Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisano protokół pobierania i wykrywania miR-15a z łez jako nowego narzędzia diagnostycznego retinopatii cukrzycowej.

Streszczenie

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest poważnym powikłaniem cukrzycy, dotykającym znaczny odsetek populacji diabetyków. Wczesna diagnoza i interwencja są kluczowe dla zapobiegania nieodwracalnej utracie wzroku. Obecne metody diagnostyczne, choć skuteczne, mają swoje ograniczenia. miRNA, małe niekodujące RNA, które hamuje stabilność i/lub translację mRNA poprzez wiązanie się z 3'-nieprzetłumaczonymi regionami (3'-UTR) docelowych mRNA, jest coraz częściej uznawane za istotnie powiązane z cukrzycą i może być uzyskane z łez. Badanie to badało potencjał egzosomalnego miR-15a pochodzącego z płynu łzowego jako nowego markera diagnostycznego dla DR. Pobrano próbki łez od 135 pacjentów z cukrzycą (36 z retinopatią cukrzycową [DR] i 50 bez DR) oraz 49 zdrowych kontrolnych osób. Izolowano egzosomy, a poziomy ekspresji miR-15a zmierzono za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR). Wyniki wykazały, że ekspresja miR-15a egzosomów była zmieniona u pacjentów z cukrzycą i DR w porównaniu z osobami zdrowymi. Wyniki te wskazują, że egzosomalny miR-15a pochodzący z płynu łezowego może odgrywać rolę w molekularnych mechanizmach leżących u podstaw cukrzycy i jej powikłań. Ponadto ma potencjał jako nieinwazyjny i wiarygodny biomarker diagnostyczny retinopatii cukrzycowej, oferując wysoką czułość i swoistość.

Wprowadzenie

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest jednym z najczęstszych powikłań mikronaczyniowych cukrzycy, zagrażając wzroku milionów osób na całym świecie. Globalna częstość występowania DR na podstawie danych populacyjnych IDP Atlas 2019 została oszacowana na 22,7% spośród całej populacji diabetyków na świecie, przy czym liczba nowych przypadków stale rośnie, szczególnie w krajach rozwiniętych i rozwijającychsię 1. Klinicznie DR charakteryzuje się wczesnym stadium DR lub nieproliferacyjnym retinopatią cukrzycową (NPDR), późnym stadium DR lub proliferacyjnym retinopatią cukrzycową (PDR) oraz obecnością obrzęku plamki żółtej. Zwiększona przepuszczalność naczyń i zablokowanie naczyń to dwie najczęstsze zmiany patologiczne obserwowane w NPDR, a nieprawidłowa neowaskularyzacja tęczówki, plamki, dysku wzrokowego lub siatkówki obserwuje się w przypadku PDR 2,3. Przejście w PDR, które może potencjalnie prowadzić do krwotoku szklistego i odwarstwienia siatkówki, może powodować poważne zaburzenia widzenia3. We wszystkich przypadkach zmiany patologiczne można wykryć za pomocą funduskopii lub badania fotografii dna dna przez wykwalifikowanych okulistów4. Stosując standardową metodę fotografii dna dna, retinopatię cukrzycową można wykryć z czułością 78%-96% i specyficznością 86%-97%5. Jednak ta metoda wykrywa ją dopiero po uszkodzeniu siatkówki. Istnieje niezaspokojona potrzeba wczesnego wykrywania DR przed pojawieniem się klinicznie widocznych objawów siatkówki, takich jak krwotok z blot, mikrotętniaki, wysięki oraz proliferacja nowych naczyń.

Rozwój narzędzi molekularnych doprowadził do odkrycia egzosomów jako potencjalnego narzędzia diagnostycznego dla różnych chorób, w tym nowotworów i chorób sercowo-naczyniowych 6,7. Egzosomy to nanowielkości cząstki związane membraną dwuwarstwową lipidową, wydzielane przez większość komórek do przestrzeni pęcherzyków zewnętrznych (EV). Egzosomy te mogą być transportowane przez biopłyny, takie jak krew, łzy, ślina i mocz, co czyni je łatwo dostępnymi do nieinwazyjnych lub minimalnie inwazyjnych procedur diagnostycznych8. Zawierają różne markery komórek pochodzenia, w tym białka, lipidy i kwasy nukleinowe. Szczególnie interesujące są małe, niekodujące RNA przenoszone w elektrowniach elektrycznych. Chociaż te RNA nie są kodowane dla białek, odgrywają kluczowe role w regulacji genów i są powiązane z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi, w tym w komórkach β trzustki, które odgrywają duże znaczenie w rozwoju cukrzycy 9,10.

