Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Podsumowanie

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Streszczenie

Mikroglej, jako makrofagi rezydujące w mózgu, są niezbędne do utrzymania homeostazy mózgu. Kształtują obwody neuronalne podczas rozwoju, badają swoje środowisko pod kątem szczątków lub martwych komórek, a także reagują na infekcje i urazy w mózgu, a także wiele innych funkcji. Jednak ich ważna rola w rozwoju neurologicznym oraz plastyczności synaptycznej i patofizjologii nie została w pełni zdefiniowana, co podkreśla potrzebę dalszych badań. Aby uzyskać bardziej kompleksowe zrozumienie roli mikrogleju w tych procesach, musimy wyizolować mikroglej i scharakteryzować go genetycznie, metabolicznie i funkcjonalnie. Jednak izolacja mikrogleju od dorosłych myszy, zwłaszcza od małych struktur mózgu, jest wyzwaniem, ponieważ stanowią one niewielki procent wszystkich komórek mózgowych, a wydajność izolowanego mikrogleju jest często zbyt niska. W tym przypadku magnetyczna izolacja mikrogleju za pomocą mikrogranulek CD11b⁺ pozwala nam sortować komórki mikrogleju z podwzgórza świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy. Obecna metoda pozwala nam osiągnąć stosunkowo wysoką czystość i plon w krótkim czasie przy zachowaniu żywotności komórek.

Wprowadzenie

Mikroglej odpowiada 5-20% wszystkich komórek nerwowych i są jedynymi komórkami glejowymi, które pochodzą od komórek progenitorowych erytromieloidalnych w woreczku żółtkowym i zaczynają kolonizować rozwijający się mózg około dnia embrionalnego E9.5^1,2. Są to długowieczne komórki, które mają zdolność do powolnej samoodnowy, niezależnie od komórek pochodzących ze szpiku kostnego³. Jako jedne z najbardziej dynamicznych komórek, są zdolne do pozyskiwania różnych fenotypów w odpowiedzi na sygnały kontekstowe i środowiskowe^2,4. Wśród sygnałów zdolnych do modulowania ich aktywności najsilniejsze są uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN), aktywność neuronów, a także składniki odżywcze. Coraz więcej badań wykazało kluczową rolę mikrogleju w urazach, chorobach neurodegeneracyjnych i otyłości^2,5,6. Niemniej jednak dokładna rola mikrogleju zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patofizjologii wymaga dalszych badań. Dlatego ich charakterystyka transkrypcyjna, metaboliczna i funkcjonalna w różnych warunkach ma ogromne znaczenie i wymaga ich izolacji, ponieważ badania in situ są odpowiednie do lokalizacji DNA, RNA i białek oraz porównań jakościowych, a także charakterystyki morfologicznej mikrogleju.

Istnieją różne techniki opisane do izolacji mikrogleju, wśród których są metoda gradientu Percolla⁷, sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej (FACS)⁸, oraz sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS). Wybór odpowiedniej metody zależy od celów badania i poziomu czystości wymaganego dla dalszych zastosowań. Wyizolowanie czystego mikrogleju z mózgu dorosłej myszy, zwłaszcza z małych struktur mózgu, takich jak podwzgórze, jest trudne ze względu na ograniczoną liczbę komórek mikrogleju. Zautomatyzowana delikatna dysocjacja podwzgórza przy użyciu technologii Miltenyi pozwala na oczyszczenie stosunkowo wysokiej wydajności mikrogleju w krótkim czasie z możliwością przetwarzania do ośmiu próbek w tym samym czasie za pomocą dysocjatora GentleMACS Octo.

