Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Podsumowanie

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Streszczenie

Wścieklizna to śmiertelna choroba zoonotyczna wywołana przez wściekliznę wywołaną Lyssawirusem (RABV) oraz powiązane negatywne wirusy RNA z rodzaju Lyssavirus ( rodzina Rhabdoviridae). Test LN34 celuje w wysoce konserwowany region lidera i gen nukleoproteinowy genomu lizawirusa oraz wykorzystuje zdegradowane prymary oraz sondę TaqMan zawierającą zablokowane nukleotydy do wykrywania RNA w różnorodnym rodzaju lizawirusa . Negatywne wynik wścieklizny powinien być wykonany tylko po zbadaniu pełnego przekroju pnia mózgu i trzech płatów móżdżku; jednak identyfikacja RNA lizawirusa w jakiejkolwiek tkance jest diagnostyczna dla zakażenia wścieklizną. Tkanka jest zbierana i ujednoliczana w odczynniku TRIzolu, który również inaktywuje wirusa. Ekstrakcja RNA przeprowadza się za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji opartego na kolumnie spinowej. Mieszanki główne przygotowuje się w czystej przestrzeni i alicyta do płyty o pojemności 96 dołków przed dodaniem próbki RNA. W warunkach klinicznych każda próbka jest testowana RT-PCR w czasie rzeczywistym pod kątem obecności RNA lizawirusa w trzech egzemplarzach oraz pojedynczo na mRNA β -aktyny gospodarza. Dodatnia i ujemna kontrola są uwzględniane podczas ekstrakcji i kroków RT-PCR w czasie rzeczywistym protokołu. Analiza danych polega na ręcznej regulacji progów w celu standaryzacji wartości Ct w różnych przebiegach instrumentów. Pozytywne wyniki określa obecność typowego wzmocnienia w teście pan-lyssavirus (Ct ≤ 35). Wyniki negatywne wynikają z braku typowej amplifikacji w teście pan-lizawirusa oraz wykrycia mRNA β-aktyny gospodarza (Ct ≤ 33). Obserwacja wartości poza tymi zakresami lub niepowodzenie kontroli testu może unieważnić przeprowadzenie lub skutkować niejednoznacznymi wynikami dla próbki. Protokół należy ściśle przestrzegać, aby zapewnić wysoką czułość i swoistość testu. Modyfikacje proceduralne mogą wpływać na wydajność testu i prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych, fałszywie negatywnych lub nieinterpretowalnych.

Wprowadzenie

Protokół ten opisuje procedurę diagnostyki wścieklizny z wykorzystaniem testu reakcji łańcuchowej LN34 pan-lizawirusa w czasie rzeczywistym (RT-PCR) od pobrania próbki aż do interpretacji wyników. Procedura zostanie podzielona na trzy części: pobieranie próbek mózgu w związku z testem LN34 (Sekcja 1), ręczną ekstrakcję RNA opartą na kolumnie przy użyciu zestawu Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research R2051) (Sekcja 2) oraz LN34 RT-PCR w czasie rzeczywistym skonfigurowanego przy użyciu zestawu AgPath-ID One-Step RT-PCR (ThermoFisher Scientific AM1005) (Sekcja 3). Ekstrakcja RNA i RT-PCR mogą być wykonywane przy użyciu innych produktów, jednak zestawy należy zweryfikować przed użyciem, aby zapewnić odpowiednią ekstrakcję i amplifikację RNA lizawirusa.

Sekcja 1 opisuje zebranie odpowiednich tkanek mózgowych do wykorzystania w teście RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym. Opis sekcji zwłok zwierzęcia, dekapitacji i usunięcia mózgu nie jest uwzględniony. Próbki mogą zawierać czynniki zakaźne. Procedury bezpieczeństwa biologicznego opisane w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6th Edition¹ powinny być przestrzegane, aby ograniczyć ryzyko. Próbki powinny być uznane za zakaźne do czasu zakończenia inaktywacji. Inaktywacja wirusa i walidacja testów powinny być przeprowadzane w każdym laboratorium zgodnie ze standardami danej instytucji. Laboratoria powinny stosować standardowe procedury bezpieczeństwa i jakości określone przez ich instytucję podczas wdrażania nowego testu diagnostycznego.

Na podstawie tego, co wiadomo o rozprzestrzenianiu się wirusa wścieklizny podczas infekcji, pień mózgu i móżdżek są najlepszymi tkankami do diagnozowania wścieklizny, a te tkanki są zalecane do testów na wściekliznę przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt oraz Światową Organizację Zdrowia Zwierząt 2,3,4,5. Ponieważ rozprzestrzenianie się wirusa może być jednostronne (Rysunek 1), zwłaszcza u większych zwierząt, należy zbadać pełny przekrój poprzeczny pnia mózgu oraz trzech płatów móżdżku w celu wykluczenia wścieklizny. W przypadku próbek, które nie spełniają tych minimalnych kryteriów, laboratorium może odrzucić próbkę jako niewystarczającą do testów lub zdecydować się na testy w celach nadzoru lub regulacji. Jeśli nie otrzyma wymaganych tkanek, ale laboratorium zdecyduje się na badanie, negatywny wynik testu powinien być uznany za niejednoznaczny dla wścieklizny u danego zwierzęcia, ponieważ obecność RNA wirusa w innych tkankach może być opóźniona, niska, przerywana lub jej brakować. W takim przypadku konieczne jest zebranie wymaganych próbek lub dodatkowe badania, aby wykluczyć wściekliznę. Jednak identyfikacja RNA lizawirusa w jakiejkolwiek tkance jest diagnostyczna dla zakażenia wścieklizną ^3,6. Przykładami próbek, które mogą być testowane na obecność RNA wirusa wścieklizny w celu regulacji lub monitorowania (ale nie wykluczenia) zakażenia wścieklizną, to kora, hipokamp, rdzeń kręgowy, próbki zdegradowane, skóra, ślina i rogówka. Po przybyciu do laboratorium należy dokonać jakościowej oceny stanu każdej próbki. Chłodzenie może zachować próbkę przez co najmniej 72 godziny, ale nie powinno być stosowane długoterminowo. Powtarzające się cykle zamrożenia i rozmrażania mogą zmniejszyć czułość testu, dlatego należy unikać więcej niż pięciu cykli zamrożenia i rozmrażania. Jeśli stan tkanki uniemożliwia pewną identyfikację struktur mózgowych, próbka powinna zostać uznana za niezadowalającą. W przypadku niezadowalającej próbki można nadal przeprowadzić testy, aby stwierdzić (ale nie wykluczyć) wściekliznę. Pozytywne wyniki testów są podawane w ten sposób. Negatywne lub niejednoznaczne wyniki dotyczące niezadowalających tkanek powinny być zgłaszane jako niejednoznaczne, aby zapobiec błędnej interpretacji jako negatywnej diagnozy.

