Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66707

⸱

29 marca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Streszczenie

Mikroskopia arkuszowa (LSM) odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu skomplikowanej trójwymiarowej (3D) struktury serca, dostarczając kluczowych informacji na temat podstawowej fizjologii serca i patologicznych reakcji. Niniejszym zagłębiamy się w rozwój i implementację techniki LSM w celu wyjaśnienia mikroarchitektury serca w modelach mysich. Metodologia integruje dostosowany system LSM z technikami oczyszczania tkanek, łagodząc rozpraszanie światła w tkankach serca w celu obrazowania wolumetrycznego. Połączenie konwencjonalnego LSM z łączeniem obrazów i podejściami do dekonwolucji wielowidokowej pozwala na uchwycenie całego serca. Aby rozwiązać problem nieodłącznego kompromisu między rozdzielczością osiową a polem widzenia (FOV), wprowadzamy metodę mikroskopii arkuszowej z osiowo zamiatanym światłem (ASLM), aby zminimalizować nieostre światło i równomiernie oświetlić serce w całym kierunku propagacji. Tymczasem metody oczyszczania tkanek, takie jak iDISCO, poprawiają penetrację światła, ułatwiając wizualizację głębokich struktur i zapewniając kompleksowe badanie mięśnia sercowego w całym sercu. Połączenie proponowanego LSM i metod oczyszczania tkanek stanowi obiecującą platformę dla naukowców w zakresie rozwiązywania struktur serca w sercach gryzoni, posiadając ogromny potencjał w zrozumieniu morfogenezy i przebudowy serca.

Wprowadzenie

Niewydolność serca pozostaje główną przyczyną śmiertelności na całym świecie, głównie z powodu braku zdolności regeneracyjnych dojrzałych kardiomiocytów1. Skomplikowana architektura serca odgrywa kluczową rolę w jego funkcjonowaniu i zapewnia wgląd w procesy rozwojowe. Dogłębne zrozumienie struktury serca jest niezbędne do wyjaśnienia podstawowych procesów morfogenezy i przebudowy serca w odpowiedzi na zawał mięśnia sercowego. Niedawny postęp wykazał, że nowonarodzone myszy mogą przywrócić funkcję serca po urazie, podczas gdy dorosłe myszy nie mają takiej zdolności regeneracyjnej2. Stanowi to podstawę do badania wskazówek związanych z nieprawidłowościami strukturalnymi i funkcjonalnymi w modelach mysich. Tradycyjne metody obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna, mają ograniczenia techniczne, w tym ograniczoną głębokość penetracji, powolny schemat skanowania punktowego i uszkodzenia fotograficzne spowodowane długotrwałą ekspozycją na światło laserowe. Utrudniają one kompleksowe trójwymiarowe (3D) obrazowanie nienaruszonego serca. W tym kontekście, mikroskopia arkuszowa światła (LSM) jawi się jako potężne rozwiązanie, oferujące zalety szybkiego obrazowania, zmniejszone uszkodzenia fotograficzne i wyjątkowe możliwości sekcji optycznej3,4,5. Unikalne cechy LSM sprawiają, że jest to obiecująca metoda przezwyciężania ograniczeń konwencjonalnych technik, zapewniająca bezprecedensowy wgląd w procesy rozwoju i przebudowy serca6,7,8.

W tym protokole wprowadzamy strategię obrazowania, która łączy zaawansowany LSM z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek9, umożliwiając obrazowanie całych serc myszy bez potrzeby specjalnego etykietowania i mechanicznego cięcia. Ponadto proponujemy, że konwencjonalne obrazowanie LSM można udoskonalić za pomocą dekonwolucji wielowidokowej10 lub technik mikroskopii arkuszowej (ASLM) z osiowym przemiataniem11,12,13,14,15 w celu poprawy rozdzielczości osiowej. Ponadto integracja łączenia obrazów z którąkolwiek z tych metod może skutecznie przezwyciężyć kompromis między rozdzielczością przestrzenną a polem widzenia (FOV), przyspieszając w ten sposób obrazowanie serc dorosłych myszy. Włączenie wielu metod oczyszczania tkanek, w tym metod hydrofobowych, hydrofilowych i opartych na hydrożelu, umożliwia głębszą penetrację światła w celu uchwycenia morfologii całego serca16,17,18,19.

