Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66737

⸱

3 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA świeżych i starych nekrofilskich much przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA.

Streszczenie

Łącznie pięć próbek próbek Chrysomya megacephala - trzy świeże próbki, jedna próbka przechowywana w alkoholu przez 2 lata i jedna próbka przechowywana w suchym, zamkniętym magazynie przez 2 lata chronionym tylko przed światłem - zostały wybrane do zbadania, czy zestaw do ekstrakcji DNA krwi może wyekstrahować DNA od nekrofilskich muszek i określić, czy alkohol może przedłużyć zachowanie DNA nekrofilskich muszek. Po pierwsze, zestaw do ekstrakcji DNA krwi został użyty do ekstrakcji DNA z tkanek klatki piersiowej. Następnie badano czystość i stężenie DNA za pomocą czytnika mikropłytek i fluorometru. Na koniec amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA przeprowadzono za pomocą nekropilicznych starterów specyficznych dla much, zlokalizowanych w mitochondrialnej sekwencji genu CO I. Wyniki wykazały, że czystość DNA wszystkich próbek była większa niż 2,0. Zaobserwowano, że stężenie DNA jest następującego: świeże próbki > stare próbki zakonserwowane alkoholem > niepoddane obróbce, stare próbki. Wszystkie próbki miały specyficzne prążki elektroforetyczne po amplifikacji PCR. Podsumowując, zestaw do ekstrakcji DNA krwi może być użyty do pomyślnego wyodrębnienia DNA z muszek nekrofilskich, a stężenie DNA w próbkach świeżych much jest większe niż w próbkach starych much. Muchy mogą być przechowywane w alkoholu przez długi czas.

Wprowadzenie

Wnioskowanie o czasie śmierci zawsze było jednym z kluczowych i trudnych zagadnień do rozwiązania w praktyce sądowej. W praktyce kryminalistyki w przypadku sprawy karnej określenie odstępu między sekcjami zwłok odgrywa kluczową rolę w ustaleniu czasu popełnienia przestępstwa, ustaleniu podejrzanego i zawężeniu zakresu dochodzenia. Tradycyjne metody wnioskowania o czasie zgonu opierają się przede wszystkim na wczesnych zjawiskach pośmiertnych, które na ogół można wykorzystać tylko do określenia czasu zgonu w ciągu 24 godzin. Długi czas śmierci nie może być jednak określony przez zjawiska pośmiertne. Obecnie w środowisku nauk sądowych powszechnie uznaje się, że entomologia sądowa ma potencjał, aby stać się skuteczną metodą wnioskowania o dłuższym czasie śmierci.

Nazwy owadów nekrofagicznych pochodzą od ich larw, które żywią się zwłokami. Wśród nich, ilekroć obecne są zwłoki, dorosłe muchy nekrofilne będą pierwszymi, które dotrą do zwłok i złożą jaja lub larwy. Larwy żywią się tkanką zwłok i dojrzewają do poczwarek, które rozwijają się w dorosłe osobniki. Muchy nekrofilskie odgrywają ogromną rolę w praktyce kryminalistyki ze względu na ich regularny cykl życiowy i rozmieszczenie geograficzne, na przykład odejmowanie czasu zgonu i określanie miejsca śmierci1,2. Jednak barierą dla wykorzystania much nekrofilnych w praktyce kryminalistycznej jest identyfikacja gatunków. Metody morfologiczne są nadal stosowane jako autorytatywna metoda identyfikacji gatunkowej muszek nekrofilnych. Morfologiczna identyfikacja gatunków wymaga jednak wysokiego stopnia integralności owadów. Jeśli muchy znajdowały się w różnych stadiach rozwojowych lub z powodu zmian morfologicznych spowodowanych wyborami środowiskowymi, wszystko to utrudniało badanie morfologiczne. W szczególności morfologia poczwarek i muszli poczwarek, które najczęściej znajdują się na miejscu zbrodni, jest ledwo rozpoznawalna. To, w połączeniu z niedoborem ekspertów morfologicznych, sprawia, że identyfikacja morfologiczna gatunków jest ogromna. W związku z tym pojawiło się zastosowanie metod biologii molekularnej do identyfikacji gatunkowej much, co zmniejsza trudność identyfikacji morfologicznej i jest niezależne od etapu rozwojowego3,4,5,6,7.

