Artykuł metodologiczny

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66754

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  , 
1Tissue and Organ Homeostasis Program, Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO), 2Cardiovascular Regeneration Program, National Cardiovascular Research Center (CNIC), 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), 4Department of Experimental Biology, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Streszczenie

Serce ssaków jest złożonym organem powstałym podczas rozwoju przez bardzo zróżnicowane populacje komórek progenitorowych. Pochodzenie, czas rekrutacji, oraz losy tych przodków są istotne dla prawidłowego rozwoju tego organu. Mechanizmy molekularne, które rządzą morfogenezą serca, są niezbędne do zrozumienia patogenezy wrodzonych chorób serca i regeneracji serca w zarodku. Klasyczne podejścia do badania tych mechanizmów wykorzystywały pokolenie transgenicznych myszy do oceny funkcji określonych genów podczas rozwoju serca. Jednak transgeneza myszy jest złożonym, czasochłonnym procesem, którego często nie można przeprowadzić w celu oceny roli określonych genów podczas rozwoju serca. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół wydajnej elektroporacji i hodowli embrionalnych serc myszy, umożliwiając transgenezę przejściową w celu szybkiej oceny wpływu wzmocnienia lub utraty funkcji genów zaangażowanych w rozwój serca. Korzystając z tej metodologii, udało nam się nadeksprymować Meis1 w sercu embrionalnym, z preferencją dla transfekcji komórek nasierdzia, demonstrując możliwości tej techniki.

Wprowadzenie

Serce jest pierwszym organem powstającym podczas rozwoju embrionalnego. Proces ten obejmuje czasowo-przestrzenną koordynację różnych populacji komórek progenitorowych pochodzących z odrębnych obszarów embrionu. Wszystko to dzieje się w czasie, gdy rozwijające się serce nieustannie bije i funkcjonuje, co podkreśla niezwykły poziom koordynacji wymagany do jego sformowania1,2,3. Biorąc pod uwagę kluczową rolę serca, ścisła regulacja na poziomach komórkowym i molekularnym jest niezbędna dla jego prawidłowego rozwoju4,5. Identyfikacja mechanizmów kontrolujących rozwój serca budzi duże zainteresowanie, ponieważ są one kluczowe dla zrozumienia wrodzonych wad serca, które dotykają znaczną liczbę pacjentów na całym świecie6. Ponadto zrozumienie rozwoju serca jest kluczowe dla wyjaśnienia regeneracji serca, ponieważ ponatalne serca ssaków zachowują zdolność regeneracyjną, która zostaje utracona lub ograniczona w wieku dorosłym7,8. W konsekwencji analiza molekularnych regulatorów rozwoju serca jest niezbędna dla postępów w badaniach nad wrodzonymi wadami serca oraz regeneracją mięśnia sercowego.

W dążeniu do osiągnięcia tego celu coraz większą uwagę poświęca się badaniu roli epikardium w rozwoju i regeneracji serca9. Epikardium jest cienką warstwą tkanki mezohelialnej, która stanowi zewnętrzną warstwę serca ssaków (Rysunek 1). Niedawne badania wykazały znaczenie epikardium podczas uszkodzeń serca, ujawniając, że tkanka ta jest zdolna wysyłać sygnały proliferacyjne do kardiomiocytów w obszarze objętym uszkodzeniem, aby złagodzić skutki urazu10,11. Mimo istotnej roli epikardium, prowadzenie dalszych badań molekularnych jest utrudnione ze względu na jego ogromną heterogenność. Eksperymenty z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (single-cell RNAseq) ujawniły heterogenność epikardium, w którym znajdują się liczne subpopulacje komórek o odmiennych sygnaturach transkrypcyjnych12,13,14,15,16. Zatem strategia przesiewania potencjalnych regulatorów rozwoju serca powinna uwzględniać różnorodność epikardialnych komórek progenitorowych.