Chociaż wiele metod oczyszczania jest kompatybilnych z obecnymi systemami LSM, celem jest zminimalizowanie rozpraszania fotonów i zwiększenie penetracji światła w tkankach, takich jak serce, poprzez zastąpienie lipidów medium ściśle odpowiadającym jego indeksowi załamania światła. iDISCO zostało wybrane jako reprezentatywne20,21 i przystosowane do obrazowania autofluorescencyjnego w tym protokole ze względu na szybkie przetwarzanie i wysoką przezroczystość ( Rysunek 1A). Reasumując, połączenie zaawansowanego podejścia LSM z technikami oczyszczania tkanek stanowi obiecujące ramy do rozwikłania skomplikowanej anatomii serca w sercach gryzoni, co ma znaczący potencjał w zakresie pogłębiania naszej wiedzy na temat morfogenezy i patogenezy serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły i eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone pod nadzorem Instytucjonalnego Komitetu Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Dallas (IACUC #21-03). W badaniu wykorzystano myszy C57BL6, w tym noworodki w 1. dobie po urodzeniu (P1) oraz dorosłe osobniki w wieku 8 tygodni. Nie zaobserwowano różnic między samcami a samicami. Wszystkie procesy pozyskiwania danych i postprocesowania obrazów zostały wykonane przy użyciu oprogramowania open-source lub platform z licencjami badawczymi lub edukacyjnymi. Zasoby są dostępne od autorów na uzasadnioną prośbę.

