometr, komora do liczenia komórekMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MikrowirówkaeppendorfWirówka 5920 R
NCViewer.com
Zbiornik azotuWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Laser UVOmnicure EXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)GenDEPOTCA005-010
Mikser planetarnyTHINKY CORPORATION, japoniaARE-310
Maszyna do obróbki plazmowejFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Gotowy bufor, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Szafka do przechowywania odczynnikówZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Mikroskop do obrazowania komórek na żywo w czasie rzeczywistymCarl ZEISS
LodówkaSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D cyfrowyIKA4003000
Scoop-SpatulaCacheBySL-SCO7001-EA
sigma, Trypsyna-EDTA solition, 0,25%Sigma aldrichT4049-100ML
Dodecyl siarczan sodu (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Nasadka na końcówkę lufy strzykawkiFISNAR3051806
Licznik TallyFirma kontrolna  C23-147-050
Dysza stożkowa (18 G)MushashiTPND-18G-U
Dysza stożkowa (22 G)MushashiTPND-22G-U
Dysza stożkowa 20 GMusashiTPND-20G-U
Trombina z osocza bydlęcegoSigma AldrichT7326-1KU
Timer, 4-kanałowyETLSL. Tim3005
Trypan Blue Solution 0,4%Gibco15250061
Roztwór neutralizujący trypsynęPromocellC-41120
UG 24 mL słoik do maści UGYamayunr 3-53
UG 58 mL słoik maści UGYamayuNo. 3-55
Kąpiel wodnaDAIHAN ScientificWB-11
Maszyna do ważeniaSartoriusbce2241-1skr
do liczenia komórek Zestaw do liczenia komórek Kolba do hodowli komórkowych Woda hodowli komórkowych Inkubator powiedział:

Bibliografia

  1. O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
  2. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends Mol Med. 27 (4), 314-331 (2021).
  3. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Ups J Med Sci. 120 (3), (2015).
  4. Wautier, J. -L., Wautier, M. -P. Vascular Permeability in Diseases. Int. J. Mol. Sci. 23 (7), (2022).
  5. Higashi, Y., Kihara, Y., Noma, K. Endothelial dysfunction and hypertension in aging. Hypertens Res. 35 (11), (2012).
  6. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med (Lausanne). 8, 798958(2022).
  7. Park, W., Lee, J. -S., Gao, G., Kim, B. S., Cho, D. -W. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 14 (1), 7696(2023).
  8. Sun, H. -J., Wu, Z. -Y., Nie, X. -W., Bian, J. -S. Role of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the link between inflammation and hydrogen sulfide. Front Pharmacol. 10, 1568(2020).
  9. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier.". Front Neurosci. 17, 1047778(2023).
  10. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  11. De Vriese, A. S., Verbeuren, T. J., Van de Voorde, J., Lameire, N. H., Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction in diabetes. Br J Pharmacol. 130 (5), 963-974 (2000).
  12. Wang, K., et al. Inflammatory environment promotes the adhesion of tumor cells to brain microvascular endothelial cells. Front Oncol. 11, 691771(2021).
  13. Tiwary, S., et al. Metastatic brain tumors disrupt the blood-brain barrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of the endothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a. Sci Rep. 8 (1), 8267(2018).
  14. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2 (1), 281-298 (2011).
  15. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC Basic Transl Sci. 4 (7), 845-854 (2019).
  16. Morgan, S. J., et al. Use of animal models of human disease for nonclinical safety assessment of novel pharmaceuticals. Toxicol Pathol. 41 (3), 508-518 (2013).
  17. Rotman, D. Can Pfizer deliver. MIT Technology Review. , Available from: https://www.technologyreview.com/2004/02/01/233321/can-pfizer-deliver/ (2004).
  18. Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
  19. Xu, Z., et al. Design and construction of a multi-organ microfluidic chip mimicking the in vivo microenvironment of lung cancer metastasis. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (39), 25840-25847 (2016).
  20. Strobel, H. A., et al. Assembly of tissue-engineered blood vessels with spatially controlled heterogeneities. Tissue Eng Part A. 24 (19-20), 1492-1503 (2018).
  21. Atchison, L., Zhang, H., Cao, K., Truskey, G. A. A Tissue engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome using human iPSC-derived smooth muscle sells. Sci Rep. 7 (1), 8168(2017).