Protokół ten został opracowany na podstawie opublikowanych procedur ^7,8,9 i zawiera zaktualizowane startery skierowane do regionu lidera genomu lizawirusa oraz sekwencji kodującej nukleoproteinę. Sonda celuje w krótką, wysoce zachowaną sekwencję i wykorzystuje zablokowane nukleotydy, co umożliwia szerokie wykrywanie. Test wykrywa RNA z różnych lizawirusów o różnym stężeniu⁸. Protokół ten demonstruje procedury laboratoryjne do przeprowadzenia testu PCR w czasie rzeczywistym LN34, jednak dokładne i czułe wykrywanie RNA lizawirusa zależy od innych elementów, które nie są szeroko objęte protokołem, takich jak przechowywanie próbek, prowadzenie dokumentacji, szkolenie i kompetencje personelu, śledzenie wyników, interpretacja wyników, zapewnienie jakości, środki bezpieczeństwa laboratoryjnego oraz rozwiązywanie problemów. Testy oparte na PCR są podatne na zanieczyszczenia krzyżowe ze względu na wysoką czułość. Zanieczyszczenia krzyżowego można uniknąć, stosując dobre praktyki laboratoryjne, takie jak częsta zmiana rękawic, obsługa jednej próbki naraz, dezynfekcja powierzchni roboczych skutecznymi środkami dekontaminującymi między próbkami oraz trzymanie rurek zamkniętych i próbek oddzielnych od odczynników PCR. Odczynniki i próbki PCR można łatwo oddzielić, stosując jednostronny przepływ pracy i rozdzielając obszary pracy przed i po amplifikacji. Na przykład przygotowuj mastermiksy PCR w miejscu fizycznie oddzielonym od miejsca przetwarzania próbek. Często zmieniaj rękawice, aby uniknąć skażenia odczynników PCR próbkami, zanieczyszczeniami lub dodatnim RNA. Płytka PCR lub probówki powinny zostać przeniesione po dodaniu mieszanki głównej do drugiego miejsca, gdzie można dodać próbkę i RNA sterujące. Co ważne, produkty PCR nie powinny być manipulowane w miejscach, gdzie przygotowywane są próbki lub mastermixy.

Nie ma nic lepszego niż praktyczna praktyka i doświadczenie podczas wykonywania testów diagnostycznych. Wszyscy nowi pracownicy powinni być szkoleni, a personel testujący powinien być oceniany pod kątem kompetencji co najmniej raz w roku, zgodnie z wymaganiami odpowiedniego dyrektora laboratorium. Wszelkie obserwacje nietypowych wyników lub niepowodzenia testu powinny być natychmiast zanotowane, zbadane i skorygowane. Każda nowa partia odczynników powinna być walidowana przy użyciu próbek o znanych wartościach Ct (takich jak próbka z dodatnim kontrolą lub zarchiwizowana). Cały sprzęt powinien być rutynowo konserwowany, zgodnie z zaleceniami producenta, a skuteczność testu powinna być weryfikowana po każdej konserwacji lub naprawie. Poziomy temperatury powinny być monitorowane na odpowiednim sprzęcie, aby lodówki i zamrażarki mieszały się w kryteriach ustalonych dla akceptowalnego zakresu temperatur dla odczynników stosowanych w badaniach diagnostycznych.

Modyfikacje proceduralne mogą wpływać na wydajność testu i prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych, fałszywie negatywnych lub nieinterpretowalnych. Zalecenia należy ściśle przestrzegać, aby zapewnić wysoką czułość i swoistość testu. Laboratorium chcące wprowadzić modyfikacje tego protokołu powinno zweryfikować i potwierdzić zmodyfikowane metody w konsultacji z CDC.

Protokół

Próbki tkanki mózgowej pobiono pośmiertnie poprzez rutynowy nadzór lub diagnostykę prowadzoną przez Oddział ds. Wirusa Poxwirusa i Wścieklizny (CDC; Atlanta, GA, USA).

1. Pobieranie tkanki mózgowej do diagnostyki pośmiertnej wścieklizny u zwierząt za pomocą testu RT-PCR LN34 pan-lizawirusa w czasie rzeczywistym

UWAGA: Próbki mogą zawierać czynniki zakaźne. Nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE) (ciężkie gumowe rękawice lub inne rękawice odporne na skaleczenie, fartuch laboratoryjny, wodoodporny fartuch, maska chirurgiczna, buty, rękawy ochronne oraz przyłbica na twarz) oraz przestrzegać wymaganych przepisów bezpieczeństwa dotyczących używania, przechowywania i utylizacji próbek. Szczepienia przed wścieklizną, regularne badania serologiczne oraz szczepienia przypominające (w razie potrzeby) są wymagane dla wszystkich przed pracą, testowaniem, produkcją lub prowadzeniem badań nad lizawirusami lub znanymi lub potencjalnie zakażonymi próbkami 2,3,4,6,10.