1. Przygotowanie próbek i utrwalanie tkanek (6 - 10 dni)

  1. Przygotuj wszystkie roztwory chemiczne w Tabela materiałów wymagane dla metody przejrzyszczania tkanek przed rozpoczęciem procedury przejrzyszczania tkanek.
    UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w szczególności podczas pracy z substancjami toksycznymi.
  2. Uśmierć zwierzęta za pomocą CO2 poprzez umieszczenie ich w CO2 komorę w wybranych punktach czasowych, takich jak P1 i 8 tydzień, w celu pobrania całego serca, a następnie zanurzyć świeżo wyizolowane serce w temperaturze pokojowej (RT) w 0,2 M KCl, aby zatrzymać je w fazie rozkurczu16.
  3. Utrwal serce, zanurzając je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), przy łagodnym wytrząsaniu na rotatorze przez noc, aby zachować anatomię serca w 4 °Cpatrz Tabela 1.
    OSTRZEŻENIE: PFA jest toksycznym odczynnikiem chemicznym; procedurę należy przeprowadzać pod wyciągiem (dygestorium).
  4. Przemyć serce w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 30 min, powtórzyć 3 razy.
    UWAGA: Opcjonalnie: Osadź serce w żelu agarozowym, aby stworzyć zespół serca dla systemu LSM zbudowanego na zamówienie w kroku 2, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotuj 1% roztwór agarozy, rozpuszczając agarozę w PBS, a następnie podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do czasu całkowitego rozpuszczenia. Wlej roztwór do formy, aby utworzyć warstwę dolną, i odstaw do momentu, aż roztwór ochłodzi się do 40 °C.
    2. Umieść serce w formie i wypełnij ją żelem agarozy, aż do jego stężenia. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z żelu agarozy, aby zminimalizować liczbę artefaktów w obrazowaniu.
      UWAGA: Zatapianie próbki zmniejsza ryzyko potencjalnego uszkodzenia anatomii serca podczas montowania.
      OSTRZEŻENIE: Należy zastosować agarozę niskotopliwą i unikać bezpośredniego umieszczania serca w podgrzanej agarozie, aby zminimalizować ryzyko narażenia próbki na wysokie temperatury.
  5. Odwodnij serce, stosując gradienty metanolu zmieszanego z wodą dejonizowaną (Rycina 1B), przetwarzając przez sekwencyjne stężenia 20%, 40%, 60%, 80% i 100%, zgodnie z opisem w Tabela 1Powtórzyć czynność raz, używając świeżego 100% metanolu, aby zapewnić całkowite odwodnienie. Odwadzać serca noworodków myszy przez 1 h w każdej mieszaninie metanolu z wytrząsaniem. W przypadku serc 8-tygodniowych myszy oraz serc szczura wydłużyć czas inkubacji do 2 h.
    UWAGA: Metanol jest substancją lotną, drażniącą i łatwopalną.
  6. Wymień methanol i chłodź serce w świeżym, 100% methanolu przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  7. Wymień roztwór i odbarw serce za pomocą 5% nadtlenku wodoru (H2O2) w metanolu, stosując stosunek objętości 1:5 (30% H2O2 do 100% metanolu) przez noc w temperaturze 4 °C aby usunąć pigmenty.
    UWAGA: Usunięcie pigmentów pozwala zminimalizować absorpcję fotonów, co prowadzi do poprawy jakości obrazu i redukcji artefaktów.
  8. Wymień roztwór i inkubuj serce w 100% metanolu przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  9. Przeprowadź delipidację serca w roztworze zawierającym 66% dichlorometanu (DCM) i 33% metanolu przez 3 h przy jednoczesnym wstrząsaniu. Upewnij się, że pod koniec tego etapu serce opadło na dno probówki. W przeciwnym razie wymień roztwór (66% DCM / 33% metanolu) i wydłuż czas inkubacji (np. o kolejną godzinę), aby uzyskać pełną delipidację. Szybko przenieś serce do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu, ponieważ DCM jest substancją bardzo lotną.
    UWAGA: Do przeprowadzenia eksperymentu należy używać naczyń z polipropylenu lub szkła, ponieważ DCM nie jest kompatybilny z polistyrenem.
  10. Do wyrównania współczynnika załamania światła (RI = 1,56) należy wykorzystać eter dibenzylu (DBE). W przypadku serc noworodków myszy proces wyrównywania współczynnika załamania trwa 2 dni, natomiast w przypadku serc myszy w wieku 8 tygodni trwa on 5 dni przy łagodnym wstrząsaniu. Należy wymieniać DBE na świeży i przedłużyć czas inkubacji, aż serce stanie się całkowicie przezroczyste.
    OSTRZEŻENIE: DBE jest substancją niebezpieczną. Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu ze skórą.

2. Montowanie próbek (1 dzień)

UWAGA: W przypadku użycia komercyjnego systemu LSM należy postępować zgodnie z protokołem firmy dotyczącym unieruchomienia serca i pominąć kroki 2.1 – 2.9.