Konkretnie, miR-15a wykazano silny związek z rozwojem cukrzycy, głównie poprzez regulację produkcji insuliny i funkcji komórek beta-trzustkowych11. Nasza grupa niedawno wykazała, że miR-15a jest zmieniony w osoczu retinopatii cukrzycowej. Ponadto wykazano, że miR-15a jest wydzielany przez beta-komórki trzustki i przemieszcza się przez krwiobieg do siatkówki12. Płyn łzowy jest uważany za łatwo dostępny płyn, łatwo dostępny z oka w sposób nieinwazyjny i opłacalny13. Zawiera mieszaninę różnych białek, lipidów, elektrolitów i innych cząsteczek, co odzwierciedla stan fizjologiczny powierzchni oka i otaczających tkanek, w tym siatkówki. Więcej miRNA wykryto w płynie łzowym niż w surowicy i roztworze humoru wodnego15,16. Skład łzy zmienia się w odpowiedzi na różne schorzenia ogólnoustrojowe, w tym cukrzycę17. W rzeczywistości analiza płynu łzowego wykazuje obiecujący potencjał do monitorowania i diagnozowania innych chorób niezwiązanych z oczami, takich jak stwardnienie rozsiane i rak piersi18,19. Przy bezpośrednim powiązaniu retinopatii cukrzycowej z okiem, bardziej istotne byłoby poszukiwanie potencjalnych właściwości diagnostycznych płynu łzowego w tej chorobie. Poziomy IL-1RA, IL-8, IL-6 i TNF-α w płynach łzowych pacjentów z retinopatią cukrzycową zaobserwowano zmiany, które również zmieniają się w zależności od ciężkości choroby20,21. W porównaniu z tradycyjnym badaniem funduskopią, analiza płynu łzowego w retinopatii cukrzycowej oferuje potencjalne korzyści pod względem dostępności, nieinwazyjnej i swoistości oraz umożliwia wczesne wykrycie przed rozwojem choroby22.

Dlatego głównym celem tego badania jest zbadanie potencjału egzosomalnego miR-15a pochodzącego z płynu łzowego jako nowego markera diagnostycznego retinopatii cukrzycowej poprzez izolację miRNA oraz ilościowe określenie z płynów łzowych populacji z retinopatią cukrzycową. Dzięki temu powstałaby nowa metoda wykrywania retinopatii cukrzycowej za pomocą przesiewu płynu łzowego, którą można wykryć jeszcze przed pojawieniem się powikłań siatkówki, umożliwiając wczesne działania zapobiegawcze lub terapeutyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone za zgodą Komitetu Etycznego ds. Badań Medycznych Universiti Malaya Medical Centre (numer referencyjny: 20165-2446). Przed rekrutacją uzyskano pisemną zgodę wszystkich ludzi. Łącznie 135 osób z pacjentów uczęszczających do kliniki okulistycznej Universiti Malaya Medical Centre (UMMC) w Kuala Lumpur zostało włączonych łącznie 135 osób. Kryteria włączenia obejmowały pacjentów, którzy korzystali z usług w ramach UMMC i byli w wieku od 20 do 80 lat. Pacjenci poddawani aktywnemu leczeniu insuliną, z historią leczenia laserowego lub anty-VEGF w ciągu ostatnich 3 miesięcy, lub stosującymi regularne leki przeciwpłytkowe lub leki przeciwzakrzepowowe zostały wykluczone z badania. Osoby podzielono następnie na trzy grupy: (1) zdrowa kontrola (kontrola), (2) cukrzyca bez retinopatii (DM bez DR) oraz (3) cukrzyca z retinopatią (DR). Podsumowanie protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotuj sterylny podstawowy zestaw opatrunków zawierający dwie kleszcze, sześć wacików, cztery gazy, tacę i worek na ochronę biologiczną.
  2. Wlej 5 ml roztworu nawadniania chlorkiem sodu o stężeniu 0,9% w/v do tacy.
  3. Otwórz paczkę chusteczek oczyszczających powieki i połóż je na sterylnym polu.
  4. Przygotuj probówkę zawierającą 250 μL roztworu konserwującego.
  5. Złóż pasek Schirmera na poziomie klina, będąc jeszcze w opakowaniu, zanim położysz sterylny pasek na sterylnym polu.
  6. Załóż rękawice chirurgiczne w sposób aseptyczny.
  7. Używając sterylnych kleszczy, zwilż waciki roztworem 0,9% w/v sterylnym chlorkiem sodu.

