Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66737

⸱

3 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA świeżych i starych nekrofilskich much przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA.

Streszczenie

Łącznie pięć próbek próbek Chrysomya megacephala - trzy świeże próbki, jedna próbka przechowywana w alkoholu przez 2 lata i jedna próbka przechowywana w suchym, zamkniętym magazynie przez 2 lata chronionym tylko przed światłem - zostały wybrane do zbadania, czy zestaw do ekstrakcji DNA krwi może wyekstrahować DNA od nekrofilskich muszek i określić, czy alkohol może przedłużyć zachowanie DNA nekrofilskich muszek. Po pierwsze, zestaw do ekstrakcji DNA krwi został użyty do ekstrakcji DNA z tkanek klatki piersiowej. Następnie badano czystość i stężenie DNA za pomocą czytnika mikropłytek i fluorometru. Na koniec amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA przeprowadzono za pomocą nekropilicznych starterów specyficznych dla much, zlokalizowanych w mitochondrialnej sekwencji genu CO I. Wyniki wykazały, że czystość DNA wszystkich próbek była większa niż 2,0. Zaobserwowano, że stężenie DNA jest następującego: świeże próbki > stare próbki zakonserwowane alkoholem > niepoddane obróbce, stare próbki. Wszystkie próbki miały specyficzne prążki elektroforetyczne po amplifikacji PCR. Podsumowując, zestaw do ekstrakcji DNA krwi może być użyty do pomyślnego wyodrębnienia DNA z muszek nekrofilskich, a stężenie DNA w próbkach świeżych much jest większe niż w próbkach starych much. Muchy mogą być przechowywane w alkoholu przez długi czas.

Wprowadzenie

Ustalenie czasu zgonu od zawsze było jedną z kluczowych i trudnych kwestii do rozstrzygnięcia w praktyce sądowej. W praktyce kryminalistyki, w przypadku spraw karnych, określenie odstępu pośmiertnego odgrywa kluczową rolę w dedukowaniu czasu popełnienia przestępstwa, zabezpieczeniu podejrzanego oraz zawężeniu zakresu śledztwa. Tradycyjne metody określania czasu zgonu opierają się głównie na wczesnych zjawiskach pośmiertnych, które zazwyczaj mogą być wykorzystane do oszacowania czasu zgonu w ciągu 24 h. Jednakże w przypadku dłuższego czasu od zgonu zjawiska pośmiertne nie pozwalają na jego precyzyjne określenie. Obecnie w środowisku kryminalistycznym uznaje się, że entomologia sądowa ma potencjał, aby stać się skuteczną metodą wnioskowania o dłuższym czasie zgonu.

Owady nekrofagiczne nazwę swoją zawdzięczają larwom żerującym na zwłokach. W przypadku obecności ciała, dorosłe muchy nekrofilne są pierwszymi, które docierają do zwłok, aby złożyć jaja lub larwy. Larwy odżywiają się tkankami ciała i przekształcają w poczwarki, z których następnie wykluwają się osobniki dorosłe. Muchy nekrofilne odgrywają ogromną rolę w kryminalistyce ze względu na ich regularny cykl życiowy i rozprzestrzenienie geograficzne, co pozwala na przykład na określenie czasu i miejsca zgonu1,2. Barierą w wykorzystaniu much nekrofilnych w praktyce sądowej jest jednak identyfikacja gatunkowa. Metody morfologiczne są nadal stosowane jako uznana metoda identyfikacji gatunków much nekrofilnych. Jednak identyfikacja morfologiczna wymaga wysokiego stopnia zachowania integralności owadów. Badanie morfologiczne staje się trudniejsze, jeśli muchy znajdują się w różnych stadiach rozwojowych lub w wyniku zmian morfologicznych wywołanych czynnikami środowiskowymi. W szczególności morfologia poczwarek i łupin poczwarek, które najczęściej znajduje się na miejscu zbrodni, jest niemal nierozpoznawalna. To, w połączeniu z niedoborem ekspertów z zakresu morfologii, sprawia, że identyfikacja gatunków metodami morfologicznymi jest niezwykle trudna. Dlatego pojawiło się zastosowanie metod biologii molekularnej do identyfikacji gatunkowej much, co zmniejsza trudności związane z identyfikacją morfologiczną i jest niezależne od stadium rozwojowego3,4,5,6,7.