  1. Wykonaj komorę oraz uchwyt odporny na roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła (np. DBE w dostosowanej metodzie iDISCO), korzystając z drukarki 3D i materiałów Onyx (Rysunek 2A)16.
  2. Przymocuj magnes do dna komory, aby ułatwić szybkie połączenie i dokładną lokalizację w systemie LSM (Rysunek 2B).
  3. Przymocuj do komory szkiełka nakrywowe o wymiarach 25 mm x 50 mm x 0,17 mm, używając przezroczystego kleju silikonowego, a następnie zweryfikuj szczelność komory, wypełniając ją DBE i sprawdzając występowanie wycieków po 1 dniu.
  4. Wykonaj uchwyt zaciskowy za pomocą drukarki 3D i przymocuj magnes do montażu zespołu serca wewnątrz komory (Rysunek 2C) lub wprowadź igłę w żel agarozowy w celu zamocowania zespołu serca.
  5. Opracuj własny system LSM, wykorzystując soczewkę cylindryczną i lasery DPSS (diode-pumped solid-state) z ciągłą falą, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16,22. Użyj długości fali wzbudzenia 532 nm do rejestracji autofluorescencji mięśnia sercowego (Rysunek 2D).
  6. Zamocuj komorę na stole 6-wymiarowym i znajdź optymalną pozycję, w której komora jest prostopadła do kierunku propagacji lasera.
  7. Użyj magnetycznego uchwytu zaciskowego, aby umieścić próbkę na środku komory, a następnie połącz uchwyt z 4-wymiarowym sterowanym silnikowo stołem (X, Y, Z i Yaw; Rysunek 2D).
  8. Zanurz zespół serca w komorze wypełnionej DBE, korzystając ze sterowanego silnikowo stołu, i określ zakres skanowania wzdłuż osi detekcji (kierunek Z).
  9. Wyznacz prędkość skanowania (Vz) silnika w kierunku Z na podstawie wielkości kroku (S) i czasu akwizycji obrazu (T), stosując poniższy wzór:
    Wzór obliczenia prędkości, Vz=S/T, równanie.
    UWAGA: Zależność między wielkością kroku a rozdzielczością osiową systemu obrazowania jest zgodna z twierdzeniem Nyquista-Shannona o próbkowaniu. Na przykład wielkość kroku ustawiono na 1 µm, biorąc pod uwagę, że rozdzielczość osiowa wynosiła 2,91 µm, jak wskazano w poprzednim raporcie16.
  10. Aby zweryfikować rozdzielczość przestrzenną i zminimalizować potencjalne problemy z nieprzezroczystością na różnych głębokościach, zmierz funkcję rozproszenia punktowego (PSF) systemu, obrazując fluorescencyjne kuleczki o średnicy 0,53 µm rozcieńczone w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia w stężeniu 1:1,5 x 105. Oblicz PSF dla całej próbki, mierząc pełną szerokość połówki maksymalnej (FWHM)16.

3. Szycie obrazu (4-8 h)

  1. Oblicz liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego serca myszy, biorąc pod uwagę ograniczone pole widzenia (FOV). Dla każdego kafelka wymiary odpowiadają FOV systemu LSM. Na przykład noworodkowe serce myszy o wymiarach przekroju 3 x 3,6 mm2 wymaga 2 x 2 kafelków do pokrycia w dostosowanym systemie LSM (Rycina 3A). W przeciwieństwie do tego, serce 8-tygodniowej myszy o wymiarach 5 x 8 mm2 wymaga 3 x 4 kafelków, aby pokryć całą strukturę serca (Rycina 3B).
    UWAGA: Szycie obrazów (stitching) jest wymagane, jeśli konwencjonalny system LSM ma ograniczone FOV podczas obrazowania całego serca.
  2. Przejmij obrazy serca, zaczynając od kafelka 1, czyli kafelka w lewym górnym rogu serca (Rycina 3A-B).
  3. Sekwencyjnie przejmij obrazy pozostałych kafelków z 10% zakładką między kolejnymi kafelkami, aż do pokrycia całego serca, jak zilustrowano na Rycynie 3C.
  4. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie open-source Fiji23. Pobierz i zainstaluj wtyczkę do Fiji, BigStitcher24.
  5. Przejdź do menu Help, wybierz Update, następnie Manage update site i zaznacz BigStitcher. Następnie kliknij Close, a potem Apply changes. Po zakończeniu pobierania wtyczki zrestartuj oprogramowanie Fiji.
  6. Otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie niezbędne kafelki z katalogu plików obrazów. Zapisz zestaw danych jako plik HDF5.
  7. Uporządkuj kafelki, wybierając Move Tile By Regular Grid, zaznacz wzór użyty do przesuwania serca i wybierz 10% zakładkę między każdym kafelkiem. Zszyj kafelki, korzystając z opcji Stitching Wizard.
  8. Wyeksportuj zszyte dane za pomocą funkcji Image Fusion, aby wygenerować plik tiff.

