Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA świeżych i starych nekrofilskich much przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA.

Streszczenie

Łącznie pięć próbek próbek Chrysomya megacephala - trzy świeże próbki, jedna próbka przechowywana w alkoholu przez 2 lata i jedna próbka przechowywana w suchym, zamkniętym magazynie przez 2 lata chronionym tylko przed światłem - zostały wybrane do zbadania, czy zestaw do ekstrakcji DNA krwi może wyekstrahować DNA od nekrofilskich muszek i określić, czy alkohol może przedłużyć zachowanie DNA nekrofilskich muszek. Po pierwsze, zestaw do ekstrakcji DNA krwi został użyty do ekstrakcji DNA z tkanek klatki piersiowej. Następnie badano czystość i stężenie DNA za pomocą czytnika mikropłytek i fluorometru. Na koniec amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA przeprowadzono za pomocą nekropilicznych starterów specyficznych dla much, zlokalizowanych w mitochondrialnej sekwencji genu CO I. Wyniki wykazały, że czystość DNA wszystkich próbek była większa niż 2,0. Zaobserwowano, że stężenie DNA jest następującego: świeże próbki > stare próbki zakonserwowane alkoholem > niepoddane obróbce, stare próbki. Wszystkie próbki miały specyficzne prążki elektroforetyczne po amplifikacji PCR. Podsumowując, zestaw do ekstrakcji DNA krwi może być użyty do pomyślnego wyodrębnienia DNA z muszek nekrofilskich, a stężenie DNA w próbkach świeżych much jest większe niż w próbkach starych much. Muchy mogą być przechowywane w alkoholu przez długi czas.

Wprowadzenie

Ustalenie czasu zgonu od zawsze było jedną z kluczowych i trudnych kwestii do rozstrzygnięcia w praktyce sądowej. W praktyce kryminalistyki, w przypadku spraw karnych, określenie odstępu pośmiertnego odgrywa kluczową rolę w dedukowaniu czasu popełnienia przestępstwa, zabezpieczeniu podejrzanego oraz zawężeniu zakresu śledztwa. Tradycyjne metody określania czasu zgonu opierają się głównie na wczesnych zjawiskach pośmiertnych, które zazwyczaj mogą być wykorzystane do oszacowania czasu zgonu w ciągu 24 h. Jednakże w przypadku dłuższego czasu od zgonu zjawiska pośmiertne nie pozwalają na jego precyzyjne określenie. Obecnie w środowisku kryminalistycznym uznaje się, że entomologia sądowa ma potencjał, aby stać się skuteczną metodą wnioskowania o dłuższym czasie zgonu.

Owady nekrofagiczne nazwę swoją zawdzięczają larwom żerującym na zwłokach. W przypadku obecności ciała, dorosłe muchy nekrofilne są pierwszymi, które docierają do zwłok, aby złożyć jaja lub larwy. Larwy odżywiają się tkankami ciała i przekształcają w poczwarki, z których następnie wykluwają się osobniki dorosłe. Muchy nekrofilne odgrywają ogromną rolę w kryminalistyce ze względu na ich regularny cykl życiowy i rozprzestrzenienie geograficzne, co pozwala na przykład na określenie czasu i miejsca zgonu^1,2. Barierą w wykorzystaniu much nekrofilnych w praktyce sądowej jest jednak identyfikacja gatunkowa. Metody morfologiczne są nadal stosowane jako uznana metoda identyfikacji gatunków much nekrofilnych. Jednak identyfikacja morfologiczna wymaga wysokiego stopnia zachowania integralności owadów. Badanie morfologiczne staje się trudniejsze, jeśli muchy znajdują się w różnych stadiach rozwojowych lub w wyniku zmian morfologicznych wywołanych czynnikami środowiskowymi. W szczególności morfologia poczwarek i łupin poczwarek, które najczęściej znajduje się na miejscu zbrodni, jest niemal nierozpoznawalna. To, w połączeniu z niedoborem ekspertów z zakresu morfologii, sprawia, że identyfikacja gatunków metodami morfologicznymi jest niezwykle trudna. Dlatego pojawiło się zastosowanie metod biologii molekularnej do identyfikacji gatunkowej much, co zmniejsza trudności związane z identyfikacją morfologiczną i jest niezależne od stadium rozwojowego^3,4,5,6,7.

