Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66717

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację mięśni szkieletowych i mięśni sercowych włóknisto-adipogennych (FAP) od myszy kolczastej (Acomys) poprzez dysocjację enzymatyczną i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. FAP uzyskane z tego protokołu mogą być skutecznie rozszerzane i różnicowane do miofibroblastów i adipocytów.

Streszczenie

Ze względu na swój wyjątkowy program naprawczy, mysz kolczasta jest nowym modelem badawczym dla medycyny regeneracyjnej. Drobnoustrojowi przodkowie fibro-adipogenni to komórki rezydujące w tkankach, które są zdolne do różnicowania się w adipocyty, fibroblasty i chondrocyty. Fibroadipogenni progenitorzy mają fundamentalne znaczenie dla orkiestracji regeneracji tkanek, ponieważ są odpowiedzialne za przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej po urazie. Badanie to koncentruje się na zbadaniu specyficznej roli włóknisto-adipogennych komórek progenitorowych w naprawie serca myszy kolczastej i regeneracji mięśni szkieletowych. W tym celu zoptymalizowano protokół oczyszczania kolczastych mięśni progenitorowych włóknisto-adipogennych myszy za pomocą cytometrii przepływowej z enzymatycznie dysocjowanych mięśni szkieletowych i sercowych. Populacja uzyskana z tego protokołu jest zdolna do ekspansji in vitro i może być różnicowana do miofibroblastów i adipocytów. Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla naukowców do zbadania charakterystycznych właściwości myszy kolczastej i porównania ich z Mus musculus. Dostarczy to informacji, które mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów regeneracyjnych w tym intrygującym modelu.

Wprowadzenie

Początkowo rozpoznawana ze względu na wyjątkowo delikatną skórę i niezwykłą zdolność do naprawiania urazów skóry, mysz kolczasta wykazała wyższą zdolność regeneracyjną w różnych układach narządów, takich jak mięśniowo-szkieletowe, nerkowe, ośrodkowy układ nerwowy i sercowo-naczyniowy, w porównaniu do Mus musculus1,2.

Progenitorzy fibro-adipogenni (FAP) to podzbiór komórek zrębu, które rezydują w różnych tkankach, w tym w mięśniu szkieletowym i sercowym. Komórki te posiadają unikalną zdolność do angażowania się w linie fibrogenne i adipogenne in vivo i in vitro3,4. FAP odgrywają kluczową rolę w regeneracji tkanek poprzez modulację macierzy zewnątrzkomórkowej i wspieranie funkcji innych typów komórek biorących udział w procesie naprawy. W mięśniach szkieletowych FAP aktywują się w odpowiedzi na uraz i ułatwiają różnicowanie komórek macierzystych mięśni oraz miogenezę5,6. W niedokrwiennym uszkodzeniu serca FAP odkładają tkankę bliznowatą, aby utrzymać integralność mięśnia sercowego. W przeciwieństwie do mięśni, FAP serca stają się chronicznie aktywowane i przyczyniają się do patologicznej przebudowy7,8.

Poprzednie badania wykazały, że macierz zewnątrzkomórkowa myszy kolczastej ma inny skład, strukturę i właściwości, które wspierają regenerację w porównaniu do Mus musculus9,10. W urazach mięśni i serca zauważono, że FAP przyczyniają się do lepszego leczenia u kolczastych myszy11,12,13. Zrozumienie zachowania i kontroli regulacyjnej FAP i zrębu myszy kolczastych może rzucić światło na mechanizm stojący za ich zdolnościami regeneracyjnymi. Podczas gdy FAP są szeroko badane w innych modelach zwierzęcych, takich jak mus musculus14,15, obecnie nie ma opublikowanych protokołów izolowania FAP myszy kolczastych. Opracowanie takiego protokołu wypełniłoby istotną lukę w tej dziedzinie i umożliwiłoby naukowcom zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw potencjału regeneracyjnego myszy kolczastej.

Ten protokół opisuje solidny i powtarzalny protokół do izolowania, rozszerzania i różnicowania FAP mięśni szkieletowych i sercowych od myszy kolczastej. Opisany tutaj protokół daje wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek, które są odpowiednie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Używając rh-TGFβ1 lub kompatybilnej pożywki dostępnej na rynku, dwóch metod szeroko stosowanych do różnicowania FAP mus musculus16, posortowane kolczaste FAP zachowują zdolność do różnicowania się odpowiednio wzdłuż linii fibrogennej i linii adipogennej (Rysunek 1).

