Artykuł metodologiczny

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

DOI:

10.3791/66754

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  , 
1Tissue and Organ Homeostasis Program, Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO), 2Cardiovascular Regeneration Program, National Cardiovascular Research Center (CNIC), 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), 4Department of Experimental Biology, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce ssaków jest złożonym organem powstałym podczas rozwoju przez bardzo zróżnicowane populacje komórek progenitorowych. Pochodzenie, czas rekrutacji, oraz losy tych przodków są istotne dla prawidłowego rozwoju tego organu. Mechanizmy molekularne, które rządzą morfogenezą serca, są niezbędne do zrozumienia patogenezy wrodzonych chorób serca i regeneracji serca w zarodku. Klasyczne podejścia do badania tych mechanizmów wykorzystywały pokolenie transgenicznych myszy do oceny funkcji określonych genów podczas rozwoju serca. Jednak transgeneza myszy jest złożonym, czasochłonnym procesem, którego często nie można przeprowadzić w celu oceny roli określonych genów podczas rozwoju serca. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół wydajnej elektroporacji i hodowli embrionalnych serc myszy, umożliwiając transgenezę przejściową w celu szybkiej oceny wpływu wzmocnienia lub utraty funkcji genów zaangażowanych w rozwój serca. Korzystając z tej metodologii, udało nam się nadeksprymować Meis1 w sercu embrionalnym, z preferencją dla transfekcji komórek nasierdzia, demonstrując możliwości tej techniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce jest pierwszym organem powstałym podczas rozwoju embrionalnego. Proces ten obejmuje czasoprzestrzenną koordynację różnych populacji komórek progenitorowych z różnych obszarów zarodka. Wszystko to dzieje się, gdy rozwijające się serce nadal bije i funkcjonuje, podkreślając niezwykłą koordynację wymaganą do jego powstania1,2,3. Biorąc pod uwagę kluczową rolę serca, ścisła regulacja na poziomie komórkowym i molekularnym jest niezbędna do jego prawidłowego powstawania4,5. Identyfikacja mechanizmów kontrolujących rozwój serca była bardzo interesująca, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla rozwikłania wrodzonych wad serca, które dotykają znaczną liczbę pacjentów na całym świecie6. Co więcej, zrozumienie rozwoju serca ma kluczowe znaczenie w rozszyfrowaniu regeneracji serca, ponieważ serca ssaków po urodzeniu zachowują zdolność regeneracyjną, która jest tracona lub utrudniona w wieku dorosłym7,8. W związku z tym analiza molekularnych regulatorów rozwoju serca jest niezbędna do przyspieszenia prac badawczych nad wrodzonymi wadami serca i regeneracją serca.

Dążąc do tego celu, coraz większy nacisk kładziono na badanie roli nasierdzia w rozwoju i regeneracji serca9. Nasierdzie to cienka warstwa tkanki międzybłonka, która stanowi najbardziej zewnętrzną warstwę serca ssaka (Ryc. 1). Ostatnie badania wykazały znaczenie nasierdzia podczas uszkodzenia serca, ujawniając, że tkanka ta jest w stanie wysyłać sygnały proliferacji do kardiomiocytów w dotkniętym obszarze, aby złagodzić uszkodzenia10,11. Pomimo znaczenia nasierdzia, prowadzenie dalszych badań molekularnych było wyzwaniem ze względu na jego ogromną niejednorodność. Eksperymenty z pojedynczym komórkowym RNAseq ujawniły heterogeniczność nasierdzia, w którym znajduje się wiele subpopulacji komórek o różnych sygnaturach transkryptomicznych12,13,14,15,16. W związku z tym strategia badań przesiewowych potencjalnych regulatorów rozwoju serca powinna uwzględniać różnorodność komórek progenitorowych nasierdzia.