Pierwszym krokiem w identyfikacji gatunków much nekrofilnych metodami biologii molekularnej jest efektywna ekstrakcja DNA, podczas gdy specjalistyczne zestawy do ekstrakcji DNA owadów nie są obecnie powszechnie dostępne. W związku z tym, sposób wykorzystania powszechnych zestawów do badania krwi w celu ekstrakcji DNA z much nekrofilnych zyskuje większe znaczenie w kryminalistyce. Muchy nekrofilne znalezione na miejscach zbrodni są często zmutilowane lub uległy rozkładowi i degradacji DNA. Próbki much nie są dostępne do ekstrakcji DNA natychmiast po pozyskaniu, a jeśli jest to możliwe, kompletne próbki muszą zostać zachowane ze względu na wymogi zabezpieczenia dowodów. W oparciu o powyższe wymagania, w niniejszym badaniu zastosowaliśmy zestaw do izolacji DNA z krwi oparty na trawieniu proteinazą K i wybraliśmy trzy świeże próbki Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Rysunek 1), jedną starą próbkę C. megacephala przechowywaną w alkoholu przez dwa lata oraz jedną próbkę C. megacephala przechowywaną w warunkach chronionych przed światłem przez dwa lata; zważono każdą z pięciu próbek i wybrano tkankę klatki piersiowej owada do ekstrakcji DNA. Porównując jakość i czystość DNA wyizolowanego ze starych i nowych próbek, przeprowadzono amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA z zastosowaniem starterów specyficznych dla much nekrofilnych, zlokalizowanych w sekwencji genu mitochondrialnego CO .

Protokół

UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano łącznie pięć próbek C. megacephala – trzy próbki świeże (Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3), jedną próbkę przechowywaną w alkoholu przez 2 lata (Old 1) oraz jedną próbkę przechowywaną przez 2 lata w suchym, szczelnym pojemniku, wyłącznie z zabezpieczeniem przed światłem (Old 2). Próbki należy oznakować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.

1. Ogólne przechowywanie i przygotowanie próbek

1. Wybór i przygotowanie próbek
   UWAGA: Podczas stosowania octanu etylu w celu uśmiercenia much nekrofagicznych należy bezwzględnie pracować w dygestorium. Przed ważeniem należy usunąć ciecz z powierzchni muchy.
   1. Próbki świeże: Po uśmierceniu much octanem etylu umieścić trzy pobrane próbki w fiolkach gazowych. Zważyć i oznaczyć próbki jako Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3, a następnie bezzwłocznie wykorzystać je w eksperymentach.
      UWAGA: Próbki świeżych much w tym protokole miały masy 56.8 mg, 49.3 mg i 52.1 mg.
   2. Próbka stara 1: Wyjąć próbki much uśmiercone octanem etylu i przechowywane w wypełnionych alkoholem probówkach wirówkowych przez 2 lata w szczelnym pojemniku, chronionych przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważyć próbkę po odsączeniu cieczy z powierzchni za pomocą papieru filtracyjnego; oznaczyć ją jako Old 1.
      UWAGA: Masa próbki Old 1 w tym protokole wynosiła 42.3 mg.
   3. Próbka stara 2: Wyjąć próbkę muchy uśmierconej octanem etylu i przechowywanej w probówce wirówkowej przez 2 lata w szczelnym pojemniku, chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej. Zważyć i oznaczyć jako Old 2.
2. Przygotowanie przed ekstrakcją
   1. Dodać niewielką ilość ciekłego azotu w celu schłodzenia stalowego pojemnika; odczekać do całkowitego odparowania ciekłego azotu.
   2. Umieścić próbkę muchy w pojemniku; powoli wlewać ciekły azot, aby zapobiec jego rozbryzgianiu i uderzeniu w próbkę owada.
   3. Zamrozić próbki w ciekłym azocie. Wyjąć próbki po odparowaniu ciekłego azotu.
   4. Oddzielić od każdej muchy klatkę piersiową, umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL i pociąć na jak najcieńsze plastry.
      UWAGA: Próbkę należy pociąć na małe kawałki, aby umożliwić jej całkowity rozpad i uwolnienie dużych ilości DNA.
   5. Powtórzyć powyższe kroki dla każdej muchy, zamrażając je indywidualnie, a następnie przenosząc do nowej probówki wirówkowej, aby zapobiec krzyżowej kontaminacji DNA.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (15-25 °C) w mikrowirówce. Wszystkie czynności muszą być wykonywane w ścisłym przestrzeganiu zasad aseptyki, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.

1. Liza tkanek
   1. Do probówki wirówkowej o pojemności 2 mL zawierającej pobraną próbkę dodać 180 µL buforu do lizy tkanek.
   2. Dodać 20 µL proteinazy K. Wymieszać dokładnie w wstrząsarku typu vortex przy 3 000 rpm przez 10 s i inkubować w 56 °C do całkowitej lizy tkanek owada.
      UWAGA: W przypadku niepełnego strawienia tkanki należy dodać więcej proteinazy K. Liza zazwyczaj kończy się w ciągu 1-3 h; czas lizy można również przedłużyć do całej nocy.
2. Wytrącanie DNA
   1. Wymieszać w wstrząsarku typu vortex przy 3 000 rpm przez 15 s. Do próbki dodać 200 µL buforu do lizy i ponownie wymieszać dokładnie w wstrząsarku przy 3 000 rpm przez 15 s.
   2. Dodać 200 µL etanolu (96-100%) i ponownie wymieszać dokładnie w wstrząsarku przy 3 000 rpm przez 15 s.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, bufor do lizy oraz etanol można dodać wspólnie w jednym kroku. Po dodaniu buforu do lizy i etanolu może powstać biały osad.
3. Przenieść mieszaninę pipetą do kolumny adsorpcyjnej DNA umieszczonej w probówce zbierającej o pojemności 2 mL. Wirować przy 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
4. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA z poprzedniego kroku w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu do usuwania białek i wirować przy 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
5. Przenieść kolumnę adsorpcyjną DNA do nowej probówki zbierającej o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu odsalającego i wirować przy 20 000 × g przez 3 min w celu osuszenia membrany kolumny adsorpcyjnej DNA. Odrzucić przeływ oraz probówkę zbierającą.
   UWAGA: Ten etap wirowania zapewnia usunięcie resztek etanolu przed następującą elucją. W przypadku obecności pozostałości etanolu należy ponownie wirować przy 20 000 × g przez 1 min.
6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną DNA w czystej probówce do mikrowirowania o pojemności 2 mL, nanieść pipetą 100 µL buforu do elucji DNA bezpośrednio na membranę kolumny, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, a następnie wirować przy 6 000 × g przez 1 min w celu elucji.
   UWAGA: Elucja z użyciem 100 µL (zamiast 200 µL) zwiększa końcowe stężenie DNA w eluarcie, ale zmniejsza całkowitą wydajność DNA. Aby zmaksymalizować wydajność DNA, należy powtórzyć elucję raz, zgodnie z opisem w kroku 2.8.
7. Próbki DNA przechowywać w 4 °C (do 1 tygodnia) lub w -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.

3. Oznaczanie stężenia DNA

1. Wyznacz wartości OD 260 i OD 280 za pomocą czytnika mikropłytek, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych. Pomiar powtórz trzykrotnie dla każdej próbki.
2. Wyznacz stężenie wyekstrahowanego DNA za pomocą fluorometru i dołączonego do niego zestawu, wykonując trzy powtórzenia dla każdej próbki.
   1. Do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mL odmierz po 190 µL roztworu roboczego, dodaj do nich po 10 µL Standardu #1 i Standardu #2, a następnie przechowuj je w ciemności przez nie mniej niż 15 min.
      UWAGA: Standard #1 i Standard #2 są precyzyjnie skalibrowane na określone stężenie DNA. Roztwory standardowe powinny zostać dokładnie przygotowane, aby zapewnić utworzenie dokładnej krzywej wzorcowej. Standard #1 to próbka dwuniciowego DNA (dsDNA) o stężeniu 0,2 ng/µL; Standard #2 ma stężenie 2 000 ng/µL. Roztwór roboczy to barwnik, który wiąże się specyficznie z dsDNA.
   2. Odmierz 2 µL badanego DNA i wymieszaj z 198 µL roztworu roboczego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 mL, a następnie przechowuj w ciemności przez nie mniej niż 15 min.
      UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest niskie, dodaj 5 µL badanego DNA do 195 µL roztworu roboczego.
   3. Po 15 min włącz urządzenie i wybierz opcję dsDNA Concentration Measurement | Long Range. W celu uzyskania krzywej wzorcowej zmierz najpierw Standard #1, a następnie Standard #2.
      UWAGA: Roztwór standardowy należy wykorzystać w tym samym dniu, w którym został przygotowany; zbyt długie przechowywanie spowoduje wystąpienie dużego błędu w krzywej wzorcowej.
   4. Umieszczaj próbki do analizy w dołkach pomiarowych jedna po drugiej, ustaw objętość dodawanego DNA na 2 µL, powtórz pomiar trzykrotnie, oblicz wartość średnią i zapisz wynik.