W tym sensie podatność modelu mysiego na modyfikacje genetyczne ułatwiła identyfikację licznych genów kluczowych dla rozwoju serca, umożliwiając tworzenie linii mutantów z funkcją wzmocnioną (gain-of-function, GOF) lub utratą funkcji (loss-of-function, LOF) specyficznych genów. Jednak podejścia te wiążą się ze znacznym nakładem czasu i zasobów eksperymentalnych; w związku z czym są one niepraktyczne przy ocenie roli dużej liczby genów kandydackich. Ponadto geny rozwojowe często pełnią funkcje plejotropowe w różnych tkankach lub są niezbędne do wczesnego rozwoju embrionalnego, co utrudnia interpretację ich udziału w rozwoju konkretnego procesu. Choć możliwe jest ukierunkowanie funkcji genu na specyficzne struktury lub punkty czasowe rozwoju, zazwyczaj wymaga to zastosowania bardziej złożonych konstrukcji genetycznych, które mogą być trudne do wytworzenia lub są ogólnie niedostępne.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, przedstawiamy metodologię elektroporacji embrionalnych serc myszy w celu przejściowej transgenezy (Rycyna 2). W połączeniu z hodowlą ex vivo oraz sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS), strategia ta demonstruje swoje możliwości poprzez przejściową funkcję wzmocnienia (GOF) Meis1, dobrze scharakteryzowanego genu zaangażowanego w rozwój i regenerację serca17,18,19. W niniejszym artykule zbadano również inne potencjalne zastosowania tej metodologii, a także omówiono jej zalety i ograniczenia oraz porównano ją z istniejącymi protokołami przejściowej modulacji ekspresji genów. Wierzymy, że zaprezentowane ramy i przykłady wizualne pozwolą na lepsze zrozumienie biologii epicardium podczas rozwoju i w przebiegu chorób.

Schemat anatomii serca przedstawiający komory oraz warstwy: osierdzie, epikardium, miokardium, endokardium.
Rysunek 1: Warstwy zarodkowego serca myszy. Schematyczny rysunek widoku czołowego zarodkowego serca myszy w dniach E13-14. Trzy główne warstwy komórkowe serca przedstawiono kolorami: żółtym (endokardium), czerwonym (miokardium) i niebieskim (epikardium). Osierdzie zaznaczono brązową linią. Cztery komory serca oznaczono skrótami: LV – lewa komora; RV – prawa komora; LA – lewy przedsionek; RA – prawy przedsionek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat elektroporacji serca zarodkowego; harmonogram przygotowania plazmidu, sekcji, hodowli i sortowania.
Rysunek 2: Schematyczny przegląd protokołu elektroporacji serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Doświadczeń na Zwierzętach CNIC i były zgodne z aktualnym ustawodawstwem, w tym z dyrektywą UE 2010/63EU oraz rekomendacją 2007/526/EC, wdrażanymi przez prawo hiszpańskie na mocy Real Decreto 53/2013. W niniejszym protokole wykorzystano samice myszy CD-1 typu dzikiego w wieku od 15 do 21 tygodni. Szczegóły dotyczące zwierząt, odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie plazmidu i narzędzi

  1. W pierwszej kolejności przygotować mieszaninę do elektroporacji, dodając na lodzie odpowiedni plazmidowy DNA do stężenia końcowego 1 µg/µL. Następnie uzupełnić mieszaninę, dodając sacharozę do stężenia końcowego 6% (rozpuszczoną w PBS) oraz biokompatybilny barwnik w stężeniu 0,01%, a całość dopełnić buforem PBS do objętości końcowej 30 µL.
    UWAGA: Na jedną próbkę zużywa się około 1-2 µL mieszaniny do elektroporacji. Proporcje mieszaniny do elektroporacji należy dostosować do liczby próbek w eksperymencie. Należy pamiętać, że DNA do elektroporacji powinno być oczyszczone z kultury bakteryjnej, co zapewni optymalną stabilność i minimalną ilość zanieczyszczeń. Więcej szczegółów na temat plazmidów wykorzystanych w tym badaniu znajduje się w sekcji wyników reprezentatywnych.
  2. Przygotować pożywkę wzrostową, suplementując DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2% buforem Hepes oraz 1% penicyliną/streptomycyną. Pożywkę przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu użycia. Dodatkowo podgrzać 1x PBS do 37 °C wraz z pożywką wzrostową.
  3. Przygotować igły, wyciągając kapilarę szklaną o średnicy 20 µm za pomocą wyciągacza do pipet przy następujących parametrach: heat = 550; pull = 100; velocity = 250; time = 120. Średnica końcowa po wyciąganiu powinna wynosić około 5-8 µm.
  4. Ustawić parametry elektroporatora na pięć cykli po 50 ms przy 40 V z odstępami 900 ms. Przygotować elektrody, pipetę ustną i igłę tępą (Rysunek 3A). Wyposażyć pipetę w igłę, aby załadować DNA (Rysunek 3A).