W tym sensie, podatność modelu mysiego na modyfikacje genetyczne ułatwiła identyfikację wielu genów kluczowych dla rozwoju serca, umożliwiając generowanie zmutowanych linii z zyskiem funkcji (GOF) lub utratą funkcji (LOF) określonych genów. Podejścia te wiążą się jednak ze znacznymi inwestycjami czasu i zasobów eksperymentalnych; W związku z tym są one niepraktyczne przy ocenie roli dużej liczby genów kandydujących. Poza tym geny rozwojowe często pełnią funkcje plejotropowe w różnych tkankach lub są niezbędne do wczesnego rozwoju embrionalnego, co utrudnia interpretację ich wkładu w rozwój w określonym procesie. Chociaż możliwe jest ukierunkowanie funkcji genów na określone struktury lub punkty czasowe rozwoju, zwykle wymaga to użycia bardziej złożonych konstrukcji genetycznych, które mogą być trudne do wygenerowania lub są ogólnie niedostępne.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, przedstawiamy metodologię elektroportowania embrionalnych serc myszy do transgenezy przejściowej (Rysunek 2). W połączeniu z hodowlą ex vivo i sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS), strategia ta demonstruje swoje możliwości dzięki przejściowemu GOF Meis1, dobrze scharakteryzowanemu genowi zaangażowanemu w rozwój i regenerację serca17,18,19. W tym artykule omówiono również inne potencjalne zastosowania tej metodologii oraz omówiono jej zalety i ograniczenia, a także porównano je z istniejącymi protokołami przejściowej modulacji ekspresji genów. Wierzymy, że przedstawione ramy i przykłady wizualne poprawią zrozumienie biologii nasierdzia podczas rozwoju i choroby.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Warstwy serca embrionalnego myszy. Schemat ideowy widoku koronalnego embrionalnego serca myszy E13-14. Trzy główne warstwy komórkowe serca są reprezentowane w kolorze żółtym (wsierdzie), czerwonym (mięsień sercowy) i niebieskim (nasierdzie). Osierdzie jest reprezentowane przez brązową linię. Cztery komory serca są w skrócie LV, lewa komora; RV, prawa komora; LA, lewe przedsionek; RA, prawe przedsionek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schematyczny przegląd protokołu elektroporacji serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach CNIC i były zgodne z obowiązującym ustawodawstwem, w tym z Dyrektywą UE 2010/63UE i Zaleceniem 2007/526/WE, zgodnie z prawem hiszpańskim na mocy Real Decreto 53/2013. Do tego protokołu wykorzystano samice myszy CD-1 typu dzikiego w wieku 15-21 tygodni. Szczegółowe informacje dotyczące zwierząt, odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie plazmidu i narzędzia

  1. Najpierw przygotuj mieszankę do elektroporacji, dodając żądany plazmidowy DNA do lodu o końcowym stężeniu 1 μg/μL. Następnie uzupełnij mieszankę, dodając sacharozę o stężeniu końcowym 6% (rozpuszczoną w PBS), biokompatybilny barwnik o stężeniu 0,01% i uzupełnij PBS aż do uzyskania końcowej objętości 30 μL,
    UWAGA: Na próbkę zużywa się około 1-2 μl mieszanki do elektroporacji. Skaluj proporcje mieszanki do elektroporacji w zależności od liczby próbek w eksperymencie. Należy pamiętać, że DNA do elektroporacji powinno być oczyszczone z hodowli bakteryjnej, zapewniając optymalną stabilność i minimalne zanieczyszczenia. Aby uzyskać więcej informacji na temat plazmidów użytych w tym badaniu, zapoznaj się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników.
  2. Przygotuj pożywkę wzrostową, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2% buforu Hepes i 1% penicyliny/streptomycyny. Przechowywać pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu użycia. Dodatkowo ogrzej 1x PBS w temperaturze 37 °C, razem z pożywką.
  3. Przygotować igły, rozciągając szklaną kapilarnę o średnicy 20 μm za pomocą ściągacza do pipet w następujących warunkach: ciepło = 550; ciągnięcie = 100; prędkość = 250; czas = 120. Ostateczna średnica po wyciągnięciu powinna wynosić około 5-8 μm.
  4. Ustaw parametry elektroporatora na pięć cykli 50 ms przy 40 V w odstępach 900 ms. Przygotuj elektrody, pipetę do ust i igłę (Rysunek 3A). Wyposaż pipetę w igłę, aby załadować DNA (Rysunek 3A).

