Izolacja, ekspansja i różnicowanie fibro-adipogennych progenitorów od modelu myszy kolczastej

Początkowo rozpoznawana ze względu na wyjątkowo delikatną skórę i niezwykłą zdolność do naprawiania urazów skóry, mysz kolczasta wykazała wyższą zdolność regeneracyjną w różnych układach narządów, takich jak mięśniowo-szkieletowe, nerkowe, ośrodkowy układ nerwowy i sercowo-naczyniowy, w porównaniu do Mus musculus1^,2.

Progenitorzy fibro-adipogenni (FAP) to podzbiór komórek zrębu, które rezydują w różnych tkankach, w tym w mięśniu szkieletowym i sercowym. Komórki te posiadają unikalną zdolność do angażowania się w linie fibrogenne i adipogenne in vivo i in vitro^3,4. FAP odgrywają kluczową rolę w regeneracji tkanek poprzez modulację macierzy zewnątrzkomórkowej i wspieranie funkcji innych typów komórek biorących udział w procesie naprawy. W mięśniach szkieletowych FAP aktywują się w odpowiedzi na uraz i ułatwiają różnicowanie komórek macierzystych mięśni oraz miogenezę^5,6. W niedokrwiennym uszkodzeniu serca FAP odkładają tkankę bliznowatą, aby utrzymać integralność mięśnia sercowego. W przeciwieństwie do mięśni, FAP serca stają się chronicznie aktywowane i przyczyniają się do patologicznej przebudowy^7,8.

Poprzednie badania wykazały, że macierz zewnątrzkomórkowa myszy kolczastej ma inny skład, strukturę i właściwości, które wspierają regenerację w porównaniu do Mus musculus^9,10. W urazach mięśni i serca zauważono, że FAP przyczyniają się do lepszego leczenia u kolczastych myszy^11,12,13. Zrozumienie zachowania i kontroli regulacyjnej FAP i zrębu myszy kolczastych może rzucić światło na mechanizm stojący za ich zdolnościami regeneracyjnymi. Podczas gdy FAP są szeroko badane w innych modelach zwierzęcych, takich jak mus musculus^14,15, obecnie nie ma opublikowanych protokołów izolowania FAP myszy kolczastych. Opracowanie takiego protokołu wypełniłoby istotną lukę w tej dziedzinie i umożliwiłoby naukowcom zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw potencjału regeneracyjnego myszy kolczastej.

Ten protokół opisuje solidny i powtarzalny protokół do izolowania, rozszerzania i różnicowania FAP mięśni szkieletowych i sercowych od myszy kolczastej. Opisany tutaj protokół daje wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek, które są odpowiednie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Używając rh-TGFβ1 lub kompatybilnej pożywki dostępnej na rynku, dwóch metod szeroko stosowanych do różnicowania FAP mus musculus¹⁶, posortowane kolczaste FAP zachowują zdolność do różnicowania się odpowiednio wzdłuż linii fibrogennej i linii adipogennej (Rysunek 1).

Wszystkie procedury utrzymania zwierząt i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej oraz przepisami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Zwierzęta trzymano w zamkniętym pomieszczeniu wolnym od patogenów w standardowych warunkach (cykl 12:12 światło-ciemność, 21-23 °C i poziom wilgotności 40%-60%) i zapewniono im bogatą w białko dietę dla myszy i wodę ad libitum. Do tego badania wykorzystano dorosłe (w wieku od 4 do 6 miesięcy, 50-60 g) samice i samce myszy Acomys dimidiatus. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworu i buforu

1. Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS).
2. Przygotować PBS-EDTA, mieszając 4 ml 0,5 M EDTA (2 mM) i 996 ml 1x PBS, pH = 7,4.
3. Przygotuj 250 mM CaCl₂, dodając 2,7745 g CaCl₂ do 100 ml wody wolnej od nukleaz.
4. Przygotuj bufor do wytrawiania: Wymieszaj 50 μg/ml liberazy, 2,5 mM CaCl₂ i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w DMEM/F12.
5. Przygotuj bufor FACS, mieszając 488 ml 1x PBS, 2 ml 0,5 M EDTA i 10 ml FBS.
6. Przygotować bufor żywotności przez zmieszanie buforu FACS z jodkiem propidyny (PI; 1 μg/ml).
7. Przygotuj podłoża podstawowe, mieszając DMEM/F12 z 5% FBS i 1% (v/v) piórem/paciorkowiec.
8. Przygotuj pożywkę proliferacyjną, mieszając DMEM/F12 z 10% FBS, 1% (v/v) pen/strep i 2,5 ng/ml bFGF.
9. Przygotować pożywkę fibrogeniczną, mieszając pożywkę zasadową i 10 ng/ml rh-TGFβ1,
10. Przygotuj pożywkę adipogenną (1x), mieszając DMEM / F12 z 1% piórem / paciorkowcem i dostępnym w handlu 10x mysim suplementem różnicującym adipogeny.
11. Przygotuj 4% PFA, dodając 4% paraformaldehydu (w/v) do 1x PBS.
12. Przygotuj 0,3% PBS-Triton, mieszając 498,5 ml 1x PBS i 1,5 ml TritonX-100.
13. Przygotuj bufor blokujący osła, mieszając 5% (v/v) surowicy osła, 1% BSA (w/v) i 0,3% PBS-Triton.
14. Przygotuj bufor blokujący osioł + mama, mieszając 2,5 ml buforu blokującego osła i 2 krople bloku MOM.
15. Przygotować roztwór barwiący DAPI, mieszając 600 nM 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS.

2. Pobieranie tkanek

1. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. W przypadku myszy kolczastych zaleca się izofluran, a następnie CO₂ (20% objętości klatki/min) i zwichnięcie kręgosłupa w celu zapewnienia śmierci.
2. Umieść mysz na etapie preparacji w pozycji leżącej na plecach i dokładnie spryskaj 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierścią myszy.
3. Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2-3 cm na brzusznej linii środkowej i odsłoń klatkę piersiową i mięsień brzucha. Przeciąć mięsień w wyrostku mieczykowatym nożyczkami do tkanek i odsłonić przeponę. Wytnij membranę i klatkę piersiową po obu stronach. Użyj hemostatu, aby zacisnąć i odkleić pocięte żeberka.
4. Naciąć prawy przedsionek nożyczkami do tkanek, umieścić igłę 23 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 20 ml w wierzchołku serca i wykonać perfuzję, powoli wstrzykując 20 ml 2 mM PBS-EDTA.
5. Wyciąć serce, opłukać na zimno 1x PBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie, usunąć przedsionki i oczyścić krew tak bardzo, jak to możliwe.
6. Usuń skórę nad stawem kolanowym. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć powięź i odizoluj mięsień czworogłowy uda nożyczkami, używając kości udowej jako przewodnika. Umieścić na osobnej szalce Petriego z zimnym 1x PBS.
7. Powtórz krok 2.6 dla drugiej nogi.

3. Trawienie tkankowe

1. Dodać 2 ml buforu wytrawiającego do 5 ml fiolki transportowej dla serca i 4 ml buforu wytrawiającego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml dla dwóch mięśni czworogłowych.
2. Zmielić tkankę nożyczkami do tkanek na pokrywie szalki Petriego na mniejsze niż 1 mm³ kawałki.
3. Dodaj zmieloną tkankę do odpowiednich probówek wytrawiających. Wiruj przez 2 sekundy na niskiej prędkości, aby wymieszać.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i wstrząsając.
5. Po 20 minutach zdejmij rurki z rotatora i pozwól kawałkom tkanki osiąść. Zdjąć supernatant z pipetą P1000 do 20 ml lodowatego buforu FACS w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
6. Uzupełnij probówki wytrawiające odpowiednio 2 ml i 4 ml buforu wytrawiającego do trawienia serca i mięśni, a następnie umieść je z powrotem w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając i potrząsając.
7. Powtórzyć kroki od 3.5 do 3.6 jeszcze raz po kolejnych 20 minutach. Umieścić supernatant w odpowiedniej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z kroku 3.5.
8. Zatrzymaj trawienie po 60 minutach, gasząc bufor wytrawiający lodowatym buforem FACS.
9. Przefiltrować zawiesinę wytrawiania i supernatant przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm na wierzchu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Uzupełnij do 40 ml buforem FACS.
10. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do lizy ACK. Inkubować na lodzie przez 5 minut i uzupełnić do 40 ml buforem FACS.
11. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
12. Zawiesić ponownie w 0,5 ml buforu FACS, pipetując w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek.
13. Przefiltrować zawiesinę przez filtr 40 μm na probówkach okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką z sitkiem komórkowym.