2. Disekcja zarodka i wyizolowanie serca

  1. Przeprowadzić krzyżówkę myszy szczepu CD-1 typu dzikiego. Następnego ranka wybrać samice z obecnym czopkiem pochwowym i przyjąć ten czas jako dzień embrionalny E0.5. Eutanazję zwierząt w dniu embrionalnym E12-12.5 przeprowadzić poprzez zwichnięcie szyjowe (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  2. Ostrożnie wypreparować macicę z myszy i położyć ją na suchym ręczniku papierowym. Następnie przeciąć macicę za pomocą precyzyjnych nożyczek, wprowadzając końcówkę nożyczek od strony mezometrium i powoli przesuwając ostrze wzdłuż całej jej długości. Obnażyć decidue i przenieść je do pożywki wzrostowej. Więcej szczegółów znajduje się w pracy Behringer i wsp.20.
  3. Przeprowadzić sekcję decidue w celu wyodrębnienia embrionów, a następnie umieścić embriony w 60 mm szalce Petriego z ciepłą pożywką wzrostową. Używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie odciąć ogon i głowę embrionu, tak aby pozostał jedynie tułów. Stadium rozwoju embrionów można zweryfikować poprzez ocenę cech anatomicznych, zgodnie z opisem Wong i wsp.21.
  4. Następnie z ostrożnością usunąć z tułowia embrionu jak najwięcej tkanki, nie uszkadzając serca ani tętnic płucnych i aorty. Po odsłonięciu serca natychmiast umieścić je w nowej, ciepłej pożywce wzrostowej i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu elektroporacji.
    UWAGA: Utrzymanie temperatury serca jest kluczowe dla jego przeżywalności. Należy upewnić się, że pożywka jest zawsze ciepła i wymieniać ją co 5-10 min. Z kolei próbkami można manipulować bez zachowania sterylności, ponieważ nie wpłynie to na wydajność procedury. Należy pamiętać, że pożywka wzrostowa zawiera antybiotyki.

3. Elektroporacja serca i hodowla ex vivo

  1. Nabrać około 10 µL mieszaniny plazmidów (przygotowanej w kroku 1.1) do igły, ostrożnie aspirując ją za pomocą pipety ustnej.
  2. Przygotować pojedyncze serce do elektroporacji, umieszczając je w czystej szalce Petriego o średnicy 60 mm z jałowym 1x PBS ogrzanym do 37 °C. Umieścić szalkę pod mikroskopem stereoskopowym (Rycina 3A).
  3. Przygotować elektrody, ustawiając odległość między biegunem dodatnim a ujemnym na około 4 mm (Rycina 3B).
    UWAGA: 4 mm to odległość otworu, w której mieszczą się serca myszy E12.5 w elektrodach użytych w tej pracy. Należy rozważyć zmianę tej odległości w zależności od wielkości próbek lub specyfikacji elektrod.
  4. Delikatnie nakłuć najpłytszą warstwę serca igłą w pipecie ustnej. Ostrożnie nanieść 1-2 µL mieszaniny plazmidów i wyjąć igłę. Można wykonać kilka wstrzyknięć, aby zapewnić optymalną penetrację oraz zwiększyć liczbę elektroporowanych komórek.
  5. Przytrzymać elektrody tak, aby serce znajdowało się pomiędzy oboma biegunami (Rycina 3C). Następnie przeprowadzić elektroporację serca zgodnie z powyższymi parametrami.
    UWAGA: Aby zapewnić maksymalną wydajność elektroporacji, można zmienić polaryzację elektrod i podać kolejny impuls.
  6. Przenieść elektroporowane serce do nowej płytki 12-dołkowej zawierającej 1 mL pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
  7. Powtarzać kroki 3.1 do 3.6, aż wszystkie próbki w eksperymencie zostaną poddane elektroporacji. Na koniec inkubować wszystkie serca w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, przez 24 h lub do czasu analizy.
    UWAGA: W naszych badaniach serca mogły pozostawać w hodowli do 48 h bez widocznych oznak pogorszenia stanu (Supplementary Movie 1; Supplementary Movie 2; Supplementary Figure 1).