1. Oznacz jedną probówkę na próbkę etykietą przystępną. Napełnij każdą probówkę do pobierania próbek 1 mL odczynnika TRIzol lub innego buforu homogenizacyjnego oraz porcję kulek MagNA Lyser (dalej "kroleczki ceramiczne"). Aby dodać keramiczne koraliki, ostrożnie wlej z rurki koralików do probówki pobierającej próbki. Rurki z ceramicznymi kulkami zazwyczaj zawierają wystarczającą ilość koralików na 2-5 próbek, używając co najmniej 20 koralików o średnicy 1,4 mm na próbkę.
   UWAGA: Odczynnik TRIzol (dalej "bufor homogenizacyjny") jest niebezpiecznym związkiem chemicznym; kontakt z kwasami lub wybielaczem uwalnia toksyczne gazy; zapewnienie odpowiedniej wentylacji; Prosimy o zapoznanie się z kartą danych bezpieczeństwa, aby uzyskać więcej informacji. Jeśli użytkownicy zastąpią inny bufor homogenizacyjny reagentem TRIzol lub Tri, konieczna jest dodatkowa walidacja. TRIzol pełni rolę bufora homogenizacji/lizy próbki, bufora inaktywacji lizawirusa oraz bufora stabilności RNA dla tego protokołu. Zastosowanie alternatywnego bufora homogenizacyjnego będzie wymagało weryfikacji efektywności ekstrakcji, inaktywacji i stabilności w kontrolowanym porównaniu obok siebie.
2. Umyj i zdezynfekuj powierzchnię roboczą środkiem dezynfekującym związki amoniaku czwartorzędowego (QAC) przez 2 minuty oraz rozłóż podkładkę chłonną pokrytą plastikiem. Umieszczaj wyłącznie odczynniki i materiały do pierwszej próbki w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC) z funkcjami odprowadzającymi niebezpieczne opary poza pomieszczenie.
   UWAGA: Zapoznaj się z wytycznymi producenta dotyczącymi limitów przechowywania rozcieńczonego QAC. Upewnij się, że podkładka wyłożona plastikiem nie blokuje przepływu powietrza w szafce bezpieczeństwa biologicznego. Jeśli przepływ powietrza jest zakłócony, nie używaj podkładki.
3. Pobierz tkanki reprezentujące pełny przekrój pnia mózgu i móżdżku za pomocą czystego, jednorazowego skalpela.
   UWAGA: Manipulacja tkankami powinna być przeprowadzana w sposób uniemożliwiający aerozolizację cieczy ani powstawanie cząstek unoszących się w powietrzu. Okapy wypalniowe ani szafki do zabezpieczeń biologicznych nie są wymagane, ale zalecane są szafki z wentylacją biologiczną, ponieważ zapewniają dodatkową ochronę przed zapachami, oparami, ektopasożytami i fragmentami kości.
   UWAGA: Używanie skalpela z materiałem potencjalnie zakażonym lizawirusem jest niebezpieczne, dlatego użytkownicy powinni podjąć odpowiednie środki ostrożności. Zaleca się stosowanie jednorazowych kleszczy.
   1. U małych zwierząt (takich jak nietoperze) można zebrać cały pień mózgu i móżdżek.
   2. W przypadku większych zwierząt pobierz pełny przekrój pnia mózgu i tkanek z każdego z trzech płatów móżdżku.
   3. OPCJONALNIE: Jeśli wykonujesz bezpośredni test na przeciwciała fluorescencyjne (DFA), pobierz odciski mózgu w tym momencie. Wykorzystaj tkankę pozostawioną po zebraniu odcisków mózgu do DFA do ekstrakcji RNA i testów za pomocą testu LN34.
      UWAGA: Jeśli do próbek dodano TRIzol, próbki nie mogą być już używane do wykrywania antygenów ani do izolacji antygenów.
4. Przygotuj próbki do homogenizacji i ekstrakcji RNA.
   UWAGA: Wydajność ekstrakcji RNA i inaktywacji wirusów może być obniżona przez zbyt dużą ilość tkanek. Ilość tkanki nie powinna przekraczać około 1/10 objętości użytego buforu homogenizacyjnego. Jeśli używa się więcej tkanki, należy odpowiednio zwiększyć ilość buforu homogenizacyjnego, aby zapewnić efektywną i skuteczną ekstrakcję RNA.
   1. W przypadku małych zwierząt wszystkie potrzebne tkanki umieść w probówce zawierającej bufor homogenizacyjny i koraliki do ekstrakcji. Nie przekraczaj 100 mg próbki w 1 mL buforu homogenizacyjnego; Dla większych próbek zwiększ objętość buforu homogenizacyjnego lub użyj wielu probówek, aby odzwierciedlić proporcję próbki 1:10: bufor.
   2. U większych zwierząt dokładnie posiekaj i ujednolic tkankę oraz usuń reprezentatywną część do probówki wypełnionej buforem homogenizacyjnym i kulkami. Nie przekraczaj 100 mg próbki w 1 mL buforu homogenizacyjnego; Dla większych próbek zwiększ objętość buforu homogenizacyjnego lub użyj wielu probówek, aby odzwierciedlić proporcję próbki 1:10: bufor.
      1. Opcja 1 (bijak do koralików): Ujednolicz tkankę za pomocą bijaka do koralików, 1 mL buforu i ceramicznych kulek. Może być konieczne zastosowanie kilku probarek o pojemności 2 mL lub większych.
      2. Opcja 1 (Bead beater): Oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnętrzne probówki środkiem dezynfekującym QAC (1:256). Zostaw to na 2 minuty.
      3. Opcja 1 (ubijacz do koralików): Wewnątrz BSC załaduj wirnik wirówki ujednoliconymi próbkami. Wszystkie próbki wiruj w temperaturze 10 000-16 000 × g przez 2 minuty w mikrowirówce stołowej. Rozładuj wirnik wirówki wewnątrz BSC.
      4. Opcja 1 (Bead beater): Niech stoi przez 2 minuty.
      5. Opcja 1 (ubijacz do koralików): Przelać 120 μL homogenitu do rurki wstępnie wypełnionej 1 mL buforu homogenizacyjnego.
         UWAGA: Homogenizacja może powodować powstawanie aerozoli i powinna być przeprowadzana w BSC.
      6. Opcja 2 (skalpel): Drobno posiekać potrzebne tkanki skalpelem jednorazowego użytku, rozmazać wymazem i przenieść wymaz do probówki z buforem homogenizacyjnym i kulkami. Nie przekraczaj 100 mg próbki w 1 mL buforu homogenizacyjnego; Dla większych próbek należy zwiększyć objętość buforu homogenizacyjnego lub użyć wielu rurek, aby odzwierciedlić stosunek 1:10 próbka:bufor.
         UWAGA: Używanie skalpela z materiałem potencjalnie zakażonym lizawirusem jest niebezpieczne, dlatego użytkownicy powinni podjąć odpowiednie środki ostrożności.
5. Zbierz pozostałe chusteczki do oryginalnego pojemnika lub do nowego, pustego pojemnika oznaczonego etykietą akcesyjną. Przechowuj tę tkankę na wypadek konieczności ponownego testowania lub dodatkowej charakterystyki.
6. Oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek środkiem dezynfekującym QAC 1:256. Zostaw to na 2 minuty.
7. Powtórz kroki 1.2-1.5 dla wszystkich pozostałych próbek.
8. Ujednolicaj próbki za pomocą mini bicia do koralików przez co najmniej 60 sekund. Sprawdź wizualnie rurki. Powtarzaj ubijanie przez kolejne 60 sekund, jeśli pozostaną duże kawałki chusteczki. Ten krok jest opcjonalny, jeśli tkanka jest całkowicie ujednolicona w kroku 1.4.2.1 powyżej.
   UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że tkanka jest dokładnie ujednolicona. Niepełna homogenizacja zmniejsza wydajność RNA.
9. Zostaw na co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
10. Oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek środkiem dezynfekującym QAC (1:256).
    UWAGA: Próbka jest obecnie uznawana za niezakaźną i może zostać pobrana z laboratorium przeciwwścieklizny.
11. Natychmiast przetwarzać próbki w buforze homogenizacyjnym do ekstrakcji RNA, przechowywać w temperaturze RT (20 °C do 25 °C) lub w chłodni (4 °C do 8 °C) przez kilka dni, albo przechowywać w temperaturze -16 °C lub niższej do długoterminowego przechowywania.