2. Przygotowanie osób ludzkich

  1. Pozwól osobie wygodnie usiąść i poproś o zamknięcie oczu.
  2. Cztery razy przetrzyj skórę okooczodołu watą nasączoną w roztworze irygacyjnym.
  3. Przetrzyj skórę okooczodołu chusteczką oczyszczającą powieki.

3. Zbieranie ludzkiego płynu łezowego

  1. Zbieraj płyny łzowe za pomocą paska Schirmersa umieszczonego na dolnym forniksie skroniowym.
  2. Zakładając częściowo złożony pasek na prawe oko, poproś badanego, by patrzył w lewo. Opuszczaj dolną pokrywkę, aby odsłonić dolny forniks.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść pasek Schirmera na zewnętrznych dwóch trzecich dolnej części spojówki forniksowej. Unikaj kontaktu paska ze skórą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki potem lub innymi substancjami na skórze.
  4. Pod paskiem umieść gazę, aby zapobiec kontaktu ze skórą.
  5. Pozwól, by łzy wchłonęły się w pasek do 20 mm lub maksymalnie 5 minut, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
  6. Jeśli poziom 20 mm nie zostanie osiągnięty, dokumentuj poziom rozdarć na podstawie oznaczeń, aby umożliwić standaryzację objętości płynu łzowego.      
  7. Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie usuń pasek Schirmera i umieść go w probówce zawierającej 1x roztwór soli fosforanowej (PBS).
  8. Włóż rurkę do chłodzenia, aby przetransportować ją do laboratorium.
  9. Oczyść powierzchnię okooczodołu, wycierając wszelkie pozostałości ze skóry.

4. Wstępne przetwarzanie próbek łez

  1. Vortex, rurka zawierająca pasek Schirmera, została namoczona w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Mieszaj rurką na dźwigni przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Wiruj rurkę w 2000 x g przez 15 minut w 4 °C.
  4. Przelej roztwór do nowej rurki, oznacz i utrzymuj w temperaturze -80 °C aż do dalszego przetwarzania.  
  5. Usuń pozostały pasek.

5. Izolacja egzosomów

UWAGA: Izolacja RNA przeprowadza się przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).

  1. Rozmraź roztwór łez na lodzie przez 10 minut.
  2. Wyrównaj kolumnę spinową na 15 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem.      
  3. Usuń dolny wylot kolumny i umieść go na dostarczonej płytce do zbierania odpadów.
  4. Usuń górną matę uszczelniającą i pozwól, by bufor magazynowy przeszedł przez kolumnę pod wpływem siły grawitacji.
  5. Dodaj 250 μL PBS i pozwól mu przechodzić przez kolumnę.      
  6. Powtórz krok 5.5.
  7. Na górę każdej kolumny nałóż próbkę o pojemności 110 μL i pozwól jej wejść do kolumny.      
  8. Przenieś kolumnę na dostarczoną płytkę do pobierania próbek.
  9. Dodaj 100 μL PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę do płytki pobierającej próbki.
  10. Przenieś kolumnę na płytę do zbierania odpadów.
  11. Dodaj 4x 200 μL PBS do kolumny i pozwól jej wejść do kolumny, aby usunąć wolną frakcję białek z pierwszego załadunku.      
  12. Dodaj do kolumny 110 μL próbki. Pozwól na wejście do kolumny.
  13. Umieść kolumnę na płycie do pobierania próbek. Dodaj 100 μL PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę.
  14. Krótko wiruj płytkę pobierającą próbkę w 100 x g przez 30 sekund. Izolowane egzosomy są teraz gotowe do izolacji RNA.