Pierwszym krokiem w identyfikacji gatunków muszek nekrofilnych w oparciu o metody biologii molekularnej jest efektywna ekstrakcja DNA, podczas gdy specjalistyczne zestawy do ekstrakcji DNA owadów nie są obecnie powszechnie dostępne. A to, jak używać zwykłych zestawów krwi do ekstrakcji DNA muszek nekrofilskich, staje się bardziej istotne z punktu widzenia medycyny sądowej. Nekrofilskie muchy znajdowane na miejscach zbrodni są często okaleczone lub uległy rozkładowi i degradacji DNA. Próbki much nie są natychmiast dostępne do ekstrakcji DNA po ich pozyskaniu lub, jeśli to możliwe, należy zachować kompletne próbki ze względu na wymogi dotyczące zachowania dowodów. Opierając się na powyższych wymaganiach, w tym badaniu zastosowaliśmy zestaw DNA krwi oparty na trawieniu proteinazy K i wybraliśmy trzy świeże próbki Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Rysunek 1), jedną starą próbkę C. megacephala umieszczoną w alkoholu na dwa lata i jedną próbkę C. megacephala umieszczoną w chronionym przed światłem magazynie na dwa lata, zważyliśmy każdą z pięciu próbek, wybrał tkankę klatki piersiowej owada do ekstrakcji DNA. Porównując jakość i czystość DNA wyekstrahowanego ze starych i nowych próbek, amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA przeprowadzono za pomocą nekrofilskich starterów specyficznych dla muchy zlokalizowanych w mitochondrialnym CO figure-introduction-1 sekwencji genów.

Protokół

UWAGA: W sumie w tym protokole użyto pięciu próbek próbek C. megacephala - trzy świeże próbki (Świeże 1, Świeże 2 i Świeże 3), jedna próbka przechowywana w alkoholu przez 2 lata (Stara 1) i jedna próbka przechowywana w suchym, zamkniętym magazynie przez 2 lata, chronionym tylko przed światłem (Stary 2). Próbki muszą być oznakowane zgodnie z wymogami doświadczalnymi.

1. Ogólne przechowywanie i przygotowanie próbek

  1. Wybór i przygotowanie próbki
    UWAGA: Pamiętaj, aby pracować pod wyciągiem podczas stosowania octanu etylu do zabijania much nekrofagicznych. Usuń płyn z powierzchni muchy przed ważeniem.
    1. Świeże próbki: Umieścić trzy pobrane próbki much w fiolkach z gazem po uśmierceniu ich octanem etylu. Zważ i nazwij próbki jako Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3 i natychmiast użyj ich w eksperymentach.
      UWAGA: Próbki świeżych much w tym protokole miały masę 56,8 mg, 49,3 mg i 52,1 mg.
    2. Stara próbka 1: Pobrać próbki much zabite octanem etylu i przechowywać w probówkach wirówkowych wypełnionych alkoholem przez 2 lata w hermetycznej obudowie, chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważyć próbkę po zaadsorbowaniu cieczy powierzchniowej za pomocą bibuły filtracyjnej; nazwij go Starym 1.
      UWAGA: Masa Old 1 wynosiła 42,3 mg w tym protokole.
    3. Stara próbka 2: Wyjąć próbkę muchy zabitą octanem etylu i przechowywać w probówce wirówkowej przez 2 lata w hermetycznym zamknięciu, chronionym przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważ i nazwij go Starym 2.
  2. Przygotowanie przed ekstrakcją
    1. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu, aby schłodzić pojemnik ze stali nierdzewnej; poczekaj, aż cały ciekły azot wyparuje.
    2. Umieścić próbkę muchy w pojemniku; wlewać ciekły azot powoli, aby ciekły azot nie rozprysnął się i nie uderzył w próbkę owadów.
    3. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie. Próbki należy usunąć po odparowaniu ciekłego azotu.
    4. Oddziel klatkę piersiową pojedynczo, umieść w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i pokrój na najmniejsze możliwe plasterki.
      UWAGA: Pokrój próbkę na małe kawałki, aby można ją było całkowicie rozszczepić, a DNA mogło zostać uwolnione w dużych ilościach.
    5. Powtórz powyższe kroki dla każdej muchy, indywidualnie zamroź, a następnie wyjmij do nowej probówki wirówkowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu DNA.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Wszystkie etapy wirowania muszą być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (15-25 °C) w mikrowirówce. Wszystkie kroki muszą być wykonywane w ścisłym przestrzeganiu zasad aseptyki i w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.