4. Barwienie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

1. W przypadku kontroli jednokolorowych i fluorescencji minus jeden (FMO) należy przygotować 30 μl buforu barwiącego (przeciwciała rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x we wstępnie znakowanych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z konfiguracją bufora do barwienia przeciwciał.
2. Przygotuj osobno pojedyncze kolory i kontrolki FMO dla mięśni i serca.
3. Przenieść 30 μl jednokolorowego buforu barwiącego do kontroli FMO na płytkę 96-dołkową. Uzupełnić 20 μl buforu FACS.
4. Do barwienia próbki FACS należy przygotować 0,5 ml buforu barwiącego (przeciwciało rozcieńczone w buforze FACS) o stężeniu roboczym 2x w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do studzienek jednokolorowych i kontrolnych FMO. Dodać bufor barwiący do reszty zawiesiny komórek i ponownie zawiesić.
6. Inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 30 minut.
7. Uzupełnić studzienki 100 μl buforu FACS, a probówkę z próbką 2 ml buforu FACS.
8. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
9. Powtórz kroki 4.7 i 4.8.
10. Zawiesić osad komórkowy w buforze żywotności. 100 μl dla próbek jednokolorowych i kontrolnych FMO, 1 ml dla próbek sortujących FACS.
11. Przygotować probówki zbiorcze, dodając 300 μl pożywki proliferacyjnej do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml.

5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

1. Strategia bramkowania: Użyj FSC vs. SSC (log) do usuwania gruzu. Użyj FSC-H vs. FSC-A do podkoszulków bramowych. Użyj CD31 vs. PI do bramki na komórkach żywotnych i ujemnych pod względem linii. Użyj PDGFRα do bramki dla FAP (Rysunek 2).
2. Sortuj do wcześniej przygotowanych probówek zbiorczych.

6. Hodowla tkankowa

1. Odwirować zebrane komórki przy sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć supernatant za pomocą pipety P1000. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
3. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (250 μl/basenik) i wysiać nasiona przy 25 tys. komórek/basenie na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
4. Hodowla w inkubatorze (37 °C, 5 % CO_{2 ).} Zmieniaj pożywkę co 3 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.

7. Różnicowanie fibrogenne

1. Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed użyciem umieść podstawowe podłoża i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.
2. Odessać pożywkę hodowlaną.
3. Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.
4. Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.
5. Dodać 250 μl pożywki fibrogennej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.
6. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ).
7. Różnicowanie należy przerwać po 48 godzinach.

8. Różnicowanie adipogenne

1. Gdy komórki są gotowe do leczenia, przed ich użyciem umieść podłoża podstawowe, podłoża adipogenne i 1x DPBS w ciepłej kąpieli lub w temperaturze pokojowej.
2. Odessać pożywkę hodowlaną.
3. Spłukać dwukrotnie 200 μl 1x DPBS.
4. Spłukać jednorazowo 200 μl podłoża zasadowego.
5. Dodaj 400 μl pożywki adipogenicznej lub zasadowej do odpowiednich studzienek.
6. Powrót do inkubatora (37°C, 5% CO_{2 ).}
7. Co 2 dni wyjmować pipetą z dołków 200 μl pożywki i dodawać 200 μl świeżej pożywki adipogenicznej lub zasadowej.
8. Zatrzymaj różnicowanie w 6 dniu w przypadku FAP mięśni szkieletowych i 14 dnia w przypadku FAP serca.

9. Barwienie immunologiczne

1. Zatrzymać test różnicowania przez zasysanie pożywki i dwukrotne przepłukanie 250 μl 1x PBS. Wszystkie płukania należy wykonywać za pomocą igły 18 G dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby uniknąć odwarstwienia komórek.
2. Dodać 250 μl 4% PFA do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
3. Usuń PFA i płucz 3 razy przez 5 minut za każdym razem 250 μl 1x PBS.
4. Podczas ostatniego prania odessać 1x PBS i dodać 250 μL buforu blokującego Donkey + MOM.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
6. Przygotować pierwszorzędowy roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła (anty-SMA i anty-perylipina) na końcową objętość 100 μl na studzienkę.
7. Zassać dołki barwiące. Pozostaw bufor blokujący osioł + MOM w dobrym stanie kontrolnym, jeśli ma to zastosowanie.
8. Dodaj pierwszorzędowy roztwór barwiący przeciwciała do odpowiednich studzienek.
9. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
10. Następnego dnia umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem 1x PBS.
11. Przygotować wtórny roztwór do barwienia przeciwciał w buforze blokującym osła o końcowej objętości 100 μl na studzienkę.
12. Odessać ostatnie płukanie i dodać wtórny roztwór barwiący przeciwciała do wszystkich studzienek.
13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut (od tego momentu próbki należy chronić przed światłem).
14. Umyj 3 razy przez 5 minut za każdym razem za pomocą 1x PBS.
15. Odessać ostatnie płukanie i dodać 250 μl roztworu barwiącego DAPI.
16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
17. Usuń roztwór barwiący DAPI i umyj raz przez 5 minut 1x PBS.
18. Dodać 100 μl Fluoromount-G do każdej studzienki.
19. Uszczelnij płytkę pokrywką i folią parafinową, aby zminimalizować parowanie. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania zdjęcia.
20. Obraz pod mikroskopem (Rysunek 3 i Rysunek 4).
    UWAGA: Surowica osła jest używana do blokowania bufora jako specyficzny dla gatunku blok przeciwko przeciwciałom drugorzędowym podniesionym przez osła, które są używane w tym protokole. Odczynnik blokujący typu mysz na myszy jest używany przeciwko pierwszorzędowemu przeciwciału anty-SMA, które jest wzniesione u myszy.