2. Protokół ekstrakcji RNA z wykorzystaniem zestawu RNA MiniPrep

1. Ustaw workspace pod BSC.
   1. Przed rozpoczęciem pracy wyczyść powierzchnię BSC używając 70% etanolu, aby usunąć kurz lub inne zanieczyszczenia środowiskowe. Wykonaj dodatkową dekontaminację powierzchni za pomocą środka dezynfekującego QAC (1:256), RNase AWAY lub RNaseZap (zgodnie z zaleceniami producenta).
   2. Rozłóż podkładkę roboczą wyłożoną plastikiem, a odczynniki, materiały i próbkę umieść w BSC.
      UWAGA: Upewnij się, że podkładka wyściełana plastikiem nie blokuje przepływu powietrza przez BSC. Jeśli przepływ powietrza jest zakłócony, nie używaj podkładki.
   3. Rozłóż wszystkie probówki zbiorcze w czystej stojakach do mikrowirówek. Wstępnie napełnij jedną probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 mL 300 μL 100% etanolu na każdą próbkę mózgu nietoperzy. W przypadku próbek z niewielką ilością tkanki (próbka mózgu nietoperzy, próbka niemózgowa lub próbka zniszczona), napełnij jedną mikrowirówkę o pojemności 1,5 mL 600 μL 100% etanolu dla każdej z nich.
2. Przygotowanie próbki
   1. Pobierz wszystkie próbki przygotowane w sekcji 1 w stojaku na rurki w BSC. Rozmroź mrożone próbki tuż przed testami.
   2. Rozmroź kontrolę ewakuacji.
      UWAGA: Zaleca się wybór próbki bez RNA lizawirusa; próbkę należy wcześniej zbadać z zakresem oczekiwanej wartości Ct dla testu beta-aktyny. Na przykład komórki z hodowli tkanek przed alicytatem lub wcześniej testowany negatywny przypadek wścieklizny (człowiek lub zwierzę).
3. Wszystkie próbki wiruj w 10 000-16 000 × g przez 2 m w mikrowirówce stołowej.
4. Przelej supernatant do nowej sterylnej rurki mikrowirówki zawierającej 100% etanolu. Upewnij się, że supernatant jest przezroczysty, bez widocznych lipidów czy tkanki stałej. Unikaj zbierania lipidów i tkanek stałych.
   1. Dla tkanki mózgowej nietoperza: przelej 300 μL supernatantu.
   2. Dla próbek z niewielką ilością tkanki (próbka mózgu nietoperzy, próbka niemózgowa lub próbka zniszczona), przenieś 600 μL supernatantu.
   3. Pozostałe jednorodne materiały przechowuj w rurce mikrowirówki z zakrętką w temperaturze ≤-16 °C.
5. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, żeby wymieszać.
6. Dla każdej próbki przenieś 600 μL mieszaniny etanolowo-supernatantowej do kolumny spinowej w probówce zbiorczej.
7. Wiruj do momentu, gdy ciecz przejdzie przez kolumnę (1 minuta przy 10 000-16 000 × g). Zrezygnuj z przepływu.
8. Powtórz, jeśli w próbce jest więcej niż 600 μL mieszaniny buforu homogenizacyjnego etanolu.
9. Przelej każdą kolumnę do nowej probówki zbierającej.
10. Dodaj 400 μL buforu przedmycia RNA do każdej kolumny i wiruj w temperaturze 10 000-16 000 × g przez 30 sekund.
11. Usuń przepływ i każdą kolumnę zwróć do tej samej rurki zbiorczej.
12. Powtórz kroki 2.10-2.11.
13. Dodaj 700 μL bufora RNA do każdej kolumny i wiruj w temperaturze 10 000-16 000 × g przez 2 minuty. Upewnij się, że bufor płukania przeszedł całkowicie przez każdą kolumnę.
14. Każdą kolumnę ostrożnie przenieś do rurki wolnej od RNazy.
15. Usuń przewód przepływowy i tubę zbiorczą od wersji 2.13.
16. Dodaj 50 μL wody wolnej od DNazy/RNazy bezpośrednio do matrycy kolumny, aby wyluczyć RNA.
    UWAGA: Nie dotykaj macierzy kolumny końcówką pipety.
17. Inkubuj przez 30 sekund w RT, następnie wiruj w 10 000-16 000 × g przez 1 minutę.
18. Ostrożnie przełóż RNA do nowej śrubowej góry, płaskiego dna z mikrowirówką oznaczoną rurką mikrowirową. Przenieś wyekstrahowane RNA do lodu do natychmiastowych badań. Przechowuj je długoterminowo w temperaturze -70 °C lub chłodniej.
    UWAGA: Przechowywanie w wyższych temperaturach lub powtarzające się zamarzania i rozmrażanie może prowadzić do degradacji RNA i wpływać na wyniki diagnostyczne.

