Artykuł metodologiczny

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66740

⸱

31 maja 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia, Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Streszczenie

Aby kontrolować i zmniejszać wpływ chorób pierwotniaków u ludzi na zdrowie publiczne, takich jak choroba Chagasa, leiszmanioza i ludzka trypanosomatoza afrykańska, konieczne jest przyspieszenie rozwoju nowych leków i szczepionek. Proces ten jest jednak pełen trudności, takich jak bardzo złożona biologia pasożytów i patogeneza chorób oraz, co typowe dla zaniedbanych chorób tropikalnych, stosunkowo ograniczone fundusze na badania i rozwój. W związku z tym modele badań in vitro i in vivo, które mogą w wystarczającym stopniu odtworzyć kluczowe cechy infekcji i choroby, zapewniając jednocześnie racjonalne wykorzystanie zasobów, mają zasadnicze znaczenie dla postępu badań nad tymi schorzeniami. Jednym z przykładów jest mysi model obrazowania bioluminescencji in vivo (BLI) dla choroby Chagasa, który zapewnia bardzo czułe wykrywanie światła o dużej długości fali generowanego przez pasożyty Trypanosoma cruzi wykazujące ekspresję lucyferazy. Pomimo tego, że technika ta stała się standardowym podejściem do badań skuteczności leków in vivo, grupy badawcze mogą nadal mieć trudności z jej wdrożeniem ze względu na brak odpowiedniego szkolenia praktycznego w zakresie obsługi sprzętu i stosowania procedur kontroli jakości, nawet jeśli odpowiedni sprzęt BLI jest łatwo dostępny. Biorąc pod uwagę ten scenariusz, protokół ten ma na celu przeprowadzenie od planowania eksperymentów do pozyskiwania i analizy danych, ze szczegółami, które ułatwiają wdrażanie protokołów w grupach badawczych z niewielkim lub żadnym doświadczeniem z BLI, zarówno dla choroby Chagasa, jak i dla innych mysich modeli chorób zakaźnych.

Wprowadzenie

Choroba Chagasa jest endemiczna w Ameryce Łacińskiej i dotyka około siedmiu milionów ludzi na całym świecie1. Rocznie ponad 50 000 zgonów i straty ekonomiczne w wysokości około 7 miliardów dolarów wynikają z niepełnosprawności tej choroby2. Choroba Chagasa jest wywoływana przez pierwotniaka Trypanosoma cruzi, heteroksenicznego pasożyta hemoflagellate zdolnego do zakażania ssaków (dzikich i domowych) i wektorów triatominowych (Hemiptera, Reduviidae)3 w obu Amerykach, gdzie ustalono transmisję wektorową. Inne ważne drogi infekcji obejmują transfuzję krwi, przeszczep narządów, doustne (poprzez spożycie żywności skażonej zakażoną triatominą)4 i transmisję wrodzoną. Niewektorowe drogi transmisji przyczyniły się do rozprzestrzenienia się choroby Chagasa na obszary nieendemiczne3,5.

Choroba Chagasa objawia się w dwóch fazach klinicznych. Ostra faza przebiega w większości przypadków bezobjawowo. Zakażenia objawowe są zwykle związane z niespecyficznymi objawami, takimi jak gorączka, zmęczenie, bóle mięśni, powiększenie węzłów chłonnych, powiększenie śledziony i powiększenie wątroby. Ostra faza jest również często związana z wyraźną parazytemią i ogólnoustrojowym krążeniem pasożytów. Śmierć może nastąpić nawet w 10% zdiagnozowanych przypadków, zwłaszcza w przypadku infekcji jamy ustnej6. Faza przewlekła często charakteryzuje się długim okresem braku jakichkolwiek objawów. Z czasem około jedna trzecia pacjentów zakażonych kilkadziesiąt lat wcześniej wykazuje objawy sercowe, którym zwykle towarzyszy zwłóknienie i zapalenie mięśnia sercowego i/lub zaburzenia żołądkowo-jelitowe głównie związane z rozwojem zespołu megaesophagus i/lub megacolon3,5,6.

Etiologiczne leczenie choroby Chagasa składa się tylko z dwóch leków: benznidazolu i nifurtimoksy. Te środki przeciwpasożytnicze są dostępne od ponad 50 lat i mają znaczną toksyczność oraz ograniczoną skuteczność5,7,8. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, bezpiecznych i skuteczniejszych metod leczenia pacjentów z chorobą Chagasa.

Bardziej wyrafinowane i dokładne techniki umożliwiają teraz uzyskanie odpowiedzi na stare pytania, które pozwalają na postęp w poszukiwaniu nowych metod leczenia choroby Chagasa. W tym sensie społeczność naukowa czerpie ogromne korzyści z genetycznie modyfikowanych pasożytów w badaniach in vivo nad przebiegiem infekcji i oceną skuteczności leków9,10,11,12. Test podłużny oparty na systemie obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) umożliwia ocenę skuteczności w trakcie i po schemacie leczenia, prowadząc do identyfikacji związków o aktywności trypanobójczej10,13. Metoda BLI zapewnia bezpośredni pomiar obciążenia pasożytami, zarówno w krążeniu, jak i w tkankach i narządach, poprzez ilościowe określenie ilości światła wytwarzanego przez genetycznie zmodyfikowany T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage11, który konstytutywnie wyraża przesuniętą ku czerwieni lucyferazę świetlika12.

Mimo to, prawie 10 lat po ustanowieniu zwierzęcego modelu choroby Chagasa BLI i badań nad skutecznością leków, tylko kilka grup badawczych dominuje nad tą techniką. Fakt ten wynika nie tylko z ograniczonego dostępu do odpowiedniego sprzętu do obrazowania, ale także z braku szkoleń i dostępności ustrukturyzowanych, szczegółowych protokołów. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z innymi podejściami, które opierają się na ocenie pasożyta za pomocą mikroskopii, serologii lub oceny zakażenia narządów/tkanek za pomocą qPCR w celu wykrycia DNA pasożyta, ponieważ umożliwia poprawę dobrostanu myszy i ograniczenie wykorzystywania zwierząt dzięki możliwości generowania bardziej wiarygodnych i zintegrowanych danych in vivo. Co więcej, metoda ta jest prawdopodobnie bardziej czuła, ponieważ umożliwia łatwe wykrycie ognisk pasożytniczych w narządach trzewnych po leczeniu farmakologicznym10,12. W związku z tym protokół ten ma na celu poprowadzenie grup badawczych zajmujących się parazytologią i innymi chorobami zakaźnymi w ustaleniu tej metodologii w swoich laboratoriach poprzez szczegółowe określenie procedur technicznych. W tym artykule dzielimy się doświadczeniami zdobytymi podczas wdrażania modelu BLI choroby Chagasa w Brazylii, pierwszego tego rodzaju w Ameryce Łacińskiej, w ramach działań na rzecz odkrycia leków koordynowanych przez inicjatywę Drugs for Neglected Diseases (DNDi).

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały przedłożone, zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi14 zalecanymi przez Komisję Etyki Zwierząt Instituto de Ciências Biomédicas na Universidade de São Paulo: protokół CEUA ICB/USP nr 5787250522.

1. Roztwory

UWAGA: Należy przyjąć rekomendowaną objętość podania wynoszącą 10 mL/kg (200 µL dla myszy o masie 20 g)15,16. Na przykład, należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 15 mg/mL, aby osiągnąć dawkę 150 mg/kg dla zwierzęcia.

  1. Nośnik zawiesiny hydroksypropylometylocelulozowa (HPMC-SV)
    UWAGA: Wymagane odczynniki to 0,5% (w/v) hydroksypropylometyloceluloza (HPMC), 0,4% (v/v) Tween 80 oraz 0,5% (v/v) alkohol benzylowy.
    1. Aby przygotować 200 mL roztworu nośnika, odważ 1 g HPMC i rozpuść w 64 mL gorącej wody ultrapure. Mieszaj przez 2 min.
    2. Dodaj 120 mL lodowatej wody ultrapure i mieszaj przez 1 h. Dodaj 1 mL alkoholu benzylowego.
    3. Następnie dodaj 0,8 mL Tween 80, stosując technikę pipetowania odwrotnego, i mieszaj do momentu, aż roztwór stanie się przezroczysty.
    4. Dopełnij roztwór do końcowej objętości 200 mL. Przechowuj HPMC-SV w warunkach chłodniczych (4 °C) przez maksymalnie 3 miesiące.
  2. Benznidazol
    1. Oblicz niezbędną ilość roztworu związku w następujący sposób:
      objętość roztworu związku = (liczba dawek każdego dnia x liczba dni x liczba myszy do leczenia x objętość podawana każdej myszy) + 30% zapasu.
    2. Odważ niezbędną ilość benznidazolu (BZ), uwzględniając pożądaną dawkę. W przypadku leczenia kuratywnego doustna dawka 100 mg/kg raz dziennie przez 10 dni pozwala osiągnąć 100% wyleczalności w przewlekłym modelu CD17.
    3. Uwzględniając pożądaną objętość końcową, oblicz odpowiednią ilość, aby uzyskać stężenie 5% (v/v) DMSO, i całkowicie rozpuść BZ w czystym DMSO.
    4. Do szklanej probówki dodaj odpowiednią objętość nośnika, aby uzyskać stężenie 95% (v/v) HPMC-SV. Przenieś BZ rozpuszczony w DMSO do szklanej probówki zawierającej HPMC-SV. Intensywnie homogenizuj zawiesinę i przechowuj ją w temperaturze 4 °C.
      Np.: Końcowa objętość formulacji BZ = 10 mL (krok 1.2.1)
      Ilość BZ = 100 mg (krok 1.2.2)
      ​5% DMSO = 0,5 mL (krok 1.2.3) oraz 95% HPMC-SV = 9,5 mL (krok 1.2.4)
    5. Przed każdym podaniem leku formulacje umieszcza się w wodnej kąpieli ultradźwiękowej na 5 min w temperaturze 37 °C i intensywnie homogenizuje przed podaniem zwierzętom.
  3. Cyklofosfamida
    1. Rozpuść niezbędną ilość cyklofosfamidy w wodzie ultrapure, aby uzyskać roztwór o stężeniu 12,5 mg/mL.
    2. Zesterylizuj roztwór poprzez filtrację i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  4. Barwienie Giemsy
    1. Rozpuść 0,6 mg proszku odczynnika Giemsy w 50 mL metanolu. Dodaj 25 mL glicerolu i wymieszaj. Usuń osady za pomocą papieru filtrującego i lejka. Przechowuj roztwór stokowy w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc go przed światłem.
    2. Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając 10 mL roztworu Giemsy w 90 mL buforu fosforanowego (20,5 M Na2HPO4, 65,4 M KH2PO4 przy pH 7,2).