4. PCR i detekcja elektroforetyczna

UWAGA: Sekwencja genu mitochondrialnego CO o długości 278 bp została poddana amplifikacji PCR z wykorzystaniem prawego primera C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG oraz lewego primera C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC⁸, a następnie przeprowadzono elektroforezę w 2% żelu agarozowym w celu weryfikacji efektu amplifikacji oraz sprawdzenia długości produktów amplifikacji.

1. Przygotować 20 µL układu do amplifikacji PCR, dodając 10 µL 2x Taq mix, 1 µL każdego z primerów, 5 µL ddH₂O oraz 3 µL matrycy DNA; wymieszać przez 10 s w wirówce.
2. Zastosować następujące parametry cyklu PCR: predenaturacja 95 °C przez 10 min; denaturacja 95 °C przez 30 s, przyłączanie 48 °C przez 30 s, elongacja 72 °C przez 45 s przez łącznie 40 cykli; oraz końcowa elongacja 72 °C przez 10 min.
3. Produkty po reakcji PCR poddać elektroforezie w 2% żelu agarozowym, a po zakończeniu elektroforezy umieścić je w systemie do obrazowania żeli w celu analizy fotograficznej.

Wyniki

Do pomiaru wartości OD260 i OD280 roztworu wyekstrahowanego DNA wykorzystaliśmy czytnik mikropłytek, a następnie wyznaczyliśmy stosunki OD260/OD280 w celu oceny czystości DNA. Wartość OD260/OD280 dla wszystkich świeżych próbek oraz starej próbki 1 była większa niż 2. Wartość OD260/OD280 dla starej próbki 2 osiągnęła maksimum 2,187, mimo że średnia wynosiła 1,753, a trzy pomiary wykazywały duże wahania ze względu na niskie (≤0,01) wartości zarówno OD260, jak i OD280 (Tabela 1). Na podstawie uzyskanej wart...

Dyskusja

Ekstrakcja DNA jest najbardziej krytycznym etapem w molekularnej identyfikacji much nekrofilnych, a zastosowana metoda ekstrakcji oraz jakość wyizolowanego DNA bezpośrednio wpływają na późniejszą detekcję. W niniejszym doświadczeniu pomyślnie wyizolowano DNA z much nekrofilnych przy użyciu powszechnie dostępnego zestawu do izolacji DNA z krwi, bez konieczności zakupu specjalistycznego zestawu do ekstrakcji DNA z owadów, co ułatwia przeprowadzenie procesu izolacji DNA z owadów.

Powierzchnia muc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor AE	Qiagen	172026832	Bufor elucyjny DNA
Bufor AL	Qiagen	172028374	do lizy
Bufor ATL	Qiagen	172028162	bufor do lizy tkanek
Bufor AW1	Qiagen	172028760	usuwania białek
Bufor AW2	Qiagen	57203108	odsalania
C1-J-2495	Podkład do przedmówek	Taihe Biotechnology	TW21109216
C1-N-2800	Podkład odwrócony	Taihe Biotechnology
TW21109217 Drabinka DNA D2000	Czas rzeczywisty (Pekin) Biotechnologia	RTM415	Zmierz położenie pasm elektroforetycznych
DNeasy Mini kolumna wirowa	Qiagen	166050343	kolumna adsorpcyjna DNA
Inkubator do suchej kąpieli	Miulab	DKT200-2D	używany do podgrzewania
MIX-30S Mini mikser	Miulab	MUC881206	działanie oscylacyjne
Proteinaza K	Qiagen	172026218	Inaktywacja wewnątrzkomórkowych nukleaz i innych białek
Fluorometr Qubit 3.0	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Szybka mikrowirówka	Scilogex	9013001121	Wirówka
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	Obrazowanie żelem
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	do PCR
	Thermo Fisher Scientific	2342797

bufor do zwykłym roztworem roboczym