Protokół

Wszystkie procedury utrzymania zwierząt i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej oraz przepisami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Zwierzęta trzymano w zamkniętym pomieszczeniu wolnym od patogenów w standardowych warunkach (cykl 12:12 światło-ciemność, 21-23 °C i poziom wilgotności 40%-60%) i zapewniono im bogatą w białko dietę dla myszy i wodę ad libitum. Do tego badania wykorzystano dorosłe (w wieku od 4 do 6 miesięcy, 50-60 g) samice i samce myszy Acomys dimidiatus. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworu i buforu

  1. Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS).
  2. Przygotować PBS-EDTA, mieszając 4 ml 0,5 M EDTA (2 mM) i 996 ml 1x PBS, pH = 7,4.
  3. Przygotuj 250 mM CaCl2, dodając 2,7745 g CaCl2 do 100 ml wody wolnej od nukleaz.
  4. Przygotuj bufor do wytrawiania: Wymieszaj 50 μg/ml liberazy, 2,5 mM CaCl2 i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w DMEM/F12.
  5. Przygotuj bufor FACS, mieszając 488 ml 1x PBS, 2 ml 0,5 M EDTA i 10 ml FBS.
  6. Przygotować bufor żywotności przez zmieszanie buforu FACS z jodkiem propidyny (PI; 1 μg/ml).
  7. Przygotuj podłoża podstawowe, mieszając DMEM/F12 z 5% FBS i 1% (v/v) piórem/paciorkowiec.
  8. Przygotuj pożywkę proliferacyjną, mieszając DMEM/F12 z 10% FBS, 1% (v/v) pen/strep i 2,5 ng/ml bFGF.
  9. Przygotować pożywkę fibrogeniczną, mieszając pożywkę zasadową i 10 ng/ml rh-TGFβ1,
  10. Przygotuj pożywkę adipogenną (1x), mieszając DMEM / F12 z 1% piórem / paciorkowcem i dostępnym w handlu 10x mysim suplementem różnicującym adipogeny.
  11. Przygotuj 4% PFA, dodając 4% paraformaldehydu (w/v) do 1x PBS.
  12. Przygotuj 0,3% PBS-Triton, mieszając 498,5 ml 1x PBS i 1,5 ml TritonX-100.
  13. Przygotuj bufor blokujący osła, mieszając 5% (v/v) surowicy osła, 1% BSA (w/v) i 0,3% PBS-Triton.
  14. Przygotuj bufor blokujący osioł + mama, mieszając 2,5 ml buforu blokującego osła i 2 krople bloku MOM.
  15. Przygotować roztwór barwiący DAPI, mieszając 600 nM 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS.

2. Pobieranie tkanek

  1. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. W przypadku myszy kolczastych zaleca się izofluran, a następnie CO2 (20% objętości klatki/min) i zwichnięcie kręgosłupa w celu zapewnienia śmierci.
  2. Umieść mysz na etapie preparacji w pozycji leżącej na plecach i dokładnie spryskaj 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią myszy.
  3. Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2-3 cm na brzusznej linii środkowej i odsłoń klatkę piersiową i mięsień brzucha. Przeciąć mięsień w wyrostku mieczykowatym nożyczkami do tkanek i odsłonić przeponę. Wytnij membranę i klatkę piersiową po obu stronach. Użyj hemostatu, aby zacisnąć i odkleić pocięte żeberka.
  4. Naciąć prawy przedsionek nożyczkami do tkanek, umieścić igłę 23 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 20 ml w wierzchołku serca i wykonać perfuzję, powoli wstrzykując 20 ml 2 mM PBS-EDTA.
  5. Wyciąć serce, opłukać na zimno 1x PBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie, usunąć przedsionki i oczyścić krew tak bardzo, jak to możliwe.
  6. Usuń skórę nad stawem kolanowym. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć powięź i odizoluj mięsień czworogłowy uda nożyczkami, używając kości udowej jako przewodnika. Umieścić na osobnej szalce Petriego z zimnym 1x PBS.
  7. Powtórz krok 2.6 dla drugiej nogi.