Po homogenizacji tkanek następuje oczyszczanie mikrogleju za pomocą technologii opartej na kolumnach MACS i supermagnetycznych nano-rozmiarowych kulkach CD11b⁺. Dlatego wszystkie próbki są przetwarzane dokładnie w ten sam sposób, uzyskując nienaruszone komórki CD11b⁺. Warto zauważyć, że CD11b jest obecny nie tylko w mikrogleju, ale ulega również ekspresji w innych komórkach linii szpikowej, w tym makrofagach i monocytach⁹. Aby to ograniczyć, perfuzja mózgu lodowatym roztworem soli fizjologicznej przed ekstrakcją podwzgórza (patrz krok protokołu 2.6) zapewnia eliminację większości komórek szpikowych, pozostawiając tylko potencjalnie niewielką frakcję rezydujących makrofagów lub tych przylegających do naczyń krwionośnych. Makrofagi i monocyty w zdrowym stanie stacjonarnym OUN stanowią niewielki procent wszystkich komórek odpornościowych mózgu (odpowiednio ~10% i <2%)^10,11. Dlatego, gdy komórki mózgowe są sortowane za pomocą kulek CD11b ⁺, można wyizolować zarówno mikroglej, jak i makrofagi, chociaż zdecydowana większość to mikroglej.

Końcowy plon mikrogleju i utrzymanie jego żywotności pozwalają nam przeprowadzać testy ex vivo, jak również in vitro, z korzyścią analizy konkretnych obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania. Najnowsze dowody wykazały, że populacja mikrogleju jest wysoce niejednorodna, reprezentując specyficzną dla regionu ekspresję genów oraz cechy morfologiczne i funkcję^2,12,13. Dlatego obecny protokół ma na celu wyizolowanie i analizę dorosłego mikrogleju w sposób specyficzny dla regionu. Rzeczywiście, możemy scharakteryzować profile genetyczne, transkrypcyjne i translacyjne dorosłego mikrogleju podwzgórza za pomocą metod takich jak sekwencjonowanie RT-qPCR i RNA, a także przeprowadzając analizę funkcjonalną in vitro.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami Unii Europejskiej (2013/63/UE) i zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną Uniwersytetu w Bordeaux (CEEA50) oraz francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Badań i Innowacji (nietechniczne podsumowanie zatwierdzonego projektu NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Następujący protokół jest wykonywany na dorosłych myszach C57BL/6 o średnim wieku 2-4 miesięcy. Można go jednak przeprowadzić u wszystkich myszy w każdym wieku i w różnych warunkach, biorąc pod uwagę, że krajobraz komórek odpornościowych OUN może ulec zmianie, a odsetek rezydujących makrofagów i monocytów może być zwiększony (np. w procesie starzenia się i neurodegeneracji).

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Następujące objętości i roztwory są ściśle związane z izolacją komórek Cd11b+.

1. Określić całkowitą objętość D-PBS/0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wymaganą na podstawie liczby próbek. Przygotować roztwór, używając dostępnego w handlu D-PBS z wapniem i magnezem oraz proszkiem BSA (patrz Tabela Materiałów).
2. Przygotować znakowane probówki dysocjacyjne (C-Tubes) i napełnić każdą z nich 1 900 μl buforu Z, dostarczonego w zestawie do dysocjacji tkanki mózgowej dla dorosłych (patrz Tabela Materiałów). Rozmrozić enzymy i trzymać je na lodzie wraz ze wszystkimi wymaganymi w poniższych krokach.
3. Przygotować i umieścić na lodzie odpowiednią objętość 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz Tabela Materiałów) potrzebnej do perfuzji (krok 2.6). Obliczyć 10 ml na każde zwierzę plus 10% w nadmiarze.
4. Do analizy RT-qPCR należy przygotować bufor qPCR na próbkę: 2,5 μl tioglicerolu + 250 μl buforu do lizy, używając dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA (patrz tabela materiałów).
5. W celu ilościowego oznaczania białek należy przygotować bufor do lizy, rozcieńczając koktajl inhibitora fosfatazy i koktajl inhibitora proteazy w stosunku 1:100 w buforze do ekstrakcji ssaków (patrz tabela materiałów).
6. Do wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) i testu fagocytozy należy przygotować 1x HBSS z dostępnych na rynku 10x HBSS (patrz Tabela materiałów). Następnie przygotuj bufor FACS, dodając 0,2% BSA do 1x HBSS.