Schemat układu do elektroporacji z szalką Petriego i elektrodami, metoda wprowadzania DNA do komórek.
Rysunek 3: Układ do elektroporacji. (A) Układ zastosowany do elektroporacji. Czerwone strzałki wskazują elektroporator, elektrody oraz szalkę Petriego, w której przeprowadzono elektroporację serc. (A') Powiększony szczegół igły do elektroporacji, zaznaczonej na obrazie (A) białym prostokątem. (B) Szczegół dostosowanej odległości elektrod zastosowanych w przypadku serc w stadium E12.5. (C) Schematyczne przedstawienie procesu elektroporacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Sortowanie komórek i analiza immunohistochemiczna

  1. Do analizy sortowania komórek z próbek przygotuj medium do trawienia w celu dysocjacji tkanki, mieszając 400 µL liberazy (5 mg/ml), 300 µL dispazy (0,1 g/mL), 4 µL CaCl2 (0,4 µM), 50 µL MgCl2 (5 µM) i uzupełniając objętość do 10 mL za pomocą DMEM. Przechowuj w lodzie do momentu użycia. Każde serce wymaga około 1 mL medium do trawienia. Dostosuj objętości do liczby próbek.
    UWAGA: W przypadku immunohistochemii utrwal serca bezpośrednio w 1,5 mL 4% PFA przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Następnego dnia przemyj serca 3x PBS i przystąp do dalszych procedur histologicznych oraz barwienia immunologicznego. Szczegółowy protokół immunohistochemiczny znajduje się w pracy Morris et al.22.
  2. Przenieś każde serce do nowej probówki zawierającej 1 mL schłodzonego medium do trawienia.
  3. Aby ułatwić dysocjację, posiekaj tkankę, delikatnie naciskając strzykawką 3-4 razy, a następnie natychmiast inkubuj na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, przy 600 rpm przez 45 min.
  4. Przefiltruj mieszaninę trawienną przez sito komórkowe 70 µm do nowej probówki i pozwól jej spłynąć grawitacyjnie. Następnie odzyskaj przefiltrowaną objętość i przefiltruj ją ponownie przez sito komórkowe 40 µm do nowej probówki 50 mL.
  5. Dodaj 500 µL płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i uzupełnij objętość do 30 mL, używając zimnego DMEM.
  6. Wirowaj mieszaninę przy 240 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  7. Odlej supernatant i postaw probówkę 50 mL dnem do góry na ręczniku papierowym, aby całkowicie ją osuszyć.
    UWAGA: Jest to dogodny moment na przerwanie eksperymentu poprzez zamrożenie osadu komórkowego. W takim przypadku resuspenduj komórki w FBS z dodatkiem 10% DMSO i przechowuj w -80 °C.
  8. Do sortowania komórek resuspenduj komórki w 300 µL buforu do sortowania (1% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny w PBS) i dodaj 0,3 µL DAPI (1000x). Przeprowadź sortowanie komórek.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność tej techniki w przeprowadzaniu eksperymentów typu gain-of-function (GOF) dla istotnych regulatorów rozwoju serca, przeprowadzono elektroporację konstruktu nadekspresującego czynnik transkrypcyjny Meis1. W tym celu wyekstrahowano RNA z embrionów w stadium E9.5, a następnie przeprowadzono odwrotną transkrypcję w celu otrzymania komplementarnego DNA (cDNA). Wykorzystując cDNA jako matrycę, sekwencję kodującą Meis1 sklonowano (Tabela uzupełniająca 1) do plazmidu ekspresyjnego pCAG (dalej określanego jako pCAG::Meis1), natomiast jako kontrolę zastosowano plazmid konstytutywnie ekspresujący GFP (pCAG::GFP). Następnie serca poddano elektroporacji samym pCAG::GFP lub pCAG::GFP w połączeniu z pCAG::Meis1.