2. Hodowla Trypanosoma cruzi

  1. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC), hoduj 4 x 106 epimastygot/mL T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 w pożywce LIT (68,44 mM NaCl, 5,36 mM KCl, 112,7 mM Na2HPO4, 5 g/L tryptony, 5 g/L wyciągu z wątroby, 0,03 M heminy, 4,16 mM glukozy), uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 µg/mL penicyliny, 100 U/mL streptomycyny i 150 µg/mL hygromycyny jako leku selekcyjnego w temperaturze 28 °C. Pasożyty zazwyczaj osiągają fazę stacjonarną w ciągu 3-4 dni.
  2. Indukuj metacyklogenezę w celu uzyskania infekcyjnych pasożytów poprzez inkubację 3 x 108 epimastygot w 10 mL pożywki Grace's Insect z 10% (v/v) FBS w probówkach stożkowych o pojemności 15 mL w temperaturze 28 ˚C przez 7-10 dni.
  3. Oceń stopień różnicowania za pomocą rozmazów barwionych metodą Giemsy. W tym celu nanieś 20 µL zróżnicowanych pasożytów na szkiełko przedmiotowe i pozostaw do wyschnięcia na 10 min.
  4. W dygestorium przeprowadź utrwalanie próbki, pokrywając szkiełko przedmiotowe czystym metanolem i pozostawiając do całkowitego wyschnięcia (1-2 min). Przykryj szkiełko przedmiotowe roboczym roztworem Giemsy na 20 min.
  5. Delikatnie przemyj szkiełko przedmiotowe wodą destylowaną. Pod mikroskopem oblicz procent metacyklicznych trypomastygot. Jeśli osiągnięto stopień różnicowania wynoszący co najmniej 10 procent, przejdź do następnego kroku.
  6. Odwiruj pasożyty (120 x g przez 10 min) i resuspenduj osad w 10 mL DPBS. Odwiruj ponownie i resuspenduj pasożyty w 5 mL DMEM uzupełnionego o 10% (v/v) FBS, 100 µg/mL penicyliny i 100 U/mL streptomycyny.
  7. W kolbie hodowlanej o powierzchni 25 cm2 przeprowadź infekcję 1,66 x 105 komórek LLC-MK2 (komórki nabłonka nerek Macaca mulatta) w temperaturze 37 °C w 5% CO2, w inkubatorze z nawilżaniem18.
  8. Trypomastigoty hodowlane (TCT) uwalniają się do pożywki po 8-9 dniach. Zainfekuj świeże monowarstwy komórek LLC-MK2 za pomocą TCT przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:40.

3. Analiza Trypanosoma cruzi homogeniczność populacji za pomocą cytometru przepływowego

  1. Zebrać TCT szczepów CL Brener Luc::Neon oraz CL Brener typu dzikiego, odwirować przy 120 x g przez 10 min, a następnie resuspendować TCT w DPBS. Dostosować gęstość pasożytów do poziomu 1 x 106/mL.
  2. Przeprowadzić analizę populacji za pomocą cytometru przepływowego w oparciu o fluorescencję mNeonGreen (ex. 506/em. 517 nm)19, rejestrując co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdej próbki.
    UWAGA: Procent fluorescencyjnej populacji uzyskuje się poprzez porównanie typu dzikiego z pasożytem transfekowanym. Aby przystąpić do zakażania myszy, należy osiągnąć minimum 95% fluorescencyjnej populacji pasożytów linii CL Brener Luc::Neon (Rycina uzupełniająca 1).

4. Eksperymentalna infekcja myszy

UWAGA: Aby zwiększyć liczbę pasożytów, trypomastigoty krwi (BT) są często pozyskiwane z myszy z niedoborem odporności10,13. W niniejszym protokole stosuje się chemiczną immunosupresję myszy BALB/C w celu pozyskania BT. W tym celu łagodną immunosupresję osiąga się poprzez cztery dostrzyczynowe iniekcje cyklofosfamidu (CTX) w dawce 62,5 mg/kg w odstępach 96 h, co jest wykonywane równocześnie z zakażeniem T. cruzi.

  1. Podaj 62,5 mg/kg sterylnej cyklofosfamidą poprzez wstrzyknięcie doszpikowe (i.p.) na 1 dzień przed T. cruzi infekcja
  2. Zainfekuj każdą mysz dawką 1 x 104 TCT w 0,2 ml DPBS drogą doszprytonową. Należy zwrócić uwagę na wysokie ryzyko wypadków podczas pracy z patogenami i igłami. Zakażenie należy przeprowadzić w BSC, nosząc rękawiczki i osłonę twarzy przez cały czas trwania procedury.
  3. Monitoruj codziennie poziom parasitemii poprzez bezpośrednią obserwację BT we krwi (metoda Pizzi-Brenderer)20W szczycie parasytemii, około 13–17 dnia po infekcji (dpi), należy przeprowadzić pobranie krwi. W tym celu myszy należy znieczulić ketaminą w dawce 100 mg/kg i ksylazyną w dawce 10 mg/kg.
  4. Po całkowitym znieczuleniu myszy21następnie należy przeprowadzić punkcję serca za pomocą strzykawki 1 ml z dołączoną igłą 24 G X¾ zawierającą 50 µL z 3,8% (m/v) cytrynianu sodu. Wyjąć igłę i ostrożnie przelać krew do probówki wirówkowej.
  5. W komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) należy wykonać rozcieńczenie alikwotu krwi w buforze lizującym amoniakowo-chlorkowo-potasowym (ACK), a następnie policzyć pasożyty w komorze Neubauera. Procedurę tę należy powtórzyć co najmniej dwukrotnie, ponieważ niewielkie skrzepy krwi wpływają na liczenie pasożytów.
    UWAGA: Aby uniknąć błędów w liczeniu, należy dostosować czynnik rozcieńczenia tak, aby liczba trypomastigot w komorze Neubauera nie była niższa niż 30 i nie przekraczała 300.
  6. Dostosuj gęstość pasożytów do poziomu 5 x 103 BT/ml poprzez zmieszanie odpowiedniej ilości krwi pełnej w DPBS.
  7. Zainfekuj myszy szczepu BALB/c bez immunosupresji dawką 1 x 103 BT w 0,2 ml DPBS na mysz (5 x 103 (BT/ml) drogą dosytrynialną przy użyciu igły 26 G (cieńsze igły prowadzą do lizy pasożytów)22Po wstrzyknięciu objętości do jamy otrzewnej należy pozostawić igłę w ciele myszy przez 5 s, aby zapobiec cofaniu się płynu.
  8. Umieścić zainfekowane myszy tymczasowo w pudełku wyłożonym ręcznikiem papierowym w celu zidentyfikowania ewentualnych wycieków lub krwawień, a następnie przenieść myszy z powrotem do ich klatek.

5. Obrazowanie in vivo

UWAGA: Słownik terminów użytych w tym materiale przedstawia się następująco:

Sesja obrazowania: akwizycja bioluminescencji przeprowadzona we wszystkich grupach określonego eksperymentu w danym dniu. Rysunek 1A przedstawia ogólny schemat procedury.

Runda obrazowania: Procedura przeprowadzona w podgrupach po trzy myszy, od momentu wstrzyknięcia D-lucyferyny do wybudzenia z narkozy. Zaleca się, aby każda grupa eksperymentalna składała się z 6 myszy, ze względu na wewnętrzną zmienność obciążenia pasożytami oraz inne czynniki wpływające na kwantyfikację BLI, opisane poniżej.

Akwizycja obrazowania: Wykonanie zdjęć za pomocą sprzętu obrazującego w celu ilościowego oznaczenia bioluminescencji, co skutkuje nałożeniem obrazu fotografii i zmierzonej bioluminescencji przedstawionej w postaci skali pseudokolorów.

Procedura obrazowania: wszystkie kroki omówione w tej części protokołu.