2. Usunięcie mózgu

1. Uspokoić zwierzę dawką 20 mg/kg ksylazyny, a następnie poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania 400 mg/kg pentobarbitalu i umieścić ją na wznak na tacy sekcyjnej.
   UWAGA: Inne kombinacje środków znieczulających do eutanazji zwierzęcia również mogą działać.
2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 10 ml lodowatego 1x PBS i podłącz ją do igły motylkowej 21 G.
3. Gdy mysz jest całkowicie znieczulona (sprawdź, szczypiąc łapy, aby upewnić się, że brak reakcji), oddech ustał, a serce jest w migotaniu, nałóż skórę kleszczami i otwórz klatkę piersiową nożyczkami, na poziomie ostatnich żeber i mostka.
4. Użyj nożyczek, aby wykonać głębokie nacięcie wzdłuż boków klatki piersiowej w kierunku górnej części klatki piersiowej, aby odsłonić serce.
5. Wprowadzić igłę 21 G w dystalną część lewej komory (upewnić się, że około 1/3 igły znajduje się wewnątrz komory). Natychmiast wykonaj nacięcie przez prawy przedsionek za pomocą nożyczek.
6. Wlej 10 ml lodowatego 1x PBS, aby oczyścić mózg z krążących komórek odpornościowych.
   UWAGA: Sprawdź wzrokowo mózg, aby upewnić się, że jest czysty i dobrze ukrwiony.
7. Odetnij głowę myszy, ostrożnie wyjmij mózg i umieść go na szalce Petriego wypełnionej lodem i pokrytej folią aluminiową.
   UWAGA: Szalka Petriego i folia pomagają w zobaczeniu fragmentów mózgu. Korzystne jest utrzymanie chłodnego środowiska podczas siekania kawałków mózgu, aby ograniczyć aktywność metaboliczną.
8. Odizoluj podwzgórze za pomocą kleszczy i pokrój je na małe kawałki żyletkami.
   1. Aby zidentyfikować i wypreparować podwzgórze, umieść mózg do góry nogami, tak aby kora była brzuszna, a podwzgórze było widoczne grzbietowo na górnej powierzchni. Oddziel podwzgórze, które znajduje się na dnie mózgu po obu stronach trzeciej komory, za pomocą zakrzywionych kleszczy. Średnia masa podwzgórza u dorosłych myszy C57BL/6 wynosi 15 mg.
      UWAGA: Fragmenty mózgu muszą być jak najmniejsze (<0,5 mm). Cięcie na małe kawałki jest krytycznym krokiem, ponieważ pozwala na lepszą dysocjację i wyższą wydajność komórek.
9. Zbierz kawałki podwzgórza w probówkach dysocjacyjnych (rurkach C) uprzednio wypełnionych 1,900 μl buforu Z (krok 1.2).
   UWAGA: Aby uzyskać dobrą wydajność komórek mikrogleju, która jest wystarczająca do przeprowadzenia testów, należy zebrać co najmniej dwa (w przypadku oznaczania ilościowego białka) lub trzy (w przypadku qPCR i RNAseq) podwzgórze na probówkę.

3. Dysocjacja tkanek

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane na lodzie. Nie należy wirować zawiesiny komórek na żadnym etapie; Dokładnie mieszać tylko pipetą o pojemności 1 000 μl.