3. Trawienie tkankowe

  1. Dodać 2 ml buforu wytrawiającego do 5 ml fiolki transportowej dla serca i 4 ml buforu wytrawiającego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml dla dwóch mięśni czworogłowych.
  2. Zmielić tkankę nożyczkami do tkanek na pokrywie szalki Petriego na mniejsze niż 1 mm3 kawałki.
  3. Dodaj zmieloną tkankę do odpowiednich probówek wytrawiających. Wiruj przez 2 sekundy na niskiej prędkości, aby wymieszać.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i wstrząsając.
  5. Po 20 minutach zdejmij rurki z rotatora i pozwól kawałkom tkanki osiąść. Zdjąć supernatant z pipetą P1000 do 20 ml lodowatego buforu FACS w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
  6. Uzupełnij probówki wytrawiające odpowiednio 2 ml i 4 ml buforu wytrawiającego do trawienia serca i mięśni, a następnie umieść je z powrotem w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i potrząsając.
  7. Powtórzyć kroki od 3.5 do 3.6 jeszcze raz po kolejnych 20 minutach. Umieścić supernatant w odpowiedniej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z kroku 3.5.
  8. Zatrzymaj trawienie po 60 minutach, gasząc bufor wytrawiający lodowatym buforem FACS.
  9. Przefiltrować zawiesinę wytrawiania i supernatant przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm na wierzchu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Uzupełnij do 40 ml buforem FACS.
  10. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do lizy ACK. Inkubować na lodzie przez 5 minut i uzupełnić do 40 ml buforem FACS.
  11. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
  12. Zawiesić ponownie w 0,5 ml buforu FACS, pipetując w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek.
  13. Przefiltrować zawiesinę przez filtr 40 μm na probówkach okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką z sitkiem komórkowym.

4. Barwienie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

  1. W przypadku kontroli jednokolorowych i fluorescencji minus jeden (FMO) należy przygotować 30 μl buforu barwiącego (przeciwciała rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x we wstępnie znakowanych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z konfiguracją bufora do barwienia przeciwciał.
  2. Przygotuj osobno pojedyncze kolory i kontrolki FMO dla mięśni i serca.
  3. Przenieść 30 μl jednokolorowego buforu barwiącego do kontroli FMO na płytkę 96-dołkową. Uzupełnić 20 μl buforu FACS.
  4. Do barwienia próbki FACS należy przygotować 0,5 ml buforu barwiącego (przeciwciało rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do studzienek jednokolorowych i kontrolnych FMO. Dodać bufor barwiący do reszty zawiesiny komórek i ponownie zawiesić.
  6. Inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 30 minut.
  7. Uzupełnić studzienki 100 μl buforu FACS, a probówkę z próbką 2 ml buforu FACS.
  8. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  9. Powtórz kroki 4.7 i 4.8.
  10. Zawiesić osad komórkowy w buforze żywotności. 100 μl dla próbek jednokolorowych i kontrolnych FMO, 1 ml dla próbek sortujących FACS.
  11. Przygotować probówki zbiorcze, dodając 300 μl pożywki proliferacyjnej do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml.

5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

  1. Strategia bramkowania: Użyj FSC vs. SSC (log) do usuwania gruzu. Użyj FSC-H vs. FSC-A do podkoszulków bramowych. Użyj CD31 vs. PI do bramki na komórkach żywotnych i ujemnych pod względem linii. Użyj PDGFRα do bramki dla FAP (Rysunek 2).
  2. Sortuj do wcześniej przygotowanych probówek zbiorczych.

6. Hodowla tkankowa

  1. Odwirować zebrane komórki przy sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć supernatant za pomocą pipety P1000. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  3. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (250 μl/basenik) i wysiać nasiona przy 25 tys. komórek/basenie na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  4. Hodowla w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2 ). Zmieniaj pożywkę co 3 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.

7. Różnicowanie fibrogenne

  1. Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed użyciem umieść podstawowe podłoża i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną.
  3. Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.
  4. Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.
  5. Dodać 250 μl pożywki fibrogennej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.
  6. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  7. Różnicowanie należy przerwać po 48 godzinach.

8. Różnicowanie adipogenne

  1. Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed ich użyciem umieść podłoża podstawowe, podłoża adipogenne i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną.
  3. Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.
  4. Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.
  5. Dodaj 400 μl pożywki adipogenicznej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.
  6. Powrót do inkubatora (37°C, 5% CO2 ).
  7. Co 2 dni wyjmować pipetą z dołków 200 μl pożywki i dodawać 200 μl świeżej pożywki adipogenicznej lub zasadowej.
  8. Zatrzymaj różnicowanie w 6 dniu w przypadku FAP mięśni szkieletowych i 14 dnia w przypadku FAP serca.