Po 24 h od elektroporacji (hpe) serca biły i wydawały się być w dobrym stanie (Rycina 4A; Film uzupełniający 1; Film uzupełniający 2). Aby ocenić żywotność elektroporowanych komórek, przeanalizowano apoptozę poprzez barwienie immunohistochemiczne kaspazy 3. Chociaż w sercu wykryto niektóre komórki dodatnie, stwierdzono, że ani mięsień sercowy, ani epicardium, w którym znajduje się większość elektroporowanych komórek, nie zostały dotknięte apoptozą (Rycina uzupełniająca 1C). Podczas oceny aktywności fluorescencyjnej zaobserwowano mozaikowy sygnał GFP w prawie wszystkich czterech jamach serca, co wskazuje, że protokół ten pozwala na dotarcie do większości struktur serca (Rycina 4A). Aby ustalić, które typy komórek serca zostały poddane elektroporacji, serca elektroporowane pCAG::GFP poddano immunobarwieniu przeciwko markerom epicardium, WT12, oraz mięśnia sercowego, MF2023, a następnie obrazowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego (Rycina 4B). Większość komórek GFP+ znajdowała się preferencyjnie w zewnętrznym regionie serca, co w dużej mierze odpowiadało sygnałowi WT1, wskazując, że metoda ta jest najskuteczniejsza w docieraniu do komórek epicardium (Rycina 4B, białe groty strzałek).

Z drugiej strony, serca poddane elektroporacji pCAG::Meis1 lub grupą kontrolną (tylko pCAG::GFP) poddano dysocjacji, a następnie zastosowano fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) w celu wyizolowania komórek GFP+ z całego narządu, zgodnie z opisem w kroku 4 protokołu. Z posortowanych komórek wyekstrahowano RNA, a następnie przeprowadzono ilościową PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), aby ocenić poziomy ekspresji Meis1 w transfected komórkach (Rysunek 4C, Tabela uzupełniająca 1). Całkowitą ekspresję genu Meis1 znormalizowano przy użyciu poziomów ekspresji mysiego genu gospodarza Eef224, a względną ekspresję genu obliczono metodą ΔΔCt25. Zaobserwowano istotny wzrost poziomów RNA Meis1 w sercach elektroporowanych plazmidem pCAG::Meis1 w porównaniu do tych z samym plazmidem pCAG::GFP (Rysunek 4C). W ten sposób wykazano potencjał tej techniki do nadekspresji interesujących genów i badania efektów molekularnych.

Rozwój jam serca z immunofluorescencją; wykres przedstawia analizę ekspresji Meis1.
Rysunek 4: Analiza molekularna elektroporowanych serc z E12.5 . (A) Fluorescencja GFP jednego serca elektroporowanego CAG::GFP 24 h po elektroporacji. Dolny obraz pokazuje fluorescencję GFP, natomiast górny obraz przedstawia nałożenie fluorescencji GFP i obrazu w jasnym polu tego samego serca. (B) Immunofluorescencja histologicznych przekrojów elektroporowanego serca E12.5. MF20 znakuje kardiomiocyty, natomiast WT1 znakuje komórki epikardium. Obrazy po prawej stronie odpowiadają powiększeniu białego prostokąta. Białe groty strzałek wskazują komórki GFP+ zlokalizowane w epikardium, ograniczonym umownie białą przerywaną linią. (C) Analiza RT-qPCR serc elektroporowanych pCAG::Meis1 lub pCAG::GFP (kontrola). Każda kropka reprezentuje powtórzenie biologiczne otrzymane z połączenia trzech serc. Łącznie analiza qPCR była przeprowadzana w trzech powtórzeniach z trzema odrębnymi powtórzeniami biologicznymi. Analizę statystyczną wykonano za pomocą testu t Studenta (*P < 0.05). Paski skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek dodatkowy 1: Efektywność elektroporacji serca i żywotność komórek. (A) Ekspresja GFP w dwóch oddzielnych sercach zarodków E12.5 poddanych elektroporacji kontrolnym plazmidem pCAG::GFP w 24 h lub 48 h po elektroporacji (hpe). Obraz sygnału GFP został nałożony na obraz w jasnym polu tego samego serca. (B) Ilościowe oznaczenie komórek GFP+ w sercach w 24 hpe i 48 hpe poddanych elektroporacji kontrolnym pCAG::GFP. Kropki oznaczają poszczególne próbki; linie ciągłe wskazują średnią, a słupki błędu odchylenie standardowe. Nie zaobserwowano istotnych różnic między oboma warunkami (nieparametryczny t-test; P > 0,9). (C) Obraz konfokalny serca E12.5 poddanego elektroporacji pCAG::GFP z immunobarwieniem na rozszczepioną kaspazę 3 oraz MF20. Linia przerywana reprezentuje warstwę mięśniową serca. Obrazy po prawej stronie stanowią powiększenie zaznaczonego białym prostokątem obszaru. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie i sekwencje starterów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1: Serce po elektroporacji pCAG::GFP po 24 h.Film przedstawiający jedno serce elektroporowane kontrolnym plazmidem pCAG::GFP 24 h po zabiegu. Serce nadal bije, a elektroporowane komórki wykazują sygnały GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Serce po elektroporacji pCAG::GFP po 48 h. Film przedstawiający serce poddane elektroporacji kontrolnym pCAG::GFP, 48 h po zabiegu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj metodologia oferuje solidne ramy do ekspresji konstruktów transgenicznych w rozwijającym się nasierdziu (Figura 4B), jak wykazano w przypadku nadekspresji Meis1 (Figura 4C). Dzięki odpowiednim konstruktom, protokół ten może być używany do przejściowej oceny wpływu wzmocnienia funkcji (GOF) lub utraty funkcji (LOF) określonego genu. LOF można zaimplementować do techniki poprzez transfekcję plazmidu ukierunkowanego na gen kandydujący poprzez interferencję RNA26. Szybka ocena genu GOF lub LOF jest szczególnie korzystna, zwłaszcza biorąc pod uwagę dużą heterogeniczność transkryptomiczną komórek nasierdzia12, co sprawia, że niepraktyczne jest generowanie transgenicznych zwierząt w celu indywidualnej oceny każdego genu kandydującego.