1. Przygotować mieszaninę enzymów 2 zgodnie z tabelą 1 (obliczając całkowitą objętość dla wszystkich probówek + 10% w nadmiarze). Do każdej probówki C dodać 50 μl enzymu zawartego w mieszance 1 (patrz tabela 1) i 30 μl mieszaniny enzymów 2. Wszystkie enzymy znajdują się w zestawie do dysocjacji tkanki mózgowej dla dorosłych (patrz tabela materiałów).
2. Zamknij C-rurki i umieść je do góry nogami w dysocjatorze ze wspornikami grzewczymi zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom program 37C_ABDK_02.
3. Przygotuj probówki zatrzaskowe o pojemności 15 ml (patrz tabela materiałów) z sitkami o średnicy 70 μm na wierzchu. Zwilż sitko 2 ml D-PBS.
4. Po zakończeniu programu dysocjacji/trawienia opróżnij rurkę C na sitko i podrap końcówką o pojemności 200 μl, aby zmniejszyć utratę komórek poprzez zwiększenie filtracji komórkowej i zmniejszenie przylegania homogenatu tkankowego do filtra.
5. Umyj probówkę 2 x 5 ml D-PBS, opróżnij popłuczyny na sitko i zarysuj końcówką o pojemności 200 μl między praniami.
6. Odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z odpowiednią objętością zimnego D-PBS zgodnie z tabelą 1.
7. Natychmiast dokładnie wymieszać z 450 μl odczynnika do pomiaru gradientu gęstości (roztwór do usuwania zanieczyszczeń, patrz tabela materiałów) i bardzo delikatnie nałożyć na 2 ml zimnego D-PBS (patrz tabela 1).
   UWAGA: Aby uzyskać warstwy gradientu o różnej gęstości, D-PBS należy delikatnie nakładać kropla po kropli, z jak najmniejszymi "zakłóceniami", po 1 ml na raz za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
8. Wirować przy 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z powolnym przyspieszaniem i powolnym hamowaniem (jeśli 9 jest równoznaczne z pełnym, należy użyć 5).
9. Powstają trzy fazy. Całkowicie zassać dwie górne fazy i wyrzucić je. Upewnij się, że nie zasysasz trzeciej dolnej fazy.
10. Napełnij 1800 μl zimnego D-PBS i delikatnie odwróć probówkę 3 razy.
11. Wirować przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu, a następnie całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie zawiesić ponownie osad komórkowy, pipetując powoli w górę i w dół za pomocą 2 ml D-PBS/BSA.

4. Izolacja magnetyczna komórek CD11b⁺

1. Odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie zawiesić ponownie osad komórek w 90 μl buforu D-PBS/BSA.
2. Dodać 10 μl mieszaniny CD11b z mikrogranulkami i dobrze wymieszać pipetą.
3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C w lodówce, nie na lodzie; umyć komórki dodając 1 ml D-PBS/BSA i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; całkowicie odessać supernatant. Ostrożnie zawiesić w 500 μl D-PBS/BSA.
4. Uruchom program POSSEL2 na separatorze, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Umieść małe kolumny (patrz Tabela materiałów) w polu magnetycznym.
   UWAGA: Do sortowania komórek magnetycznych można wybrać zarówno małe, jak i duże kolumny, zgodnie z oczekiwaną średnią liczbą komórek. Małe kolumny mają pojemność do 1 × 10⁷ oznaczonych komórek, a duże kolumny do 1 × 10⁸. Podczas izolowania komórek od małych struktur, takich jak podwzgórze, zaleca się stosowanie małych kolumn. Objętości odczynników są różne w przypadku stosowania dużych kolumn (patrz instrukcje producenta).
5. Zwilżyć kolumny (patrz tabela materiałów) 500 μl D-PBS/BSA. Jeżeli do dalszej analizy potrzebna jest ujemna frakcja komórek (CD11b^-), należy umieścić płytkę zbiorczą pod kolumnami, a następnie nałożyć zawiesinę komórek w kolumnach.
6. Wykonaj trzy etapy mycia, dodając jednorazowo 500 μl D-PBS/BSA do kolumny, za każdym razem czekając, aż bufor przejdzie przez kolumnę.
   UWAGA: ważne jest, aby zapobiec wysychaniu górnej części kolumny, dlatego zaleca się, aby nie czekać, aż cały bufor przejdzie przez nią.
7. Przenieść całkowite ścieki frakcji CD11b z dołków płytki zbiorczej do 15-mililitrowych probówek.
8. Wyjąć kolumnę z separatora, umieścić ją w probówce o pojemności 5 ml i odpipetować 1 ml D-PBS/BSA do kolumny.
9. Natychmiast wypłukać magnetycznie znakowaną frakcję komórkową, mocno naciskając tłok dostarczony z kolumną.
10. W końcu policz komórki CD11b ⁺ za pomocą hemacytometru lub dowolnej innej metody; spodziewaj się ~ 15 000 komórek na podwzgórze.
11. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.