Pierwszym krokiem w identyfikacji gatunków much nekrofilnych metodami biologii molekularnej jest efektywna ekstrakcja DNA, podczas gdy specjalistyczne zestawy do ekstrakcji DNA owadów nie są obecnie powszechnie dostępne. W związku z tym, sposób wykorzystania powszechnych zestawów do badania krwi w celu ekstrakcji DNA z much nekrofilnych zyskuje większe znaczenie w kryminalistyce. Muchy nekrofilne znalezione na miejscach zbrodni są często zmutilowane lub uległy rozkładowi i degradacji DNA. Próbki much nie są dostępne do ekstrakcji DNA natychmiast po pozyskaniu, a jeśli jest to możliwe, kompletne próbki muszą zostać zachowane ze względu na wymogi zabezpieczenia dowodów. W oparciu o powyższe wymagania, w niniejszym badaniu zastosowaliśmy zestaw do izolacji DNA z krwi oparty na trawieniu proteinazą K i wybraliśmy trzy świeże próbki Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Rysunek 1), jedną starą próbkę C. megacephala przechowywaną w alkoholu przez dwa lata oraz jedną próbkę C. megacephala przechowywaną w warunkach chronionych przed światłem przez dwa lata; zważono każdą z pięciu próbek i wybrano tkankę klatki piersiowej owada do ekstrakcji DNA. Porównując jakość i czystość DNA wyizolowanego ze starych i nowych próbek, przeprowadzono amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA z zastosowaniem starterów specyficznych dla much nekrofilnych, zlokalizowanych w sekwencji genu mitochondrialnego CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdziału rozpuszczalnika; zestaw laboratoryjny..

Protokół

UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano łącznie pięć próbek C. megacephala – trzy próbki świeże (Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3), jedną próbkę przechowywaną w alkoholu przez 2 lata (Old 1) oraz jedną próbkę przechowywaną przez 2 lata w suchym, szczelnym pojemniku, wyłącznie z zabezpieczeniem przed światłem (Old 2). Próbki należy oznakować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.

1. Ogólne przechowywanie i przygotowanie próbek

  1. Wybór i przygotowanie próbek
    UWAGA: Podczas stosowania octanu etylu w celu uśmiercenia much nekrofagicznych należy bezwzględnie pracować w dygestorium. Przed ważeniem należy usunąć ciecz z powierzchni muchy.
    1. Próbki świeże: Po uśmierceniu much octanem etylu umieścić trzy pobrane próbki w fiolkach gazowych. Zważyć i oznaczyć próbki jako Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3, a następnie bezzwłocznie wykorzystać je w eksperymentach.
      UWAGA: Próbki świeżych much w tym protokole miały masy 56.8 mg, 49.3 mg i 52.1 mg.
    2. Próbka stara 1: Wyjąć próbki much uśmiercone octanem etylu i przechowywane w wypełnionych alkoholem probówkach wirówkowych przez 2 lata w szczelnym pojemniku, chronionych przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważyć próbkę po odsączeniu cieczy z powierzchni za pomocą papieru filtracyjnego; oznaczyć ją jako Old 1.
      UWAGA: Masa próbki Old 1 w tym protokole wynosiła 42.3 mg.
    3. Próbka stara 2: Wyjąć próbkę muchy uśmierconej octanem etylu i przechowywanej w probówce wirówkowej przez 2 lata w szczelnym pojemniku, chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważyć i oznaczyć jako Old 2.
  2. Przygotowanie przed ekstrakcją
    1. Dodać niewielką ilość ciekłego azotu w celu schłodzenia stalowego pojemnika; odczekać do całkowitego odparowania ciekłego azotu.
    2. Umieścić próbkę muchy w pojemniku; powoli wlewać ciekły azot, aby zapobiec jego rozbryzgianiu i uderzeniu w próbkę owada.
    3. Zamrozić próbki w ciekłym azocie. Wyjąć próbki po odparowaniu ciekłego azotu.
    4. Oddzielić od każdej muchy klatkę piersiową, umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL i pociąć na jak najcieńsze plastry.
      UWAGA: Próbkę należy pociąć na małe kawałki, aby umożliwić jej całkowity rozpad i uwolnienie dużych ilości DNA.
    5. Powtórzyć powyższe kroki dla każdej muchy, zamrażając je indywidualnie, a następnie przenosząc do nowej probówki wirówkowej, aby zapobiec krzyżowej kontaminacji DNA.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (15-25 °C) w mikrowirówce. Wszystkie czynności muszą być wykonywane w ścisłym przestrzeganiu zasad aseptyki, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.