3. Protokół do testu RT-PCR w czasie rzeczywistym pan-lizawirusa LN34

1. Przygotuj odczynniki.
   1. Sztuczna kontrola dodatnia
      1. Jeśli CDC⁸ wyprodukuje sztuczne RNA z dodatnim kontrolem, należy postępować zgodnie z instrukcjami na opakowaniu dotyczących przechowywania, rekonstrukcji i alicytacji. Pomiń ten krok, jeśli jednorazowe alikwoty dodatniego RNA są już w zasięgu.
         UWAGA: Dodatnia kontrola RNA w stężeniach roboczych powinna być obsługiwana w obszarze dodawania szablonu, a nie w tym samym miejscu, co przygotowanie mastermixu. Dodatnia kontrola RNA powinna wydawać wartość progu cyklu (Ct) w oczekiwanym zakresie określonym dla danej partii. Między cyklami wartość LN34 Ct dla dodatniego RNA kontroli nie powinna różnić się o więcej niż ±1,5 Ct.
      2. Rozmroz jednorazowy aliquot z przechowywania ≤ -70 °C tuż przed użyciem na lodzie lub bloku lodowym. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj, a aliquoty przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze chłodzonej.
         UWAGA: Pozytywna kontrola powinna być przeprowadzona w trzech egzemplarzach w teście LN34; Sztuczna dodatnia kontrola⁸ nie wzmocni się w teście beta-aktyny.
   2. Kontrola ekstrakcji i próbki: Umieść świeżo pobrane próbki na lodzie (lub bloku lodowym) lub rozmroz próbki z przechowywania w temperaturze ≤ -70 °C na lodzie (lub bloku lodowym) tuż przed użyciem.
      UWAGA: RNA powinno być rozmrażane i przetwarzane w obszarze przeznaczonym do dodawania próbek lub szablonów, który jest oddzielny od obszarów wykorzystywanych do przygotowywania lub manipulacji mastermixem produktów PCR lub dużych ilości materiału wirusowego (np. generowanie pozytywnej kontroli, propagacja wirusa)
2. Przygotuj odczynniki do mieszanki w miejscu przygotowania mieszanki głównej.
   1. Przygotowanie mastermixu w testie singleplex LN34 RT-PCR
      UWAGA: Użytkownicy mogą testować próbki w formacie singleplex (krok 3.2.1) lub multipleks (krok 3.2.2). Wykonywanie zarówno wersji 3.2.1, jak i 3.3.2 nie jest konieczne. Przygotowanie mieszanki głównej, alicytacje spodkładów i sond oraz brak szablonu odczynników kontrolnych powinny być rozmrażane i manipulowane w czystej przestrzeni, oddzielnie od przetwarzania próbek, sekcji zwłok, PCR i innych obszarów, gdzie manipulowane są materiały wirusowe. Może to być osiągnięte poprzez oddzielne pomieszczenia lub system szafek z jednostronnym przepływem próbek.
      1. Generuj mieszanki zapalnika i sondy w stężeniach roboczych, jak wskazano w Tabeli 1 i Tabeli 2. Pomiń ten krok, jeśli już masz w ręku działające aliquoty rozcieńczenia spłonników i sond.
      2. Aliquot spłony i sondy przekształcają w magazyny magazynowe o pojemności 1,5 mL oraz 50 μL robocze i przechowywać w temperaturze ≤ -16°C w ciemności. Pomiń ten krok, jeśli już masz w ręku działające aliquoty rozcieńczenia spłonników i sond.
         UWAGA: Zaleca się wykonanie kroku 3.2.1.2.
      3. Jednostopniowy bufor RT-PCR rozmrażający, brak kontroli szablonowej, spłonki i sondy z magazynowania ≤ -16 °C na lodzie lub bloku lodowym w obszarze przygotowania mieszanki głównej.
         UWAGA: Używaj odczynników do daty ważności lub do momentu awarii wydajności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
      4. Przed użyciem krótko przeprowadź i wiruj wszystkie, zapalniki i sondy.
      5. Przechowuj jednostopniowy enzym RT-PCR na lodzie lub w bloku lodowym do czasu użycia.
      6. Próbki RNA
         UWAGA: Używaj świeżo ekstrahowanego RNA, kiedy tylko jest to możliwe, ponieważ zamrożenie i rozmrażanie może wpływać na wydajność
      7. Przechowuj próbki RNA na lodzie lub bloku lodowym do czasu użycia.
      8. Rozmroź wszelkie zamrożone próbki RNA na lodzie lub bloku lodu.
      9. Oznacz jedną rurkę mikrowirówki na każdy test (LN34 i βA).
      10. Określ liczbę reakcji (N), które należy przygotować na jeden test.
      11. Obliczamy liczbę reakcji dla testu LN34, mnożąc liczbę próbek przez 3 i dodając 6 dla odwiertów kontrolnych oraz 10% dodatkowych reakcji, aby zrekompensować objętość utraconą podczas pipetowania. (np. dla 10 próbek: (10 x 3) + 6 = 36 reakcji; reakcje nadmiarowe: (36 x 0,1) + 36 = 3,6 + 36 = 39,6 reakcji łącznie, czyli 40 reakcji zaokrąglonych w górę)
          UWAGA: W badaniach klinicznych zaleca się badanie wszystkich próbek w trzech egzemplarzach na LN34. Do celów nadzoru każda próbka może być badana w duplikacie. Zaleca się stosowanie potrójnych egzemplarzy podczas wstępnego wdrożenia testu, aby zapewnić niską zmienność między replikami i dobrą technikę.
      12. Oblicz liczbę reakcji dla testu βA, dodając liczbę próbek plus 4 dołki kontrolne oraz 10% dodatkowych reakcji, aby uwzględnić objętość utraconą podczas pipetowania.
      13. Określ objętość każdego odczynnika dla mastermiksów LN34 i βA za pomocą Tabeli 2.
      14. Wyznacz dołki dla każdej próbki do badania w trzech egzemplarzach w teście LN34 oraz pojedynczo dla testu βA za pomocą mapy płyt 96 dołków.
      15. Podaj 23 μL mieszanki testowej LN34 do każdego przydzielonego LN34 na długo po krótkim wirowaniu i obracaniu przez 30 sekund za pomocą stołowej mikrowirówki do zbierania cieczy na dnie rurki. Unikaj wprowadzania bąbelków.
      16. Podaj odczynniki 23 μL mieszanki testowej βA do każdego przypisanego βA po krótkim wirowaniu i obracaniu przez 30 sekund w mikrowirówce stołowej, aby zebrać ciecz na dnie.
      17. Zorganizuj reakcje bez kontroli szablonu (NTC), pipetując 2 μL wody klasy PCR do każdego otworu NTC.
      18. Pokrywy i płyty transferowe do szablonu dodania obszaru.
      19. Krótko przeprowadź i wiruj probówki zawierające próbki RNA.
      20. Pipeta 2 μL wyekstrahowanego RNA z pierwszej próbki do każdej studni oznaczonej dla tej próbki. Unikaj wprowadzania bąbelków.
      21. Upewnij się, że RNA zostało wciągnięte do pipety poprzez wizualizację.
      22. Pipeta na boku dołka, aby upewnić się, że próbka została dodana do właściwego dołka.
      23. Unikaj machania końcówkami pipet zawierającymi RNA nad otwartymi dołkami, tak jak to możliwe.
      24. Powtórz krok 3.2.10 dla pozostałych próbek i dodatniego RNA.
      25. Po dodaniu wszystkich próbek i kontrolek nałóż osłonę optycznego kleju na otwory. Uważaj, aby zakryć wszystkie studnie i całkowicie uszczelnić.
      26. Wiruj w wirówce 500 × g przez 1 minutę w wirówce stołowej lub użyj wirówki płytowej typu wirowacz do sałatki.
      27. Umieść szczelną płytkę w przyrządzie PCR w czasie rzeczywistym skalibrowanym pod barwniki FAM i VIC/HEX i ustaw je na parametry cykliczne pokazane w Tabeli 3.
   2. Przygotuj mieszanki główne do testu LN34 Multiplexed (LN34M).
      1. Oznacz jedną rurkę mikrowirówki LN34M zgodnie z Tabelą 2.
      2. Określ liczbę reakcji (N), które należy przygotować na jeden test.
      3. Oblicz liczbę reakcji dla testu LN34M, mnożąc liczbę próbek przez 3 i dodając 6 dla studni kontrolnych oraz 10% dodatkowych reakcji, aby uwzględnić objętość utraconą podczas pipetowania. (np. dla 10 próbek: (10 x 3) + 6 = 36 reakcji; reakcje nadmiarowe: (36 x 0,1) + 36 = 3,6 + 36 = 39,6 reakcji łącznie, czyli 40 reakcji zaokrąglonych w górę)
      4. Wybierz format 25 μL lub 12,5 μL. Określ objętość każdego odczynnika dla mastermixu LN34M, korzystając z Tabeli 2.
      5. Wyznacz odwierty dla każdej próbki do przebadania w trzech egzemplarzach w teście LN34M, korzystając z mapy płyt 96 studni.
      6. Dostarczaj odczynniki do testu LN34M do studni. Krótko wiruj i obróć rurki, aby zebrać ciecz na dnie, przed podaniem 23 μL (do reakcji 25 μL) lub 10,5 μL (do reakcji 12,5 μL) mieszanki głównej do każdego przypisanego dołku. Unikaj wprowadzania bąbelków.
      7. Reakcje NTC przygotuj przez pipetowanie 2 μL wody klasy PCR do każdego otworu NTC.
      8. Pokrywy i płyty transferowe do szablonu dodania obszaru.
      9. Krótko przewij i obróć rurki zawierające próbki RNA, aby zebrać ciecz na dnie.
      10. Pipeta 2 μL wyekstrahowanego RNA z pierwszej próbki do każdej studni oznaczonej dla tej próbki. Unikaj wprowadzania bąbelków.
      11. Upewnij się, że RNA jest wciągane do wizualizacji pipety.
      12. Pipeta na boku dołka, aby upewnić się, że próbka została dodana do właściwego dołka.
      13. Unikaj machania końcówkami pipet zawierającymi RNA nad otwartymi dołkami, tak jak to możliwe.
      14. Powtórz krok 3.3.8 dla pozostałych próbek oraz dodatniego RNA.
      15. Po dodaniu ostatniej próbki/kontroli należy nałożyć osłonę klejącą optyczną na otwory, upewniając się, że wszystkie otwory są całkowicie zakryte i uszczelnione.
      16. Wiruj w wirówce 500 × g przez 1 minutę w wirówce stołowej lub użyj wirownika płytowego typu wirujący do sałatki.
      17. Umieść szczelną płytkę w przyrządzie PCR w czasie rzeczywistym skalibrowanym pod barwniki FAM i VIC/HEX reporter i ustaw go na parametry cykliczne, jak pokazano w Tabeli 3. Ustaw pasywne barwienie referencyjne na ROX i uruchom w trybie Standard ( nie uruchamiaj w trybie szybkim)
          UWAGA: To ustawienie jest specyficzne dla instrumentów wymienionych w tym protokole i wymaga użycia jednostopniowego odczynnika RT-PCR zawierającego ROX jako barwnik pasywny. Alternatywne instrumenty wymagają różnych podejść do określenia optymalnych ustawień pracy. Dbaj o standardową konserwację przyrządów zgodnie z producentem, aby zapewnić najlepsze osiągi.