5. Analizy

1. W przypadku analizy RT-qPCR należy ponownie zawiesić osady komórkowe za pomocą buforu qPCR (w celu przygotowania, patrz krok 1.3) i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do ekstrakcji mRNA. Wyizoluj całkowite RNA, a następnie przetwórz je i przeanalizuj zgodnie z wytycznymi MIQE¹⁴. Na koniec zsyntetyzuj cDNA i wykonaj qPCR za pomocą urządzenia RT-PCR. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze wszystkimi dostępnymi na rynku zestawami.
2. W celu ilościowego określenia białka przemyj granulki komórkowe D-PBS (bez BSA) co najmniej 2x, aby wyeliminować BSA. Następnie ponownie zawieś osady komórkowe z dwóch podwzgórz za pomocą 20 μl buforu do lizy. Przystąpić do oznaczania ilościowego białka za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Postępowaliśmy zgodnie z instrukcjami producenta¹⁵, aby określić ilościowo białka do przeprowadzenia testu aktywności kinaz serynowo-treoninowych.
3. W celu wykrycia reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach mikrogleju, ponownie zawieś osad w 1x HBSS. Komórki należy traktować zgodnie z protokołem producenta zestawu do testu cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Następnie ponownie zawieś leczone komórki w 200 μl buforu FACS (w celu przygotowania, patrz krok 1.5) i wykonaj FACS w celu wykrycia komórek zestresowanych oksydacyjnie.
4. W przypadku testu fagocytozy inkubuj posortowane komórki w D-PBS/BSA z fluorescencyjnymi kulkami lateksowymi (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut. Dostosuj liczbę kulek tak, aby wynosiła średnio 4 kulki na komórkę. Następnie odwirować przy 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS i odczytać emisję fluorescencji za pomocą FACS (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

Wyniki

Ocena końcowej wydajności opiera się na poziomie czystości oraz ilości wyizolowanych komórek i może być określona za pomocą RT-qPCR, zliczania komórek oraz oznaczania ilości białka. Czystość wyizolowanych magnetycznie komórek z podwzgórza potwierdzono poprzez analizę ekspresji genów CD11b, C1qa, Gad1 oraz GFAP za pomocą RT-qPCR (Rycina 1). CD11b i C1qa są ekspresjonowane głównie przez mikroglej w ośrodkowym układzie nerwowym w stanie spoczynku¹⁶, natomiast Gad1 i GFAP służą odpowiednio jako marker neuronalny i astrocytarny. Całkowita ilość cDNA z jednego podwzgórza mieściła się w zakresie od 55 do 98 ng. Warto zauważyć, że tylko frakcja pozytywna wykazywała ekspresję CD11b i C1qa, co wskazuje na brak potencjalnej utraty komórek mikrogleju we frakcji negatywnej. Startery podano w Tabeli 2.

Ponadto, niskie poziomy markerów neuronalnych i astrocytarnych gwarantują, że ogromna większość wyizolowanych komórek to mikroglej, ponieważ rezydentne makrofagi i monocyty stanowią jedynie 10 % całkowitej populacji komórek odpornościowych w zdrowym mózgu^10,11. Wyniki te dowodzą skuteczności selekcji magnetycznej i torują drogę do zastosowania RT-qPCR w celu oceny poziomów ekspresji wszystkich interesujących genów w świeżo posortowanych komórkach mikrogleju podwzgórza. Podobnie, w posortowanym mikrogleju podwzgórza można przeprowadzić analizę RNAseq, aby uzyskać kompleksowy wgląd w jego transkryptom.

Ilość wyizolowanych komórek określono poprzez zliczanie komórek, co wykazało obecność ~15 000 komórek na podwzgórze (wspomniano w kroku 4.10 protokołu). Dodatkowo oznaczono stężenie białka w posortowanych mikroglejach, co ujawniło średnie stężenie 0,5 µg/µL w komórkach CD11b⁺ wyizolowanych z dwóch połączonych podwzgórz (Rycina 2). Wiedza ta pozwala na przeprowadzenie różnych analiz w zależności od minimalnego progu zawartości białka. Ponadto, poprzez łączenie większej liczby podwzgórz, można uzyskać wyższe stężenie, co poszerza zakres potencjalnych analiz. Białka wyekstrahowane z mikroglejów podwzgórza umożliwiają zastosowanie różnorodnych technik, w tym immunoassay AlphaLISA oraz testów aktywności kinaz.