Schemat obrazowania bioluminescencyjnego z reakcją lucyferazy i analizą danych wykresu strumienia, badanie in vivo.
Rysunek 1: Pozyskiwanie danych BLI. (A) Schemat procesu pozyskiwania danych zastosowany w badaniach nad chorobami zakaźnymi, na przykładzie bioluminescencyjnego modelu mysiego choroby Chagasa. Myszy zainfekowane genetycznie zmodyfikowanym T. cruzi są analizowane za pomocą obrazowania in vivo w ustalonych punktach czasowych. W każdej serii obrazowania grupom do trzech myszy wstrzykuje się 150 mg/kg enzymu-substratu (D-lucyferyny). Po 5 min podaje się znieczulenie w postaci 2,5% (v/v) izofluranu w tlenie. Gdy myszy stają się całkowicie nieruchome, są umieszczane w systemie obrazowania, a akwizycję rozpoczyna się zgodnie z określonymi ustawieniami. Po obrazowaniu myszy budzą się z narkozy i wracają do klatek. Częste pytania i problemy, z którymi badacze mogą się spotkać podczas pozyskiwania danych, zaznaczono kolorem czerwonym. Schemat ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Lewis et al. (2014)12 (stworzony w BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) Kinetyka in vivo D-lucyferyny/przesuniętej w czerwień lucyferazy świetlikowej (PpyRE9h). Myszy w szczycie parasitemii T. cruzi (n = 3) znieczulono i wstrzyknięto im 150 mg/kg D-lucyferyny. Obrazy pozyskiwano przez 1 h (czas ekspozycji: 2 min; binning: 4). Góra: ilościowe oznaczenie całkowitego strumienia brzusznego (p/s) (lewa oś Y, na czerwono) oraz jako procent najwyższego pomiaru średniego (prawa oś Y, na niebiesko). Dane przedstawiono jako średnią (krzywe) i odchylenie standardowe (obszar zacieniowany). Dół: Pozyskane obrazy dla pierwszego (4 min), najwyższego sygnału BLI (30 min) i ostatniego (62 min) punktu czasowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Sprawdź zielony pasek w oknie Acquisition, aby zweryfikować, czy kamera CCD (charge-coupled device) jest schłodzona (-90 °C). Kliknij pasek (zielony lub czerwony), aby wyświetlić temperaturę.
    UWAGA: Zgodnie z instrukcją obsługi sprzętu obrazującego, urządzenie i oprogramowanie powinny być stale włączone, aby utrzymać niską temperaturę CCD.
  2. Zweryfikuj, czy wykonano automatyczną regulację tła. W tym celu kliknij Acquisition > Background > View available Dark Charge. Pojawi się lista z kilkoma kombinacjami ustawień.
    UWAGA: Procedura ta redukuje szumy luminescencyjne. Jeśli wybrana konfiguracja skutkuje wartością wyższą niż 1000, zgodnie ze wzorem „czas ekspozycji x (binning²)”, nie należy pomijać ciemnego ładunku (dark charge). W zależności od konfiguracji oprogramowania, binning może być wyświetlany jako liczba (współczynnik binningu) lub zakres od „small” do „large”. Zależność między zakresem a współczynnikiem binningu znajduje się w instrukcji urządzenia.
  3. Jeśli okno Activity Window (biały obszar na dole oprogramowania) nie jest widoczne, włącz je w Menu View > Activity Window.
  4. Ustaw obszar obrazowania, klikając Acquisition Window > Field of View. Opcja C (13.2 cm) pozwala na obrazowanie 3 myszy, a Opcja D (22 cm) 5 myszy.
  5. Wybierz opcję automatycznego zapisu, klikając Acquisition > Auto-Save, a następnie wybierz lub utwórz nowy folder dla każdego punktu czasowego.
  6. Połóż matowy czarny papier na obszarze obrazowania i umieść slajdy oddzielające prostopadle między wlotami. Jeśli producent nie dostarczył slajdów, użyj kawałków (3 cm x 15 cm) matowego czarnego papieru.
  7. Dostosuj wewnętrzny obszar komory obrazowania, aby dopasować szklane stożki nosowe do wlotów anestezji. Użyj małych kawałków czarnej taśmy izolacyjnej, aby przymocować system anestezji do platformy (poza obszarem obrazowania).
    UWAGA: W niektórych wersjach urządzeń obrazujących obszar obrazowania jest definiowany przez laser. Jeśli to narzędzie jest niedostępne, wykonaj zdjęcia za pomocą oprogramowania, aby sprawdzić położenie slajdów oddzielających w obszarze obrazowania.
  8. Ustaw waporyzator izofluranu na 2.5% (v/v) w tlenie dla komory obrazowania i komory indukcyjnej. Sprawdź za pomocą manometru, czy gaz przepływa przez system21.
    UWAGA: Jeśli urządzenie obrazujące nie posiada dołączonego systemu anestezji inhalacyjnej, możliwe są inne opcje znieczulenia, takie jak wstrzyknięcie ksylazyny i ketaminy23. W takim przypadku wybudzanie myszy jest powolne, a ryzyko zgonu wysokie24.
  9. Napełnij strzykawki (igły 31 G) D-lucyferyną (szczegółowy protokół przygotowania D-lucyferyny jest dostarczany przez różnych dostawców)25,26, chroń je przed bezpośrednim światłem i przygotuj kilka plastikowych pojemników lub dodatkowych klatek, wyściełając ich wnętrze ręcznikiem papierowym.
  10. Miej pod ręką zegar/zegarek, aby łatwo śledzić czas, oraz notatnik laboratoryjny do rejestrowania grup myszy, czasu wstrzyknięcia lucyferyny i wszelkich innych informacji podczas procedury.
  11. Zważ wszystkie myszy i zarejestruj ich masę. Oznacz każdą mysz markerem lub tatuażem na ogonie. Przez cały eksperyment dbaj o to, aby identyfikacja myszy była dobrze widoczna. Ten krok można wykonać również w dniu poprzedzającym obrazowanie.
    UWAGA: Oznaczenie nie powinno zajmować dużego obszaru ciała, ponieważ tusz może zakłócać sygnał bioluminescencyjny. Markery permanentne w różnych kolorach mogą również pomóc w rozróżnieniu grup.
  12. Aby rozpocząć sesję obrazowania, zarejestruj obraz luminescencyjny tła (ustawienia: Exposure Time: 5 min; Binning: „large” lub „16”, f/stop: 1) komory obrazowania bez myszy. Procedura ta pomaga zidentyfikować autoluminescencyjne źródła światła lub niepożądane problemy ze sprzętem.
    UWAGA: Ponieważ BLI opiera się na reakcji enzymatycznej, czas jest kluczowym elementem eksperymentu. Sprawdź wszystkie wymienione powyżej elementy i ustawienia sprzętu przed rozpoczęciem pracy ze zwierzętami.
  13. Wstrzyknij 150 mg/kg (i.p.) D-lucyferyny pierwszym 3 myszom, unikając naruszenia organów wewnętrznych. Umieść myszy w pojemniku, aby ocenić, czy D-lucyferyna nie wycieka (jasnożółty roztwór). Zanotuj, jeśli tak się stanie, a następnie zarejestruj grupę myszy i czas wstrzyknięcia D-lucyferyny.
  14. Odczekaj 5 min, a następnie przenieś myszy do komory indukcyjnej anestezji. Włącz system. Pełne znieczulenie myszy (brak reakcji, takich jak drżenie łap, ogona itp.) trwa około 3 min21.
  15. Otwórz drzwiczki urządzenia obrazującego, włącz przepływ anestetyku do komory obrazowania i jednocześnie wyłącz go w komorze indukcyjnej.
  16. Umieść każdą mysz w pozycji stożków nosowych: od myszy 1-3, od lewej do prawej strony. Delikatnie ułóż myszy stroną brzuszną do góry w obszarze obrazowania wskazanym przez laser. Podczas układania zweryfikuj ID i pozycję myszy. Nie wprowadzaj na siłę częściowo znieczulonych myszy do stożków nosowych.
  17. Umieść slajdy oddzielające między myszami i zamknij drzwiczki urządzenia obrazującego.
  18. Dostosuj ustawienia akwizycji w oknie oprogramowania Acquisition window w następujący sposób:
    1. Dla myszy niezainfekowanych: Exposure Time = 5 min / Binning = „large” lub „16”
      (najbardziej czuły matematycznie zestaw konfiguracji do ustalenia wartości progowych).
    2. Dla myszy zainfekowanych w modelu ostrym: Exposure Time = 2 min/ Binning = „medium” lub „4”.
    3. Dla myszy zainfekowanych w modelu przewlekłym: Exposure Time = 5 min/ Binning = „large” lub „16”.
  19. Zweryfikuj, czy wstrzyknięcie D-lucyferyny odbyło się co najmniej 10 min przed rozpoczęciem akwizycji. Jeśli nie, odczekaj niezbędny czas, aby uzyskać obrazy podczas szczytu sygnału lucyferazy (Rycina 1B); w przeciwnym razie kliknij Acquire, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
  20. Po rozpoczęciu obrazowania pojawi się okno Image Labels. Wypełnij pola odpowiednimi informacjami o każdej grupie, w tym czasem wstrzyknięcia lucyferyny, eksperymentem, identyfikacją myszy, punktem czasowym i wszelkimi innymi pożądanymi informacjami ułatwiającymi prowadzenie dokumentacji. Informacje te zostaną zawarte w pliku z tabelą pomiarów.
  21. Sprawdź, czy na końcu akwizycji obrazu wyświetla się ostrzeżenie Saturated Image. Obrazy nasycone są nieakceptowalne. Jeśli tak się stanie, zmniejsz binning i wykonaj nowy obraz. Zanotuj to do późniejszej analizy.
  22. Po uzyskaniu obrazu otwórz drzwiczki urządzenia obrazującego i odwróć myszy na grzbiet (stroną grzbietową do góry). Powtórz akwizycję i odpowiednio ją opisz.
  23. Po zakończeniu tej akwizycji obrazowania wyłącz przepływ anestetyku. Delikatnie wyjmij myszy z komory obrazowania i umieść je w pojemniku.
  24. Zapisz masę ciała myszy, obserwując ich wybudzanie z anestezji. Zapisz wszelkie nieprawidłowe zachowania lub anomalie w budowie ciała stwierdzone podczas procedury. Gdy myszy zaczną się poruszać, umieść je w klatkach.
    UWAGA: Zweryfikuj intensywność BLI dla każdego uzyskanego obrazu. Po zakończeniu akwizycji zarejestrowany obraz bioluminescencyjny i fotografia zostaną wyświetlone w oprogramowaniu z automatyczną skalą, której nie należy brać pod uwagę. Ustaw skalę zdefiniowaną w analizie danych (opisaną poniżej) w oknie Tool Palette.