4. Interpretacja wyników

1. Ustaw automatyczne obliczenia bazowe i ręczne progi z wartością 0,2 dla LN34/FAM i 0,05 dla βA/HEX/VIC.
   UWAGA: To ustawienie jest specyficzne dla instrumentów wymienionych w tym protokole i wymaga użycia jednostopniowego odczynnika RT-PCR zawierającego ROX jako barwnik pasywny. Alternatywne instrumenty wymagają różnych metod obliczania wartości bazowych i progowych.
2. Określ wynik diagnostyczny na podstawie wskazówek z Tabeli 4 , jeśli wszystkie kontrolne działania przebiegły zgodnie z oczekiwaniami (Tabela 5).
3. Potwierdź wszystkie wartości Ct lub Cq, oglądając wykresy amplifikacyjne.
4. Sprawdź wszelkie nietypowe wyniki zgodnie z zaleceniami.

5. Przechowywanie i przechowywanie próbek

1. Wszystkie próbki przechowywać w temperaturze -16 °C lub niższej do czasu zakończenia testów i ogłoszenia wyników. Zachowaj oryginalne tkanki, aby potwierdzić wyniki lub zidentyfikować zwierzę żywicielskie z gatunkiem w przypadku nietypowych wyników testu.
2. Używaj unikalnych identyfikatorów próbek; Wszystkie probówki, raporty i dokumenty oznaczają pełnymi, unikalnymi identyfikatorami próbek.
3. Zachowaj próbki pośrednie (krótkoterminowe) na wypadek konieczności powtarzania testów.
4. Zachowaj reprezentatywne pozytywne próbki w razie potrzeby do wykorzystania jako kontrola, typowanie epidemiologiczne i inne cele.
5. Przechowuj RNA w temperaturze ≤-70 °C do długotrwałego przechowywania.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy z udanego testu LN34 przeprowadzonego na przyrządzie ABI ViiA7 w czasie rzeczywistym przedstawiono na Rysunku 2. Wyniki oglądania przedstawione na skali logarytmicznej umożliwiają łatwe obserwowanie wartości Ct, punktu, w którym krzywa przecina linię progową (rysunek 2A,C). Na wykresie w skali liniowej udane wzmocnienie pojawi się jako krzywa sigmoidalna (lub w kształcie litery "S") (rysunek 2B,D), natomiast wyniki ujemne powinny być prostą, płaską linią. Zaleca się oglądanie wyników zarówno w skali liniowej, jak i logarytmicznej, aby zidentyfikować możliwe anomalie lub błędy. Typowe pozytywne i negatywne wyniki w widoku wieloskładnikowym można zobaczyć odpowiednio na rysunku 2E,F, gdzie poziom fluorescencji barwnika oznaczającego sondę (FAM dla LN34, VIC/HEX dla βA) można zaobserwować względem pasywnego barwnika w buforze reakcji (ROX).

Przykłady nieprawidłowych wyników pokazano na Rysunku 3. Porównania między wykresami udanych przejazdów (Rysunek 2) a wykresami nieprawidłowymi (Rysunek 3) mogą być wykorzystywane do izolowania nietypowych przejazdów i problemów z instrumentami. Rysunek 3A pokazuje sygnał przekraczający próg, co daje wartość Ct dla LN34, ale krzywa wzmocnienia jest bardzo nietypowa i rośnie liniowo. Wykres wieloskładnikowy (Rysunek 3B) pokazuje również falistą linię, która nie jest typowa dla próby dodatniej. Ten przykład podkreśla znaczenie przeglądania wykresów amplifikacji, a nie tylko kopiowania wartości Ct. Zawsze upewnij się, że krzywe amplifikacji wyglądają normalnie dla wszystkich próbek. Zaleca się również obejrzenie wykresu wieloskładnikowego, aby upewnić się, że nie występują nieprawidłowości. Czasami sygnały bazowe na nieprzejrzystych poziomach mogą generować wartości Ct w przypadkach, gdy nie nastąpiło wzmocnienie. Jeśli sygnały wzmacniające wydają się liniowe, zaleca się korektę linii bazowej, aby sprawdzić, czy krzywa znika. W przypadku nietypowego sygnału cały przebieg powinien być powtórzony. Zaleca się czyszczenie i uruchomienie płyty tła na urządzeniu PCR w czasie rzeczywistym, jeśli problemy się utrzymają. Jeśli są dostępne, produkty PCR można stosować na żelu agarozowym i/lub sekwencjonować, aby zdiagnozować nietypowe wyniki. Nie zaleca się stosowania wyników elektroforezy żelowej ani sekwencjonowania do określania wyników diagnostycznych.

Poprzednie badania wykazały niską zmienność między replikami, testem, operatorem i laboratorium w testie LN34⁷. Jeśli zaobserwuje się wysoką zmienność (różnicę >±1,5 Ct) między replikacjami tej samej próbki, należy ponownie zbadać to RNA. Duża zmienność może być spowodowana problemami z pipetami, praktykami laboratoryjnymi, błędnym pipetowaniem lub maszynami PCR w czasie rzeczywistym. Powtarzające się obserwacje wysokiej zmienności w kilku próbkach lub w różnych testach mogą wskazywać na problemy systemowe. Próbki z niskim RNA, zbliżające się do progu testu dla próbki pozytywnej (Ct 35), mogą wykazywać większą zmienność wartości Ct między replikacjami. Może być konieczna konsultacja z CDC i rozwiązywanie problemów, aby wyjaśnić przyczynę utrzymującej się zmienności, niespójnych wyników lub niepowodzenia testu.

Wysoka czułość testów opartych na PCR sprawia, że są one z natury podatne na skażenie. Ścisłe przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych to najlepszy sposób na ograniczenie zanieczyszczenia krzyżowego. Umiejętność rozpoznawania potencjalnych zanieczyszczeń jest ważna. Należy podejrzewać zanieczyszczenie reagentami, jeśli nie ma kontroli szablonu i podejrzewane negatywne dołki próbki w testie dają podobne wartości Ct. Powtórz testy z nowymi alikwotami odczynników PCR (bufor, woda, startery i enzym) oraz tym samym RNA. Jeśli wszystkie próbki i kontrola ekstrakcji dają podobne wartości CT, ale NTC jest ujemne, należy zbadać zanieczyszczenie odczynników ekstrakcyjnych i powtórzyć ekstrakcję przy użyciu nowych. Dobrą praktyką jest wytwarzanie małych aliquotów odczynników, aby zmniejszyć ryzyko skażenia i uniknąć możliwości wyrzucenia dużych ilości drogich odczynników. Identyfikacja zanieczyszczenia krzyżowego próbki jest trudniejsza. Jeśli podejrzewa się skażenie próbki, powtórz pobieranie próbki, zaczynając od oryginalnych tkanek. W niektórych przypadkach sekwencjonowanie wirusowego RNA może potwierdzić zanieczyszczenie, zwłaszcza gdy zanieczyszczające RNA jest bardzo różne od oczekiwanego wariantu wirusa (takiego jak wirus kontrolny stosowany w laboratorium). Sekwencjonowanie dwóch próbek przetwarzanych jednocześnie może określić, czy sekwencje wirusowe są identyczne, ale może być nieinformacyjne, jeśli sekwencje mają być bardzo podobne (na przykład ten sam wariant zebrany w tym samym hrabstwie). Jeśli podejrzewa się zanieczyszczenie próbki dodatnim RNA, można przeprowadzić amplikony z testu LN34 na żelu agarozowym, aby odróżnić RNA lizawirusa (165 bp) od RNA z dodatnim kontrolem (99 bp). Sekwencja szablonu użytego do wygenerowania dodatniego RNA dostarczonego przez CDC⁸.