2. Sekcja zarodków i ekstrakcja serca

  1. Skonfiguruj krzyżówkę między myszami CD-1 typu dzikiego. Następnego ranka wybierz samice, które mają czop pochwowy i zanotuj ten czas jako dzień embrionalny E0.5. Poddać zwierzęta eutanazji w dniu embrionalnym E12-12.5 przez zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  2. Ostrożnie wyjmij macicę z myszy i umieść ją w suchym ręczniku papierowym. Następnie przeciąć macicę cienkimi nożyczkami, wkładając końcówkę nożyczek w stronę mesometrialu i powoli przesuwając krawędź ostrza na całej długości. Odsłoń deciduae i przenieś je na podłoże wzrostowe. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz pracę Behringer et al.20.
  3. Rozciąć deciduae, aby wyekstrahować zarodki, a następnie umieścić zarodki na 60-milimetrowej szalce Petriego z ciepłym podłożem wzrostowym. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie odetnij ogon i głowę zarodka, aby pozostał tylko tułów ciała. Stadium zarodków można zweryfikować, oceniając cechy anatomiczne, jak opisali Wong et al.21.
  4. Następnie należy ostrożnie usunąć jak najwięcej tkanki z pnia zarodka, nie uszkadzając serca ani tętnic płucnych i aorty. Po wystawieniu serca należy je natychmiast umieścić w nowym, ciepłym podłożu i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu elektroporacji.
    UWAGA: Utrzymanie temperatury serca ma kluczowe znaczenie dla jego przetrwania. Upewnij się, że podłoże jest zawsze ciepłe i wymieniaj je co 5-10 minut. Z drugiej strony, z próbkami można obchodzić się bez zachowania sterylności, ponieważ nie wpłynie to na skuteczność procedury. Należy pamiętać, że pożywka wzrostowa zawiera antybiotyki.

3. Elektroporacja serca i posiew ex vivo

  1. Załadować około 10 μl mieszanki plazmidowej (przygotowanej w kroku 1.1) do igły, ostrożnie odsysając pipetą doustną.
  2. Przygotuj pojedyncze serce do elektroporacji, umieszczając je na czystej szalce Petriego o średnicy 60 mm ze sterylnym 1x PBS podgrzanym do 37 °C. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 3A).
  3. Przygotuj elektrody, regulując odległość między biegunami dodatnim i ujemnym do około 4 mm (Rysunek 3B).
    UWAGA: 4 mm to odległość apertury, w której mieszczą się serca myszy E12.5 w elektrodach używanych w tej pracy. Rozważ zmianę tej odległości w oparciu o różne rozmiary próbek lub specyfikacje elektrod.
  4. Delikatnie nakłuć najbardziej powierzchowną warstwę serca za pomocą igły w pipecie do ust. Ostrożnie odpipetować 1-2 μl mieszanki plazmidowej i wyjąć igłę. Można wykonać wielokrotne iniekcje, aby zapewnić optymalną penetrację, a także zwiększyć liczbę elektroporowanych ogniw.
  5. Przytrzymaj elektrody na miejscu, tak aby serce znajdowało się pomiędzy obydwoma biegunami (Rysunek 3C). Następnie należy naelektryzować serce w warunkach określonych powyżej.
    UWAGA: Aby zapewnić maksymalną wydajność elektroporacji, istnieje możliwość zmiany biegunowości elektrod i podania kolejnego impulsu.
  6. Przenieść elektroporowane serce na nową 12-dołkową płytkę zawierającą 1 ml pożywki wzrostowej i umieścić ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Powtarzaj kroki od 3.1 do 3.6, aż wszystkie próbki w eksperymencie zostaną poddane elektroporacji. Na koniec inkubować wszystkie serca w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny lub do analizy.
    UWAGA: W naszych rękach serca można było pozostawić w kulturze do 48 godzin bez widocznych oznak zepsucia (Film uzupełniający 1; Film uzupełniający 2; Rysunek uzupełniający 1).