6. Izolacja RNA

UWAGA: Izolacja RNA przeprowadza się przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).

  1. Uczestnik 200 μL izolowanych egzosomów do izolacji RNA.      
  2. Dodaj 60 μL buforu lizyzowego do izolowanych egzosomów. Vortex przez 5 sekund.
  3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  4. Dodaj 20 μL buforu opadowego inhibitora, zachowuj wir przez 20 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  5. Wiruj w 12 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieś przezroczysty, bezbarwny supernatant do nowej rurki.
  7. Dodaj 1 objętość izopropanolu.
  8. Wiruj przez 5 sekund i przelej roztwór do mini kolumny obrotowej dołączonej do zestawu.
  9. Wirówka w temperaturze pokojowej przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ przez niego.
  10. Przemyj kolumnę 700 μL bufora RWT.
  11. Wirówka przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ.
  12. Przemyj kolumnę 500 μL bufora płukania RPE.
  13. Wirówka przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ.
  14. Dodaj 500 μL etanolu 80% do mini kolumny spinowej próbki.
  15. Wirówka przez 2 minuty przy 8000 x g. Usuń przewód i rurkę zbiorczą.
  16. Włóż mini kolumnę obrotową do nowej probówki zbiorczej 2 mL.      
  17. Wiruj kolumnę i rurkę w ilości 18 000 x g przez 5 minut. Usuń przepływ i probówkę zbiorczą.
  18. Umieść mini kolumnę spinową w nowej rurce 1,5 mL i dodaj 15 μL wody wolnej od RNazy w centrum błony spinowej.
  19. Inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  20. Wiruj w 18 000 x g przez 1 minutę, aby wyludzić RNA. RNA jest gotowe do dalszego przetwarzania.      
  21. Przeprowadz analizę śledzenia nanocząstek w celu kontroli jakości i weryfikacji wydajności RNA.

7. Synteza cDNA

  1. Syntezę cDNA wykonuj przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów, zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotuj mieszankę główną zgodnie z Tabelą 1 w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  3. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół.
  4. Pipeta 5,1 μL głównej mieszanki do lamp PCR o pojemności 0,1 μL.
  5. Dodaj 9,9 μL próbki do przydzielonej probówki zawierającej mieszankę master.
  6. Włóż rurki PCR do termocyklera i uruchom zgodnie z Tabelą 2.
    UWAGA: cDNA jest gotowe do dalszej analizy.
SkładnikObjętość/reakcja
Bufor RT 10x1,5 μL
100M mieszanka dNTP0,15 μL
Inhibitor RNAse (200U/μL)0,19 μL
Enzym RT Multiscribe (50U/μl)1 μl
20x RT Primer0,75 μL
Woda wolna od RNAe1,51 μL
Przykład9,9 μL
Całkowity wolumen15 μL

Tabela 1: Przygotowanie mieszanki głównej PCR używanej do syntezy cDNA z izolowanego RNA.

KrokTemperaturaCzas trwania
Transkrypcja wsteczna16 °C30 min
42 °C30 min
Stop85 °C5 min
Zatrzymaj4 °C

Tabela 2: Warunki termocykliczne dla syntezy cDNA.

8. Cyfrowe kropelki PCR

UWAGA: Cyfrowe krople PCR (ddPCR) wykonywane jest przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów).