W przypadku innych patogenów laboratoriaki mogą być używane do ręcznego ustawienia progu, aby pozbyć się "szumu", takiego jak słabe wzmocnienie pokazane cyjanem na Rysunku 4. Ta praktyka NIE jest zalecana przy diagnozie wścieklizny, ponieważ może prowadzić do fałszywie negatywnych wyników z poważnymi konsekwencjami, gdyż wścieklizna jest niemal w 100% śmiertelna. NIE zmieniaj ręcznie progu, aby uzyskać negatywne wyniki dla próbek słabych lub późnych amplifikacji. Próbki te muszą zostać ponownie pobrane i/lub ponownie przetestowane, aby wykluczyć wściekliznę.

Rysunek 1: Pole widokowe pokazujące jednostronne rozprzestrzenianie się antygenu wirusa wścieklizny u zakażonego osła za pomocą bezpośredniego testu fluorescencyjnych przeciwciał. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wykresy amplifikacyjne i wieloskładnikowe z udanego testu LN34. Dane wyników (A-D) są przedstawione na skali logaritmowej (A,C) oraz (B,D) w skali liniowej dla testów LN34 i βA. Panele A i B przedstawiają wyniki LN34 z dwóch próbek (w kolorach różowych i cyjanowych) w porównaniu do kontroli pozytywnej (w żółtym). W panelu B jest płaska zielona linia, która przedstawia dodatkową próbkę negatywną w serii. W A zielone linie nie wykazują żadnego wzmocnienia i są przedstawione jako przerywane segmenty. Próg dla testu LN34 został ręcznie ustawiony na 0,2 i jest pokazany przez czerwoną linię poziomą. (C,D) Wyniki testu βA dla dwóch próbek (czerwonej i cyjanowej). Próg testu βA został ręcznie ustawiony na 0,05. (E,F) Wykresy wieloskładnikowe przedstawiają fluorescencję (RFU) w każdym cyklu dla FAM (LN34), VIC (βA) oraz ROX (pasywny barwnik obecny w buforze AgPath-ID). Poziom ROX powinien pozostać na stałym poziomie przez wszystkie cykle. Typowa próbka dodatnia jest pokazana na panelu E; Fluorescencja FAM rośnie jako krzywa sigmoidalna zaczynając od cyklu 18 dla tej próby. Typowa próbka ujemna jest pokazana na panelu F, gdzie poziom FAM pozostaje równoległy do poziomu ROX przez wszystkie cykle. Dane pochodzą z instrumentu PCR w czasie rzeczywistym ABI ViiA7. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy rzadkiego, nietypowego sygnału obserwowanego w teście LN34 są wykonywane na przyrządzie PCR ViiA7 w czasie rzeczywistym. (A-F) Wykresy amplifikacyjne (A,C,E) oraz wieloskładnikowe (B,D,F) powstałe w wyniku zanieczyszczenia studni. Liniowy wzrost (A,C) i fluktuacje faliste (B,D) w fluorescencji FAM nie reprezentują prawdziwego wzmocnienia opartego na kształcie krzywych i wielkości zmiany fluorescencji. Panele A do D prawdopodobnie reprezentują próbki ujemne, mimo że dla repliki pokazanej w panelach A i B uzyskano wartość Ct. Panele E i F pokazują nieparzysty sygnał falujący, który łatwiej jest dostrzec na wykresie wieloskładnikowym. Ten typ sygnału powinien być zbadany i może wskazywać na problemy z instrumentami, mimo że wszystkie sterowanie przebiega zgodnie z oczekiwaniami podczas tej trasy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Krzywe RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym z 2 próbek podejrzanych na wściekliznę, pokazujące dwie metody ustalania wartości progowych. (A) Próg LN34 został ustawiony na 0,2 (zalecane dla wszystkich testów). (B) Ręczne określenie innego progu dla każdego przebiegu, aby zamaskować sygnał uznany za "szum" (sygnał opóźnionego wzmocnienia). Metoda stosowana w panelu B NIE jest zalecana w przypadku wścieklizny ze względu na poważne konsekwencje nieuznania prawdziwie pozytywnego wyniku. Późne amplifikowanie może wskazywać na słabą próbkę pozytywną, hamowanie PCR lub nieudaną ekstrakcję w przypadku pozytywnym. Może to również wskazywać na zanieczyszczenie krzyżowe. Złota próbka (oznaczona czarnymi strzałkami) daje wartość Ct na progu testu i nie powinna być uznawana za ujemną. Próbki z późną amplifikacją powinny być ponownie pobierane i testowane. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Sekwencje i stężenia primerów i sond stosowane w testach RT-PCR w czasie rzeczywistym LN34 (singleplex LN34), LN34M (multipleksowany LN34 i βA). Sondy LN34 są oznaczane fluorescencyjnym barwnikiem FAM na 5ʹend oraz czarnodziurowym gasnikiem (BHQ1) na 3ʹendzie. Sonda βA jest oznaczona fluorescencyjnym barwnikiem HEX na 5ʹend oraz czarnym odkrywcem (BHQ1) na 3ʹendzie. Zablokowane bazy zmodyfikowane nukleotydami są oznaczane plusem poprzedzającym zasadę w sekwencji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przygotowanie testów do testów LN34lys, Actin3 i LN34M. Nazwy, sekwencje i stężenia starterów i sond można znaleźć w Tabeli 1. LN34_F1 odpowiada ACGCTTAACAACCAGATCAAGAA⁷. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Parametry cykliczne dla instrumentów ABI. WAŻNE: Upewnij się, że uruchamiasz w trybie STANDARD , a nie FAST . Jako pasywny barwnik referencyjny powinien być wybrany ROX. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Algorytm interpretacji wyników RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym dla formatów singleplex (górna, niebieska tabela) i multipleks (dolny, czerwony tabela). Wynik LN34 pozytywny należy uznać za dodatni, nawet jeśli wynik βA jest ujemny lub niejednoznaczny. Jeśli amplikon LN34 nie zostanie wykryty, βA Ct musi znajdować się ≤ wartości Ct określonej wartości progowej, aby uznać ją za ujemną. Wartości βA Ct wskazują na jakość badanej próbki i wskazują na możliwe hamowanie. Niskie stężenie w oryginalnym próbce klinicznej może wpływać na krzywe wzrostu βA, prowadząc do braku zauważalnego amplifikacji. Dodatkowe czynniki przyczyniające się do niewykrycia β-aktyny to słaba ekstrakcja RNA z powodu utraty RNA lub przeniesienia inhibitorów PCR, nieprawidłowy zestaw i technika testowania, niezadowalający typ lub jakość próbki oraz nieprawidłowości odczynników lub sprzętu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Działania i interpretacje wspólnych wyników dla kontroli testów LN34. Wszystkie trzy kontrolne (RNA z dodatnim testem na wściekliznę, kontrolę ekstrakcji negatywną na wściekliznę oraz brak kontroli szablonowej muszą dawać oczekiwane rezultaty, aby przebieg przeszedł. Niepowodzenie kontroli pozytywnej lub brak kontroli szablonowej może wskazywać na błędne piepowanie, odczynnik lub awarię sprzętu. Cały cykl, włącznie ze wszystkimi badanymi próbkami RNA, musi być powtórzony. Awaria kontroli ekstrakcji może wskazywać na problem podczas ekstrakcji akcji, taki jak awaria odczynników, błędne piftowanie lub zanieczyszczenie krzyżowe. Pobieranie wszystkich próbek musi być powtórzone. Awarie kontroli powinny być rzadkie wśród doświadczonego personelu laboratoryjnego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Udane badanie LN34 wymaga dodatniej kontroli, kontroli ekstrakcji, a reakcje kontroli wzorcowej nie przebiegają zgodnie z oczekiwaniami w każdym testie, w przeciwnym razie cykl musi zostać unieważniony i powtórzony. Wszystkie trzy pozytywne reakcje replikacyjne LN34 powinny przekroczyć próg w określonym zakresie lub powtórzyć ten proces. Dodatnie RNA kontrolowane opisane w poprzednich publikacjach ^7,8 nie amplifikuje się w teście βA. Reakcje kontrolne bez szablonu nie powinny wykazywać krzywych amplifikacji przekraczających linię progową ani dla testu LN34, ani βA. Kontrola ekstrakcji nie powinna wykazywać amplifikacji dla LN34. Jeśli zaobserwowane zostanie nieoczekiwane wzmocnienie w NTC lub kontroli ekstrakcji, może to wskazywać na skażenie i unieważnić przeprowadzenie testów powtórzonych dla wszystkich próbek (patrz Tabela 5). Użytkownicy mogą rozważyć dodanie dodatkowych kontroli, w tym kontroli bez procesu lub bez próbki, aby monitorować zanieczyszczenie odczynników ekstrakcyjnych βA przez gospodarza.