Ponieważ protokół ten wykorzystuje hodowlę ex vivo, daje możliwość zbadania losu komórek nasierdzia w oknie czasowym. Rozwijające się nasierdzie odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu odrębnych regionów w dorosłym sercu 13,27,28; Tak więc zrozumienie jego wkładu w rozwój serca jest kluczowe w analizie podstaw wrodzonych wad rozwojowych serca. Chociaż ten artykuł nie zagłębia się w tę aplikację, wytyczne przedstawione w protokole mogą być potencjalnie pomocne w przyszłych badaniach mapowania losu nasierdzia

Pomimo praktycznej użyteczności obecnej metody, należy przyznać się do pewnych ograniczeń. Ponieważ metodologia ta opiera się na przejściowej transgenezie, ekspresja plazmidu może zostać utracona lub zmniejszona w czasie, co ogranicza zakres protokołu do badania określonego okna rozwojowego29. Jednak w tym badaniu nadekspresja GFP utrzymywała się przez cały czas trwania kultur po elektroporacji (48 hpe). Ponadto potencjalne ograniczenia obecnych technologii hodowli ex vivo utrudniają zastosowanie tej metody do oceny późnych etapów rozwoju embrionalnego lub pourodzeniowego, zwłaszcza tam, gdzie hodowla ex vivo po elektroporacji staje się wyzwaniem30. Chociaż istnieją bardziej wyrafinowane metody hodowli zarodków ex vivo 31,32, mogą one wymagać użycia sprzętu, który jest mniej dostępny dla badaczy i mogą nie gwarantować przeżycia próbki.

Chociaż przedstawiony tutaj protokół został zaprojektowany tak, aby był tak prosty, jak to tylko możliwe, aby zwiększyć odtwarzalność, zawiera kluczowe kroki, które mają zasadnicze znaczenie dla sukcesu. Po pierwsze, sekcja zarodków musi być przeprowadzona ostrożnie i szybko, aby zminimalizować uszkodzenia serca, które mogą zagrozić przetrwaniu narządu po elektroporacji. Zdecydowanie zaleca się zachowanie szczególnej ostrożności na tym etapie, wraz z użyciem optymalnego sprzętu do preparacji. Innym krytycznym aspektem protokołu jest wykonanie samej elektroporacji, ponieważ nieodpowiednie wstrzyknięcie plazmidu może skutkować niepożądanymi skutkami. Dlatego zaleca się wykonanie wielu wstrzyknięć na jedno serce, a wstrzyknięcie próbki w dość powierzchowny sposób może być korzystne dla zwiększenia przeżywalności narządów. Wreszcie, dysocjacja komórek podczas przetwarzania serca musi być rygorystycznie przeprowadzona, przestrzegając czasów przewidzianych w protokole, aby zmaksymalizować żywotność komórek.