  1. Liza tkanek
    1. Dodać 180 μl buforu do lizy tkanek do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej ściętą próbkę.
    2. Dodać 20 μl proteinazy K. Dokładnie wymieszać, wirując z prędkością 3 000 obr./min przez 10 s i inkubować w temperaturze 56 °C, aż do całkowitej lizy tkanek owadów.
      UWAGA: Dodaj więcej proteinazy K, jeśli tkanka nie jest w pełni strawiona. Liza jest zwykle zakończona w ciągu 1-3 godzin, może również wydłużyć czas lizy przez noc.
  2. Wytrącanie DNA
    1. Wirować z prędkością 3 000 obr./min przez 15 s. Dodać 200 μl buforu do lizy do próbki i dokładnie wymieszać przez wirowanie z prędkością 3 000 obr./min przez 15 s.
    2. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) i ponownie dokładnie wymieszać, wirując z prędkością 3 000 obr./min przez 15 s.
      UWAGA: Bufor do lizy i etanol można wstępnie dodać razem w jednym kroku, aby zaoszczędzić czas. Po dodaniu buforu do lizy i etanolu może powstać biały osad.
  3. Odpipetować mieszaninę do kolumny adsorpcyjnej DNA umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min. Wyrzuć probówkę przepływową i zbiorczą.
  4. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA z poprzedniego etapu w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, dodać 500 μl buforu do usuwania białka i odwirować przy 6 000 × g przez 1 minutę. Wyrzuć probówkę przepływową i zbiorczą.
  5. Przenieś kolumnę adsorpcyjną DNA do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml, dodaj 500 μl buforu odsalającego i odwiruj przy 20 000 × g przez 3 minuty w celu wysuszenia membrany kolumny adsorpcyjnej DNA. Wyrzuć probówkę przepływową i zbiorczą.
    UWAGA: Ten etap wirowania zapewnia usunięcie wszelkich pozostałości etanolu przed następną elucją. W przypadku przeniesienia etanolu należy ponownie odwirować przy 20 000 × g przez 1 minutę.
  6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml, bezpośrednio odpipetować 100 μl buforu elucyjnego DNA na membranę kolumny, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, a następnie odwirować przy 6 000 × g przez 1 minutę do elucji.
    UWAGA: Elucja za pomocą 100 μL (zamiast 200 μL) zwiększa końcowe stężenie DNA w eluacie, ale także zmniejsza ogólną wydajność DNA. Aby zmaksymalizować wydajność DNA, powtórz elucję jeden raz, jak opisano w kroku 2.8.
  7. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 tygodnia) lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

3. Wykrywanie stężenia DNA

  1. Określ wartości OD 260 i OD 280, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych za pomocą czytnika mikropłytek. Powtórzyć te czynności trzy razy dla każdej próbki.
  2. Określić stężenie wyekstrahowanego DNA za pomocą fluorometru, korzystając z zestawu towarzyszącego, z trzema powtórzeniami dla każdej próbki.
    1. Weź 190 μl roztworu roboczego do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml, weź po 10 μl Wzorca #1 i Wzorca #2, dodaj je do roztworów roboczych i trzymaj z dala od światła przez nie mniej niż 15 minut.
      UWAGA: Standard #1 i Standard #2 są dokładnie skalibrowane dla określonego stężenia DNA. Roztwory wzorcowe powinny być dokładnie skonfigurowane, aby zapewnić utworzenie dokładnej krzywej wzorcowej. Standard #1 to próbka dwuniciowego DNA (dsDNA) o stężeniu 0,2 ng/μl; norma #2 wynosi 2,000 ng/μL. Roztworem roboczym jest barwnik, który wiąże się specyficznie z dsDNA.
    2. Weź 2 μl testowego DNA i wymieszaj je ze 198 μl roztworu roboczego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml i trzymaj z dala od światła przez nie mniej niż 15 minut.
      UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest niskie, dodać 5 μl badanego DNA ze 195 μl roztworu roboczego.
    3. Po 15 minutach włącz instrument i wybierz dsDNA Pomiar stężenia | Duży zasięg. Najpierw przetestuj Normę #1, a następnie Normę #2, aby uzyskać krzywą standardową.
      UWAGA: Roztwór wzorcowy musi być użyty tego samego dnia po jego skonfigurowaniu; Pozostawienie go na zbyt długo spowoduje duży błąd w krzywej standardowej.
    4. Próbki do badania należy umieścić w studzienkach testowych jedna po drugiej, dostosować objętość impulsu DNA do 2 μl, powtórzyć pomiar trzy razy, przyjąć wartość średnią i zarejestrować.