Gdy śmiertelność na wściekliznę zbliża się do 100%, zaleca się dalsze badanie wszelkich słabych lub nieprawidłowych amplifikacji, nawet jeśli nie daje wartości CT. Reakcje ujemne lub NTC nie powinny wykazywać żadnego wzmocnienia, a fluorescencja powinna pojawiać się jako linia płaska równoległa do fluorescencji ROX w widoku wieloskładnikowym. Obserwacje krzywych, zwłaszcza w wielu replikacjach, mogą wskazywać na zanieczyszczenie krzyżowe lub słaby wynik pozytywny. Wszystkie repliki dla próbki dodatniej powinny być amplifikowane, aby uzyskać ważny wynik pozytywny. Jeśli tylko podzbiór replikacji amplifikuje się w którymkolwiek z testów, próbka powinna zostać ponownie przebadana. Ponadto każda próba dająca wysoce zmienne wyniki (różnice wartości Ct > ±1,5 między replikacjami) powinna być uznana za nieważną i próbka powinna być ponownie przebadana. Jeśli problem się utrzymuje, próbkę należy ponownie pobrać.

Próbka pozytywna na wściekliznę, pobrana z prawidłowo zebranej i przechowywanej tkanki pnia mózgu i móżdżku, powinna mieć wartość Ct krótszą niż 35 cykli w badaniu LN34. Wszystkie niejednoznaczne próbki muszą być ponownie przebadane za pomocą LN34 RT-PCR w czasie rzeczywistym. Jeśli próbka jest niejednoznaczna po powtórzeniu testów i wszystkie kontrole przeprowadzone zgodnie z oczekiwaniami, zaleca się ponowne wyodrębnienie RNA. Próbki z niskim poziomem RNA wirusowego (LN34 Ct > 35) mogą wskazywać na potencjalne problemy, takie jak skażenie, niskie obciążenie wirusem, hamowanie PCR lub nieudana ekstrakcija. Pobierz świeże fragmenty mózgu z oryginalnej tkanki, wykonaj ekstrakcję RNA i ponownie przebadaj próbkę. Podobnie, wartości Ct > 33 (singleplex), 37 (LN34M) lub brak amplifikacji w badaniu βA mogą wskazywać na niepowodzenie ekstrakcji RNA. Powtórz ekstrakcję dla takich próbek, a następnie powtórz badania zarówno LN34, jak i aktyny. Jeśli próbka po wielokrotnych testach ponownie da niejednoznaczny wynik, należy użyć metody wtórnej, takiej jak test DFA (zwany też FAT), DRIT lub izolacja wirusa. Jeśli zaobserwowane są dalsze rozbieżności lub niejednoznaczne wyniki, prosimy o konsultację z laboratorium referencyjnym przeciw wściekliźnie w celu uzyskania potwierdzających testów.

Jeśli inhibitory występują w ekstrakcji RNA, testy PCR mogą dać fałszywie negatywny wynik. Jeśli podejrzewa się hamowanie lub hamowanie reakcji kontrolnych βA (takich jak wartość Ct > 33 lub wartość Ct > 37) dla konkretnej próbki, ekstrahowane RNA powinno być testowane w 2 lub więcej rozcieńczeniach (np. 1:10 i 1:100 w wodzie wolnej od nukleazy), aby rozcieńczyć ewentualne inhibitory PCR. Dla trudnych próbek zawartość RNA można zwiększyć do 8,5 μL w reakcji RT-PCR, nie dodając wody. Może to ujawniać zwiększoną inhibicję (późniejsza wartość Ct w porównaniu do 2 μL wejściowego RNA) lub niski poziom RNA w oryginalnej próbie (wcześniejsza wartość Ct przy użyciu 8,5 μL w porównaniu do 2 μL wejściowego RNA).

Test LN34 nie rozróżnia lizawirusów ani nie określa wariantów wirusa wścieklizny. Amplicon z testu LN34 może być sekwencjonowany pod kątem niskiej rozdzielczości typowania wariantu wirusa wścieklizny lub identyfikacji lizawirusa^{typu 11}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
7500 Fast	Biosystemy stosowane	Nie ma	Nie zastępuj bez weryfikacji
7500 Fast Dx	Biosystemy stosowane	Nie ma	Nie zastępuj bez weryfikacji
ABI ViiA 7	Biosystemy stosowane	Nie ma	Nie zastępuj bez weryfikacji
AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	AM1005	Nie zastępuj bez weryfikacji
Beadbug6	Benchmark Scientific	D1036
Zestaw MiniPrep z RNA Direct-zol	Zymo Research	R2052
MagNA Lyser zielone koraliki	Roche	3358941001
Mikrowirówka	Eppendorf	5425 R
Optyczne płytki reakcyjne 96-dołkowe	ThermoFisher Scientific	4346907
Osłony z klejem optycznym	ThermoFisher Scientific	4311971	Alternatywa: czapki
Aplikatory z włóknem poliestrowym do stosowania wymazy	BD BBL Poliestrowy Włókno Aplikacyjny Opaska Aplikacyjny	220690
QuantStudio 6Flex	Biosystemy stosowane	4485691	Nie zastępuj bez weryfikacji
Czwartorzędowy środek dezynfekujący amonikiem (1:256)	LYSOL	WBB56939	Nie zastępuj bez weryfikacji
PROSZĘ DO WOLI	ThermoFisher Scientific	7002PK
RNaseZap	ThermoFisher Scientific	AM9780
Skalpel jednorazowy, skalpel z mechanizmem bezpieczeństwa;	Integra Miltex	4-510
Sterylne mikrowirówki poliproylenowe (1,5 mL), wolne od nukleazy	Sarstedt	72.692.405
Mikrowirówki sterylne poliproylenowe (2 mL), wolne od nukleazy	Sarstedt	72.694.600
Odczynnik TRIzol	ThermoFisher Scientific	15596026	Nie zastępuj bez weryfikacji