figure-protocol-1
Rysunek 3: Konfiguracja elektroporacji. (A) Zestaw używany do elektroporacji. Czerwone strzałki wskazują elektroporator, elektrody i szalkę Petriego, na której elektroporowane są serca. (A') Zbliż się do szczegółów igły do elektroporacji, jak podkreślono w (A) białym prostokątem. (B) Szczegóły dotyczące skorygowanej odległości elektrod stosowanych w sercach E12.5. (C) Schematyczne przedstawienie elektroporacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Sortowanie komórek i analiza immunohistochemiczna

  1. Do analizy sortowania komórek próbek należy przygotować pożywkę wytrawiającą w celu dysocjacji tkanki poprzez zmieszanie ze sobą 400 μl liberazy (5 mg/ml), 300 μl dypazy (0,1 g/ml), 4 μl CaCl2(0,4 μM), 50 μl MgCl2(5 μM) i uzupełnić do 10 ml DMEM. Trzymaj na lodzie do czasu użycia. Każde serce potrzebuje około 1 ml pożywki trawiącej. Dostosuj objętości w zależności od liczby próbek.
    UWAGA: W przypadku immunohistochemii należy bezpośrednio umieścić serca w 1,5 ml 4% PFA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia umyj serca 3x PBS i przystąp do dalszych procedur histologicznych i barwienia immunologicznego. Szczegółowy protokół immunohistochemiczny można znaleźć w Morris et al.22.
  2. Przenieś każde serce w kulturze do nowej probówki zawierającej 1 ml lodowatej pożywki do wytrawiania.
  3. Aby ułatwić dysocjację, posiekaj tkankę, delikatnie nakładając strzykawkę 3-4 razy i natychmiast inkubuj na gorącej płycie w temperaturze 37 °C, 600 obr./min przez 45 minut.
  4. Przefiltrować mieszankę wytrawiającą przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do nowej probówki i pozostawić ją opróżnioną przez przepływ grawitacyjny. Następnie uratuj objętość przepustową i przefiltruj ją ponownie za pomocą sitka o pojemności 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Dodać 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i uzupełnić do 30 ml za pomocą zimnego DMEM.
  6. Odwirować mieszaninę przy 240 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wyrzuć supernatant i umieść probówkę o pojemności 50 ml do góry nogami na ręczniku papierowym do całkowitego wyschnięcia.
    UWAGA: Jest to wygodny moment do wstrzymania eksperymentu poprzez zamrożenie osadu komórkowego. Jeśli tak, ponownie zawiesić ogniwa z 10% DMSO w FBS i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  8. W celu sortowania komórek należy ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu sortującego (1% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny w PBS) i dodać 0,3 μl DAPI (1000x). Wykonaj sortowanie komórek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować skuteczność tej techniki w przeprowadzaniu eksperymentów z wzmocnieniem funkcji (GOF) dla odpowiednich regulatorów rozwoju serca, konstrukt został poddany elektropoturowaniu nadekspresji czynnika transkrypcyjnego Meis1. Aby to osiągnąć, wyekstrahowano RNA z zarodków E9,5 i przeprowadzono odwrotną transkrypcję w celu uzyskania komplementarnego DNA (cDNA). Używając cDNA jako matrycy, sekwencja kodująca Meis1 została sklonowana (Tabela uzupełniająca 1) do plazmidu ekspresji pCAG (zwanego dalej pCAG::Meis1), podczas gdy konstytutywny plazmid eksprymujący GFP (pCAG::GFP) został użyty jako kontrola. Serca były następnie elektroporowane za pomocą tylko pCAG::GFP lub w połączeniu z pCAG::Meis1.