4. PCR i detekcja elektroforetyczna

UWAGA: Mitochondrialny CO figure-protocol-1 sekwencję genu o długości 278 pz pobrano do amplifikacji PCR za pomocą startera C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, a startera odwrotnego C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, a następnie przeprowadzono elektroforezę w żelu agarozowym 2% w celu sprawdzenia efektu amplifikacji i długości produktów amplifikacji.

  1. Ustawić 20 μl systemu amplifikacji PCR, dodając 10 μl 2x mieszanki Taq, 1 μl każdego startera, 5 μl ddH2O i 3 μl matrycy DNA; dobrze mieszać przez 10 s w wirówce.
  2. Stosować następujące parametry cykliczne PCR: denaturacja 95 °C przez 10 minut, denaturacja 95 °C przez 30 s, wyżarzanie 48 °C przez 30 s, przedłużenie 72 °C przez 45 s, łącznie 40 cykli; i końcowe przedłużenie 72 °C przez 10 min.
  3. Produkty po PCR należy poddać elektroforezie w żelu agarozowym 2%, a po elektroforezie umieścić je w systemie obrazowania w żelu w celu analizy zdjęć.

Wyniki

Użyliśmy czytnika mikropłytek do zmierzenia wartości OD260 i OD280 w ekstrahowanym roztworze DNA, a następnie uzyskaliśmy wartości OD260/OD280, aby ocenić czystość DNA. Wartość OD260/OD280 we wszystkich świeżych próbkach i starej próbce 1 była większa niż 2. OD260/OD280 starej próbki 2 miał maksymalną wartość 2,187, chociaż średnia wynosiła 1,753, a jego trzy pomiary ulegały znacznym wahaniom ze względu na małe (≤0,01) wartości zarówno OD280, jak i OD280 (tabela 1). Na podstawie uzyskanej wartości OD260 oszacowaliśmy stężenie DNA. Stężenie DNA w tych trzech próbkach było następujące: świeże próbki > starej próbce 1 > starej próbce 2, mierzone za pomocą czytnika mikropłytek, ale różnica między świeżymi próbkami a starymi próbkami była niewielka, tylko ~10-20 ng/μL (Tabela 1), podczas gdy stężenie DNA w trzech świeżych próbkach mierzone za pomocą fluorometru Qubit było większe niż zmierzone przez czytnik mikropłytek o 125-130 ng/μL, z różnicą 15 ng/μl w starej próbce 1 i tylko 1,3 ng/μl w starej próbce 2. Stężenie DNA w świeżych próbkach > starej próbce 1 > starej próbce 2 (tabela 2).

DNA wyekstrahowane obecnie stosowaną metodą ekstrakcji zawiera wszystkie składniki DNA z różnych źródeł w próbce. Oznacza to, że roztwór DNA był nie tylko roztworem genomowego DNA much. Startery do specyficznej amplifikacji mitochondrialnego CO muchy figure-results-1 fragmenty genu zostały wybrane na podstawie literatury i zweryfikowane przez NCBI-Blast Primer. Wyniki pokazały, że starter do przodu C1-J-2495 i starter odwrotny C1-N-2800 mitochondrialnego CO figure-results-2 gen były starterami specyficznymi dla muchy z polimorfizmem sekwencji i obejmowały wiele gatunków much. Wyniki amplifikacji nie wykazały obecności ludzkich genów. Była to para wiarygodnych biomarkerów DNA do identyfikacji muchówek nekrofilnych i została wybrana do weryfikacji wyników tego eksperymentu.