  1. Liza tkanek
    1. Do probówki wirówkowej o pojemności 2 mL zawierającej pobraną próbkę dodać 180 µL buforu do lizy tkanek.
    2. Dodać 20 µL proteinazy K. Wymieszać dokładnie w wstrząsarku typu vortex przy 3 000 rpm przez 10 s i inkubować w 56 °C do całkowitej lizy tkanek owada.
      UWAGA: W przypadku niepełnego strawienia tkanki należy dodać więcej proteinazy K. Liza zazwyczaj kończy się w ciągu 1-3 h; czas lizy można również przedłużyć do całej nocy.
  2. Wytrącanie DNA
    1. Wymieszać w wstrząsarku typu vortex przy 3 000 rpm przez 15 s. Do próbki dodać 200 µL buforu do lizy i ponownie wymieszać dokładnie w wstrząsarku przy 3 000 rpm przez 15 s.
    2. Dodać 200 µL etanolu (96-100%) i ponownie wymieszać dokładnie w wstrząsarku przy 3 000 rpm przez 15 s.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, bufor do lizy oraz etanol można dodać wspólnie w jednym kroku. Po dodaniu buforu do lizy i etanolu może powstać biały osad.
  3. Przenieść mieszaninę pipetą do kolumny adsorpcyjnej DNA umieszczonej w probówce zbierającej o pojemności 2 mL. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
  4. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA z poprzedniego kroku w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu do usuwania białek i wirować przy 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
  5. Przenieść kolumnę adsorpcyjną DNA do nowej probówki zbierającej o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu odsalającego i wirować przy 20 000 × g przez 3 min w celu osuszenia membrany kolumny adsorpcyjnej DNA. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
    UWAGA: Ten etap wirowania zapewnia usunięcie resztek etanolu przed następującą elucją. W przypadku obecności pozostałości etanolu należy ponownie wirować przy 20 000 × g przez 1 min.
  6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA w czystej probówce do mikrowirowania o pojemności 2 mL, nanieść pipetą 100 µL buforu do elucji DNA bezpośrednio na membranę kolumny, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, a następnie wirować przy 6 000 × g przez 1 min w celu elucji.
    UWAGA: Elucja z użyciem 100 µL (zamiast 200 µL) zwiększa końcowe stężenie DNA w eluarcie, ale zmniejsza całkowitą wydajność DNA. Aby zmaksymalizować wydajność DNA, należy powtórzyć elucję raz, zgodnie z opisem w kroku 2.8.
  7. Próbki DNA przechowywać w 4 °C (do 1 tygodnia) lub w -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.