  1. Przygotuj mieszankę główną do ddPCR w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zgodnie z Tabelą 3.
  2. Pipeta 19,8 μL mieszanki głównej do lamp PCR o pojemności 0,1 μL. Dodaj 2,2 μL próbek i dobrze wymieszaj, pipetując mieszankę w górę i w dół przez 10 razy.
  3. Przelej 20 μL mieszaniny próbki do tora próbek wkładu ddPCR.      
  4. Dodaj 50 μL oleju do toru olejowego wkładu.      
  5. Przymocuj uszczelkę do wkładu za pomocą haczyka na płycie.
  6. Włóż wkład do maszyny generującej krople. Dźwięk kliknięcia oznacza prawidłowe włożenie wkładu do maszyny do generowania kropel.
  7. Ostrożnie przenieś wszystkie wygenerowane krople do dołków płyty z 96 dołkami. Dodaj przynajmniej jedną studnię bez kontroli szablonu jako kontrolę ujemną.
  8. Uszczelnij płytę za pomocą folii przebijającej w maszynie do uszczelniania płyt (patrz Tabela materiałów).
  9. Włóż płytę do termocyklera i uruchom zgodnie z Tabelą 4.
  10. Przełóż płytkę do maszyny do odczytu kropel, aby policzyć krople dodatnie i ujemne.
  11. Ilościowo określ liczbę kopii/mL, używając liczby kopii/wartości 20 μL wygenerowanej z przebiegu.
SkładnikObjętość/reakcja
2x ddPCR supermix dla sond (bez dUTP)10 μL
20x Zapalniki/sonda1 μL
Przykład7 μL
Woda wolna od RNAe2 μL
Całkowity wolumen20 μL

Tabela 3: Przygotowanie miksu PCR używanego do ddPCR.

KrokTemperaturaCzas trwaniaRampaCykl
Aktywacja enzymów95 °C10 min~2 °C/s na każdy krok1
Denaturacja94 °CLata 3040
Wyżarzanie60 °C1 min40
Deaktywacja enzymów98 °C10 min1
Zatrzymaj4 °CNie maNie ma

Tabela 4: Warunki termocykliczne dla ddPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Krzywa standardowa
Stworzono standardową krzywą, aby określić dokładną ilość łez pobranych od każdego pacjenta. Zasadniczo różne objętości konserwantów w zakresie od 3 μL do 25 μL były wystawione na działanie pasków Schirmera. Obserwowano także odległość mokrego obszaru na Schirmerze. Procedurę powtarzano trzy razy dla każdej procedury, a średni odczyt był obliczany. Utworzono standardową krzywą objętości zebranych łez względem odległości mokrych obszarów Schirmera (Rysunek 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie dna dna, optyczna tomografia koherencji oraz angiografia fluoresceinowa to obecnie dostępne techniki wykrywania retinopatii cukrzycowej. Te trzy techniki są często stosowane razem, aby zapewnić kompleksową ocenę różnych chorób siatkówki i naczyniówki. Funduskopia to badanie kliniczne rutynowo wykonywane podczas oceny retinopatii cukrzycowej. Metoda ta jest stosowana przez wykwalifikowanych okulistów i stanowi złoty standard w diagnozowaniu retinopatii cukrzycowej. Metoda ta umożliwia szczegółową ocenę siatkówki i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają ze sobą rywalizujących interesów.

Podziękowania

Badania te zostały wsparte przez Alcon Research Institute (IF011-2020) oraz FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% chlorku sodu w otoczeniuAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x fosforanowa sól buforowaThermo Fisher Scientific10010-023
Biosystemy stosowane  Zestaw do transkrypcji odwrotnej mikroRNA TaqManBiosystemy stosowane4366596
ddPCR Supermix dla sond (brak dUTP)Laboratoria BioRad1863024
Płyty ddPCR 96-dołkoweLaboratoria BioRad12001925
Naboje DG8Laboratoria BioRad1864008
Uszczelki DG8Laboratoria BioRad1863009
Olej generujący krople dla sondLaboratoria BioRad1863005
Zestaw izolacyjny egzosomów egzospin-96Systemy naprowadzania komórekEX07-96
miRNeasy Serum/Zaawansowany Zestaw PlazmowyQiagen  217204
Uszczelniacz płyt PX1 PCRLaboratoria BioRad1814000
Cyfrowy system PCR QX100 z kroplamiLaboratoria BioRadQX100
QXDx Generator kropli  Laboratoria BioRad12001049
Pas SchirmeraOptitechSCH-100
Termiczny cykler T100Laboratoria BioRad1861096
Test mikroRNA Taqmana MTOMED 20 (ID testu: 000389 )Biosystemy stosowane4440887Sekwencja celu: UAGCAGCAUAAUGGUUUGUG

Bibliografia

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Egzosomy łezbiomarkery płynu łzowegodroplet digital PCRizolacja egzosomówprofilowanie mikroRNAśledzenie nanocząstekdiagnostyka nieinwazyjnazapobieganie utracie wzroku
MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.