Wszystkie próbki wykazywały oczywiste pasma elektroforetyczne o długościach od 250 pz do 400 pz. Pasma były jaśniejsze w świeżych próbkach niż w starych próbkach, a stare próbki umieszczone w alkoholu (Rysunek 2, Stary1) były jaśniejsze niż niepoddane obróbce stare próbki (Rysunek 2, Stary2), ale stare próbki miały również dwa pasma w różnych pozycjach. Ślepa kontrolka nie miała pasm (Rysunek 2).

figure-results-3
Rysunek 1: Obrazy Chrysomya megacephala z różnych kątów. (a) Mężczyzna; (B) kobieta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 2: Elektroferogram produktów do amplifikacji PCR. Pierwsze trzy prążki od lewej to produkty amplifikacji PCR DNA ze świeżych próbek much. Czwarte pasmo elektroforetyczne jest produktem PCR DNA ze starej próbki muchy zakonserwowanej w alkoholu. Piąte prążki to produkt PCR DNA ze starej próbki muchy bez specjalnej konserwacji. Szóste pasmo to pusta kontrolka; jest czysty, co dowodzi, że podczas amplifikacji PCR nie doszło do zanieczyszczenia. Po prawej stronie znajduje się drabina DNA, na której oznaczyliśmy pozycje DNA o długości 250 pz i 400 pz. Pasma elektroforetyczne wszystkich próbek produktów PCR wynosiły nieco powyżej 250 pz i poniżej 400 pz pasm drabinkowych. Ta pozycja odpowiada długości genu docelowego 278 pz. Gołym okiem bardziej oczywiste jest, że prążki DNA reprezentujące świeże próbki są jaśniejsze niż te ze starych próbek. Stare próbki zawierają inne prążki DNA, które są tam obecne w mniej intensywnych, niedocelowych genach, o różnej długości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

próbkaŚwieży1Świeży2Świeży3Stary1Stary2
OD260/OD2802.354±0.0362,245±0,0272.060±0.0382.143±0.0121.753±0,421
DNA (ng / μL)119.91±1.686Numer katalogowy 116.084±4.96595.239±3.40186.845±6.1410.151±0.168

Tabela 1: Pomiar czystości i stężenia DNA za pomocą czytnika mikropłytek.

próbkaŚwieży1Świeży2Świeży3Stary1Stary2
DNA (ng / μL)243.333±1.528237.667±2.082226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

Tabela 2: Pomiar stężenia DNA za pomocą fluorometru.

Dyskusja

Ekstrakcja DNA jest najbardziej krytycznym ogniwem w identyfikacji molekularnej muszek nekrofilnych, a metoda jej ekstrakcji i jakość wyekstrahowanego DNA bezpośrednio wpływają na późniejsze wykrycie. W tym eksperymencie udało nam się wyekstrahować DNA od muszek nekrofilnych za pomocą zwykłego zestawu do krwi, bez konieczności zakupu specjalnego zestawu do ekstrakcji DNA owadów, co ułatwia ekstrakcję DNA owadów.

Powierzchnia much jest bogata w chitynę, szczególnie w stadiach larwalnych i poczwarkowych, gdzie chityna naskórkowa może osiągnąć 60-70%, co utrudnia ekstrakcję DNA od muszek nekrofilskich9. Podczas procesu ekstrakcji odkryliśmy, że jeśli próbka była mokra, mimo że odpowiednio ją ścinaliśmy, próbka pozostawała galaretowata, gdy do trawienia zastosowano proteinazę K. Zapobiegło to powrotnemu przepływowi dodanej cieczy przez kolumnę adsorpcyjną. Aby rozwiązać ten problem, najpierw zastosowaliśmy ciekły azot do szybkiego zamrożenia próbek, aby muchy były kruche i łatwe do zmielenia, a także łatwe do pełnego strawienia. Jeśli ciekły azot nie jest dostępny do mielenia, a wydajność ekstrakcji DNA nadal nie ulega poprawie, próbki much można umieścić w przewiewnym pomieszczeniu na około 48 godzin. Próbki można pozostawić do wyschnięcia, zanim zostaną odpowiednio ścięte, a następnie wyekstrahowane DNA.

Biorąc pod uwagę, że degradacja DNA starych próbek była większym problemem, próbki klatki piersiowej muchy zostały wybrane do ekstrakcji DNA w tym eksperymencie ze względu na wysoką zawartość DNA w klatce piersiowej. Jednak użycie klatki piersiowej jest zbyt destrukcyjne dla integralności morfologicznej muchy, aby można było w pełni zachować późniejsze dowody i potrzebę identyfikacji morfologicznej. Próbki są trudne do pobrania, gdy klatka piersiowa gniła. Jeśli próbki są świeże, preferowana może być ekstrakcja DNA ze stopy i skrzydła. Stopa i skrzydło są rozmieszczone symetrycznie i obustronnie, a pełniejsze cechy morfologiczne można zachować po ekstrakcji tkanki z jednej strony. Jednak stężenie DNA wyekstrahowanego ze skrzydła i stopy jest stosunkowo niskie, co jest ryzykowne dla kolejnych badań. Ponadto próbki były małe i łatwo je zgubić10.