6. Analiza danych

UWAGA: Powyższy protokół opiera się na komercyjnym oprogramowaniu do obrazowania in vivo. Jednakże wersja nie wymagająca licencji oprogramowania może być wykorzystana do przeprowadzenia najbardziej podstawowej analizy. Szczegółowe informacje na temat oprogramowania znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Otwórz pliki.
    1. Otwórz folder zawierający dane pozyskane z określonego punktu czasowego obrazowania, wybierając Menu Plik > Przeglądarka > Wybierz folder (Rysunek 2A - Krok 1).
      UWAGA: Otworzy się nowe okno w formacie tabeli ze wszystkimi nabytymi danymi zapisanymi w wybranym pliku. Zostaną w nim wyświetlone Liczba kliknięć oznaczenie, którym jest identyfikator obrazu automatycznie nadawany przez oprogramowanie (numery daty i godziny), informacje podane przez badacza w Etykiety obrazów okno podczas akwizycji oraz ustawienia akwizycji. Wszystkie te dane pomagają w sortowaniu obrazów, które mogą zostać wykorzystane w analizie, biorąc pod uwagę, że obrazy nasycone nie mogą być użyte.
    2. Wybierz wiele wierszy powiązanych z wybranymi obrazami, w tym kontrole nie Zainfekowane. Zapisz identyfikator obrazu w notatniku laboratoryjnym wraz z informacjami zarejestrowanymi podczas sesji obrazowania.
    3. Złóż wybrane obrazy, klikając w Załaduj jako grupęTa procedura tworzy nowy obraz sekwencji. Dzięki temu możliwe jest jednoczesne dostosowanie parametrów dla wszystkich obrazów. Nowy obraz sekwencji należy zapisać w nowym folderze, innym niż ten użyty w kroku 6.1, aby ułatwić ponowną analizę surowych danych w razie potrzeby.
    4. Na obrazie sekwencyjnym zidentyfikuj binning zastosowany dla każdego obrazu, klikając na Opcje > Wyświetlanie > Wybierz czynnik grupowania (binning factor) (Rycina 2A - Krok 2). Uzyskany współczynnik binningu zostanie wyświetlony w górnej części każdego obrazu w sekwencji.
    5. Ujednolic wszystkie czynniki binningu do tej samej wartości. Aby to zrobić, należy dwukrotnie kliknąć obraz, który ma zostać dostosowany. Na Paleta narzędzi okno > Korekta obrazu sekcja, wybierz odpowiedni czynnik binningu (Rysunek 2A - Krok 3) – wybór współczynnika binningu opisano w kroku 5.18. Wykonaj tę procedurę dla wszystkich obrazów zbieżnych.
      UWAGA: Niniejsza procedura ma bezpośredni wpływ na kwantyfikację BLI (Tabela 1) i zostanie w niej szerzej omówione w sekcji Dyskusja.
  2. Ustaw skalę.
    1. Odróżnić wiarygodny sygnał bioluminescencyjny (powyżej 600 zliczeń zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia) w oparciu o kontrolę niezinfekowaną. W tym celu należy dwukrotnie kliknąć obraz myszy niezinfekowanych. Następnie w lewym górnym rogu nowego okna należy wybrać opcję Zliczenia w Jednostki pole. Następnie wyregulować Skala kolorystyczna dla wartości minimalnej wynoszącej 600. Otrzymany obraz będzie stanowił punkt odniesienia do ustawienia minimalnej skali radiancji.
    2. Przy aktywnym oknie sekwencji wybierz opcję Promienistość w Jednostki pole. Dostosuj Skala kolorystyczna i Tabela kolorów w Paleta narzędziW tym celu odznacz pole wyboru. Indywidualny w Zakresy skali kolorystycznej obszar
    3. Zaznacz pola Skala logarytmiczna i Podręcznik (Rycina 2A - Krok 4). Ustaw minimalne wartości skali zgodnie z kontrolą niezinfekowaną (zgodnie z obserwacją w kroku 6.8), a obszar o najwyższym sygnale jako wartość maksymalną (jak pokazano w Rycina 2A (wskazane strzałkami).
      UWAGA: Pomiar światła 2D in vivo jest kwantyfikacją względną. Różne wartości skali mogą wynikać z różnic w wersjach i kalibracji poszczególnych urządzeń. W związku z tym wartości przedstawione w wynikach reprezentatywnych mogą nie być zgodne z innymi eksperymentami wykonanymi na innych urządzeniach, a mimo to pozostawać równie poprawne w odniesieniu do kontroli wewnętrznych (niezainfekowanych oraz zainfekowanych i nieleczonych).
    4. Po ustawieniu tej samej skali dla wszystkich obrazów, należy dwukrotnie kliknąć każdy z nich, zmaksymalizować okno, a następnie wyeksportować widok obrazu w formacie graficznym (.jpg, .tiff itp.), korzystając z Eksport grafiki przycisk, nazywając pliki przez leczenie_IDmyszy_punktczasowy. (Rycina 2A - Krok 5). Powtórz tę procedurę dla wszystkich obrazów.
  3. Wykonaj pomiary.
    1. Wybierz dowolny obraz z sekwencji i kliknij go dwukrotnie. Na Paleta narzędzi okno > ROI (obszar zainteresowania) sekcja narzędzia, kliknij w Kwadrat przycisk (Rysunek 2B- Krok 1) i narysować prostokąt obejmujący całą mysz.
    2. Kliknij krawędź utworzonego ROI, a następnie skopiuj i wklej ten sam ROI dla każdej myszy (w wyniku czego na obrazie znajdą się trzy ROI). Zapisz ROI, klikając przycisk zapisu w Sekcja narzędzi ROIZastosuj zapisane ROI dla wszystkich obrazów, zaznaczając odpowiednie pole. Zastosuj do sekwencji, a następnie kliknij Załaduj. Zapisane ROI będą wykorzystywane dla wszystkich myszy w całym eksperymencie.
    3. Dostosuj pozycję ROI dla każdej myszy, aby zwierzę lepiej mieściło się w obszarze pomiarowym. Po oznaczeniu wszystkich myszy kliknij w Pomiar ROI przycisk (Rycina 2B- Krok 2). Tabela pomiarów ROI pojawi się. Wybierz Typy pomiarów: Promienistość; Atrybuty obrazu: Wszystkie możliwe wartości; Wymiary ROI: cmNastępnie kliknij w Zaznacz wszystko przycisk, a następnie Kopia przycisk
    4. Wklej dane bezpośrednio do oprogramowania do analizy tabel (arkusza kalkulacyjnego). Alternatywnie wyeksportuj plik w formacie .csv lub .txt.
  4. Przetwarzanie danych.
    1. W oprogramowaniu do analizy tabel zorganizuj dane według grup (grupa traktowana, grupa kontrolna niezakażona, grupa nietraktowana itp.).
    2. Obciążenie pasożytami przedstawiono jako bioluminescencję całego ciała. Należy zatem zestawić dane dotyczące wartości całkowitego strumienia (Total Flux) z grzbietowej i brzusznej strony ciała tych samych myszy, a następnie je zsumować.
    3. Oblicz średnią i odchylenie standardowe sumarycznych wartości z uwzględnieniem każdej grupy (np. Tabela uzupełniająca 1). Wprowadź dane do oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej.
    4. Przygotuj panel z obrazami bioluminescencyjnymi w programie do edycji obrazów lub prezentacji slajdów. Umieść każdą mysz w osobnej kolumnie, a każdy punkt czasowy w osobnym wierszu, aby stworzyć macierz skuteczności leku, co ułatwi wizualizację i interpretację danych.
      UWAGA: Istnieje możliwość bezpośredniego importu obrazów do oprogramowania do analizy obrazu z pominięciem kroku 6.2.4 (Widok > Okno układu obrazu). Jednak interfejs i narzędzia oprogramowania ograniczają możliwości organizacji danych.

Analiza obrazowania in vivo, dane luminescencyjne, interfejs oprogramowania, schemat, mapowanie natężenia światła.
Rysunek 2: Etapy analizy danych od ustawienia skal obrazu po kwantyfikację luminescencji. (A) Widok oprogramowania Living Image do przetwarzania danych obrazowych. Krok 1: Prześlij uzyskane dane jako sekwencję za pomocą narzędzia Browser. Krok 2: Zidentyfikuj binning zastosowany dla każdego pomiaru (pojawi się on nad poszczególnymi obrazami). Krok 3: Ustaw dla wszystkich obrazów myszy zainfekowanych ten sam współczynnik binningu i zastosuj współczynnik binningu 16 dla myszy niezainfekowanych. Krok 4: Ustaw skalę kolorów ręcznie w oparciu o myszy niezainfekowane (fioletowa strzałka), które powinny być widoczne na ekranie jako niebioluminescencyjne, oraz myszy zainfekowane i nieleczone w obszarach najwyższych ognisk bioluminescencji (czerwona strzałka), które powinny być widoczne jako czerwone. Krok 5: Aby uzyskać obraz pozbawiony wszelkich informacji tekstowych, kliknij dwukrotnie każdy obraz i wyeksportuj go za pomocą przycisku Export Graphics. (B) Widok narzędzi do wyznaczania obszarów zainteresowania (ROI). Krok 1: Narysuj ROI pokrywające w całości mysz, a następnie skopiuj i wklej to samo ROI dla każdego zwierzęcia. Zapisz dostosowane ROI i zastosuj je do wszystkich obrazów w eksperymencie. Krok 2: Kliknij przycisk Measure ROIs, aby wygenerować tabelę do eksportu w formacie .csv lub .txt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

7. Procedura ex vivo

  1. Wstrzyknij 150 mg/kg D-lucyferyny i.p. myszy (jedna na rundę ex vivo) i odczekaj 3 min. Zanurz myszy w narkozie, stosując 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny i.p.
  2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, gdy mysz przestanie reagować na uciśnięcie łap, nacinaj skórę myszy, aby odsłonić otrzewną (bez otwierania jamy otrzewnej) oraz tkankę pachową po lewej stronie. Przeprowadź upuszczenie krwi poprzez przecięcie tętnicy i naczynia pachowego.
  3. Zbierz krew za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Następnie przeprowadź perfuzję 10 mL roztworu 0,3 mg/mL D-lucyferyny w DPBS przez lewą komorę serca.
  4. Rozłóż wybrane organy w wyznaczonych miejscach na szalce Petriego i namocz je w roztworze 0,3 mg/mL d-lucyferyny. Procedurę tę należy przeprowadzić w ciągu maksymalnie 30 min.
  5. Wykonaj obrazowanie luminescencyjne wyciętych organów (serca, płuc, grasicy, wątroby, mięśnia czworogłowego uda, krezki, śledziony, nerki, nadnerczy, tłuszczu trzewnego, przełyku, żołądka, jelita cienkiego, kątnicy, jelita grubego, mózgu, tłuszczu podskórnego, macicy, tłuszczu gonadalnego, pęcherza moczowego i błony otrzewnej), stosując czas ekspozycji 5 min i binning 16, w zależności od intensywności sygnału (obrazy przesycone są niedopuszczalne)22.
    UWAGA: Tę samą procedurę należy przeprowadzić u myszy niezinfekowanej przed myszami zinfekowanymi w celu ustalenia progu detekcji.