9. Barwienie immunologiczne

  1. Zatrzymać test różnicowania przez zasysanie pożywki i dwukrotne przepłukanie 250 μl 1x PBS. Wszystkie płukania należy wykonywać za pomocą igły 18 G dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby uniknąć odwarstwienia komórek.
  2. Dodać 250 μl 4% PFA do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
  3. Usuń PFA i płucz 3 razy przez 5 minut za każdym razem 250 μl 1x PBS.
  4. Podczas ostatniego prania odessać 1x PBS i dodać 250 μL buforu blokującego Donkey + MOM.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
  6. Przygotować pierwszorzędowy roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła (anty-SMA i anty-perylipina) na końcową objętość 100 μl na studzienkę.
  7. Zassać dołki barwiące. Pozostaw bufor blokujący osioł + MOM w dobrym stanie kontrolnym, jeśli ma to zastosowanie.
  8. Dodaj pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała do odpowiednich studzienek.
  9. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  10. Następnego dnia umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem 1x PBS.
  11. Przygotować wtórny roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła o końcowej objętości 100 μl na studzienkę.
  12. Odessać ostatnie płukanie i dodać wtórny roztwór barwiący przeciwciała do wszystkich studzienek.
  13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut (od tego momentu próbki należy chronić przed światłem).
  14. Umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem za pomocą 1x PBS.
  15. Odessać ostatnie płukanie i dodać 250 μl roztworu barwiącego DAPI.
  16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  17. Usuń roztwór barwiący DAPI i umyj raz przez 5 minut 1x PBS.
  18. Dodać 100 μl Fluoromount-G do każdej studzienki.
  19. Uszczelnij płytkę pokrywką i folią parafinową, aby zminimalizować parowanie. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania zdjęcia.
  20. Obraz pod mikroskopem (Rysunek 3 i Rysunek 4).
    UWAGA: Surowica osła jest używana do blokowania bufora jako specyficzny dla gatunku blok przeciwko przeciwciałom drugorzędowym podniesionym przez osła, które są używane w tym protokole. Odczynnik blokujący typu mysz na myszy jest używany przeciwko pierwszorzędowemu przeciwciału anty-SMA, które jest wzniesione u myszy.

Wyniki

Schemat tego protokołu izolacji i hodowli FAP mięśni szkieletowych i serca przedstawiono w Rysunku 1. W przypadku pobierania tkanek zmiana koloru wątroby z ciemnoczerwonej na bladożółtą zazwyczaj świadczy o prawidłowym przebiegu perfuzji. Przy określonym przedziale wiekowym myszy kolczastej masa serca wynosi zazwyczaj około 200 mg, natomiast masa mięśnia czworogłowego wynosi około 350 mg.

Podczas każdej wymiany buforu trawiennego w krokach 3.5-3.7 bufor w probówkach do trawienia staje się mętny w miarę uwalniania komórek z tkanki. Po zakończeniu procesu roztwór powinien mieć postać względnie homogenicznej zawiesiny z pozostałymi fragmentami tkanki. Należy przerwać trawienie, zanim wszystkie tkanki zostaną całkowicie rozłożone, aby uniknąć nadmiernego trawienia, co negatywnie wpłynęłoby na żywotność komórek i wyniki hodowli.

Przewidywane wykresy przepływu dla FACS przedstawiono na Rysunku 2. Oczekuje się, że FAPs będą stanowiły około 2% żywych komórek LIN-. Odsetek zdarzeń PI+ jest wskaźnikiem jakości przygotowania próbki i powinien być mniejszy niż 10%. W badaniu tym zazwyczaj uzyskuje się 150k FAPs na serce (tylko komory) oraz 100k FAPs z dwóch mięśni czworogłowych uda.

Po przeniesieniu na płytkę komórki zazwyczaj przytwierdzają się w ciągu 72 h, osiągają 80% konfluencji w ciągu 5 dni i wykazują typową morfologię fibroblastów z wypustkami (Rysunek 5).