Po 24 godzinach od elektroporacji (hpe), serca biły i wydawały się być w dobrym stanie (Rysunek 4A; Film uzupełniający 1; Film uzupełniający 2). Aby ocenić żywotność elektroporowanych komórek, analizowano apoptozę poprzez immunohistochemiczne barwienie kaspazy 3. Chociaż niektóre dodatnie komórki wykryto w sercu, ani mięsień sercowy, ani nasierdzie, gdzie znajduje się większość komórek elektroporowanych, nie stwierdzono, aby były dotknięte apoptozą (rysunek uzupełniający 1C). Kiedy oceniano aktywność fluorescencji, zaobserwowano mozaikowy sygnał GFP w prawie wszystkich czterech komorach serca, co wskazuje, że protokół ten jest w stanie dotrzeć do większości struktur serca (Figura 4A). Aby określić, które typy komórek serca zostały poddane elektroporacji, serca pCAG::GFP-elektroporowane poddano barwieniu immunologicznemu na podstawie markerów nasierdzia, WT12 i mięśnia sercowego, MF2023, a następnie zobrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego (Figura 4B). Większość komórek GFP+ była preferencyjnie zlokalizowana w zewnętrznym obszarze serca, co w dużej mierze odpowiadało sygnałowi WT1, co wskazuje, że ta metoda jest najbardziej skuteczna w docieraniu do komórek nasierdzia (Figura 4B, białe groty strzałek).

Z drugiej strony, serca pCAG::Meis1-elektroporowane lub kontrolne (tylko pCAG::GFP) zostały zdysocjowane, a komórki zostały poddane sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) w celu wyizolowania komórek GFP+ z całego narządu, jak opisano w kroku 4 protokołu. RNA wyekstrahowano z posortowanych komórek i przeprowadzono ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) w celu oceny poziomów ekspresji Meis1 w transfekowanych komórkach (Figura 4C, Tabela uzupełniająca 1). Całkowita ekspresja genu Meis1 została znormalizowana przy użyciu poziomów ekspresji mysiego genu porządkowego Eef224, a względną ekspresję genu obliczono przy użyciu metody ΔΔCt25. Znaczącą regulację w górę poziomów RNA Meis1 zaobserwowano w sercach poddanych elektroporacji plazmidem pCAG::Meis1 w porównaniu z tymi, w których zastosowano tylko plazmid pCAG::GFP (Ryc. 4C). Pokazuje to zatem potencjał tej techniki w zakresie nadekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania i zajęcia się wynikiem molekularnym.

figure-results-1
Rysunek 4: Analiza molekularna elektroporowanych serc E12.5. (A) Fluorescencja GFP jednego serca poddanego elektroporacji GFP 24 godziny po elektroporacji. Dolny obraz pokazuje fluorescencję GFP, podczas gdy górny obraz pokazuje połączenie GFP i jasnego pola tego samego serca. (B) Immunofluorescencja elektroporowanych wycinków histologicznych serca E12,5. MF20 oznacza kardiomiocyty, podczas gdy WT1 oznacza komórki nasierdzia. Obrazy po prawej stronie odpowiadają powiększeniom białego prostokąta. Białe groty strzałek wskazują komórki GFP+ znajdujące się w nasierdziu, z grubsza ograniczone przerywaną białą linią. (C) Analiza RT-qPCR serc poddanych elektroporacji za pomocą pCAG::Meis1 lub pCAG::GFP (kontrola). Każda kropka reprezentuje biologiczną replikę uzyskaną z połączenia trzech serc. W sumie analizę qPCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach z trzema odrębnymi kontrpróbami biologicznymi. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta (*P < 0,05). Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wydajność elektroporacji serca i żywotność komórek. (A) Ekspresja GFP w dwóch różnych sercach E12.5 elektroporowanych plazmidem kontrolnym pCAG::GFP po 24 godzinach lub 48 godzinach po elektroporacji (hpe). Obraz sygnału GFP został nałożony na obraz jasnego pola tego samego serca. (B) Kwantyfikacja komórek GFP+ w sercach 24 hpe i 48 hpe poddanych elektroporacji kontrolnym pCAG::GFP. Kropki oznaczają wyraźne próbki; Linie ciągłe wskazują średnią, podczas gdy słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Nie zaobserwowano istotnej różnicy między obydwoma warunkami (nieparametryczny test t; P > 0,9). (C) Konfokalny obraz serca E12.5 elektroporowanego pCAG::GFP barwionego immunologicznie przeciwko rozszczepionej kaspazie 3 i MF20. Linia przerywana reprezentuje warstwę mięśnia sercowego serca. Obrazy po prawej stronie są powiększane od białego prostokąta. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie i sekwencje elementarne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1: pCAG::GFP-elektroporowane serce po 24 godzinach. Film przedstawiający jedno serce elektroporowane plazmidem kontrolnym pCAG::GFP 24 godziny po zabiegu. Serce nadal bije, a elektroporowane komórki wyrażają sygnały GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: pCAG::GFP-elektroporowane serce po 48 godzinach. Film przedstawiający elektroporowane serce z kontrolą pCAG::GFP, 48 godzin po elektroporacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj metodologia oferuje solidne ramy do ekspresji konstruktów transgenicznych w rozwijającym się nasierdziu (Figura 4B), jak wykazano w przypadku nadekspresji Meis1 (Figura 4C). Dzięki odpowiednim konstruktom, protokół ten może być używany do przejściowej oceny wpływu wzmocnienia funkcji (GOF) lub utraty funkcji (LOF) określonego genu. LOF można zaimplementować do techniki poprzez transfekcję plazmidu ukierunkowanego na gen kandydujący poprzez interferencję RNA26. Szybka ocena genu GOF lub LOF jest szczególnie korzystna, zwłaszcza biorąc pod uwagę dużą heterogeniczność transkryptomiczną komórek nasierdzia12, co sprawia, że niepraktyczne jest generowanie transgenicznych zwierząt w celu indywidualnej oceny każdego genu kandydującego.