  22. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  23. Gold, K. A., et al. 3D bioprinted multicellular vascular models. Adv Healthc Mater. 10 (21), 2101141(2021).
  24. Tabriz, A. G., Hermida, M. A., Leslie, N. R., Shu, W. Three-dimensional bioprinting of complex cell laden alginate hydrogel structures. Biofabrication. 7 (4), 045012(2015).
  25. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Adv. Funct. Mater. 27 (33), 1700798(2017).
  26. Cho, W. -W., Ahn, M., Kim, B. S., Cho, D. -W. Blood-lymphatic integrated system with heterogeneous melanoma spheroids via in-bath three-dimensional bioprinting for modelling of combinational targeted therapy. Adv Sci (Weinh). 9 (29), 2202093(2022).
  27. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  28. Polacheck, W. J., Kutys, M. L., Tefft, J. B., Chen, C. S. Microfabricated blood vessels for modeling the vascular transport barrier. Nat Protoc. 14 (5), 1425-1454 (2019).
  29. Li, H., et al. Expanding sacrificially printed microfluidic channel-embedded paper devices for construction of volumetric tissue models in vitro. Biofabrication. 12 (4), 045027(2020).
  30. Gao, G., Park, J. Y., Kim, B. S., Jang, J., Cho, D. Coaxial cell printing of freestanding, perfusable, and functional in vitro vascular models for recapitulation of native vascular endothelium pathophysiology. Adv Healthc Mater. 7 (23), 1801102(2018).
  31. Farasatkia, A., Kharaziha, M., Ashrafizadeh, F., Salehi, S. Transparent silk/gelatin methacrylate (GelMA) fibrillar film for corneal regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 120, 111744(2021).
  32. Duong, V. T., et al. Double-layered blood vessels over 3 mm in diameter extruded by the inverse-gravity technique. Biofabrication. 15 (4), 045022(2023).
  33. Luo, L., et al. Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries. Bioact Mater. 6 (3), 638-654 (2021).
  34. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  35. Wang, Y., et al. Development of a photo-crosslinking, biodegradable GelMA/PEGDA hydrogel for guided bone regeneration materials. Materials. 11 (8), 1345(2018).
  36. Han, Y., et al. Biomimetic injectable hydrogel microspheres with enhanced lubrication and controllable drug release for the treatment of osteoarthritis. Bioact Mater. 6 (10), 3596-3607 (2021).
  37. Bupphathong, S., et al. Gelatin methacrylate hydrogel for tissue engineering applications-a review on material modifications. Pharmaceuticals. 15 (2), 171(2022).
  38. Wu, Z., et al. Microfluidic printing of tunable hollow microfibers for vascular tissue engineering. Adv Mater Technol. 6 (8), 2000683(2021).
  39. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., Jacobo-Albavera, L. Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review. Appl. Sci. 10 (3), 938(2020).
  40. Khattak, S. F., Bhatia, S. R., Roberts, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Eng. 11 (5-6), 974-983 (2005).
  41. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  42. Kim, S. -J., et al. Bioprinting methods for fabricating in vitro tubular blood vessel models. Cyborg Bionic Syst. 4, 0043(2023).
  43. Maji, S., Lee, M., Lee, J., Lee, J., Lee, H. Development of lumen-based perfusable 3D liver in vitro model using single-step bioprinting with composite bioinks. Mater Today Bio. 21, 100723(2023).
  44. Pauty, J., et al. A vascular permeability assay using an in vitro human microvessel model mimicking the inflammatory condition. Nanotheranostics. 1 (1), 103-113 (2017).
  45. van Duinen, V., et al. 96 perfusable blood vessels to study vascular permeability in vitro. Sci Rep. 7 (1), 18071(2017).
  46. Pink, D. B. S., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS ONE. 7 (3), e33760(2012).
  47. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. AAdv Healthc Mater. 12 (18), 2300151(2023).
  48. Zhang, F., Lin, D. S. Y., Rajasekar, S., Sotra, A., Zhang, B. Pump-less platform enables long-term recirculating perfusion of 3D printed tubular tissues. Adv Healthc Mater. 12 (27), 2300423(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Biodruk 3Dmodele tkanek naczyniowychkomórki śródbłonkakanały hydrożelowenaczynia perfuzyjneimmunobarwienie CD31modelowanie naczyń krwionośnych
Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.