Ponadto opisany protokół umożliwia badaczom przeprowadzenie kilku ex vivo analizy, umożliwiające badanie aktywności mikrogleju oraz jego roli w podwzgórzu zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym. Ilościowe oznaczenie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) stanowi kluczowy aspekt odpowiedzi immunologicznej mikrogleju¹⁷W związku z tym, po separacji mikroglej można poddać działaniu dostępnych komercyjnie odczynników, które umożliwiają detekcję ROS w żywych komórkach poprzez emisję zwiększonego sygnału fluorescencyjnego w wyniku utleniania. Mikroglej wyizolowany magnetycznie z trzech połączonych podwzgórz jest wystarczający do detekcji ROS metodą FACS, co pokazano w Rycina 3Achoć nasze wyniki wykazują dość wysoką zmienność produkcji ROS w komórkach w analizowanych warunkach. Warto zauważyć, że przy użyciu wspomnianego zestawu komercyjnego (patrz w Tabela materiałów), byliśmy również w stanie ocenić żywotność wyizolowanych komórek Cd11b+, dzięki zastosowaniu barwnika do martwych komórek, który nie przenika przez błonę komórkową i wykazuje wzrost fluorescencji po związaniu z DNA. W szczególności nasze dane wykazują, że 99% komórek jest żywych (Rycina 3BW celu rozróżnienia komórek żywych od martwych, a także komórek poddanych stresowi oksydacyjnemu od komórek niestresowanych, na podstawie ich właściwości fluorescencyjnych zastosowano strategie bramkowania.

Kolejną główną cechą aktywności mikrogleju jest fagocytoza, dynamiczny i ściśle regulowany proces, który odgrywa kluczową rolę w nadzorze immunologicznym, naprawie tkanek oraz ogólnej homeostazie ośrodkowego układu nerwowego¹⁸. Co istotne, komórki Cd11b⁺ wyizolowane za pomocą koralików magnetycznych mogą być hodowane przez 24 h, a następnie inkubowane z fluorescencyjnymi lateksowymi mikrokoralikami w różnych odstępach czasu, aby ocenić – za pomocą FACS lub mikroskopii fluorescencyjnej – zmiany w aktywności fagocytarnej w różnych warunkach. Świeżo wyizolowany mikroglej może być również bezpośrednio w probówce eksponowany na koraliki fluorescencyjne lub dowolny rodzaj cząsteczek sprzężonych z pHrodo (np. synaptosomy), a fagocytozę można ocenić za pomocą analizy FACS.

Dokładnie rzecz biorąc, inkubowaliśmy bezpośrednio w probówce zawierającej zawiesinę posortowanych komórek – mikroglej wyizolowany z dwóch połączonych podwzgórzy lub z całego mózgu – z fluorescencyjnymi kuleczkami lateksowymi. Mikroglej, który pochłonął co najmniej jedną fluorescencyjną kuleczkę, można odróżnić od komórek niephagocytujących za pomocą cytometrii przepływowej, ponieważ mikroglej fagocytujący wykaże zwiększoną fluorescencję. Do wyznaczenia bramkowania wykorzystano kontrole negatywne, których nie inkubowano z kuleczkami. W obu naszych warunkach eksperymentalnych (myszy karmione standardową karmą vs dietą wysokotłuszczową (HFD)) zaobserwowaliśmy bardzo niski odsetek mikrogleju fagocytującego (Rycina 4A). Niemniej jednak, wynik ten przedstawiono tutaj, aby zademonstrować skuteczność tej metody, która w sposób zdumiewający pozwala również na rozróżnienie komórek, które pochłonęły 1 kuleczkę, 2 kuleczki, 3 kuleczki i tak dalej (Rycina 4B). Ostatecznie wszystkie podejścia omiczne można zastosować do wyizolowanego mikrogleju podwzgórza. Sugerujemy połączenie trzech podwzgórzy, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do przeprowadzenia tych analiz.