Trawienie tkanek, schemat sortowania komórek metodą FACS; ekspansja FAP, proces różnicowania.
Rysunek 1: Schematyczny przebieg protokołu i przybliżony czas wymagany dla każdego etapu. Pobieranie tkanek: 10 min na mysz. Trawienie tkanek: 1,5-2 h. Barwienie komórek: 45 min-75 min. Sortowanie komórek metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS): 2 h. Ekspansja progenitorów fibro-adypogennych (FAP): 4 dni. Różnicowanie FAP: 48 h dla różnicowania fibrogennego, 6 dni dla różnicowania adypogennego w przypadku FAP z mięśni szkieletowych oraz 14 dni dla FAP z serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat cytometrii przepływowej; sortowanie FAP z mięśni szkieletowych i serca, wykresy FSC-SSC, bramkowanie populacji komórek.
Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy FACS dla izolacji FAP z mięśni szkieletowych (góra) i serca (dół). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia różnicowania FAP mięśni szkieletowych, fibrogenne, adipogenne, kontrolne, immunofluorescencja.
Rysunek 3: Różnicowanie FAP mięśni szkieletowych myszy kolczatej. (A) Kontrola różnicowania fibrogennego. (B) Różnicowanie fibrogenne. (C) Kontrola różnicowania adipogennego. (D) Różnicowanie adipogenne. Perilipina (zielony), SMA (magenta), DAPI (niebieski), pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Różnicowanie FAP serca, obraz mikroskopowy; procesy fibrogenne vs. adipogenne, analiza komórek.
Rycina 4: Różnicowanie FAP serca myszy kolczastej. (A) Kontrola różnicowania fibrogennego. (B) Różnicowanie fibrogenne. (C) Kontrola różnicowania adipogennego. (D) Różnicowanie adipogenne. Perilipina (zielony), SMA (magenta), DAPI (niebieski), pasek skali = 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

FAPs mięśni szkieletowych i sercowych, obraz mikroskopowy, analiza morfologii komórkowej.
Rycina 5: Obrazy w polu jasnym FAP mięśni szkieletowych (A) i serca (B) myszy kolczastej po 5 dniach hodowli, przed różnicowaniem. Pasek skali = 360 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

KontroleCD31 SCPDGFRα SCCD31 FMOPDGFRα FMOPróbka
Przeciwciało CD31+--++
Przeciwciało PDGFRα-++-+

Tabela 1: Schematyczny przewodnik po przygotowaniu koktajli przeciwciał do barwienia dla kontroli i próbek. SC = kontrola jednobarwna, FMO = kontrola fluorescence minus one, + = z odpowiednim przeciwciałem, - = bez odpowiedniego przeciwciała.

Dyskusja

Kolczaste tkanki myszy są bardziej wrażliwe na stresy związane z dysocjacją tkanek i istnieje kilka aspektów tego protokołu mających na celu zminimalizowanie stresu w celu poprawy żywotności komórek. Technika seryjnej dysocjacji enzymatycznej jest stosowana do przygotowania próbki w celu obniżenia wymaganego stężenia enzymu. W miarę postępu trawienia enzymatycznego aktywność enzymatyczna maleje. Zastępując go świeżymi enzymami, można lepiej osiągnąć stałą aktywność enzymatyczną podczas całego trawienia i uniknąć wysokich stężeń enzymu. Ponadto unika się zmiany buforu wytrawiającego w celu nadmiernego strawienia już uwolnionych komórek w roztworze. Po drugie, bufor do lizy ACK służy do usuwania czerwonych krwinek. Chociaż serce jest wykrwawione i perfundowane, nadal zawiera czerwone krwinki, ponieważ jest to silnie unaczyniony narząd. Usuwając zanieczyszczające krwinki czerwone, czas wymagany do FACS jest zminimalizowany, aby uniknąć degradacji komórek. Wreszcie, ważne jest, aby od kroku 2.1 do kroku 6.4 pracować szybko i sumiennie oraz postępować zgodnie z najlepszymi praktykami dotyczącymi pracy z komórkami, takimi jak delikatne pipetowanie i utrzymywanie lodu tak długo, jak to możliwe. Niektóre szczegóły są trudne do pokazania nawet w formacie audiowizualnym i mogą wymagać pewnego poziomu doświadczenia.

W hodowli komórkowej początkowa gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie dla optymalnej ekspansji komórek. FAP w naczyniu komunikują się w sposób parakrynny i stymulują wzrost poprzez wydzielane czynniki wzrostu. W warunkach niskiej gęstości wysiewu komórki nie otrzymują wystarczających sygnałów do wzrostu i albo nie będą się rozwijać, albo będą wymagały dodatkowego czasu hodowli, aby osiągnąć odpowiedni poziom konfluencji dla dalszych zastosowań. Jest to również uzasadnienie dla zmiany tylko połowy pożywki podczas każdej zmiany pożywki w różnicowaniu adipogennym. Ważne jest, aby pozostawić trochę kondycjonowanej pożywki, która zawiera czynniki wzrostu z preadipocytów, które są krytyczne dla ich różnicowania.