Schemat tego protokołu do izolacji i hodowli FAP mięśni szkieletowych i serca jest podsumowany w Rysunek 1. W przypadku pobrania tkanek wątroba zmieniająca kolor z ciemnoczerwonego na bladożółty zwykle wskazuje na udaną perfuzję. W określonych przedziałach wiekowych myszy kolczastej masa serca wynosi zwykle około 200 mg, podczas gdy mięsień czworogłowy wynosi około 350 mg.

Podczas każdej zmiany bufora trawienia w krokach 3.5-3.7, bufor trawienny w rurkach trawiennych wydaje się nieprzezroczysty, gdy komórki są uwalniane z tkanki. Pod koniec trawienia roztwór musi być stosunkowo jednorodną zawiesiną, w której pozostały pewne kawałki tkanki. Pamiętaj, aby zakończyć trawienie, zanim wszystkie tkanki zostaną całkowicie strawione, aby uniknąć nadmiernego trawienia, które negatywnie wpłynie na żywotność komórek i wyniki hodowli.

Oczekiwane wykresy przepływu dla FACS są pokazane w Rysunek 2. Oczekuje się, że FAP będą stanowić około 2% żywych komórek i komórek LIN-. Odsetek zdarzeń PI+ jest wskaźnikiem jakości przygotowania próbki i powinien być mniejszy niż 10%. W tym badaniu zwykle uzyskuje się 150 tys. FAP na serce (tylko komory) i 100 tys. FAP z dwóch mięśni czworogłowych.

Po umieszczeniu na płytce, komórki zazwyczaj łączą się w ciągu 72 godzin, osiągają 80% zbieżności w ciągu 5 dni i wykazują typową morfologię fibroblastów z projekcjami (Rysunek 5).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu i przybliżony czas wymagany dla każdego kroku. Pobieranie tkanek: 10 minut na mysz. Trawienie tkanek: 1,5-2 h. Barwienie komórek: 45 min-75 min. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją: 2 h. Ekspansja drobnoustrojowych komórek progenitorowych włóknisto-adipogennych (FAP): 4 dni. Różnicowanie FAP: 48 godzin dla różnicowania fibrogennego, 6 dni dla różnicowania adipogennego dla FAP mięśni szkieletowych i 14 dni dla FAP serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy FACS dla izolacji FAP mięśni szkieletowych (na górze) i serca (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Różnicowanie FAP mięśni szkieletowych myszy kolczastych. (A) Kontrola różnicowania fibrogennego. (B) Różnicowanie fibrogenne. (C) Kontrola różnicowania adipogennego. (D) Różnicowanie adipogenne. Perilipin (zielony), SMA (magenta), DAPI (niebieski), podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Różnicowanie FAP serca myszy kolczastej. (A) Kontrola różnicowania fibrogennego. (B) Różnicowanie fibrogenne. (C) Kontrola różnicowania adipogennego. (D) Różnicowanie adipogenne. Perilipin (zielony), SMA (magenta), DAPI (niebieski), podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obrazy w jasnym polu mięśni szkieletowych (A) i serca (B) myszy kolczastych FAP po 5 dniach hodowli, przed różnicowaniem. Podziałka = 360 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Schematyczny przewodnik do ustawiania koktajli barwienia przeciwciał dla kontroli i próbki. SC = kontrola pojedynczego koloru, FMO = fluorescencja minus jedna kontrola, + = z odpowiednim przeciwciałem, - = bez odpowiedniego przeciwciała.

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.