Podsumowując, identyfikacja kluczowych genów odpowiedzialnych za powstawanie serca ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wrodzonych chorób serca i regeneracji. Opracowana w ten sposób metodologia pozwala na szybkie badania przesiewowe efektów wzmocnienia funkcji genów (GOF) i utraty funkcji (LOF) w rozwijającym się sercu. Uznając pewne ograniczenia, metoda ta wykazuje znaczny potencjał w zakresie ekstrapolacji na różne etapy rozwoju lub mapowania losów embrionalnych komórek nasierdziowych. Poprzez wizualne wskazówki zawarte w tym artykule, staramy się zaoferować cenny zestaw narzędzi do oceny ogromnej złożoności i potencjału rozwijającego się nasierdzia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant RTI2018-097617-J-I00 z hiszpańskiego Ministerio de Ciencia e Innovación i Acción 9 z Universidad de Jaén do O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 z hiszpańskiego Ministerio de Ciencia e Innovación oraz grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 z programu UE Horyzont 2020 dla M.T. JMG było wspierane przez stypendium doktoranckie z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Zarówno CNIC, jak i CBMSO są wspierane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, a CNIC jest wspierane przez Fundację ProCNIC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#55 KleszczeDumont 11295-51
12-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnemStół imadła BD Falcon353043
35 mm Grandado8798771617573
40 & mikro; m Sitko do komórekFischer Scientific08-771-1
Probówki 50 mlBD Falcon352070
70 µ m Sitko komórkoweCorningCLS431751
Przeciwciało poliklonowe anty-GFPInvitrogenA102621:1000 zastosowane
przeciwciało monoklonalne anty-miozyny 4 (MF20)Invitrogen14-6503-821:500 rozcieńczenie
CD1 Wild Dostarczaneprzez Animalary Unit (CNIC)
Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) Sygnalizacjakomórkowa przeciwciała Technologie9661Zastosowano rozcieńczenie 1:400
DAPITechnologie sygnalizacji komórkowej4083Zastosowano rozcieńczenie 1:1000
Dypaza/kolagenazaRoche10269638001
Woda
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen10438-026
Inkubator CO2 Heracell 150iTermo Scientific51032720
Mikroskop stereoskopowy Leica S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
model P-97Instrument SutterSU-P-97
Plazmid ekspresji pCAGAddgene#89689
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15070-063
Szalki Petriego 35 & razy; 10 mmBD Falcon351008
szalki Petriego 60 & razy; 15 mmBD Falcon353002
Phenol RedMerckP3532
KońcówkiPonownie wykorzystane ze starego sprzętu laboratoryjnego
Hodowla surowicy szczurzej zarodek, samce szczurów SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Rekombinowane przeciwciało anty-Wilms Tumor Protein 1 (WT1)Abcamab899011:300 Rozcieńczenie
Elektroporator o fali kwadratowej CUY21SCNepa GeneCUY664-10X15
Sterylny PBSDostarczony i autoklawowany przez jednostkę techniczną
Sacharoza Millipore84100
Pęseta elektrody ze zmiennym odstępemNepa GeneCUY650P5
Jednostka SKU destylowana Ściągacz do mikropipet do pipet używane

Bibliografia

  1. Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
  2. Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), 2986(2021).
  3. Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).
  4. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668(2017).
  5. Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
  6. Zimmerman, M. S., et al. regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
  7. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
  8. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  9. Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
  10. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  11. Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692(2012).
  12. Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921(2021).
  13. Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).
  14. Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).
  15. Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).
  16. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).
  17. Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
  18. Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
  19. Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
  20. Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  21. Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
  22. Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  23. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).
  24. Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
  27. Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
  28. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
  29. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165(2021).
  30. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
  31. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  32. Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. (75), e50359(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transgeneza myszyrozwój sercaelektroporacja sercatransfekcja plazmidowakomórki progenitorowesortowanie komórekkomórki epikardialneanaliza fluorescencyjna
Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.