Podczas barwienia immunologicznego ważne jest, aby zachować ostrożność podczas dodawania lub usuwania, aby zminimalizować oderwanie komórek. W szczególności w kroku 9.1 komórki są najbardziej podatne na odklejanie się przed utrwaleniem. Zaleca się ręczne zasysanie, takie jak pipeta lub igła i strzykawka, ale nie zaleca się stosowania mocnych aspiratorów próżniowych.

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że PDGFRα jest ogólnym markerem FAPs, a do rozróżnienia unikalnych podtypów FAP17 potrzeba więcej markerów. Podtypy, takie jak progenitorzy DPP4 +, tacy jak FAP i CD10 + adipogenne FAPy, są zaangażowane zarówno w kontekst choroby, jak i homeostazy 18,19,20. Podzbiory FAP prawdopodobnie istnieją również u myszy kolczastej. Mogą występować w różnych proporcjach, wykazywać różne zachowanie komórkowe lub mieć różne funkcje fizjologiczne w porównaniu z odpowiadającymi im podzbiorami FAP mus musculus. Dalsza optymalizacja markerów specyficznych dla podtypu FAP u myszy kolczastej będzie konieczna, aby zbadać szczegóły FAP myszy kolczastych.

Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje solidną i powtarzalną metodę izolacji, hodowli i różnicowania FAP mięśni szkieletowych i serca od myszy kolczastej. Kolczasta mysz nabiera rozpędu jako nowy, hiperregeneracyjny model zwierzęcy. FAP i zrąb są silnie zaangażowane w utrzymanie homeostazy mięśni i serca oraz przyczyniają się do dysfunkcji narządów w wielu modelach chorób przewlekłych 5,7. Scharakteryzowanie FAP myszy kolczastych może wyjaśnić mechanizm stojący za ich niezwykłą zdolnością regeneracyjną i utorować drogę do nowych strategii w medycynie regeneracyjnej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Andy'emu Johnsonowi i Justinowi Wongowi, rdzeniowi przepływu UBC, za ich ekspertyzę i pomoc w optymalizacji protokołu FACS, a także personelowi Centrum Badań Biomedycznych UBC za opiekę nad myszami kolczastymi. Rysunek 1 został wykonany przy użyciu Biorender. Rysunek 2 został wykonany przy użyciu oprogramowania FlowJo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.5M EDTAInvitrogen15575– 038
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlVWR87003-294
15  ml probówka wirówkowaFalcon352096
1x Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Gibco14190-144
20 ml strzykawkaBD309661
4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)InvitrogenD3571
40  μ m sitko komórkoweFalcon352340
48-dołkowa płaska płytka do hodowli tkankowejFalcon53078
5 ml polipropylenFalcon352063
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitowąFalcon352235
ml strzykawkaBD309646
50  ml probówka wirówkowaFalcon352070
60 mm szalka PetriegoFalcon353002
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej z dnem w kształcie litery VCorning3894<
em>Acomys dimidiatus myszy (myszy kolczaste)uprzejmie podarowane przez dr Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)GibcoA10492-01
Antyperylipina (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD Igła PrecisionGlide 18 GBD305195
Igła BD PrecisionGlide 23 GBD305145
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
WirówkaEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Osioł anty-mysz Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Osioł anty-królik Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
Serum osłaSigmaS30-100ML
Sorter FACS - MoFlo Astrios 5 laserówRedlica BeckmanB52102
Płodowa surowica bydlęcaGemini100-500
Drobne nożyczkiFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
KleszczeFST11051-10
HemostatFST91308-12
ludzkie białko rekombinowane FGF-zasadowe (bFGF)Gibco13256029
Ludzkie białko rekombinowane TGF beta 1 (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Inkubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Mikroskop odwrócony - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x SuplementSTEMCELL technologies5507
Odczynnik blokujący mysz na myszy (MOM)Vector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydSigmaP1648-500g
Penicylina-StreptomycynaGibco15140– 122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Jodek propidyny (PI)InvitrogenP3566
Fiolka transportowa 5mL tubkaCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5
5

Bibliografia

  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fibro-adipogenne komórki progenitorowecytometria przepływowatrawienie enzymatyczneregeneracja mięśnia sercowegoregeneracja mięśni szkieletowychsortowanie komórekdysocjacja tkanekekspansja komórek progenitorowychprzebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej
Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.