Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66726

⸱

21 czerwca 2024

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 3Department of Biology, Washburn University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodologię transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi za pomocą konstruktu, który jest utrzymywany przez cały okres pasowania trofozoitów in vitro, jak również poprzez torbienie i ekscystację.

Streszczenie

Wszystkie geny rybosomalne trofozoitów Naegleria są utrzymywane w zamkniętym kolistym pozachromosomalnym rybosomalnym DNA (rDNA) zawierającym element (CERE). Chociaż niewiele wiadomo na temat CERE, pełna analiza sekwencji genomu trzech gatunków Naegleria wyraźnie pokazuje, że w genomie jądrowym nie ma cystron rDNA. Co więcej, w N. gruberi CERE zmapowano pojedynczy początek replikacji DNA, co potwierdza hipotezę, że CERE replikuje się niezależnie od genomu jądrowego. Ta cecha CERE sugeruje, że możliwe jest wykorzystanie zmodyfikowanego CERE do wprowadzenia obcych białek do trofozoitów Naegleria. Pierwszym krokiem w badaniu wykorzystania CERE jako wektora w Naegleria było opracowanie protokołu transfekcji N. gruberi za pomocą molekularnego klonu N. gruberi CERE sklonowanego do pGEM7zf+ (pGRUB). Po transfekcji pGRUB był łatwo wykrywany w trofozoitach N. gruberi przez co najmniej siedem pasaży, a także przez torbienie i ekscystację. Jako kontrolę, trofozoity transfekowano wektorem szkieletowym, pGEM7zf+, bez sekwencji N. gruberi (pGEM). pGEM nie został wykryty po pierwszym pasażu po transfekcji do N. gruberi, co wskazuje na jego niezdolność do replikacji w organizmie eukariotycznym. Badania te opisują protokół transfekcji trofozoitów Naegleria i wykazują, że sekwencja plazmidu bakteryjnego w pGRUB nie hamuje udanej transfekcji i replikacji transfekowanego klonu CERE. Co więcej, ten protokół transfekcji będzie miał kluczowe znaczenie dla zrozumienia minimalnej sekwencji CERE, która napędza jego replikację w trofozoitach, a także identyfikacji regionów regulatorowych w sekwencji nierybosomalnej (NRS).

Wprowadzenie

Rodzaj Naegleria obejmuje ponad 45 gatunków, chociaż jest mało prawdopodobne, że wszyscy członkowie gatunku zostali zidentyfikowani1. Naegleria mogą występować w różnych formach: jako trofozoity (ameby), jako wiciowce lub, gdy zasoby są poważnie ograniczone, jako cysty1,2,3,4. Rodzaj Naegleria jest znany ze swojego jednego szczególnie niebezpiecznego gatunku, Naegleria fowleri, znanego jako 'ameba zjadająca mózg' (recenzja w1,2,3,4,5,6,7), które jest przyczyną prawie zawsze śmiertelnego pierwotnego amebowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.

Naegleria kodują swoje rDNA na CERE znajdującym się w jąderku. Pełne sekwencjonowanie genomów trzech gatunków Naegleria potwierdza brak rDNA w genomie jądrowym8,9,10,11. Opierając się na ograniczonych sekwencjach CERE o pełnej długości, CERE waha się od około 10 kbp do 18 kbp długości. CERE każdego gatunku Naegleria zawierają pojedynczy cystron rDNA (zawierający rybosomalne DNA 5,8, 18 i 28S) na każdej z około 4 000 CERE na komórkę12,13,14. Oprócz rDNA, każda CERE ma dużą sekwencję nie-rDNA (NRS). Rozmiary CERE różnią się w zależności od gatunku; różnice wynikają głównie z różnej długości NRS, ponieważ sekwencje rDNA są wysoce konserwatywne w całym rodzaju1,15,16,17,18,19,20. Mapowanie pojedynczego początku replikacji DNA w obrębie N. gruberi CERE NRS21 stanowi silne wsparcie dla hipotezy, że Naegleria CERE replikuje się niezależnie od genomu jądrowego.

N. gruberi to niepatogenna ameba często używana do badania biologii Naegleria. Opracowaliśmy metodologię przekształcania trofozoitów N. gruberi za pomocą klonu CERE z tego samego gatunku, aby przetestować hipotezę, że ameby Naegleria tolerują i niezależnie replikują CERE w trofozoitach. Osiągnięto to poprzez przekształcenie N. gruberi z pełnowymiarowym klonem N. gruberi CERE w trofozoity i śledzenie losów klonu dawcy CERE za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ogólny przegląd protokołu jest opisany w Rysunek 1. Przedstawione w niniejszym dokumencie dane pokazują, że klon dawcy może być wykryty przez co najmniej siedem pasaży w hodowli tkankowej, a także może być utrzymany poprzez torbienie i ekscystację. Badania te stanowią podstawę do analizy replikacji CERE, a także do zbadania jej zastosowania jako wektora transfekcji Naeglerii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące gatunków, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Sekwencja konstrukcji pGRUB 17 004 par zasad znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

1. Hodowla trofozoitów

  1. Rozmrażać zamrożone trofozoity N. gruberi w temperaturze 37 °C przez 3 min.
  2. Zaszczepić trofozoity w kolbach T25 w zmodyfikowanym peptonie/ekstrakcie drożdżowym/kwasie nukleinowym/kwasie foliowym/heminie 10% pożywką dla płodowej surowicy cielęcej (PYNFH) plus 2% buforem (fosforan disodowy, diwodorofosforan potasu).
  3. Hoduj trofozoity w temperaturze 25 °C aż do ~80% zlewania się, gdzie wykazują morfologię ameboidalną (Rysunek 2A).
    UWAGA: Podczas początkowego ożywiania kultury trofozoitów ze stanu zamrożenia, może minąć do 5-7 dni, zanim T25 stanie się zlewny. Dekantuj pożywkę co 3-4 dni i zastąp ją nową.
  4. Umieść kolby zlewające się na lodzie na 5-10 minut, aby uwolnić przylegające trofozoity z plastiku. Delikatnie zamieszać kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe przylegające komórki. Trofozoity mają teraz "zaokrągloną w górę" morfologię (Ryc. 2B).
  5. Podzielić kultury w stosunku 1:2 do 1:4 do nowych kolb do hodowli tkankowych.
  6. Usuń PYNFH i zastąp go sterylnymi środkami do torbowania (120 mM chlorek sodu, 0,03 mM chlorek magnezu, 1 mM fosforan disodowy, 1 mM diwodorofosforan potasu, 0,03 mM chlorek wapnia, 0,02 mM chlorek żelaza, pH 6,8)22 do encyst N. gruberi.
    UWAGA: Większość trofozoitów otorbia się po 72 godzinach (Rysunek 2C). Opróżnianie powinno nastąpić w ciągu 72 godzin.
  7. Usunąć torbiele z kolb, odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C i ponownie zawiesić torbiele w pożywce PYNFH z 10% płodową surowicą cielęcą w celu wygładzenia komórek. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny, aż trofozoity zaczną się pojawiać.

2. Transfekcja trofozoitów

  1. Umieścić trofozoity na 6-dołkowej płaskodennej płytce do hodowli tkankowej (1 ml 1 x 106 trofozoitów/ml) i wyhodować w temperaturze 25 °C.
  2. Transfekuj komórki, gdy osiągną 70%-80% zlewania (~10,4 x 104 komórki/cm2 w 6-dołkowych klastrach). Przed użyciem podgrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej.
  3. Przygotować mieszaninę odczynnika plazmid-transfekcja w następujący sposób: 75 ng plazmidowego DNA i 0,225 μl odczynnika do transfekcji w 200 μl pożywki PYNFH bez FBS. Przygotować wystarczającą ilość mieszaniny odczynnika do transfekcji plazmidu i transfekcji, aby wykonać transfekcję w dwóch egzemplarzach.
    UWAGA: W tym badaniu użyto plazmidu bakteryjnego zawierającego pełnowymiarowy klon N. gruberi CERE (pGRUB). Pusty plazmid (pGEM) został użyty jako kontrola negatywna (Rysunek 3).
  4. Mieszaninę odczynnika do transfekcji plazmidu inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Usuń ~800 μL pożywki z monowarstw trofozoitu tuż przed transfekcją.
  6. Umieść mieszaninę odczynnika plazmid-transfekcja na trofozoitach.
  7. Delikatnie obracaj płytkę co 15 minut, aby zapobiec agregacji nośnika na krawędziach płytki.
  8. Przemyć monowarstwy raz 2 ml pożywki wzrostowej po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 25 °C.
  9. Potraktować monowarstwy 10 M DNazą w 1 ml 10x buforu DNazy przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia resztkowego plazmidowego DNA, przemyć raz pożywką wzrostową, dodać 2 ml świeżej pożywki i umieścić w temperaturze 25 °C. Inkubować płytkę przez 24-36 godzin.
  10. Umieść płytkę na lodzie na 10 minut, aby uwolnić komórki.
  11. Podziel jedną studnię (1:2) na dwie nowe.
  12. Zbierz trofozoity z pozostałych studni do celów eksperymentalnych.
    UWAGA: Wszystkie kultury są wykonywane w dwóch egzemplarzach. Dla każdego warunku 1 studzienka jest używana do przejścia, a 1 służy do izolacji CERE.

3. Izolacja CERE od Naeglerii

  1. Oblicz liczbę trofozoitów w każdym studzience użytej do izolacji CERE za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanowym i hemocytometru23.
  2. Umieść trofozoity w probówce o pojemności 2,0 ml.
  3. Przemyt trofozoity raz na 100 mM chlorku sodu (pH 7,5) przez odwirowanie (600 x g, 10 min, 4 °C).
    UWAGA: Chlorek sodu zapobiega przywieraniu trofozoitów do boków rurki.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 100 μl 100 mM EDTA (pH 7,5).
  5. Umieścić probówkę w bloku grzewczym na 15 minut w temperaturze 98 °C w celu lizy komórek i dezaktywacji enzymów w trofozoitach.
    UWAGA: Ten krok dezaktywuje DNazy, które są obfite w trofozoity Naegleria. DNazy mogą zakłócać zdolność wykrywania natywnego CERE i klonu molekularnego w kroku 4. Wydajność DNA zmniejsza się, gdy w kroku 3.4 używa się ponad ~3 x 106 komórek.
  6. Odwirować probówki z maksymalną prędkością (16 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby osadzać resztki.
  7. Przenieść supernatanty do nowej probówki.
  8. Etanol wytrącić supernatanty z 0,5 objętości 7,5 M octanu amonu (pH 7,5), 3 objętościami bezwzględnego etanolu i 1 μl 10 mg/ml glikogenu jako nośnika.
  9. Odwróć probówkę kilka razy i umieść probówkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę lub na noc.
  10. Ogrzać próbki do temperatury pokojowej.
  11. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 16 000 x g.
  12. Usunąć supernatant i przemyć osad 70% etanolem przez odwirowanie przez 5 minut przy 16 000 x g (w temperaturze pokojowej).
  13. Usuń etanol i susz granulat na powietrzu przez 5 minut.
  14. Ponownie zawiesić wysuszone granulki w sterylnej wodzie dejonizowanej (DI). Normalizuj objętość do 10 000 trofozoitów na μl.
  15. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia w PCR.

4. Wykrywanie metodą PCR przekształconych trofozoitów

  1. Użyj 20 000 odpowiedników komórkowych DNA, starterów 600 nM (Tabela 1) i polimerazy Taq i wykonaj PCR24.
    UWAGA: Startery, które odróżniają natywne CERE od sklonowanego CERE, są wymienione w Tabeli 1, podobnie jak warunki PCR. Rysunek 3 pokazuje położenie podkładów na konstrukcjach. PCR będzie wymagał optymalizacji w zależności od użytych starterów, a także zastosowanej konkretnej mieszanki PCR.
  2. Mikrofale 0,8% agarozy w 1x bazie Tris, kwasie octowym i buforze EDTA (TAE) aż agaroza się rozpuści.
  3. Schłodzić agarozę do temperatury ~50 °C w temperaturze pokojowej.
  4. Wlej roztwór do tacki do odlewania żelu zawierającej grzebień do tworzenia studzienek.
  5. Pozostaw żel w temperaturze pokojowej do zestalenia.
  6. Umieść żel w aparacie do elektroforezy.
  7. Zdekantować 1x TAE do komory elektroforetycznej, aż żel zostanie pokryty.
  8. Wyjmij grzebień.
  9. Dodaj 6x barwnik ładujący (0,25% błękitu bromfenolowego, 0,25% cyjanolu ksylenowego, 30% glicerolu) do próbek i załaduj żel. Użyj drabinki DNA, aby określić rozmiar produktu PCR.
  10. Podłącz elektrodę, włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 80 V przez ~1,5-2 godziny.
  11. Wyłącz zasilanie i usuń żel.
  12. Wybarwić żel barwnikiem DNA (np. 10 μl 10 mg/ml bromku etydyny) w 100 ml wody demineralizowanej przez 10 minut.
  13. Odplamić żel przez 20 minut w wodzie DI.
  14. Wizualizuj żel na systemie światła ultrafioletowego (UV) i udokumentuj wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza PCR trofozoitów transfekowanych plazmidem pGRUB wykazuje, że transfekowany CERE jest wykrywalny przez co najmniej siedem pasaży trofozoitów, a także podczas enkystacji i ekskystacji (Rycina 4). Primery użyte w reakcji PCR wiążą się zarówno z wektorem pGEM, jak i z sekwencją CERE, co zapewnia, że PCR nie wykrywa natywnego CERE. Analiza PCR przeprowadzona po transfekcji trofozoitów plazmidem pGEM wykazała wynik negatywny (Rycina 4), co wskazuje, że pusty p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opisany tutaj jest bardzo prosty, chociaż każdy konstrukt będzie prawdopodobnie wymagał pewnego stopnia optymalizacji, szczególnie stosunku odczynnika do transfekcji DNA, w zależności od charakteru konstruktu i gatunku użytego Naegleria . Przetestowaliśmy tylko jeden dostępny na rynku odczynnik do transfekcji przy użyciu tego protokołu, ale jest prawdopodobne, że kilka innych może być skutecznych. Biorąc pod uwagę, że używany jest pełnowymiarowy klon CERE, zawierający funkcjonalny początek replikacji, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono żadnych finansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

Te badania były częściowo finansowane z grantu z Funduszu George'a F. Haddixa Uniwersytetu Creighton (KMD). Rysunek 1 jest generowany w biorender.com, a rysunek 3 jest generowany w benchling.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaBio Rad161-3102
Octan amonuSigma AldrichA-7330
Chlorek wapniaSigma AldrichC-4901
Kolby do hodowli
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0,5 MAffymetrix15694
Aparat żelowy do elektroferezyAmersham Biosciences80-6052-45
Probówki Eppendorfa, 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Probówki Eppendorf, 2 mlFisher Scientific05-408-138
Etanol, 100%Decon Laboratories2716
Bromek etydynySigma AldrichE-8751
Surowica bydlęcapłodu Gibco26140
Kwas foliowySigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus DrabinkaThermo ScientificSM1331
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
Blok grzewczyThermo Scientific88871001
HemacytometrHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
Chlorek żelazaSigma Aldrich372870-256
LigazaNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
MikroskopNikonTMS
em>N. gruberiATCC30224
Kwas nukleinowyChem Impex Int' l#01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
Fosforan potasuSigma AldrichP0662-500G
Zasilacz elektrofazowy PowerPac HC Odczynnikido
MCBSX0420
Fosforan sodu, dwuzasadowySigma AldrichS2554
eppendorf5415R
Tris, podstawaSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0,4%Gibco15250-061
ViaFect WagaPromegaE4981
InstrumentsAPX-60
Ekstrakt drożdżowyGibco212750
kruszonego lodu, T-75 Thermo Scientific 130190 Płytka hodowlana, 6-dołkowa Corning 3506 < chlorku sodu 1645052 Wirówka stołowa Denver powiedział:

Bibliografia

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
  3. Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
  4. Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
  5. Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).
  6. Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
  7. Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
  8. Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
  9. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
  10. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
  11. Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
  12. Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
  13. Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
  14. Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
  15. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
  16. Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).
  17. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567(2021).
  18. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).
  19. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).
  20. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
  21. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
  22. Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
  23. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  25. Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
  26. Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
  27. De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
  28. Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
  29. Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

DNA rybosomalnereplikacja CEREtransfekcja klonów molekularnychhodowla trofozoitówtransfekcja plazmidowaprotokół encystowaniaanaliza PCRelektroforeza w żelu agarozowymmiejsce początku replikacji
Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.