3. Oznaczanie stężenia DNA

  1. Wyznacz wartości OD 260 i OD 280 za pomocą czytnika mikropłytek, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych. Pomiar powtórz trzykrotnie dla każdej próbki.
  2. Wyznacz stężenie wyekstrahowanego DNA za pomocą fluorometru i dołączonego do niego zestawu, wykonując trzy powtórzenia dla każdej próbki.
    1. Do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mL odmierz po 190 µL roztworu roboczego, dodaj do nich po 10 µL Standardu #1 i Standardu #2, a następnie przechowuj je w ciemności przez nie mniej niż 15 min.
      UWAGA: Standard #1 i Standard #2 są precyzyjnie skalibrowane na określone stężenie DNA. Roztwory standardowe powinny zostać dokładnie przygotowane, aby zapewnić utworzenie dokładnej krzywej wzorcowej. Standard #1 to próbka dwuniciowego DNA (dsDNA) o stężeniu 0,2 ng/µL; Standard #2 ma stężenie 2 000 ng/µL. Roztwór roboczy to barwnik, który wiąże się specyficznie z dsDNA.
    2. Odmierz 2 µL badanego DNA i wymieszaj z 198 µL roztworu roboczego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 mL, a następnie przechowuj w ciemności przez nie mniej niż 15 min.
      UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest niskie, dodaj 5 µL badanego DNA do 195 µL roztworu roboczego.
    3. Po 15 min włącz urządzenie i wybierz opcję dsDNA Concentration Measurement | Long Range. W celu uzyskania krzywej wzorcowej zmierz najpierw Standard #1, a następnie Standard #2.
      UWAGA: Roztwór standardowy należy wykorzystać w tym samym dniu, w którym został przygotowany; zbyt długie przechowywanie spowoduje wystąpienie dużego błędu w krzywej wzorcowej.
    4. Umieszczaj próbki do analizy w dołkach pomiarowych jedna po drugiej, ustaw objętość dodawanego DNA na 2 µL, powtórz pomiar trzykrotnie, oblicz wartość średnią i zapisz wynik.

4. PCR i detekcja elektroforetyczna

UWAGA: Sekwencja genu mitochondrialnego CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdziału rozpuszczalnika; ustawienie laboratoryjne. o długości 278 bp została poddana amplifikacji PCR z wykorzystaniem prawego primera C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG oraz lewego primera C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, a następnie przeprowadzono elektroforezę w 2% żelu agarozowym w celu weryfikacji efektu amplifikacji oraz sprawdzenia długości produktów amplifikacji.

  1. Przygotować 20 µL układu do amplifikacji PCR, dodając 10 µL 2x Taq mix, 1 µL każdego z primerów, 5 µL ddH2O oraz 3 µL matrycy DNA; wymieszać przez 10 s w wirówce.
  2. Zastosować następujące parametry cyklu PCR: predenaturacja 95 °C przez 10 min; denaturacja 95 °C przez 30 s, przyłączanie 48 °C przez 30 s, elongacja 72 °C przez 45 s przez łącznie 40 cykli; oraz końcowa elongacja 72 °C przez 10 min.
  3. Produkty po reakcji PCR poddać elektroforezie w 2% żelu agarozowym, a po zakończeniu elektroforezy umieścić je w systemie do obrazowania żeli w celu analizy fotograficznej.