Wyniki

Wykorzystując odpowiedni model mysi oparty na pasożytach transgenicznych, które konstytutywnie wykazują ekspresję lucyferazy, możliwe jest odtworzenie kluczowych cech infekcji T. cruzi u ludzi przy minimalnym uszczerbku dla gospodarza, co pozwala na monitorowanie pasożytów w czasie rzeczywistym za pomocą BLI całego ciała gospodarza w sposób podłużny (przez całe życie), przez okres do kilku miesięcy12.

Rycina 3 przedstawia eksperyment pilotażowy obrazujący przebieg czasowy infekcji szczepem CL Brener Luc::Neon od 1. dnia po infekcji do 150 dpi u myszy BALB/c. W ciągu pierwszych 20 dpi obciążenie pasożytami wnioskowane z bioluminescencji wzrasta, co jest typowe dla szczytu parasitemii, po czym następuje gwałtowny spadek ładunku pasożytów wynikający z kontroli immunologicznej organizmu myszy. W związku z tym fazę ostrą infekcji uznaje się za pierwsze 50 dpi. Fazę przewlekłą definiuje się jako okres, w którym infekcja osiąga stałe tempo bioluminescencji, od 100 do 150 dpi.

Badanie przewlekłej infekcji, obrazowanie bioluminescencyjne, wykres strumienia; analiza progresji infekcji.
Rycina 3: Zrozumienie modelu. Kinetyka infekcji Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon u myszy BALB/c (n = 11). Górny panel: brzuszne i grzbietowe obrazy bioluminescencyjne z różnych punktów czasowych przez 150 dni po infekcji (dpi) przy użyciu 1 x 10³ trypomastigot krwiobiegu podanych w iniekcji domięśniowej. Skala mapy cieplnej (w Log10) sygnału bioluminescencyjnego w jednostkach promieniowania (p/s/cm2/sr). Kod kolorystyczny: fioletowy = 5 x 103; czerwony = 1 x 107. Dolny panel: kwantyfikacja sygnału bioluminescencyjnego w całkowitym strumieniu Total Flux (p/s) całego ciała myszy. Dane przedstawiono jako średnie (linie) i odchylenia standardowe (obszary zacieniowane). Okresy zdefiniowane dla fazy ostrej i przewlekłej infekcji w tym modelu mysim są wyróżnione na pomarańczowo. Średnie wartości luminescencji myszy niezinfekowanych (n = 3) przedstawiono jako próg (jasnoszara linia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Można również przewidzieć wyniki terapeutyczne, ponieważ główne fazy infekcji są dobrze odwzorowane w modelu mysim. W związku z tym BLI jest obecnie stosowane w nauce translacyjnej w ramach badań typu proof-of-concept, które wspierają podejmowanie decyzji dotyczących potencjalnej skuteczności związków i ich postępów w procesie opracowywania leków10,27. W ostrym modelu mysim leczenie doustne powinno rozpocząć się, gdy infekcja osiągnie szczyt parasytemii (około 14-21 dpi), co charakteryzuje się wysoką liczbą trypomastigotes w krwiobiegu (około 1 x 105 trypomastigotes/mL – dane nie pokazano) i infekcją systemową. W fazie przewlekłej leczenie myszy rozpoczyna się w 100 dpi, kiedy obciążenie pasożytami jest znacznie niższe, przy stabilnej subpatentnej parasytemii.

Aby zademonstrować zastosowanie opisanego powyżej protokołu w ocenie środków przeciwpasożytniczych, porównaliśmy skuteczność terapeutyczną benznidazolu (BZ), standardowego leku stosowanego w leczeniu choroby Chagasa, oraz posakonazolu (Posa), inhibitora sterolowej 14α-demetylazy (CYP51), który nie przyniósł oczekiwanych rezultatów w badaniach klinicznych nad chorobą Chagasa i który okazał się nieskuteczny jako środek przeciwpasożytniczy przeciwko T. cruzi in vitro oraz in vivo, w tym w modelu BLI opisanym w niniejszym protokole13,18,28,29,30.

W ostrym modelu mysim kohorty po 6 myszy w grupie otrzymywały doustnie przez gavage31 przez 20 dni Posa w dawce 20 mg/kg lub BZ w dawce 100 mg/kg, raz dziennie. Myszy leczono również BZ przez 5 dni w dawce 100 mg/kg raz dziennie, aby ocenić efekt krótkotrwałego leczenia. Po eliminacji związku (10 dni po zakończeniu leczenia) myszy u których nie stwierdzono sygnału BLI poddano immunosupresji – warunkowi, który sprzyja nawrotowi infekcji, gdy nie osiągnięto wyleczenia parazytologicznego (Rycina 4A). Leczenie Posa spowodowało redukcję obciążenia pasożytami wnioskowaną z bioluminescencji o 99,49% ± 0,27% (średnia ± odchylenie standardowe) na koniec leczenia; poziomy te pozostały zbliżone do poziomu myszy niezainfekowanych podczas okresu eliminacji związku (z wyjątkiem myszy nr 3, z przejściowym sygnałem w 40 dpi, oraz myszy nr 2, która wykazała słabą plamkę BLI w 44 dpi). W porównaniu z grupą nieleczoną, 20-dniowe leczenie BZ zredukowało obciążenie pasożytami wnioskowane z bioluminescencji o 100% ± 0,01% na koniec leczenia. Z kolei krótkotrwałe leczenie BZ przez 5 dni doprowadziło do redukcji o 99,98% ± 0,03% w 19 dpi (poziom zbliżony do progu detekcji). Jednak w tym przypadku redukcja BLI była przejściowa i w kolejnych pomiarach u wszystkich myszy wystąpiła reaktywacja infekcji (Rycina 4B).

Oś czasu i dane modelu ostrego CD; zakażenie, leczenie; wyniki eksperymentalne; schemat, wykresy.
Rycina 4: Projekt eksperymentu typu proof-of-concept oraz wyniki uzyskane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego w ostrym modelu choroby Chagasa. (A) Schematyczny wykres przebiegu czasowego w mysim modelu ostrej choroby Chagasa w badaniach przedklinicznych służących do oceny skuteczności związku. Czarne kropki: punkty czasowe obrazowania. Kolba z lekiem i pomarańczowy pasek: odpowiednio początek i koniec leczenia. Ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu. dpi: dzień po zakażeniu. Kod kolorów: szary = zakażenie bez leczenia; pomarańczowy = okres leczenia; niebieski = faza eliminacji związku; żółty = okres immunosupresji. (B) Przebieg czasowy leczenia Trypanosoma cruzi. Panel lewy: brzuszne obrazy bioluminescencyjne myszy BALB/c (i) nieleczonych lub leczonych przez 20 dni za pomocą (ii) posakonazolu (Posa) w dawce 20 mg/kg, (iii) benznidazolu (BZ) w dawce 100 mg/kg przez 20 dni oraz (iv) BZ w dawce 100 mg/kg przez 5 dni (n = 6/grupa). Wszystkie preparaty podawano doustnie za pomocą zgłębników (10 mL/kg) raz dziennie. Mapa ciepła w skali Log10 wskazuje intensywność sygnału bioluminescencyjnego od poziomu niskiego (niebieski) do wysokiego (czerwony). Wykres prawy: ilościowa ocena danych z obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała. Dane przedstawiono jako średnie (linie) i odchylenia standardowe (obszary zacieniowane). Legenda: Kolba z lekiem: początek leczenia (14 dpi); pomarańczowy pasek: koniec leczenia (18 dpi/33 dpi); ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu (od 44. do 53. dnia); pomarańczowa kropka: mysz analizowana procedurą ex vivo; § dane wykluczone ze względu na wyciek D-lucyferyny z moczem. (C) Procedura ex vivo służąca do wykrywania ognisk T. cruzi w organach i tkankach. Legenda rozkładu płytek znajduje się na dole rysunku (stworzono za pomocą BioRender.com: ZY26LG8AOF). Zastosowano tę samą skalę promieniowania, co w panelu in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

W tym modelu leczenie przeciwpasożytnicze może zredukować liczbę pasożytów poniżej granicy wykrywalności BLI wynoszącej 1000 pasożytów. W związku z tym myszy wydają się BLI-ujemne10. Aby upewnić się, że osiągnięto wyleczenie parasitologiczne, konieczne jest wywołanie immunosupresji u myszy poprzez podanie cyklofosfamidu29,32. Myszy, które po leczeniu farmakologicznym nadal mają niewykrywalną liczbę pasożytów, staną się BLI-dodatnie po immunosupresji. Efekt ten jest wyraźniej widoczny przy leczeniu Posa w modelu ostrym, które sprzyja nawrotom pasożytów. W tym eksperymencie procedurę ex vivo przeprowadzono u myszy z najniższym sygnałem bioluminescencyjnym w celu oceny tropizmu tkankowego pasożytów (Rycina 4C). Myszy nieleczone wykazują silne sygnały bioluminescencyjne, zwłaszcza w przewodzie pokarmowym (TGI) i tkankach powiązanych, takich jak tłuszcz trzewny i krezka. Ponadto skóra była miejscem związanym z przetrwaniem pasożytów. Myszy leczone Posa wykazały punkty bioluminescencyjne o niższej intensywności, które były bardziej ograniczone do okrężnicy, krezki i tłuszczu trzewnego. Z kolei u myszy leczonych zgodnie z kuracyjnym schematem leczenia, takim jak BZ 100 mg/kg przez 20 dni, nie wykryto sygnału bioluminescencyjnego nawet w warunkach immunosupresji. Dlatego, biorąc pod uwagę wywołanie warunków sprzyjających wzrostowi sygnału bioluminescencyjnego powyżej poziomu progowego 1000 pasożytów10 oraz zwiększenie czułości poprzez odsłonięcie narządów trzewnych, uznaje się, że BZ 100 mg/kg przez 20 dni zapewnia całkowite wyleczenie. Ocena całkowitego wyleczenia została wcześniej zwalidowana za pomocą różnych technik10,13,17,33,34.

Podobny schemat badania zastosowano w modelu przewlekłym (Rycina 5A), w którym myszy (n = 6/grupa) zaczęto leczyć w 100. dniu po zakażeniu. W tym momencie podawano doustnie raz dziennie przez 20 dni Posa w dawce 20 mg/kg, BZ w dawce 100 mg/kg lub 10 mg/kg. Po okresie eliminacji leku myszy z ujemnym wynikiem BLI poddano immunosupresji. Ponadto, w celu oceny całkowitego wyleczenia, myszy, które nadal pozostawały BLI-ujemne po zakończeniu fazy immunosupresji, poddano analizie ex vivo.

W przypadku infekcji przewlekłej leczenie Posa w dawce 20 mg/kg doprowadziło do spadku obciążenia pasożytami, wywnioskowanego z bioluminescencji, o 95,03% ± 6,18% pod koniec leczenia, a poziomy te pozostały zbliżone do poziomu u myszy niezainfekowanych podczas okresu eliminacji leku. Po immunosupresji u większości myszy zaobserwowano zmienny poziom i rozkład sygnału BLI (Rysunek 5B). Procedura ex vivo wykazała, że jedna mysz z ujemnym wynikiem BLI całego ciała, leczzona Posa, posiadała bioluminescencyjną plamkę w jelicie grubym, którą wykryto podczas badania ex vivo (Rysunek 5C).

Oś czasu chronicznego modelu CD, obrazowanie bioluminescencyjne, efekty leczenia, wyniki eksperymentu zakażeniowego.
Rycina 5: Projekt eksperymentu oceny leków i wyniki uzyskane w chronicznym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. (A) Schemat projektu eksperymentu w mysim modelu chronicznej choroby Chagasa. Czarne kropki: punkty czasowe obrazowania. Kolba z lekiem i pomarańczowy pasek: odpowiednio początek i koniec leczenia. Ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu. Dpi: dzień po zakażeniu. Kod kolorystyczny: szary = zakażenie bez leczenia; pomarańczowy = okres leczenia; niebieski = faza eliminacji związku; żółty = immunosupresja; liliowy = nawrót. (B) Podłużna ocena skuteczności leczenia w chronicznym modelu choroby Chagasa. Panel lewy: brzuszne BLI myszy BALB/c (i) nieleczone lub leczone przez 20 dni za pomocą (ii) posakonazolu (Posa) w dawce 20 mg/kg; (iii) benznidazolu (BZ) w dawce 100 mg/kg oraz (iv) BZ w dawce 10 mg/kg (n = 6/grupa). Wszystkie leki podawano doustnie przez zgłębnik raz dziennie. Wykres prawy: suma surowych danych całkowitego strumienia z części brzusznej i grzbietowej. Legenda: kolba z lekiem: początek leczenia (102 dpi); pomarańczowy pasek: koniec leczenia (121 dpi); żółty pasek i ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu (od dnia 131-142). Pomarańczowa kropka: mysz analizowana procedurą ex vivo. ! mysz padła podczas znieczulenia. Równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, ilustrujący równowagę sił, kluczowy w edukacji z zakresu fizyki i inżynierii. Mysz wykazuje nieprawidłowości w obrębie jamy brzusznej. Skala mapy ciepła (Log10) wskazuje intensywność bioluminescencji w jednostkach promieniowania od poziomu niskiego (3 × 105 jako kolor niebieski) do wysokiego (1 × 107 jako kolor czerwony). (C) Analiza ex vivo tropizmu T. cruzi w tkankach. Detekcja bioluminescencji w wyciętych organach od myszy z immunosupresją, u których BLI in vivo było ujemne po leczeniu Posa oraz BZ w dawce 100 mg/kg, lub od myszy z najniższym sygnałem w grupach nieleczonych i leczonych BZ w dawce 10 mg/kg. Legenda rozmieszczenia na płytce znajduje się na dole ryciny (stworzono w BioRender.com: ZY26LG8AOF). Skala promieniowania jest taka sama jak w panelu in vivo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Leczenie BZ w dawce 100 mg/kg zredukowało bioluminescencję do poziomów progowych (93,87% ± 2,14%) w 122 dpi oraz w dalszej kolejności aż do końca eksperymentu. W analizie ex vivo BZ osiągnął wskaźnik wyleczenia na poziomie 100% (6/6 myszy), ponieważ u żadnej z myszy nie stwierdzono powrotu sygnału bioluminescencyjnego, nawet po immunosupresji i przebadaniu organów wewnętrznych. Oznacza to brak nawrotu choroby. Niemniej jednak, schemat leczenia BZ z zastosowaniem niższej koncentracji doprowadził do niewielkiej redukcji bioluminescencji (85,95% ± 18,43%), ale nie przyniósł wyleczenia, gdyż u myszy nadal wykrywalne były ogniska sygnału bioluminescencyjnego we wszystkich kolejnych punktach czasowych. Zatem model ten pozwala na ilościowe rozróżnienie między terapiami nieskutecznymi (posakonazol i podoptymalne leczenie benznidazolem) a terapiami skutecznymi (optymalne dawkowanie i czas trwania leczenia benznidazolem).

Rycina uzupełniająca 1: Analiza przedinfekcyjna ekspresji lucyferazy w populacji T. cruzi poprzez pomiar fluorescencji genu raportującego mNeonGreen. Cytometria przepływowa białka fluorescencyjnego mNeonGreen konstytutywnie ekspresowanego przez pasożyta CL Brener Luc::Neon. Znormalizowany histogram liczby pasożytów (oś Y) w zależności od intensywności fluorescencji mNeonGreen (oś X). Legenda wewnętrzna przedstawia analizowany szczep i formę, medianę fluorescencji oraz procent populacji fluorescencyjnej. Linie bramkowania określono na podstawie szczepu typu dzikiego (WT) CL Brener jako kontroli niefluorescencyjnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przykład tabeli analizy w pomiarze BLI. Surowe dane uzyskane z kwantyfikacji obrazowania bioluminescencyjnego w 19. dniu po zakażeniu w modelu ostrym, wykorzystane w reprezentatywnych wynikach przedstawionych na Ryc. 4B. Opis grup: Kontrola jako myszy niezakażone (n = 3/grupa); nośnik jako zakażone myszy nieleczone; posakonazol (Posa) w dawce 20 mg/kg przez 20 dni; benznidazol (BZ) w dawce 100 mg/kg przez 20 dni; BZ w dawce 100 mg/kg przez 5 dni (n = 6/grupa). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obrazowanie bioluminescencyjne to przełomowa metoda, która pozwala na wykrycie genu raportowego za pomocą widma promieniowania elektromagnetycznego w zakresie widzialnym i podczerwonym. W związku z tym nie ma potrzeby stosowania znakowanych radioizotopem, aby śledzić próbkę35. BLI nadaje się dla modeli gryzoni i innych małych gatunków. Jest bardzo przydatny w badaniach przedklinicznych, ponieważ jest bezpieczniejszy i pozwala na kilka rund obrazu, powodując minimalny dyskomfort zwierząt. Poza tym obrazowanie in vivo jest bardzo elastyczne ze względu na możliwość łączenia bioluminescencji, fluorescencji i innych technik, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna36.

Obrazowanie optyczne zależy od optycznych właściwości fizycznych, takich jak absorpcja i rozpraszanie. Wszystkie tkanki w różny sposób absorbują i rozpraszają światło o różnych długościach fal37. Jednym z krytycznych kroków jest wybór genu reporterowego bez uwzględnienia emitowanej długości fali światła wytwarzanego w wyniku reakcji chemicznej. Podczas gdy poziom ekspresji genu reporterowego może być wysoki in vitro w testach bioluminescencyjnych, te same poziomy ekspresji mogą nie zostać osiągnięte w przypadku przejścia do warunków in vivo. W tym protokole użyliśmy przesuniętej ku czerwieni wersji kodonu Photinus pyralis lucyferazy (PpyRE9H)38 dla trypanosomatydów9, która emituje światło o długości fali 617 nm, co jest jednym z najbardziej odpowiednich do badań in vivo 39. Długości fal dłuższe niż 600 nm są mniej absorbowane i rozpraszane przez endogenne chromofory organizmu, zwłaszcza hemoglobinę i melaninę. W ten sposób czerwone światło może być przenoszone przez kilka centymetrów tkanki, dzięki czemu fotony docierają do kamery CCD nawet z wnętrza tkanek trzewnych39,40.

Jednym z obszarów budzących obawy w ustawieniach obrazowania jest brak kompleksowego zrozumienia ich funkcji i efektów. Binning, technika wstępnego przetwarzania, łączy informacje uzyskane przez sąsiadujące ze sobą detektory w większy piksel. Proces ten zwiększa stosunek sygnału do szumu, redukując szumy tła i poprawiając czułość. Zmniejsza to jednak dokładność rozdzielczości przestrzennej, co skutkuje pikselowaniem obrazu 41,42. Ten kompromis jest ważnym czynnikiem w strategii obrazowania.

Opierając się na Docelowym Profilu Produktu i Profilu Kandydata Docelowego dla choroby Chagasa34, badanie potwierdzające słuszność koncepcji koncentruje się na czułości wykrywania T. cruzi i pomaga ustalić, czy nowy kandydat na lek może osiągnąć sterylne wyleczenie (reprezentowane przez brak nawrotu po kilku rundach immunosupresji). W związku z tym BLI wykonujemy przy użyciu najwyższego współczynnika binningu bez przesycania obrazu. Gdy obraz ulega przesyceniu, wykonywana jest nowa akwizycja przy użyciu niższego współczynnika kategoryzacji. Podczas analizy do obrazów, które wymagały innego kategoryzacji, stosowana jest korekta matematyczna. W ten sposób końcowe dane powinny być prezentowane przy użyciu tego samego kategoryzacji. W tabeli 1 przedstawiono różne wartości uzyskane po zastosowaniu charakterystycznych współczynników kategoryzacji na tym samym obrazie i ROI.

Tabela 1: Wpływ ustawień kategoryzacji na kwantyfikację BLI. Kwantyfikacja trzech ROI na obrazie modelu ostrego (d13) i modelu przewlekłego (d118), analizowanych w różnych czynnikach kategoryzacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Ze względu na obecny scenariusz choroby Chagasa w klinice, wysiłki związane z odkrywaniem leków mają na celu całkowite wyeliminowanie pasożytów (leczenie parazytologiczne)27,34. W związku z tym protokół przedkliniczny in vivo obejmuje podejścia, które przezwyciężają ograniczenia technicznej wrażliwości BLI. Jednym z podejść jest leczenie myszy cyklofosfamidem w celu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej, która kontroluje obciążenie pasożytami. Inną strategią jest zmniejszenie głębokości tkanki i usunięcie warstw mięśni, skóry i futra, które blokują drogę światła do kamery. Dzięki procedurze ex vivo można wykryć małe plamki bioluminescencyjne, ujawniające ogniska pasożyta poniżej progu BLI in vivo, jak pokazano na rycinie 5C w wyniku ex vivo myszy leczonej Posa.

Zaprojektowanie eksperymentu pilotażowego w celu oceny samego modelu i dynamiki infekcji ma kluczowe znaczenie dla ustalenia dokładnego eksperymentu do oceny skuteczności leków przeciwpasożytniczych. Dzięki temu badacz będzie mógł z wyprzedzeniem określić odpowiednie ustawienia BLI i przebieg czasu infekcji. W eksperymencie eksploracyjnym jednym z narzędzi, które może być pomocne w definiowaniu ustawień akwizycji, jest "Autoekspozycja". Za pomocą tego narzędzia badacz ustala priorytet trzech ustawień (czas ekspozycji, Binning i F/Stop), aby uzyskać najlepszy możliwy obraz. W szczególności badacz powinien upewnić się, że obrazy są rejestrowane w zakresie dynamicznym kamery CCD, bez przesycenia lub niedoświetlenia, co można sprawdzić za pomocą minimalnych i maksymalnych limitów skali oraz funkcji automatycznej ekspozycji ( Menu Edytuj > Preferencje > Tab Akwizycja > Tab Automatyczna ekspozycja). W tym protokole przysłona aparatu została ustawiona na maksymalną wartość (F/Stop: 1), a dla modeli ostrych i przewlekłych zdefiniowano różne czasy ekspozycji i współczynniki kategoryzacji. Te ustawienia zapewniają przewidywalność w czasie, aby jednocześnie wykonywać różne rundy obrazu. Biorąc pod uwagę, że metoda reporterowa opiera się na reakcji enzymatycznej, zarówno biodystrybucja substratu do myszy, jak i kinetyka lucyferazy wpływają na sygnał bioluminescencyjny, a tym samym na kwantyfikację infekcji (Figura 1B). W związku z tym pozyskiwanie obrazów w różnych momentach kinetyki enzymatycznej wprowadza zmienność danych, której nie można uwzględnić ani skorygować, i wpływa na obliczenia całkowitego strumienia (fotony/sekundę) lub radiancji (fotony/sekunda/cm2/steradian). Poza tym zakażenie T. cruzi wykazuje dynamiczne pozycjonowanie przestrzenne u myszy (różne obszary i tkanki, głębokość i obciążenie pasożytami). W związku z tym ustalenie wartości zliczeń do pozyskania może pominąć słabsze źródła sygnału (mała liczba pasożytów w określonym miejscu głębiej tkanki), jeśli źródło innego silniejszego sygnału spełnia określone kryteria automatycznej ekspozycji.

Trudną funkcją oprogramowania Living Image jest wyświetlanie uzyskanego obrazu w automatycznej skali kolorów. Nie ma możliwości wstępnego ustawienia skali, aby automatycznie wyświetlała zupełnie nowy uzyskany obraz zgodnie z wybranymi wartościami skali (patrz krok 6.2 protokołu). Taka sytuacja zmusza badacza do ręcznej zmiany obrazów jeden po drugim na wybrane wartości max i min. W konsekwencji niedoświadczeni i niezbyt dobrze przeszkoleni użytkownicy nie mają odpowiedniego odczytu podczas sesji akwizycyjnej i mogą w tym momencie wprowadzić dane w błąd lub stracić ważne informacje. W tym celu korzystny jest eksperyment pilotażowy.

Jednym z najczęstszych pytań dotyczących projektu eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji jest to, jak wybrać czas trwania leczenia i dawkę. W przypadku nowych jednostek chemicznych parametry te są zwykle definiowane przez siłę działania i selektywność związku in vitro, w połączeniu z danymi wygenerowanymi przez metabolizm i farmakokinetykę leków (DMPK) oraz badania tolerancji przeprowadzone przed badaniem skuteczności in vivo. Podsumowując, po zidentyfikowaniu związków, które są w stanie selektywnie zabijać pasożyta wewnątrz komórek, pierwsze eksperymenty ADME (wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie) są przeprowadzane in vitro w celu oszacowania m.in. rozpuszczalności w wodzie, przepuszczalności komórek i stabilności metabolicznej. Jeżeli związki wykazują dobrą równowagę właściwości in vitro (zwykle definiowanych w docelowych profilach kandydujących), wówczas kandydaci ci są przechodzili do badań farmakokinetyki in vivo (PK) na zdrowych myszach, które określają ekspozycję na związek we krwi (i być może również w tkankach) i dają ogólne pojęcie o tolerancji przy różnych poziomach dawek17, Lokal mieszkalny 34,43. W idealnej sytuacji celem oceny farmakokinetycznej w większości chorób zakaźnych jest określenie możliwości osiągnięcia stężeń wolnych w osoczu (skorygowanych o wiązanie z białkami osocza), które są wyższe od stężeń EC50/EC90 44 44 - skutecznego stężenia, które zabija lub przynajmniej hamuje wzrost odpowiednio 50% lub 90% pasożytów - przez wystarczająco długi okres czasu. Jeśli przy określonym poziomie dawki zostanie osiągnięta wystarczająca ekspozycja, wówczas schemat ten może być stosowany podczas badań skuteczności z wykorzystaniem modelu Chagasa BLI. W przypadku badań repozycji leków powinny być dostępne dane dotyczące farmakokinetyki in vitro i in vivo. Dobrym początkiem do reprofilacji leków są chemiczne bazy danych, takie jak PubChem45, które dostarczają uznanych danych, które można przekształcić w myszy za pomocą skalowania allometrycznego46 w celu oszacowania bezpiecznych i nietoksycznych schematów leczenia, które mają zostać przetestowane. Jednak nie zawsze tak jest. Badania farmakokinetyczne są nadal pomijaną dziedziną w naukach akademickich, a niewiele firm farmaceutycznych publikuje swoje wyniki badań farmakokinetycznych. Społeczność naukowa zajmująca się odkrywaniem leków zaleca włączenie oceny farmakokinetyki in vivo wraz z testami skuteczności leków (farmakodynamika)47. W związku z tym obrazowanie przedkliniczne jest kompatybilne z pomiarami złożonymi jednocześnie, a to powiązane podejście zwiększa niezawodność danych.

Ponadto obchodzenie się z myszami, ich waga i stan zdrowia są monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu. Oznaki toksyczności i skutki uboczne, takie jak garbienie się, drżenie, utrata równowagi, niechęć do poruszania się, niechęć do jedzenia lub picia, pokłony lub jakiekolwiek inne nieprawidłowości występujące w grupie lub u poszczególnych myszy, powinny być rejestrowane i zgłaszane w badaniach przedklinicznych. Jednym z celów obrazowania optycznego jest zapewnienie dobrostanu zwierząt. W związku z tym humanitarne punkty końcowe powinny być stosowane u myszy z objawami bólu opisanymi w skali grymasu48. Ponadto myszy były ważone co tydzień podczas pozyskiwania BLI i częściej podczas dawkowania leków i leczenia CTX. Zgodnie z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, myszy, które tracą więcej niż 20% masy ciała, muszą zostać natychmiast humanitarnie poddane eutanazji.

Model bioluminescencyjny T. cruzi jest obecnie najnowocześniejszym modelem eksperymentalnym służącym do odkrywania i opracowywania nowych metod leczenia choroby Chagasa. Model, który odtwarza kluczowe cechy infekcji T. cruzi i choroby Chagasa49, umożliwiając monitorowanie parazytemii w czasie rzeczywistym i różnicowanie związków o różnych profilach skuteczności związanych ze znanymi sposobami działania. BLI to technika, która zwiększa asertywność w identyfikacji zakażonych tkanek. Umożliwia precyzyjną selekcję zakażonych tkanek do wykorzystania w szerokim zakresie podejść, w tym we wszystkich klasycznych metodach już stosowanych w badaniach nad T. cruzi 50,51. Ponadto umożliwia naukowcom odkrywanie najnowocześniejszych technologii i opracowywanie nowych33. Ponadto BLI zapewnia jednocześnie poprawę dobrostanu zwierząt i bardziej racjonalne użytkowanie zgodnie z zasadami 3R10,35.

Kilka grup badawczych zajmujących się zaniedbanymi chorobami tropikalnymi umieszcza się w krajach, w których urządzenia do obrazowania in vivo są niedostępne. Aby przezwyciężyć obecny scenariusz, nowe międzynarodowe sieci, takie jak Global BioImaging i powiązane z nimi konsorcja, promują działania mające na celu zapewnienie otwartego dostępu do podstawowych obiektów obrazowania oraz poprawę szkolenia personelu i naukowców zajmujących się obrazowaniem52,53. Inicjatywy te, wraz z przyjaznymi protokołami dla użytkowników, takimi jak ten, mogą stworzyć warunki demokratyzujące zaawansowane technologie dla wszystkich badaczy. Wdrożenie tej metody w przedklinicznym odkrywaniu leku zapewniło solidny odczyt skuteczności i wartość predykcyjną wyników klinicznych, ułatwiając odkrycie leku na chorobę Chagasa.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Amandzie Franscisco, Johnowi Kelly'emu i Fanny Escudié za zapewnienie szkoleń BLI i wsparcia w testach skuteczności leków, Johnowi Kelly'emu i Simone Calderano za dostarczenie pasożytów, oraz Gabrielowi Padilli za wsparcie w badaniach na zwierzętach. A.C.S otrzymał stypendium CAPES PSDE na szkolenie w London School of Hygiene and Tropical Medicine (Wielka Brytania). Autorzy pragną również podziękować Platformie Badań nad Cytometrią Przepływową i Obrazowaniem (FLUIR) w Głównym Ośrodku Badań Naukowych - Uniwersytecie w Sao Paulo (CEFAP-USP) za wsparcie techniczne w analizie sprzętu IVIS Spectrum oraz Laboratorium Genetyki i Kontroli Sanitarnej ICB-USP za testy poeksperymentalne do kontroli jakości myszy jako wolnych od określonych patogenów. Ten projekt został sfinansowany przez DNDi. DNDi jest wdzięczne swoim darczyńcom, publicznym i prywatnym, którzy zapewnili finansowanie wszystkich działań DNDi od momentu powstania w 2003 roku. Pełna lista darczyńców DNDi znajduje się na stronie https://dndi.org/about/donors/.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD LSRFortessa&handel; Analizator komórek X-20BD Biosciences
Waga wagowa (zakład dla zwierząt)Dostępne u kilku dostawców
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemRevvity (dawniej PerkinElmer)
Oprogramowanie FlowJ v10.7.1BD Biosciences
Living Image Software dla Spectrum v4.7.1Revvity (dawniej PerkinElmer)Nielicencjonowane oprogramowanie analityczne o nazwie "Aura Imaging" może być używane do najbardziej podstawowych funkcji dostarczanych przez Spectral Instruments Imaging (firma Bruker) (https://spectralinvivo.com/software/)
Oprogramowanie Microsoft OfficeMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Low GlucoseVitrocellD0025
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761-500G
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco16000-044
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Trypsyna 0,5% EDTAGibco25300-062
LIT pożywkaIn dom
Hygromycyna B (50 mg/mL)Gibco10687010
Grace′ s Medium dla owadówSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-lucyferyna sól potasowaRevvity (dawniej PerkinElmer)122799Można również zastosować: VivoGlo Lucyferin, klasa in vivo (Promega/P1043); D-Lucyferyna, sól monopotasowa (Thermo Scientific/88293) lub PierceD-luciferin, sól monosodowa* (Thermo Scientific/88291); D-lucyferyna, sól potasowa (GoldBio/LUCK lub eLUCK); D-lucyferyna, sól sodowa* (GoldBio/LUCNA lub eLUCNA) *Różnice w soli sodowej lub potasowej mają minimalne szanse na rozpuszczalność, jednak nie wpływają na wydajność in vivo.
DPBSGibco21600-044
Cyklofosfamid (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hydroksypropylo)metyloceluloza (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
Alkohol benzylowySigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazolELEA
Posaconazol (preparat handlowy Noxafil)Schering-Phough
GiemsaDostępne u kilku dostawców
igła do zgłębnika (stal nierdzewna prosta) - 22GAAton  CA2003
Strzykawka 1 ml i igła 31GDostępne u kilku dostawców
Strzykawka 1 ml i wyjmowana igła 26GDostępne u kilku dostawców
Strzykawka 1 ml i wyjmowana igła 24G X¾Dostępne u kilku dostawców
Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; mDostępne u kilku dostawców
A4 Matowy papier 120 gr lub grubszyKolor papieru / Canson (dostępny u kilku dostawców)
folia aluminiowaDostępne u kilku dostawców
Komora NeubaueraDostępne u kilku dostawców

Bibliografia

  1. WHO fact sheet. Chagas disease (also known as American trypanosomiasis). WHO, World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease-(american-trypanosomiasis) (2023).
  2. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infect Dis. 13 (4), 342-348 (2013).
  3. Bern, C. Chagas' disease. N Engl J Med. 373 (5), 456-466 (2015).
  4. Shikanai-Yasuda, M. A., Carvalho, N. B. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis. 54 (6), 845-852 (2012).
  5. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Front Public Health. 7, 166(2019).
  6. Perez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  7. Field, M. C., et al. Anti-trypanosomatid drug discovery: An ongoing challenge and a continuing need. Nat Rev Microbiol. 15 (7), 447(2017).
  8. Kratz, J. M. Drug discovery for chagas disease: A viewpoint. Acta Trop. 198, 105107(2019).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl Trop Dis. 7 (11), e2571(2013).
  10. Lewis, M. D., Francisco, A. F., Taylor, M. C., Kelly, J. M. A new experimental model for assessing drug efficacy against Trypanosoma cruzi infection based on highly sensitive in vivo imaging. J Biomol Screen. 20 (1), 36-43 (2015).
  11. Costa, F. C., et al. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Negl Trop Dis. 12 (4), e0006388(2018).
  12. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  13. Francisco, A. F., et al. Limited ability of posaconazole to cure both acute and chronic Trypanosoma cruzi infections revealed by highly sensitive in vivo imaging. Antimicrob Agents Chemother. 59 (8), 4653-4661 (2015).
  14. du Sert, N. P., et al. The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Turner, P. V., Pekow, C., Vasbinder, M. A., Brabb, T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 614-627 (2011).
  17. Francisco, A. F., et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Sci Rep. 6, 35351(2016).
  18. Moraes, C. B., et al. Nitroheterocyclic compounds are more efficacious than CYP51 inhibitors against Trypanosoma cruzi: implications for Chagas disease drug discovery and development. Sci Rep. 4, 4703(2014).
  19. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  20. de Araújo-Jorge, T. C., de Castro, S. L. Chagas Disease: Manual for Animal Experimentation. , FIOCRUZ Publisher. Rio de Janeiro. (2000).
  21. JoVE. JoVE Science Education Database. Anesthesia Induction and Maintenance. JoVE. , (2023).
  22. Taylor, M. C., et al. Exploiting genetically modified dual-reporter strains to monitor experimental Trypanosoma cruzi infections and host-parasite interactions. Methods Mol Biol. 1955, 147-163 (2019).
  23. Keyaerts, M., et al. Inhibition of firefly luciferase by general anesthetics: effect on in vitro and in vivo bioluminescence imaging. PLoS One. 7 (1), e30061(2012).
  24. Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral Procedures in rice rats (Oryzomys palustris). J Am Assoc Lab Anim Sci. 58 (1), 40-49 (2019).
  25. GoldBio. GoldBio Luciferin In Vivo Handbook - a detailed method for Luciferin preparation and administration for model animals. GoldBio Protocol. , Available from: https://goldbio.com/documents/1068/Luciferin%20in%20vivo%20handbook.pdf (2013).
  26. Revity. Preparation of IVISbriteTM D-Luciferin for in vitro and in vivo bioluminescent assays. Revvity Standard Operate Procedure (Tech Notes). , Available from: https://resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/SOP_LuciferinPrep_InVitroInVivo_BLI-Assays.pdf (2023).
  27. Chatelain, E., Scandale, I. Animal models of Chagas disease and their translational value to drug development). Expert Opin Drug Discov. 15 (12), 1381-1402 (2020).
  28. Khare, S., et al. Antitrypanosomal treatment with benznidazole is superior to posaconazole regimens in mouse models of Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 59 (10), 6385-6394 (2015).
  29. Bustamante, J. M., Craft, J. M., Crowe, B. D., Ketchie, S. A., Tarleton, R. L. New, combined, and reduced dosing treatment protocols cure Trypanosoma cruzi infection in mice. J Infect Dis. 209 (1), 150-162 (2014).
  30. Molina, I., et al. Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas' disease. N Engl J Med. 370 (20), 1899-1908 (2014).
  31. JoVE. Science Education Database. Compound Administration II. JoVE. , (2023).
  32. Pukhalsky, A. L., Toptygina, A. P., Viktorov, V. V. Immunosuppressive action of cyclophosphamide in mice: Contribution of some factors to determination of strain differences. Int J Immunopharmacol. 15 (4), 509-514 (1993).
  33. Francisco, A. F., et al. Comparing in vivo bioluminescence imaging and the Multi-Cruzi immunoassay platform to develop improved Chagas disease diagnostic procedures and biomarkers for monitoring parasitological cure. PLoS Negl Trop Dis. 16 (10), e0010827(2022).
  34. Kratz, J. M., et al. The translational challenge in Chagas disease drug development. Mem Inst Oswaldo Cruz. 117, e200501(2022).
  35. Youn, H., Hong, K. -J. In vivo noninvasive small animal molecular imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
  36. Refaat, A., et al. In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. J Nanobiotechnology. 20 (1), 450(2022).
  37. Pirovano, G., Roberts, S., Kossatz, S., Reiner, T. Optical imaging modalities: Principles and applications in preclinical research and clinical settings. J Nucl Med. 61 (10), 1419-1427 (2020).
  38. Branchini, B. R., Southworth, T. L., Khattak, N. F., Michelini, E., Roda, A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. Anal Biochem. 345 (1), 140-148 (2005).
  39. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10 (4), 041210(2005).
  40. O'Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. Mennel, L., et al. A photosensor employing data-driven binning for ultrafast image recognition. Sci Rep. 12 (1), 14441(2022).
  42. Yoo, Y., Im, J., Paik, J. Low-light image enhancement using adaptive digital pixel binning. Sensors. 15 (7), 14917-14931 (2015).
  43. Moraes, C. B., et al. Accelerating drug discovery efforts for trypanosomatidic infections using an integrated transnational academic drug discovery platform. SLAS Discov. 24 (3), 346-361 (2019).
  44. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm Stat. 10 (2), 128-134 (2011).
  45. Kim, S., et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 51, D1 D1373-D1380 (2023).
  46. Sharma, V., McNeill, J. H. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation. Br J Pharmacol. 157 (6), 907-921 (2009).
  47. Barrow, J. C., Lindsley, C. W. The importance of PK-PD. J Med Chem. 66 (7), 4273-4274 (2023).
  48. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  49. Lewis, M. D., Kelly, J. M. Putting infection dynamics at the heart of Chagas disease. Trends Parasitol. 32 (11), 899-911 (2016).
  50. Brener, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 4, 389-396 (1962).
  51. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 129 (1), 53-59 (2003).
  52. Keppler, A., Grebnev, G., Reis, Y. Global BioImaging. , . (2024).
  53. Pfander, C., et al. Euro-BioImaging - Interdisciplinary research infrastructure bringing together communities and imaging facilities to support excellent research. iScience. 25 (2), 103800(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trypanosoma cruziobrazowanie in vivoobci enie paso ytniczereporter lucyferazymonitorowanie pod u nerodki przeciwpaso ytnicze
Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.