4. Dekonwolucja wielowymiarowa (5 dni)

  1. Wykorzystaj fluorescencyjne kuleczki do rejestracji obrazów w celu rekonstrukcji wielokątnej wzdłuż serca (Rysunek 3D).
    1. Przygotuj żywicę25, mieszając eter diglicydylowy bisfenolu A (D.E.R. 332), izoforonodiaminę, 5-amino-1,3,3-trimetylocykloheksanometylaminę (IPDA) oraz eter diglicydylowy glikolu polipropylenowego (D.E.R 736) w stosunku objętościowym 4:1:1.
    2. Odwirować 10 µL fluorescencyjnych kuleczek przy 161 x g przez 5 min i dodać 20 µL metanolu, aby zastąpić roztwór konserwujący kuleczki. Powtórzyć czynność 3 razy.
    3. Przygotować 10 mL roztworu o stężeniu kuleczek 1:1 x 105, mieszając roztwór kuleczek w metanolu z żywicą przygotowaną w kroku 4.1.1.
    4. Odpowietrzyć roztwór w komorze próżniowej przez 3 h, aby usunąć pęcherzyki powietrza i bąbelki.
    5. Wlać roztwór do formy silikonowej lub plastikowej słomki do napojów i odczekać od 2 do 3 dni do jego utwardzenia. Po 1 dniu, zanim żywica całkowicie stwardnieje, umieścić szklaną rurkę wewnątrz formy i odczekać, aż rurka przylgnie do żywicy. Wyjąć żywicę z formy wraz z rurką szklaną (Rysunek 3D).
    6. Umieścić serce w szklanej rurce, wypełnić ją DBE i zamontować rurkę szklaną w komorze wypełnionej DBE.
  2. Przechwycić sekwencyjne obrazy serca myszy wraz z kuleczkami z oświetlonego przekroju, przesuwając zespół serca wzdłuż osi detekcji (oś Z; Rysunek 3E-F).
    UWAGA: W kroku 3 zaimplementować zszywanie obrazów (stitching), aby wygenerować poszczególne stosy obrazów, jeśli rozmiar serca przekracza pole widzenia (FOV).
  3. Obrócić serce myszy o 60° wzdłuż osi Y, aby przechwycić kolejne stosy pod różnymi kątami, tj. 0°, 60°, 120°, 180°, 240° i 300° (Rysunek 3E-F).
  4. Otworzyć wtyczkę BigStitcher i zaimportować wszystkie obrazy z katalogu plików obrazów. Zapisać zbiór danych jako plik HDF5.
  5. Wybrać opcję Detect Interest Points i ręcznie zaznaczyć kuleczki istotne dla rejestracji.
  6. Wybrać model transformacji Affine dla rejestracji. Wybrać Point Spread Function i przypisać PSF do wszystkich widoków.
  7. Kliknąć Multiview Deconvolution i wybrać typ iteracji Efficient Bayesian. Zdefiniować liczbę iteracji jako 10 i uruchomić proces26.
  8. Kliknąć Image Fusion, aby wyeksportować plik tiff.
    UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat dekonwolucji wielokątnej można znaleźć w innych raportach lub protokołach24,27,28.

5. Sprzęt systemu arkusza światła z przesuwaniem osiowym (1 dzień)

  1. Zainstaluj elektryczną soczewkę regulowaną (ETL) w płaszczyźnie Fouriera soczewki cylindrycznej (CL)27 (Rysunek 2D), aby skanować wiązkę laserową osiowo14. Upewnij się, że interfejs cieczy w ETL jest poziomy, aby zapobiec zniekształceniom czoła fali wywołanym przez grawitację. Precyzyjnie wyrównaj ETL, aby zminimalizować decentrację wiązki i aberracje optyczne wyższego rzędu30.
  2. Zainstaluj kartę DAQ w stacji roboczej i podłącz kabel BNC do karty DAQ, aby zsynchronizować czas ekspozycji kamery ze skanowaniem ETL.
  3. Otwórz obudowę sterownika ETL i zdejmij pokrywę (Rysunek 4).
  4. Przylutuj przewód sygnałowy kabla BNC do pinu Analog in B, zgodnie z oznaczeniem na dole płytki PCB (Rysunek 4).
  5. Przylutuj przewód uziemiający kabla BNC do pinu GND; następnie podłącz drugi koniec kabla BNC do wyjścia AO (Analog Output) w karcie DAQ (Rysunek 4).
  6. Podłącz sterownik ETL do portu USB stacji roboczej, połącz sterownik z ETL za pomocą kabla Hirose i zainstaluj oprogramowanie Lens Driver Controller Software.
  7. Zmień tryb pracy (Operation mode) w oprogramowaniu Lens Driver Controller Software na Analog, aby sterować ETL za pomocą wyzwalacza generowanego przez kartę DAQ.
  8. W oprogramowaniu kamery sCMOS przełącz tryb przechwytywania (Capture mode) na External (Light-sheet). Upewnij się, że kierunek skanowania aktywnych pikseli jest prostopadły do kierunku skanowania laserowego, aby wspomóc synchronizację.
  9. Podłącz zewnętrzny port wyzwalacza z tyłu kamery sCMOS do wyjścia AO karty DAQ za pomocą kabla BNC (Rysunek 4).