Wyniki

Do pomiaru wartości OD260 i OD280 roztworu wyekstrahowanego DNA wykorzystaliśmy czytnik mikropłytek, a następnie wyznaczyliśmy stosunki OD260/OD280 w celu oceny czystości DNA. Wartość OD260/OD280 dla wszystkich świeżych próbek oraz starej próbki 1 była większa niż 2. Wartość OD260/OD280 dla starej próbki 2 osiągnęła maksimum 2,187, mimo że średnia wynosiła 1,753, a trzy pomiary wykazywały duże wahania ze względu na niskie (≤0,01) wartości zarówno OD260, jak i OD280 (Tabela 1). Na podstawie uzyskanej wartości OD260 oszacowano stężenie DNA. Stężenia DNA w trzech grupach układały się w następującej kolejności: próbki świeże > stara próbka 1 > stara próbka 2 (pomiar czytnikiem mikropłytek), przy czym różnica między próbkami świeżymi a starymi była niewielka i wynosiła jedynie ~10-20 ng/µL (Tabela 1). Z kolei stężenie DNA w trzech świeżych próbkach zmierzone fluorometrem Qubit było wyższe o 125-130 ng/µL niż stężenie zmierzone czytnikiem mikropłytek, natomiast różnica ta wynosiła 15 ng/µL dla starej próbki 1 i tylko 1,3 ng/µL dla starej próbki 2. Stężenie DNA wykazało zależność: próbki świeże > stara próbka 1 > stara próbka 2 (Tabela 2).

DNA wyekstrahowane przy użyciu obecnie stosowanej metody ekstrakcji zawiera wszystkie komponenty DNA z różnych źródeł znajdujących się w próbce. Oznacza to, że roztwór DNA nie był wyłącznie roztworem genomowego DNA muchy. Primery do specyficznej amplifikacji fragmentów genu mitochondrialnego CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdzielania rozpuszczalników; zestaw laboratoryjny. zostały wybrane na podstawie literatury i zweryfikowane za pomocą NCBI-Blast Primer. Wyniki wykazały, że primer forward C1-J-2495 oraz primer reverse C1-N-2800 genu mitochondrialnego CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdzielania rozpuszczalników; zestaw laboratoryjny. były primerami specyficznymi dla much z polimorfizmem sekwencji i obejmowały wiele gatunków much. Wyniki amplifikacji nie wykazały obecności genów ludzkich. Stanowiły one parę wiarygodnych biomarkerów DNA do identyfikacji much nekrofilnych i zostały wybrane do weryfikacji wyników niniejszego eksperymentu.

Wszystkie badane próbki wykazały wyraźne prążki elektroforetyczne o długości od 250 bp do 400 bp. Prążki były jaśniejsze w próbkach świeżych niż w starych, a stare próbki z dodatkiem alkoholu (Ryc. 2, Old1) były jaśniejsze niż niepoddane obróbce stare próbki (Ryc. 2, Old2), przy czym w starych próbkach pojawiły się również dwa prążki w innych pozycjach. W kontroli ujemnej nie stwierdzono obecności prążków (Ryc. 2).

Schemat porównawczy anatomii Drosophila; widoki głowy i tułowia pod mikroskopem; badanie morfologiczne.
Rycina 1: Zdjęcia Chrysomya megacephala pod różnymi kątami. (A) samiec; (B) samica. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Żel elektroforetyczny pokazujący prążki DNA; drabinka 250-400 bp; porównanie próbek; analiza molekularna.
Rysunek 2: Elektroforegram produktów amplifikacji PCR. Pierwsze trzy prążki od lewej to produkty amplifikacji PCR DNA z próbek świeżych much. Czwarty prążek elektroforetyczny to produkt PCR DNA ze starej próbki muchy konserwowanej w alkoholu. Piąty prążek to produkt PCR DNA ze starej próbki muchy bez specjalnej konserwacji. Szósty prążek to kontrola ujemna; jest on czysty, co dowodzi, że podczas amplifikacji PCR nie doszło do kontaminacji. Po prawej stronie znajduje się drabinka DNA, w której oznaczyliśmy pozycje DNA o długościach 250 bp i 400 bp. Prążki elektroforetyczne produktów PCR wszystkich próbek znajdowały się nieco powyżej prążka 250 bp i poniżej prążka 400 bp drabinki. Pozycja ta odpowiada długości docelowego genu o wielkości 278 bp. Gołym okiem widać, że prążki DNA reprezentujące świeże próbki są jaśniejsze niż prążki starych próbek. Próbki stare zawierają inne prążki DNA, które są obecne w postaci mniej intensywnych genów niedocelowych o różnych długościach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PróbkaFresh1Fresh2Fresh3Old1Old2
OD260/OD2802.354±0.0362.245±0.0272.060±0.0382.143±0.0121.753±0.421
DNA (ng/µL)119.91±1.686116.084±4.96595.239±3.40186.845±6.1410.151±0.168

Tabela 1: Pomiar czystości i stężenia DNA za pomocą czytnika mikropłytek.