Ponieważ protokół ten wykorzystuje hodowlę ex vivo, daje możliwość zbadania losu komórek nasierdzia w oknie czasowym. Rozwijające się nasierdzie odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu odrębnych regionów w dorosłym sercu 13,27,28; Tak więc zrozumienie jego wkładu w rozwój serca jest kluczowe w analizie podstaw wrodzonych wad rozwojowych serca. Chociaż ten artykuł nie zagłębia się w tę aplikację, wytyczne przedstawione w protokole mogą być potencjalnie pomocne w przyszłych badaniach mapowania losu nasierdzia

Pomimo praktycznej użyteczności obecnej metody, należy przyznać się do pewnych ograniczeń. Ponieważ metodologia ta opiera się na przejściowej transgenezie, ekspresja plazmidu może zostać utracona lub zmniejszona w czasie, co ogranicza zakres protokołu do badania określonego okna rozwojowego29. Jednak w tym badaniu nadekspresja GFP utrzymywała się przez cały czas trwania kultur po elektroporacji (48 hpe). Ponadto potencjalne ograniczenia obecnych technologii hodowli ex vivo utrudniają zastosowanie tej metody do oceny późnych etapów rozwoju embrionalnego lub pourodzeniowego, zwłaszcza tam, gdzie hodowla ex vivo po elektroporacji staje się wyzwaniem30. Chociaż istnieją bardziej wyrafinowane metody hodowli zarodków ex vivo 31,32, mogą one wymagać użycia sprzętu, który jest mniej dostępny dla badaczy i mogą nie gwarantować przeżycia próbki.

Chociaż przedstawiony tutaj protokół został zaprojektowany tak, aby był tak prosty, jak to tylko możliwe, aby zwiększyć odtwarzalność, zawiera kluczowe kroki, które mają zasadnicze znaczenie dla sukcesu. Po pierwsze, sekcja zarodków musi być przeprowadzona ostrożnie i szybko, aby zminimalizować uszkodzenia serca, które mogą zagrozić przetrwaniu narządu po elektroporacji. Zdecydowanie zaleca się zachowanie szczególnej ostrożności na tym etapie, wraz z użyciem optymalnego sprzętu do preparacji. Innym krytycznym aspektem protokołu jest wykonanie samej elektroporacji, ponieważ nieodpowiednie wstrzyknięcie plazmidu może skutkować niepożądanymi skutkami. Dlatego zaleca się wykonanie wielu wstrzyknięć na jedno serce, a wstrzyknięcie próbki w dość powierzchowny sposób może być korzystne dla zwiększenia przeżywalności narządów. Wreszcie, dysocjacja komórek podczas przetwarzania serca musi być rygorystycznie przeprowadzona, przestrzegając czasów przewidzianych w protokole, aby zmaksymalizować żywotność komórek.