6. Synchronizacja systemu światłowodowego z przesunięciem osiowym (7 dni)

  1. Zdefiniuj czas ekspozycji na podstawie dopuszczalnego stosunku sygnału do tła (SBR), który dla proponowanego badania wynosi co najmniej 10. Zwiększ czas ekspozycji, jeśli SBR jest niższy niż 10.
    UWAGA: Czas ekspozycji w zakresie od 10 do 50 ms zapewnia dopuszczalny SBR w tym projekcie.
  2. Zdefiniuj czas akwizycji obrazu (T) oraz odstęp linii (L) na podstawie czasu ekspozycji (E) dla kamery oraz częstotliwości ETL (f), korzystając z następujących równań:
    Wzór na okres T=1/2f; przedstawia zależność matematyczną; edukacyjne wyjaśnienie wzoru.
    Równowaga statyczna; wzór L=(T−E)/P; zwięzłe równanie; zastosowanie edukacyjne.
    Gdzie P oznacza liczbę kolumn pikseli w sensorze kamery. Parametry reprezentatywne dla odniesienia to odpowiednio f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms oraz L = 243 µs.
  3. W programie LabVIEW Trigger Generator.vi wygeneruj triggery prostokątne i trójkątne w celu synchronizacji (Rysunek 5).
    UWAGA: Spersonalizowany program LabVIEW jest dostępny od autorów na uzasadnioną prośbę.
  4. Zamontuj koraliki fluorescencyjne rozcieńczone w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia16 o stężeniu 1:1 x 103, aby zlokalizować pozycję przerwy wiązki na obrazie (Rysunek 6A).
  5. W programie zidentyfikuj punkty początkowy i końcowy wiązki lasera w polu widzenia (FOV), zmieniając napięcie w kierunku skanowania.
  6. Aby zsynchronizować kamerę sCMOS i ETL, zeskanuj wiązkę lasera wzdłuż osi X oraz aktywne piksele wzdłuż osi Y, aby wygenerować obraz 2D (Rysunek 6B). Jaśniejsze i ostrzejsze koraliki wzdłuż przekątnej obrazu wskazują na precyzyjną synchronizację między sCMOS a ETL.
    UWAGA: Synchronizacja prędkości skanowania ETL i aktywacji pikseli sCMOS jest kluczowa dla jakości obrazu. Różne typowe błędy asynchroniczności podsumowano na Rysunku 6C-F.
  7. Po ustaleniu optymalnych parametrów synchronizacji, obróć kamerę sCMOS o 90° wokół osi Z, aby wyrównać kierunek aktywnych pikseli z kierunkiem skanowania lasera.
  8. Powtórz krok 2.10 i zmierz FWHM funkcji PSF. Zastosuj tę samą metodę, która została wskazana w poprzednim raporcie16; średnie rozdzielczości boczna i osiowa ASLM wynoszą odpowiednio 2,18 µm i 2,88 µm (Rysunek 7).
    UWAGA: Jednorodne oświetlenie i rozdzielczość w całym polu widzenia FOV są możliwe do osiągnięcia w idealnych warunkach (Rysunek 7A-B). Asynchroniczna praca ETL z kamerą sCMOS, a także niewspółosiowość oświetlenia i detekcji, mogą prowadzić do niejednorodnej rozdzielczości przestrzennej (Rysunek 7C-D).
  9. W przypadku obrazowania serca, po wyrównaniu systemu i ustaleniu optymalnych parametrów synchronizacji systemu, przejdź do kroków od 2.6 do 2.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykazano, że LSM sprzyja badaniom kardiologicznym31,32,33,34,35,36,37 ze względu na minimalne ryzyko uszkodzeń fotochemicznych, wysoką rozdzielczość przestrzenną oraz możliwość sekcjonowania optycznego, w przeciwieństwie do innych metod obrazowania optycznego, takich jak obrazowanie w jasnym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Postęp w dziedzinie metod obrazowania, obliczeń i oczyszczania tkanek zapewnił niezrównaną możliwość dogłębnego zbadania struktury i funkcji serca. Ma to ogromny potencjał w zakresie pogłębienia naszej wiedzy na temat morfogenezy i patogenezy serca przy użyciu nienaruszonego modelu serca gryzonia. W przeciwieństwie do badań in vivo serca danio pręgowanego przy użyciu podobnego podejścia 40,41,42,43, integracja zaawansowanych technik LSM i metod oczyszczania tkanek pozwala nam przezwyciężyć wyzwania między rozdzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Wyrażamy naszą wdzięczność grupie dr Erica Olsona z UT Southwestern Medical Center za hojne podzielenie się modelami zwierzęcymi. Doceniamy wszystkie konstruktywne uwagi dostarczone przez członków D-inkubatora na UT Dallas. Praca ta była wspierana przez NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) i program UT Dallas STARS (Y.D.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Agaroza< / mocny>