PróbkaŚwieży1Świeże2Świeży3Stary1Stary2
DNA(ng/µL)243.333±1.528237.667±2.082226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

Tabela 2: Pomiar stężenia DNA za pomocą fluorometru.

Dyskusja

Ekstrakcja DNA jest najbardziej krytycznym etapem w molekularnej identyfikacji much nekrofilnych, a zastosowana metoda ekstrakcji oraz jakość wyizolowanego DNA bezpośrednio wpływają na późniejszą detekcję. W niniejszym doświadczeniu pomyślnie wyizolowano DNA z much nekrofilnych przy użyciu powszechnie dostępnego zestawu do izolacji DNA z krwi, bez konieczności zakupu specjalistycznego zestawu do ekstrakcji DNA z owadów, co ułatwia przeprowadzenie procesu izolacji DNA z owadów.

Powierzchnia much jest bogata w chitynę, szczególnie w stadiach larwalnym i poczwarki, gdzie chityna epidermalna może osiągać 60-70%, co utrudnia ekstrakcję DNA z much nekrofilnych9. Podczas procesu ekstrakcji zauważyliśmy, że jeśli próbka była wilgotna, to mimo odpowiedniego rozdrobnienia, po zastosowaniu proteinazy K w celu trawienia próbka pozostawała żelowata. Uniemożliwiało to powrotny przepływ dodanego płynu przez kolumnę adsorpcyjną. Aby rozwiązać ten problem, najpierw zastosowaliśmy ciekły azot do szybkiego zamrożenia próbek, aby uczynić muchy kruchymi i łatwymi do zmielenia, a także do pełnego strawienia. Jeśli ciekły azot nie jest dostępny do mielenia, a wydajność ekstrakcji DNA wciąż wymaga poprawy, próbki much można umieścić w wentylowanym obszarze na około 48 h. Próbki można pozostawić do wyschnięcia przed ich odpowiednim rozdrobnieniem i późniejszą ekstrakcją DNA.

Biorąc pod uwagę, że degradacja DNA w starych próbkach stanowiła większy problem, w tym eksperymencie do ekstrakcji DNA wybrano próbki klatki piersiowej muchy ze względu na wysoką zawartość DNA w tym obszarze. Jednakże wykorzystanie klatki piersiowej zbyt mocno narusza integralność morfologiczną muchy, co uniemożliwia pełne zachowanie późniejszych dowodów oraz utrudnia identyfikację morfologiczną. Próbki są trudne do wyekstrahowania w przypadku gnicia klatki piersiowej. Jeśli próbki są świeże, preferowana może być ekstrakcja DNA z odnóża lub skrzydła. Odnóża i skrzydła są rozmieszczone symetrycznie i obustronnie, dzięki czemu po ekstrakcji tkanki z jednej strony można zachować pełniejsze cechy morfologiczne. Jednakże stężenie DNA wyekstrahowanego ze skrzydła i odnóża jest stosunkowo niskie, co wiąże się z ryzykiem w przypadku dalszych badań. Dodatkowo próbki były małe i łatwo było je zgubić10.

Podczas stosowania zestawu do ekstrakcji DNA w celu wyodrębnienia DNA, wartości OD260/OD280 zmierzone za pomocą czytnika mikropłytek były większe niż 2, z wyjątkiem próbki Old sample 2. Po pierwsze, można stwierdzić, że białko zostało usunięte dokładniej, jednak w starych próbkach może występować kontaminacja RNA, pęknięcia dwuniciowego DNA spowodowane wielokrotnym wirowaniem lub degradacja DNA11. Po drugie, może to również wskazywać, że alkohol przedłuża trwałość RNA.