W przypadku zastosowania zestawu do ekstrakcji DNA do ekstrakcji DNA, wartości OD260/OD280 zmierzone przez czytnik mikropłytek były większe niż 2, z wyjątkiem starej próbki 2. Po pierwsze, można stwierdzić, że białko zostało usunięte dokładniej, ale może dojść do zanieczyszczenia RNA, pęknięć dwuniciowych DNA z powodu wielokrotnego wirowania lub degradacji DNA w starych próbkach11. Po drugie, może to również wskazywać, że alkohol przedłuża zachowanie RNA.

Stężenie DNA oblicza się na podstawie wartości OD260 czytnika mikropłytek, podczas gdy fluorometr kubitowy służy najpierw do ustalenia krzywej wzorcowej, a następnie do pomiaru wartości absorbancji w celu obliczenia stężenia DNA. Obie metody mogą realizować pomiar śladowego stężenia DNA, ale każda z nich ma swoje zalety i wady: Czytnik mikropłytek stosuje OD260 do obliczenia stężenia DNA, ale jego metoda obliczeniowa jest również estymacją. Jeśli próbka zostanie zmieszana z dużą liczbą nukleotydów lub białek i innych substancji, które mogą absorbować światło ultrafioletowe, błąd fotometryczny będzie większy, dlatego powinniśmy starać się je wcześniej usunąć.

Czytniki mikropłytek i spektrofotometry UV wykorzystują do wykrywania absorbancję UV, która nie jest w stanie rozróżnić DNA, RNA, zdegradowanych kwasów nukleinowych, wolnych nukleotydów i innych zanieczyszczeń, a na absorbancję duży wpływ ma również zanieczyszczenie innymi substancjami, co sprawia, że jej odczyty są stosunkowo niewiarygodne. Podczas próbkowania impulsów, które są zwykle mierzone w kroplach, próbki są wzbogacane bezpośrednio, bez rozcieńczania lub przetwarzania, co pozwala na jednoczesny pomiar wielu próbek i bezpośrednie obliczanie czystości DNA na podstawie pomiarów OD260/OD280. Z drugiej strony fluorometr Qubit jest przeznaczony do pomiaru tylko stężenia dwuniciowego DNA poprzez zastosowanie dwóch roztworów wzorcowych o znanym stężeniu w celu ustalenia krzywej wzorcowej i zastosowanie charakterystyki barwników fluorescencyjnych, które wiążą się specyficznie z dwuniciowym DNA. Jednak każda próbka musi być indywidualnie poddana obróbce wstępnej, a następnie indywidualnie zmierzona, co jest kłopotliwe w przypadku aplikacji próbek wsadowych, a czystość wyekstrahowanego DNA nie może być zmierzona. W specyficznym zastosowaniu tych dwóch można wybrać zgodnie z własnymi potrzebami do badania jakości DNA 12,13,14.

Stężenie DNA w świeżych próbkach było większe niż w starych próbkach umieszczonych w alkoholu i większe niż w starych próbkach niepoddanych działaniu substancji, niezależnie od tego, czy stężenie DNA mierzono za pomocą czytnika mikropłytek, czy fluorometru kubitowego. W celu długotrwałego przechowywania próbki można zanurzyć w alkoholu, aby zapobiec rozwojowi bakterii i grzybów15,16.

Różne metody pomiarowe miały mniejszy wpływ na pomiary DNA starych próbek bez żadnej obróbki, prawdopodobnie dlatego, że stare próbki były bardziej zdegradowane, zwłaszcza białka i RNA mogą ulegać degradacji szybciej niż DNA. Natomiast świeże próbki zawierały więcej białka i RNA, a zatem miały większy wpływ na wyniki. Jeśli porównywane są tylko stężenia dwuniciowego DNA, powinniśmy skorzystać z wyników fluorometru kubitowego, a wyniki naszych eksperymentów stworzyły również znaczny gradient stężeń DNA w starych i nowych próbkach.