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermo Fisher16520050
Woda dejonizowana--
Chemikalia do oczyszczania tkanek 
5-amino-1,3,3-trimetylocykloheksanoamina, mieszanina cis i transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Eter dibenzylowy (DBE)Sigma-Aldrich33630
Dichlorometan (DCM)Sigma-Aldrich270997
Koraliki fluorescencyjneSpherotechFP-0556-2
Nadtlenek wodoru (H2O2)Sigma-Aldrich216736
MetanolSigma-Aldrich439193
Paraformaldehyd (PFA)Thermo Fisher47392
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich79383
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP3911
Oprogramowanie i algorytmy
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHö rl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
Kluczowe elementy dostosowanego systemu arkuszy świetlnych
Korpus z zoomem 0,63 - 6,3xOlympusMVX-ZB10 
Obiektyw 10X IlluminationNikonMRH00105
1X Obiektyw detekcyjnyOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSSLaser Laserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589  nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
Złącze BNCNational InstrumentBNC-2110
Soczewka cylindrycznaThorlabsACY254-050-A
Sterownik silnika prądu stałego, 4 osiePhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL ETLOptotuneCAB-6-300
ETL FiltrOptotuneEL-E-4i
Filtr ChromaET525/30
FiltrChromaET585-40
FiltrChromaET645-75
Koło filtrów Migawka InstrumentLAMBDA 10-B
Zmotoryzowany stolik translacyjnyPhysik InstrumenteL-406.20DG10
Zmotoryzowany stolik translacyjnyPhysik InstrumenteL-406.40DG10
Zmotoryzowany stolik translacyjnyPhysik InstrumenteM-403.4PD
NI wielofunkcyjny I/ONational InstrumentPCIe-6363
Kamera sCMOSHamamatsuC13440-20CU
Silnik krokowyPololu1474
Obiektyw tubusuOlympusMVX-TLU
Sterownik obiektywu

Bibliografia

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73(2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002(2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396(2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209(2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924(2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795(2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278(2023).
  17. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821(2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769(2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149(2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  32. Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257(2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754(2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112(2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263(2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807(2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271(2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678(2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101(2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072(2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mikroskopia arkuszowaobrazowanie struktury sercautrwalanie i przejrzystanie tkanekobrazowanie serca gryzonimikrostruktura mięśnia sercowegomikroskopia z osiowym przesuwaniem wiązkiszycie obrazówdekonwolucja wielowidokowadopasowanie współczynnika refrakcjiprzebudowa serca
Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.