Stężenie DNA oblicza się na podstawie wartości OD260 z czytnika mikropłytek, natomiast fluorometr Qubit służy najpierw do sporządzenia krzywej wzorcowej, a następnie do pomiaru wartości absorbancji w celu obliczenia stężenia DNA. Obie metody umożliwiają pomiar śladowych stężeń DNA, jednak każda z nich ma swoje zalety i wady: czytnik mikropłytek wykorzystuje OD260 do obliczenia stężenia DNA, ale zastosowana metoda obliczeń jest jedynie szacunkowa. Jeśli próbka jest zanieczyszczona dużą ilością nukleotydów, białek lub innych substancji absorbujących światło ultrafioletowe, błąd fotometryczny będzie większy, dlatego należy dążyć do ich wcześniejszego usunięcia.

Czytniki mikropłytek oraz spektrofotometry UV wykorzystują absorbancję w UV do detekcji, która nie pozwala na rozróżnienie między DNA, RNA, zdegradowanymi kwasami nukleinowymi, wolnymi nukleotydami a innymi zanieczyszczeniami; absorbancja jest również w znacznym stopniu wpływana przez obecność innych substancji, co sprawia, że odczyty są stosunkowo niewiarygodne. Podczas dozowania próbek, które zazwyczaj mierzy się w kroplach, są one nakładane bezpośrednio bez rozcieńczania lub przetwarzania, co umożliwia jednoczesny pomiar wielu próbek i bezpośrednie obliczenie czystości DNA na podstawie pomiarów OD260/OD280. Z kolei fluorometr Qubit został zaprojektowany do pomiaru wyłącznie stężenia dwuniciowego DNA poprzez zastosowanie dwóch roztworów standardowych o znanym stężeniu w celu wyznaczenia krzywej wzorcowej oraz wykorzystanie właściwości barwników fluorescencyjnych wiążących się specyficznie z dwuniciowym DNA. Jednakże każda próbka wymaga indywidualnego przygotowania, a następnie osobnego pomiaru, co jest uciążliwe w przypadku analizy serii próbek, ponadto nie można w ten sposób zmierzyć czystości wyekstrahowanego DNA. W konkretnych zastosowaniach można wybrać jedną z tych dwóch metod w zależności od własnych potrzeb w zakresie kontroli jakości DNA12,13,14.

Stężenie DNA w świeżych próbkach było wyższe niż w starych próbkach przechowywanych w alkoholu oraz wyższe niż w niepoddanych konserwacji starych próbkach, niezależnie od tego, czy stężenie DNA mierzono za pomocą czytnika mikropłytek, czy fluorometru Qubit. W celu długoterminowego przechowywania próbki można zanurzyć w alkoholu, aby zapobiec wzrostowi bakterii i grzybów15,16.

Różne metody pomiarowe miały mniejszy wpływ na pomiary DNA w starych próbkach niepoddanych żadnej obróbce, prawdopodobnie dlatego, że stare próbki były bardziej zdegradowane, przy czym białka i RNA mogły ulegać degradacji szybciej niż DNA. Z kolei świeże próbki zawierały więcej białek i RNA, co w konsekwencji miało większy wpływ na wyniki. Jeśli porównywane są wyłącznie stężenia dwuniciowego DNA, należy korzystać z wyników fluorometru Qubit; wyniki naszych eksperymentów wykazały również istotny gradient stężenia DNA w próbkach starych i nowych.