Podsumowując, identyfikacja kluczowych genów odpowiedzialnych za powstawanie serca ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wrodzonych chorób serca i regeneracji. Opracowana w ten sposób metodologia pozwala na szybkie badania przesiewowe efektów wzmocnienia funkcji genów (GOF) i utraty funkcji (LOF) w rozwijającym się sercu. Uznając pewne ograniczenia, metoda ta wykazuje znaczny potencjał w zakresie ekstrapolacji na różne etapy rozwoju lub mapowania losów embrionalnych komórek nasierdziowych. Poprzez wizualne wskazówki zawarte w tym artykule, staramy się zaoferować cenny zestaw narzędzi do oceny ogromnej złożoności i potencjału rozwijającego się nasierdzia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant RTI2018-097617-J-I00 z hiszpańskiego Ministerio de Ciencia e Innovación i Acción 9 z Universidad de Jaén do O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 z hiszpańskiego Ministerio de Ciencia e Innovación oraz grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 z programu UE Horyzont 2020 dla M.T. JMG było wspierane przez stypendium doktoranckie z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Zarówno CNIC, jak i CBMSO są wspierane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, a CNIC jest wspierane przez Fundację ProCNIC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#55 KleszczeDumont 11295-51
12-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnemStół imadła BD Falcon353043
35 mm Grandado8798771617573
40 & mikro; m Sitko do komórekFischer Scientific08-771-1
Probówki 50 mlBD Falcon352070
70 µ m Sitko komórkoweCorningCLS431751
Przeciwciało poliklonowe anty-GFPInvitrogenA102621:1000 zastosowane
przeciwciało monoklonalne anty-miozyny 4 (MF20)Invitrogen14-6503-821:500 rozcieńczenie
CD1 Wild Dostarczaneprzez Animalary Unit (CNIC)
Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) Sygnalizacjakomórkowa przeciwciała Technologie9661Zastosowano rozcieńczenie 1:400
DAPITechnologie sygnalizacji komórkowej4083Zastosowano rozcieńczenie 1:1000
Dypaza/kolagenazaRoche10269638001
Woda
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen10438-026
Inkubator CO2 Heracell 150iTermo Scientific51032720
Mikroskop stereoskopowy Leica S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
model P-97Instrument SutterSU-P-97
Plazmid ekspresji pCAGAddgene#89689
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15070-063
Szalki Petriego 35 & razy; 10 mmBD Falcon351008
szalki Petriego 60 & razy; 15 mmBD Falcon353002
Phenol RedMerckP3532
KońcówkiPonownie wykorzystane ze starego sprzętu laboratoryjnego
Hodowla surowicy szczurzej zarodek, samce szczurów SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Rekombinowane przeciwciało anty-Wilms Tumor Protein 1 (WT1)Abcamab899011:300 Rozcieńczenie
Elektroporator o fali kwadratowej CUY21SCNepa GeneCUY664-10X15
Sterylny PBSDostarczony i autoklawowany przez jednostkę techniczną
Sacharoza Millipore84100
Pęseta elektrody ze zmiennym odstępemNepa GeneCUY650P5
Jednostka SKU destylowana Ściągacz do mikropipet do pipet używane

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
  2. Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), 2986(2021).
  3. Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).
  4. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668(2017).
  5. Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
  6. Zimmerman, M. S., et al. regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
  7. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
  8. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  9. Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
  10. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  11. Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692(2012).
  12. Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921(2021).
  13. Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).
  14. Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).
  15. Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).
  16. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).
  17. Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
  18. Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
  19. Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
  20. Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  21. Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
  22. Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  23. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).
  24. Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
  27. Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
  28. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
  29. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165(2021).
  30. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
  31. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  32. Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. (75), e50359(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transgeneza myszyrozw j sercaelektroporacja sercatransfekcja plazmidowakom rki progenitorowesortowanie kom rekkom rki epikardialneanaliza fluorescencyjna

Powiązane artykuły