Zawartość DNA zarówno w świeżych, jak i starych próbkach po ekstrakcji DNA może być wykorzystana do późniejszej analizy biologii molekularnej. Podobnie jak w tym eksperymencie, startery wybrane do mitochondrialnego genu CO figure-discussion-1 miały tylko 278 pz i wszystkie z nich mogły być z powodzeniem amplifikowane przez DNA. Mitochondrialny gen CO figure-discussion-2 jest z kolei locus rozpoznawanym u much ze względu na jego potencjał barkodowania DNA, co pozwala na identyfikację nekrofilskich gatunków much poprzez późniejszą analizę sekwencjonowania17. Biologię molekularną dłużej zachowanych próbek można z powodzeniem uzyskać, dobierając startery do innych krótszych sekwencji DNA. Warto zauważyć, że pasma elektroforetyczne starych próbek miały dwie prążki o różnych pozycjach i krótszych sekwencjach, prawdopodobnie z powodu niespecyficznej amplifikacji starterów spowodowanej degradacją DNA w połączeniu z niską temperaturą wyżarzania.

Jednak w tym eksperymencie mniej próbek było przechowywanych przez długi czas, aby zaspokoić potrzebę powtarzalnych eksperymentów, podczas gdy wyniki wymagały tylko reprezentatywnych próbek. W związku z tym nie przeprowadziliśmy testu powtarzalności, który może być badawczy dla zachowania starych i nowych próbek, ale nie wpływa na udaną ekstrakcję próbek much nekrofilskich.

Podsumowując, użycie zestawu do ekstrakcji DNA z krwi może również pomóc w ekstrakcji DNA muchy nekrofilskiej. Z powodzeniem można wyekstrahować zarówno stare, jak i nowe próbki, a całe wyekstrahowane DNA można wykorzystać do późniejszej analizy. Alkohol jest również korzystny dla długotrwałego przechowywania próbek DNA much.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82060341,81560304) oraz przez Projekt Naukowo-Badawczy Platformy Innowacji Akademickich Prowincji Hainan (YSPTZX202134).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor AEQiagen172026832Bufor elucyjny DNA
Bufor ALQiagen172028374do lizy
Bufor ATLQiagen172028162bufor do lizy tkanek
Bufor AW1Qiagen172028760usuwania białek
Bufor AW2Qiagen57203108odsalania
C1-J-2495Podkład do przedmówekTaihe BiotechnologyTW21109216
C1-N-2800Podkład odwróconyTaihe Biotechnology
TW21109217 Drabinka DNA D2000Czas rzeczywisty (Pekin) BiotechnologiaRTM415Zmierz położenie pasm elektroforetycznych
DNeasy Mini kolumna wirowaQiagen166050343kolumna adsorpcyjna DNA
Inkubator do suchej kąpieliMiulabDKT200-2Dużywany do podgrzewania
MIX-30S Mini mikserMiulabMUC881206działanie oscylacyjne
Proteinaza KQiagen172026218Inaktywacja wewnątrzkomórkowych nukleaz i innych białek
Fluorometr Qubit 3.0Thermo Fisher Scientific2321611188
Szybka mikrowirówkaScilogex9013001121Wirówka
Standard#1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard#2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455Obrazowanie żelem
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Ado PCR
Thermo Fisher Scientific2342797
bufor do zwykłym roztworem roboczym

Bibliografia

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium. Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).
  3. Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology. Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).
  4. Odeniran, P. O., et al. molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria. Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).
  5. Wells, J. D., Stevens, J. R. Application of DNA-based methods in forensic entomology. Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).
  6. Kotrba, M., et al. DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species. J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).
  7. Weedon, M. N., et al. Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation. BMJ. 372, 214(2021).
  8. Cai, J. -F., et al. The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China. Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).
  9. Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects. Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).
  10. Guo, Y. Q., et al. Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies. J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).
  11. Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures. J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).
  12. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J Vis Exp. (48), e2699(2011).
  13. Masago, K., et al. Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests. Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).
  14. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).
  15. Adams, Z. J., Hall, M. J. Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length. Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).
  16. Fliegerova, K., et al. Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population. Anaerobe. 29, 80-84 (2014).
  17. Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review. Acta Trop. 238, 106778(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66737

Tagi

Muchy nekrofagiczneChrysomya megacephalazestaw do izolacji DNA z krwiczysto DNAst enie DNAkonserwacja w alkoholuamplifikacja PCRelektroforeza w eluczytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły