Method Article

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

DOI:

10.3791/66741

⸱

May 3rd, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh, University of Pittsburgh School of Medicine, 2North Allegheny High School, 3Wright State University Boonshoft School of Medicine, 4College of Engineering, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedkliniczne badania nad terapią genową, szczególnie na gryzoniach i dużych modelach zwierzęcych, wymagają produkcji wektorów AAV o wysokiej wydajności i czystości. Tradycyjne podejścia w laboratoriach badawczych często obejmują intensywne wykorzystanie szalek do hodowli komórkowych do hodowli HEK293T komórek, co może być zarówno pracochłonne, jak i problematyczne. W tym miejscu zaprezentowana jest unikalna metoda wewnętrzna, która upraszcza ten proces dzięki specjalnej platformie fabryki ogniw (lub stosów ogniw, CF10). Integracja dwufazowego podziału glikolu polietylenowego i wody z ultrawirowaniem w gradionym jodiksanolu poprawia zarówno wydajność, jak i czystość generowanych wektorów AAV. Czystość wektorów AAV jest weryfikowana za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem, natomiast stosunek pełnych do pustych cząstek określa się za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Podejście to oferuje wydajną platformę fabryki komórek do produkcji wektorów AAV z wysoką wydajnością, w połączeniu z ulepszoną metodą oczyszczania, aby spełnić wymagania jakościowe dotyczące badań in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) stały się niezastąpionym narzędziem w badaniach nad terapią genową, oferując unikalne połączenie skuteczności i bezpieczeństwa dostarczania genów1. Tradycyjne metody generowania AAV w warunkach laboratoryjnych odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia i zastosowania terapii genowej2. Jednak metody te, choć fundamentalne, wykazują pewne ograniczenia i wyzwania, zwłaszcza pod względem wydajności, efektywności czasowej i jakości wytwarzanych wektorów, w szczególności stosunku pełnych do pustych cząstek3.

Konwencjonalna procedura produkcji AAV polega przede wszystkim na transfekcji komórek HEK2934. Proces ten, zwykle przeprowadzany w szalkach do hodowli komórkowych, wymaga transfekcji komórek plazmidem zawierającym interesujący nas gen wraz z plazmidem pomocniczym i plazmidem kapsydu AAV5,6. Po transfekcji komórki wytwarzają cząsteczki AAV, które są następnie zbierane i oczyszczane5,6. Proces oczyszczania często obejmuje ultrawirowanie, co jest krytycznym krokiem w uzyskiwaniu wektorów AAV o wysokiej czystości7. Ultrawirowanie, szczególnie przy użyciu chlorku cezu (CsCl) lub gradientu jodoksanolu, jest standardową metodą oddzielania cząstek AAV od resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń8. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanej czystości i stężenia wektorów AAV, co bezpośrednio wpływa na ich skuteczność w dostarczaniu genów8. Pomimo powszechnego stosowania, tradycyjne ultrawirowanie ma swoje wady. Na przykład wydajność wektorów AAV z tej metody może być zmienna i często niska, co stanowi poważne wyzwanie, gdy potrzebne są duże ilości wektorów o wysokim mianie, szczególnie w przypadku badań in vivo lub dużych modeli zwierzęcych9.

Innym krytycznym aspektem jakości wektora AAV jest stosunek pełnych do pustych cząstek10. Preparaty AAV często zawierają mieszaninę tych cząstek; Jednak tylko pełne cząstki zawierają terapeutyczny materiał genetyczny. Obecność dużej ilości pustych cząstek może znacznie zmniejszyć efektywność dostarczania genów10. Ocena i optymalizacja stosunku pełnych do pustych cząstek jest zatem kluczowym parametrem w ocenie skuteczności wektorów AAV. Tradycyjne metody, choć zdolne do wytwarzania wektorów AAV, często mają trudności z konsekwentnym kontrolowaniem tego stosunku, co prowadzi do różnic w potencji wektorów10.

Tutaj prezentowana jest unikalna metoda, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV przy użyciu platformy fabryki komórek bez użycia pracochłonnych HEK293T hodowli komórkowych w naczyniach komórkowych, integrując dwufazowe rozdzielanie glikolu polietylenowego/wodnego z ultrawirowaniem gradientu jodixanol. Czystość wektora AAV jest potwierdzana za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem, a stosunek pełnych do pustych cząstek jest określany za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), spełniającej standardy jakości dla badań in vivo11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników, plazmidów i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Skład stosowanych jest podany w pliku uzupełniającym 1.

1. Przygotowanie plazmidu

  1. Transformacja plazmidów (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) w E. coli.
    UWAGA: Do amplifikacji plazmidu można użyć dowolnego szczepu E. coli. W przypadku niektórych plazmidów specjalne kompetentne komórki, takie jak stabilny NEB, mogą poprawić wydajność plazmidu. Trzy plazmidy używane w tym protokole to pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 i pAAV-Cap: pAAV-RC6.
  2. Hodować bakterie w pożywce LB zawierającej odpowiednie selektywne antybiotyki w optymalnej objętości w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin
    UWAGA: W przypadku stosowania stabilnych komórek NEB należy hodować w temperaturze 30 °C przez 18-20 godzin.
  3. Zebrać plazmidowe DNA przez odwirowanie pożywki hodowlanej E. coli w temperaturze 4000 x g, 4 °C, przez 15 minut.
  4. Ostrożnie wlej ciecz sklarowaną nad osadem z butelki wirówki do pojemnika na odpady i oczyść plazmidowe DNA z osadu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na dużą skalę bez endotoksyn.
    UWAGA: Upewnij się, że nalewasz go powoli i unikaj rozpryskiwania.
  5. Zmierzyć stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Sprawdź czystość DNA, sprawdzając stosunek OD260/OD280. Stosunek dla czystego DNA wynosi około 1,8. Stężenie DNA powinno wynosić powyżej 1 μg/μl dla późniejszego etapu kotransfekcji. Przygotować zapas glicerolu bakteryjnego, dodając 500 μl kultury na noc do 500 μl 50% glicerolu w kriowiale i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie komórek HEK293T

  1. Wysiewaj HEK293T komórki z pożywką DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającą 10% FBS do 10-warstwowej fabryki komórek (CF10) i pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze przez noc.
    UWAGA: Pasaże komórek 293T powinny być mniejsze niż 10, aby zapewnić optymalne warunki do solidnej produkcji AAV. Jeśli to możliwe, nie dodawaj w tym czasie antybiotyków do pożywki hodowlanej. CF10 ma około 42 razy większą powierzchnię wzrostu niż szalka do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm. Zasiać tę samą gęstość komórek w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm, aby umożliwić sprawdzenie wzrostu komórek pod mikroskopem. Przygotuj zawiesinę komórek o objętości 1075 ml, dodaj 25 ml zawiesiny komórek do naczynia o średnicy 150 mm, a pozostałą część dodaj do naczynia CF10.
  2. Sprawdź zbieg komórek następnego dnia przed transfekcją.
    UWAGA: Komórki powinny osiągnąć 80%-90% konfluencji w momencie transfekcji, obserwując pod mikroskopem.

3. Potrójna transfekcja plazmidów AAV

  1. Oblicz ilość każdego plazmidu potrzebną (pAAV-GOI, pHelper, serotyp pAAV), aby uzyskać stosunek molowy 1,2: 1: 1 z 2,5-5 mg całkowitego DNA na CF10,
    UWAGA: Stosunek molowy trzech plazmidów może być zmienny dla optymalnej skuteczności transfekcji. Lepiej jest przetestować go w małej skali przed przejściem do tego ustawienia CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 i pAAV-RC6 są używane do stworzenia wirusa AAV6-CMV-GFP jako przykład. Wzór kalkulatora PEI jest wymieniony w tabeli 1.
  2. Podać 350 ml OptiMEM do sterylnej butelki o pojemności 500 ml.
  3. Dodaj wszystkie trzy plazmidowe DNA do butelki zawierającej Opti-MEM. Dobrze wymieszaj.
  4. Dodać 15 ml roztworu polietylenininu (PEI) o stężeniu 1 mg/ml (stosunek 1:3 μg DNA do μg PEI). Potrząsaj mieszaniną OptiMEM/DNA/PEI energicznie w górę i w dół przez 30 s.
    UWAGA: Robienie bąbelków jest w porządku.
  5. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
    UWAGA: Dłuższa inkubacja może zmniejszyć wydajność transfekcji.
  6. Dodać roztwór OptiMEM/DNA/PEI do 1 litrowej butelki zawierającej 700 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy z 10 mM HEPES, 2% FBS. Dobrze wymieszaj.
    UWAGA: W tym badaniu niski poziom glukozy w DMEM wykazał lepszą produkcję wektora AAV po kotransfekcji. Dodatek HEPES pomaga utrzymać komórki w lepszej kondycji. Wymieszaj, powoli obracając butelkę. Unikaj tworzenia zbyt wielu bąbelków.
  7. Wyjmij CF10 z inkubatora i odkurz pożywkę do pojemnika na odpady.
    UWAGA: Połóż CF10 na powierzchni wewnątrz maski i stopniowo podnoś jedną stronę do góry, powoli odkurzaj media bez odłączania ogniw.
  8. Ostrożnie dodaj mieszaninę transfektantów do CF10. Upewnij się, że wszystkie dziesięć warstw jest pokrytych mediami.
    UWAGA: Dodać 25 ml mieszaniny transfektantów do naczynia o średnicy 150 mm. Monitoruj komórki codziennie, aż do zbiorów. Dodaj pozostałą mieszaninę transfektantów do CF10, wlewając powoli. Obróć CF10 bardzo ostrożnie i upewnij się, że każda warstwa ma równą objętość.
  9. Umieść CF10 z powrotem w inkubatorze na 72-96 godz.
    UWAGA: Sprawdź miskę monitora 150 mm, aby zdecydować, kiedy zebrać wektory AAV. Kiedy komórki bardzo łatwo się odczepiają przy pełnym obciążeniu AAV, nadszedł czas na zbiory.

4. Zbieranie wektorów AAV

  1. Zbierz wirusa 3-4 dni po transfekcji, energicznie potrząsając CF10. Wlać pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 250 ml i odwirowywać wirusa w temperaturze 4000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W przypadku serotypu AAV6 użytego w tym protokole, 80% AAV pozostanie w większości związane z materiałem komórkowym w pastylce. A 20% AAV zostało wydzielone do mediów. Proporcje te mogą się różnić dla innych serotypów AAV.
  2. Przefiltrować oczyszczony supernatant za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm i zachować go do wytrącenia.
  3. Przepłukać CF10 500 ml DPBS 1x buforu i odwirować przy 4000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego i pipety zasysającej. Dodać 20 ml buforu do lizy AAV na CF10 w temperaturze -80 °C do momentu oczyszczenia.
    UWAGA: Przenieś lizat AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu późniejszej ekstrakcji AAV.
  5. Wyjąć przefiltrowany supernatant, dodać 40% roztwór PEG-2,5 M NaCl do końcowego stężenia 8% PEG i inkubować w chłodnym pomieszczeniu na rotatorze orbitalnym przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.
    UWAGA: Do 100 ml supernatantu dodać 25 ml 40% roztworu PEG-2,5 M NaCl.
  6. Wytrącić wirusa przez odwirowanie w temperaturze 4000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przenieść mieszaninę do probówek stożkowych o pojemności 250 ml w celu odwirowania.
  7. Odessać, aby usunąć supernatant i dodać 5-10 ml buforu do reprodukcji AAV HEPES, aby zawiesić granulki. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu kontynuowania oczyszczania lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja AAV

  1. Rozmrozić osad wirusa w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut za pomocą shakera.
    UWAGA: Zwiruj lizat AAV, aby całkowicie się rozpuścił.
  2. Zamrażać w kąpieli 100% etanolowej w temperaturze -80 °C przez 20-30 min.
    UWAGA: Alternatywnie cykl zamrażania można wykonać za pomocą zimnej zlewki ze 100% etanolem otoczonej suchym lodem.
  3. Wykonaj zamrażanie/rozmrażanie 3-4 razy i w razie potrzeby wirowanie pomiędzy.
    UWAGA: Ten cykl można wstrzymać na etapie zamrażania. Przechowywać lizat AAV w temperaturze -80 °C do czasu zakończenia dalszych prac.
  4. Rozmrozić lizat AAV (od kroku 5.3) i ponownie zawiesić AAV (od kroku 4.7)" w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut za pomocą wytrząsarki i wirować.
    UWAGA: Upewnij się, że całkowicie się rozpuścił i wymieszaj.
  5. Dodaj nukleazę benzonazy (250 jednostek/μl) do lizatu AAV i ponownie zawiesić AAV do końcowego stężenia 50 jednostek/ml. Wiruj roztwór.
  6. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 30 min.
    UWAGA: Wyjmij 10% podwielokrotności deoksycholanu sodu w łaźni wodnej, aby dać czas na rozpuszczenie, rozgrzanie i dokładne wymieszanie.
  7. Dodać 10% deoksycholanu sodu do końcowego stężenia 0,5% i inkubować w temperaturze 37 °C z włączonym wytrząsarką przez 30 min.
    UWAGA: Deoksycholan sodu zastosowano w celu zwiększenia uwalniania AAV z komórek.
  8. Rozprowadzić surowy roztwór AAV w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieść supernatant do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Do przeniesienia supernatantu należy użyć pipety o pojemności 1 ml. Wyrzuć granulki.
  10. Dodać równą ilość chloroformu i wyekstrahować AAV przez wirowanie przez 1-2 min.
    UWAGA: Roztwór powinien stać się nieprzezroczysty, biały, mleczny.
  11. Przenieść mleczny roztwór do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i równomiernie rozprowadzić. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Ostrożnie odpipetować górną różową warstwę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie naruszaj warstw chloroformu/białka.
  13. Zmierz końcową objętość za pomocą pipety. Zgodnie z surową tabelą objętości siarczanu AAV-PEG (tabela 2), wymieszaj odpowiednie objętości 50% (NH4)2SO4 i 40% roztworu PEG. Wirować przez 2 min.
  14. Przenieś mieszaninę do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml w celu równomiernego rozprowadzenia. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C
  15. Zebrać dolną warstwę za pomocą igły 22 G i strzykawki o pojemności 3 ml. Zebrać AAV w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego ultrawirowania gradientów jodiksanolu.

6. Oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradinie jodiksanolu

  1. Gradienty jodu należy przygotować na świeżo przed załadowaniem AAV zgodnie z liczbą użytych probówek do ultrawirowania (Tabela 3).
    UWAGA: Czerwień fenolowa została użyta do obserwacji warstw.
  2. Powoli nakładaj każdy roztwór do okrągłej probówki z szybkozamykającą się ultrawirówką polipropylenową za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do długiej igły o wadze 16 G. Unikaj bąbelków.
  3. Ostrożnie dodać do 17 ml roztworu AAV na wierzch gradientu za pomocą strzykawki 22 G. Użyj buforu do dializy AAV, aby uzupełnić rurkę.
    UWAGA: Dodaj roztwór AAV, ładując krople na ścianę w probówce ultrawirówkowej. Nie zaburzaj warstw gradientu.
  4. Uszczelnij probówki ultrawirówki za pomocą zgrzewarki elektrycznej.
    UWAGA: Zrównoważyć probówki przed wysłaniem ich do ultrawirówki z różnicą ±0,2 g.
  5. Wirować przy 350 000 x g przez 2 godziny w wirniku Ti70 w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie wyjmij probówki z wirnika i umieść je w stojaku na probówki ultrawirówkowe.
    UWAGA: Upewnij się, że gradienty nie są zakłócone.
  7. Zbierz frakcje AAV, wykonując poniższe czynności:
    1. Ustabilizuj rurkę na uchwycie stojaka.
    2. Nakłuć probówki ultrawirówki nieco poniżej granicy faz 40%-60% za pomocą igły 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml.
      UWAGA: Otwór igły powinien być skierowany do góry, skierowany w stronę nachylenia 40%.
    3. Przebić otwór w górnej części rurki za pomocą igły 16 G.
    4. Zbierz do 5 ml na probówkę. Unikaj gromadzenia się zanieczyszczeń białkowych na granicy faz 25%-40%.
    5. Powtórz te czynności dla każdej probówki do ultrawirówki.
      UWAGA: Przenieś frakcje AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

7. Druga runda ultrawirowania gradientów jodiksanolu

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Ten krok ma na celu zmniejszenie współczynnika pustego AAV w celu uzyskania wyższej jakości pełnego kapsydu AAV.

  1. Rozcieńczyć AAV >1:1 buforem do dializy AAV.
    UWAGA: AAV pobrany z pierwszej rundy ultrawirowania zawierał 40% warstwę jodiksanolu. Należy go rozcieńczyć o co najmniej 50%, aby można go było nałożyć na warstwę 30% jodiksanolu.
  2. Nałożyć każdy roztwór (Tabela 4) do probówki do ultrawirowania za pomocą igły nakłuwanej 16 G i powoli założyć strzykawkę o pojemności 10 ml. Unikaj bąbelków.
  3. Ostrożnie dodać 20 ml rozcieńczonego roztworu AAV na wierzch gradientu za pomocą strzykawki 22 G. Użyj buforu do dializy AAV, aby uzupełnić rurkę.
  4. Powtórz kroki od 6.4 do 6.7.

8. Dializa i stężenie AAV

  1. Przenieść wirusa AAV do kasety dializacyjnej za pomocą nowej igły 18 G i strzykawki o pojemności 10 ml. Powoli wstrzyknij wirusa do kasety i usuń z niej powietrze.
  2. Dodać mieszadło do zlewki zawierającej bufor do dializy AAV i umieścić go na płytce mieszającej.
  3. Umieścić kasetę dializacyjną w buforze dializacyjnym z boją pływakową. Mieszać w temperaturze 4 °C. Zmienić 2-3 razy bufor dializacyjny AAV.
    UWAGA: Użyj wystarczającej ilości bufora, aby kaseta mogła się unosić i przeprowadzić wymianę bufora. Przykryj zlewkę folią aluminiową.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 18 G, zbierz wirusa z kasety do filtra odśrodkowego.
  5. Wirować przy 4 000 x g przez 15-30 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przepłukać AAV buforem dializacyjnym AAV 2-3 razy. Skoncentruj AAV, aż ~200 μl pozostałego znajdzie się na górze filtra.
  6. Zbierz skoncentrowany AAV z jednostki filtrującej. Przepłukać filtr kolejnymi 300 μl buforu do dializy AAV i przenieść go do zagęszczonego AAV.
  7. Przefiltrować wirusa przez filtr strzykawkowy 0,22 μm za pomocą 1 ml tuberkulinowej strzykawki typu luer. Aby zapewnić najmniejszą utratę objętości, użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby przepchnąć powietrze przez filtr 2-3 razy.
  8. Oczyszczony wirus AAV należy przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania.
    UWAGA: Miareczkować porcję wirusa i przechowywać w temperaturze -80 °C w ciągu 1 tygodnia.

9. Miareczkowanie wirusa AAV

UWAGA: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy TaqMan (qPCR) została użyta do miareczkowania oczyszczonego AAV.

  1. Potraktuj wektory AAV DNazą I i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Jako przykład reakcji 10 μL stosuje się 2 μL próbki wirusa AAV, 1 μL DNazy, 1 μL buforu DNazy i 6 μLH2O. Można go wykonać w termocyklerze z probówkami PCR.
  2. Przygotuj zestawy starterów przeznaczone dla regionu wstawiania AAV.
    UWAGA: Celami mogą być promotor, transgen i reporter w konstrukcie AAV. Startery wymieniono w tabeli 5.
  3. Przygotować wzorce plazmidu DNA (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 i 0,0001 pg/μL) oraz kontrolę ujemną (H2O).
  4. Przygotuj główną mieszankę qPCR, w tym startery, zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Umieścić wzorce i próbki w trzech egzemplarzach na płytce do PCR. Dodaj mieszaninę qPCR do wzorców i próbek. Uszczelnić płytkę i przeprowadzić reakcję qPCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Warunki reakcji zależą od materiałów/odczynników i instrumentu. Stosowane są szybkie i konwencjonalne cykle PCR.
  6. Obliczać miano wirusa AAV.
    UWAGA: Stężenie próbki w tym protokole wynosi 1/10 rozcieńczenia od oryginalnych próbek.
  7. Wirusa AAV należy rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas.
    UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania podczas przechowywania. W przypadku stosowania do eksperymentów in vivo nie należy stosować rozmrażania ponad dwukrotnych porcji.

10. Kontrola jakości AAV

UWAGA: Wirusy AAV zostały scharakteryzowane pod kątem czystości za pomocą srebrnego barwnika SDS-PAGE przy użyciu żelu SDS-PAGE i barwione za pomocą dostępnego na rynku zestawu do barwienia.

  1. Denaturacja 3 x 109 vg próbki wirusa AAV za pomocą buforu Laemmli.
    UWAGA: Użyj referencyjnego wirusa AAV jako kontroli. Używany jest referencyjny pełny kapsyd AAV6-CMV-GFP.
  2. Załaduj denaturat AAV na żel SDS-PAGE o nachyleniu 4%-20% i pracuj pod napięciem 180 V przez 50 minut.
  3. Usuń żel z płytki do elektroforezy. Żel należy zabarwić srebrnym zestawem do barwienia zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Sprawdź białka kapsydu AAV VP1, VP2 i VP3.
    UWAGA: Czysty wirus AAV zawiera tylko białko kapsydu VP1, VP2 i VP3. Jeśli nie jest czysty, na żelu będą widoczne inne prążki białkowe.
    UWAGA: Przeprowadzono transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) rekombinowanych wirionów AAV barwionych ujemnie w celu oceny integralności morfologicznej i stosunku pełnego/pustego.
  5. Podnieś siatkę EM za pomocą pęsety i połóż się na ławce błyszczącą stroną siatki skierowaną do góry.
  6. Odmierzyć pipetą 5 μl próbki AAV na siatkę i pozostawić do wyschnięcia przez odparowanie.
    UWAGA: W razie potrzeby rozcieńczyć AAV. 1012 vg/ml to średnie miano. Wyschnięcie siatki może zająć 30-60 minut.
  7. Przemyć siatkę przez pipetowanie, kropla po kropli, dosypując około 200 μlH2Ona siatkę.
  8. Usuń nadmiar wody, powoli kładąc bibułę chromatograficzną pionowo obok siatki.
  9. Odmierzyć pipetą 5 μl 2% roztworu octanu uranylu na siatkę. Inkubować przez 5 minut i odciąć, jak wspomniano powyżej. Pozostaw siatkę do wyschnięcia.
  10. Wizualizuj cząstki AAV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (przy 50 000-krotnym powiększeniu). Kapsydy wirusowe z genomem wirusa pojawią się jako jednorodne białe sześciokąty, podczas gdy puste kapsydy pojawią się jako sześciokąty z białą obwódką, ale ciemnym środkiem.
  11. Policz losowo co najmniej 100 cząstek, aby określić przybliżony procent pełnych i pustych cząstek AAV.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym szczegółowym protokole krok po kroku, ustandaryzowana platforma jest demonstrowana do wytwarzania wirusa AAV o wysokim mianie i wysokiej jakości z CF10 w warunkach laboratorium badawczego na dużą skalę. W porównaniu z konwencjonalnymi szalkami do hodowli komórkowych, CF10 zapewnia wygodny sposób hodowli dużych ilości komórek i produkcji wirusa AAV (Rysunek 1). Przetestowano kilka warunków hodowli, aby ustalić, czy komórki w optymalnym środowisku mogą sprzyjać produkcji wirusa. DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełniony 10 mM HEPES i 2% FBS wykazał najlepszą produkcję AAV.

Kilka protokołów zostało przetestowanych w celu oczyszczenia AAV. Większość zabiegów charakteryzuje się niską wydajnością wirusa i zanieczyszczeniem kapsydami AAV. W tym przypadku opracowano poprawiony protokół oczyszczania, łączący AAV zarówno z osadów komórkowych, jak i pożywek hodowlanych (Rysunek 2). Odkryliśmy, że 80% AAV znajdowało się w komórkach, a kolejne 20% AAV znajdowało się w pożywkach hodowlanych, które były wydzielane z komórek. Obie części AAV traktowano DNazą w celu usunięcia wolnego DNA. Deoksycholan sodu zastosowano w celu dalszego uwalniania AAV z komórek. AAV zostały następnie wyekstrahowane za pomocą ekstrakcji chloroformem, a następnie wodnego podziału dwufazowego. Kroki te pozwoliły na usunięcie większości zanieczyszczeń białkowych. AAV pozostaje rozpuszczalny w fazie siarczanu amonu.

Pozostałe zanieczyszczenia zostały usunięte za pomocą nieciągłego ultrawirowania z gradientem jodixanolu (Rysunek 3A). Gradient był również pomocny w usuwaniu pustych kapsydów AAV, zwłaszcza w drugiej rundzie ultrawirowania w gradiencie jodiksanolu.

Czystość wirusa AAV została określona przez barwienie srebrem. Po uzyskaniu trzech głównych prążków odpowiadających białku kapsydu AAV, VP1, VP2 i VP3, o czystości większej niż 90%, wirus AAV nadawał się do stosowania in vivo (Figura 3B). Stosunek pełnego kapsydu AAV do pustego kapsydu uzyskano za pomocą TEM (Rysunek 3C). Tylko pełny kapsyd z wkładką transgenu pozwoliłby na ekspresję transgenu w docelowej tkance. Duża ilość pustego kapsydu może również wywołać odpowiedź immunologiczną na kapsyd AAV. Te kontrole jakości są niezbędne dla każdego wirusa AAV, który jest wytwarzany i oczyszczany przed użyciem.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja produkcji AAV metodą potrójnej transfekcji komórek HEK293T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja oczyszczania AAV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradinie jodiksanolu i weryfikacja czystości wirusa AAV. (A) Warstwy gradientu jodixanolu i pozycja igły do zbioru. (B) Reprezentatywny żel oceniający zawartość i czystość kapsydu. M: marker molekularny; R: referencyjny pełny kapsyd AAV6; S1: kapsyd AAVDJ produkcji własnej produkcji z jedną rundą ultrawirowania; S2: kapsyd AAVDJ produkcji własnej produkcji z dwiema rundami ultrawirowania; S3: kapsyd AAV6 produkcji własnej. (C) Obraz AAV z mikroskopii elektronowej. Wirus pobrany po oczyszczeniu. Kapsydy wirusowe zawierające genom wirusa pojawiają się jako jednorodne białe sześciokąty, podczas gdy puste kapsydy pojawiają się jako sześciokąty z białą obwódką, ale ciemnym środkiem. Podziałka: 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Kalkulator PEI dla opakowań AAV. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Wykres objętości surowego AAV-PEG-Siarczanu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Przygotowanie gradientu jodixanol. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Przygotowanie drugiej rundy gradientu jodiksanolu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Startery do miareczkowania AAV. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Skład użytych do badania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przypadku wprowadzono zaawansowany technicznie protokół do produkcji na dużą skalę wektorów AAV o wysokim mianie i wysokiej jakości przy użyciu platformy fabryki komórek (CF10), co stanowi znaczny postęp w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli komórkowych. Wykorzystanie fabryk komórkowych upraszcza proces hodowli dużych ilości komórek, ułatwiając bardziej efektywną produkcję wirusów AAV1. Ponadto, optymalizując warunki hodowli, szczególnie w przypadku DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionego 10 mM HEPES i 2% FBS, potwierdzono znacznie zwiększoną produkcję wirusa, co wskazuje na kluczową rolę środowiska komórkowego w wydajności wirusa.

Zmieniony protokół oczyszczania, który łączy AAV zarówno z osadów komórkowych, jak i pożywek hodowlanych, rozwiązuje powszechny problem niskiej wydajności wirusa i zanieczyszczeń obserwowanych w wielu istniejących protokołach. Etapy ekstrakcji chloroformem i wodnego dwufazowego podziału skutecznie usuwają większość zanieczyszczeń białkowych, przy czym AAV pozostaje rozpuszczalny w fazie siarczanu amonu. Poprawę zarówno wydajności, jak i czystości wektorów AAV przy użyciu dwufazowego podziału PEG/wodnego w połączeniu z ultrawirowaniem w gradinie jodiksanolu, w przeciwieństwie do tradycyjnych metod ultrawirowania gradientowego, można przypisać zwiększonej początkowej separacji za pomocą dwufazowego podziału PEG/wodnego, wyrafinowanej czystości za pomocą ultrawirowania w gradinie jodiksanolu oraz zmniejszeniu współoczyszczania zanieczyszczeń12. Po pierwsze, wprowadzenie dwufazowego podziału PEG/wodnego przed ultrawirowaniem znacznie poprawia początkową separację cząstek AAV od szczątków komórkowych i innych zanieczyszczeń. PEG, polimer o dużej masie cząsteczkowej, po zmieszaniu z roztworem wodnym tworzy dwie odrębne fazy13. Wektory AAV mają skłonność do preferencyjnego podziału na jedną z tych faz (zwykle fazę bogatą w PEG), podczas gdy wiele zanieczyszczeń i zanieczyszczeń jest podzielonych na pozostałe13. To selektywne dzielenie skutecznie koncentruje cząstki AAV i usuwa znaczną część zanieczyszczeń jeszcze przed ultrawirowaniem, zwiększając w ten sposób wydajność i zmniejszając ładunek zanieczyszczeń wchodzących do etapuultrawirowania 13. Po drugie, ultrawirowanie w gradionym jodiksanolu dodatkowo poprawia czystość wektorów AAV. Jodixanol, niejonowe, izoosmolarne medium gradientowe, pozwala na łagodniejszą i bardziej kontrolowaną separację w porównaniu z tradycyjnymi gradientami CsCl14. W tym gradiencie cząstki AAV migrują do pozycji w gradiencie, która odpowiada ich gęstości wyporu14. Co ważne, proces ten jest skuteczny w oddzielaniu pełnych kapsydów AAV (zawierających ładunek genetyczny) od pustych kapsydów (pozbawionych materiału genetycznego), co jest kluczowym wyznacznikiem jakości wektora. Izoosmolarny charakter jodiksanolu zachowuje również integralność kapsydów AAV lepiej niż środki hiperosmolarne, takie jak CsCl, potencjalnie prowadząc do wyższych plonów nienaruszonych, funkcjonalnych wektorów14. Wreszcie, tradycyjne metody ultrawirowania, zwłaszcza te wykorzystujące gradienty CsCl, mogą czasami współoczyszczać zanieczyszczenia, które mają podobną gęstość wyporu do wektorów AAV15. Dzięki zastosowaniu podziału PEG jako etapu wstępnego, ładunek takich zanieczyszczeń jest znacznie zmniejszony przed ultrawirowaniem13. To zmniejszenie ładunku zanieczyszczeń oznacza, że gradient jodiksanolu może działać skuteczniej i bardziej selektywnie w oczyszczaniu wektorów AAV, prowadząc do wyższej czystości15.

Czystość i jakość wektorów AAV są rygorystycznie oceniane za pomocą barwienia srebrem i TEM11. Obserwacja trzech głównych prążków odpowiadających białkom kapsydu AAV VP1, VP2 i VP3, o czystości przekraczającej 90%, wskazuje na przydatność tych wektorów AAV do stosowania in vivo . Analiza TEM w celu określenia stosunku pełnego do pustego kapsydu jest szczególnie istotna, ponieważ wysoki odsetek pustych kapsydów może prowadzić do zmniejszenia wydajności dostarczania genów i potencjalnej odpowiedzi immunologicznej11. Ta kontrola jakości, choć niezbędna, dodatkowo komplikuje procedurę i może wymagać dodatkowej wiedzy technicznej.

Podsumowując, protokół oferuje znaczący postęp techniczny w produkcji wektorów AAV, szczególnie pod względem skalowalności i czystości. Jednak złożoność związana z procesem oczyszczania oraz potrzeba specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej mogą nadal stanowić niewielkie ograniczenie dla jego zastosowania w niektórych warunkach badawczych. Dalsze udoskonalanie i upraszczanie tych technik może sprawić, że podejście to stanie się bardziej dostępne i będzie miało szersze zastosowanie w dziedzinie badań nad terapią genową.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TZ zaprojektował eksperymenty. Eksperymenty przeprowadzili TZ, VD, SB i JP. TZ i VD wygenerowały dane i przeanalizowały je. TZ i YX napisali rękopis. TZ i GG zrewidowały manuskrypt. Prace te były wspierane przez Szpital Dziecięcy UPMC w Pittsburghu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293T/17 ogniwATTCCRL-11268
0,5 M EDTAMilliporeSigma324506-100ml
1 mL strzykawka Henke-JectFisher Scientific14-817-211
10% roztwór pluroniczny F68Fisher Scientific24-040-032
10x Bufor Tris/Glicyna/SDSBiorad1610732
1M HEPESFisher Scientific15-630-080
2% roztwór octanu uranyluMikroskopia elektronowa Nauki22400-2
4%– 20% prefabrykowane żele białkowebiorad4561094
40% roztwór PEGSigmaP1458-50ML
AAV6 referencyjne pełne kapsydyRiver LaboratoriesRS-AAV6-FL
Roztwór do odrywania komórek AccutaseFisher ScientificA6964-100ML
BenzonazaSigmaE1014-25KU
BioLite Hodowla komórkowa Naczynia poddane obróbce 150 mmFisher Scientific12-556-003
Filtr odśrodkowyMilliporeSigmaUFC905024
Corning  Filtry strzykawkowe PESFisher Scientific09-754-29
Kasety do dializy, 10 K MWCOFisher ScientificPI66810
Jednorazowe jednostki filtrujące PES 1 L 0,2 i mikro; mFisher ScientificFB12566506
Jednorazowe jednostki filtrujące PES 1 L 0,45 i mikro; mFisher ScientificFB12566507
Jednorazowe jednostki filtrujące PES 500 ml 0,2 i mikro; mFisher ScientificFB12566504
DMEM o wysokim poziomie glukozyFisher Scientific10-569-044
DMEM o niskim poziomie glukozyFisher Scientific10567022
DNaseNEBM0303S
DPBS 1xFisher Scientific14-190-250
Płodowa surowica Bovin (FBS)BiowestS1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, CuMikroskopia elektronowa SciencesFCF300-Cu-50
glicerolSigmaG5516-1L
KClSigmaP9541-500G
LB agarSigmaL2897-250G
LB bulionFisher ScientificBP9732-500
MgCL2· 6H2OSigmaM9272-100G
Stabilne kompetentne komórki NEBC3040H
Nest Biofactory 10-komorowyMidSci771302
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel740424
Opti-MEMFisher Scientific31-985-088
OptiPrep Gradient gęstości średniMillipore SigmaD1556-250ml
pAAV-CMV-GFPAddgene105530
pAAV-DJCell BioLabVPK-420-DJ
pAAV-RC6Cell BioLabVPK-426
pAdDeltaF6Addgene112867
PEG 8000PromegaV3011
PEI MaxPolysciences, Inc49553-93-7
Pen-StrepFisher Scientific15-140-163
Czerwień fenolowaMillipore Sigma1.07242.0100
Zestaw Pierce Silver Stain KitThermo Fisher Scientific24612
Rurka QuickSealFisher ScientificNC9144589
Chlorek soduSigma1162245000
Deoksycholan sodu Millipore SigmaD6750-100G
Taqman Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
Type 70 Ti Tytanowy rotor o stałym kącieBeckman Coulter337922
Western BlottingSubstrate ThermoFisher Numer katalogowy: 32209
Charles nachylenia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  2. Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy. Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).
  3. Bilal, A. S., et al. Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production. Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).
  4. Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene. Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).
  5. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  6. Challis, R. C., et al. Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).
  7. Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).
  8. Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration. Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).
  9. Berns, K. I., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases. Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).
  10. Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).
  11. Chen, H. Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy. Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).
  12. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  13. Kato, M., et al. In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects. Commun Biol. 6 (1), 508(2023).
  14. Sena-Esteves, M., Gao, G. Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).
  15. Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient. Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV VectorsCell Factory PlatformHigh Titer ProductionHEK293T CellsIodixanol GradientPolyethylene Glycol PurificationSDS PAGE AnalysisTransmission Electron MicroscopyViral PurityGene Therapy

Related Articles