Zawartość DNA zarówno w świeżych, jak i starych próbkach po ekstrakcji może być wykorzystana do późniejszych analiz biologii molekularnej. W tym eksperymencie starannie dobrane primery do mitochondrialnego genu CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdzielania rozpuszczalnika; zestaw laboratoryjny. miały długość zaledwie 278 bp i wszystkie zostały pomyślnie amplifikowane. Mitochondrialny gen CO Technika chromatograficzna; schemat eksperymentu cienkowarstwowego; proces rozdzielania rozpuszczalnika; zestaw laboratoryjny. jest z kolei locus uznawanym u much za posiadający potencjał do kodowania kreskowego DNA (DNA barcoding), co umożliwia identyfikację gatunków much nekrofilnych za pomocą późniejszej analizy sekwencjonowania17. Analizy biologii molekularnej dłużej przechowywanych próbek można pomyślnie przeprowadzić poprzez wybór primerów do innych, krótszych sekwencji DNA. Warto zauważyć, że w próbkach starych prążki elektroforetyczne występowały w dwóch różnych pozycjach i miały krótsze sekwencje, co prawdopodobnie wynikało z niespecyficznej amplifikacji primerów spowodowanej degradacją DNA w połączeniu z niską temperaturą przyłączania (annealing temperature).

Jednak w tym eksperymencie zachowano mniej próbek przez dłuższy czas, aby zaspokoić potrzebę powtarzania doświadczeń, podczas gdy wyniki wymagały jedynie próbek reprezentatywnych. W związku z tym nie przeprowadzono testu powtarzalności, który mógłby mieć charakter eksploracyjny w odniesieniu do konserwacji starych i nowych próbek, co jednak nie wpływa na pomyślną ekstrakcję z próbek much nekrofilnych.

Podsumowując, zastosowanie zestawu do ekstrakcji DNA z krwi może być pomocne również przy izolacji DNA much nekrofagicznych. Pomyślnie można wyekstrahować DNA zarówno z próbek starych, jak i nowych, a cały uzyskany materiał genetyczny może zostać wykorzystany do dalszych analiz. Alkohol jest również korzystny dla długoterminowej konserwacji próbek DNA much.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82060341,81560304) oraz przez Projekt Naukowo-Badawczy Platformy Innowacji Akademickich Prowincji Hainan (YSPTZX202134).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor AEQiagen172026832Bufor elucyjny DNA
Bufor ALQiagen172028374do lizy
Bufor ATLQiagen172028162bufor do lizy tkanek
Bufor AW1Qiagen172028760usuwania białek
Bufor AW2Qiagen57203108odsalania
C1-J-2495Podkład do przedmówekTaihe BiotechnologyTW21109216
C1-N-2800Podkład odwróconyTaihe Biotechnology
TW21109217 Drabinka DNA D2000Czas rzeczywisty (Pekin) BiotechnologiaRTM415Zmierz położenie pasm elektroforetycznych
DNeasy Mini kolumna wirowaQiagen166050343kolumna adsorpcyjna DNA
Inkubator do suchej kąpieliMiulabDKT200-2Dużywany do podgrzewania
MIX-30S Mini mikserMiulabMUC881206działanie oscylacyjne
Proteinaza KQiagen172026218Inaktywacja wewnątrzkomórkowych nukleaz i innych białek
Fluorometr Qubit 3.0Thermo Fisher Scientific2321611188
Szybka mikrowirówkaScilogex9013001121Wirówka
Standard#1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard#2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455Obrazowanie żelem
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Ado PCR
Thermo Fisher Scientific2342797
bufor do zwykłym roztworem roboczym

Bibliografia

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
  3. Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
  4. Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
  5. Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
  6. Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
  7. Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
  8. Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
  9. Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
  10. Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
  11. Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
  12. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
  13. Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
  14. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
  15. Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
  16. Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
  17. Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66737

Tagi

Muchy nekrofagiczneChrysomya megacephalazestaw do izolacji DNA z krwiczystość DNAstężenie DNAkonserwacja w alkoholuamplifikacja PCRelektroforeza w żeluczytnik mikropłytek
Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.