Rycina 1: Ocena czystości komórek CD11b⁺ za pomocą RT-qPCR. Ilościowe oznaczenie w posortowanych komórkach ekspresji mRNA integryny CD11b, podjednostki A podkomponentu C1q dopełniacza C1q, decelerazy kwasu glutaminowego Gad1 oraz kwaśnego białka włókienstwa glejowego GFAP, znormalizowane względem poziomów mRNA genów referencyjnych Eef1a1 oraz Sdha. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Oznaczenie ilości białka z komórek podwzgórza po sortowaniu komórek. Ilościowe oznaczenie stężenia białka w komórkach CD11b⁺ i CD11b^-. Zarówno komórki CD11b⁺, jak i CD11b^- poddano lizie w 20 µL buforu do lizy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 3: Detekcja ROS w żywych komórkach mikrogleju. Ilościowe oznaczenie (A) komórek poddanych stresowi oksydacyjnemu oraz (B) żywych komórek w populacji wyselekcjonowanych komórek Cd11b⁺, wraz z odpowiednimi wykresami konturowymi FACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Ilościowe oznaczenie aktywności fagocytycznej mikrogleju. (A) Ilościowe oznaczenie komórek fagocytujących wśród komórek Cd11b⁺ wyizolowanych z dwóch podwzgórz lub jednego mózgu, wraz z odpowiadającym im wykresem konturowym FACS. (B) Procent komórek fagocytujących w zależności od liczby fagocytowanych kuleczek, wraz z odpowiadającym im wykresem konturowym FACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mieszanina enzymów 2
Enzym A	Bufor Y	Enzym P
10 µL	20 µL	50 µL
	D-PBS	Debris Removal Solution	Nakładka z D-PBS
15-100 mg struktury	1000 µL	450 µL	2 mL

Tabela 1: Przygotowanie mieszaniny dysocjującej (objętości odnoszą się do pojedynczej próbki) oraz warstw gradientu.

Geny	Białko			Forward			Reverse
Itgam	Integrin alpha M (CD11b)			CTCATCACTGCTGGCCTATACAA			GCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
Sdha	Succinate Dehydrogenase Complex Flavoprotein Subunit A			CCCTCTCATATGTGGACATCAA			CAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qa	Complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide			CGAGGTGTGGATCGAAAAGG			GAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
Gad1	glutamate decarboxylase 1			GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAG			CTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfap	glial fibrillary acidic protein			AGGTCCGCTTCCTGGAACA			GGGCTCCTTGGCTCGAA

Tabela 2: Sekwencje starterów do RT-qPCR.

Sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej (FACS)	Magnetyczne sortowanie komórek (MACS)
Przeciwciała biochemiczne znakowane fluorescencyjnie	Kuleczki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami
Dyferencjacja poza markerami powierzchniowymi komórek	Różnicowanie wyłącznie na podstawie markerów powierzchniowych komórek
Znaczna wydajność początkowa	Umiarkowana wydajność początkowa
Wolniejsza niż MACS przy jednoczesnej obsłudze wielu próbek	Szybsza niż FACS metoda jednoczesnej analizy wielu próbek
Mniej delikatna niż MACS	Łagodniejsza niż FACS

Tabela 3: Przedstawienie charakterystyki i ograniczeń FACS oraz MACS

Dyskusja

Obecny protokół przedstawia izolację mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie. Przedstawione powyżej wyniki potwierdzają czystość i żywotność izolowanych komórek, a także skuteczność tej metody w funkcjonalnym charakterystyce mikrogleju ex vivo, np. poprzez aktywność fagocytarną i kwantyfikację produkcji ROS. Klasyczne metody izolacji określonej populacji komórek mogą być również stosowane w przypadku komórek mikrogleju. Frakcjonowanie w gradiencie gęstości jest dobrze znaną metodą rozdzielania różnych komórek i ich cząstek w zależności od ich wielkości i/lub gęstości. Technika ta może być stosowana do izolacji i hodowli pierwotnego mikrogleju. Jednak oczyszczanie dorosłego mikrogleju wymaga dalszego sortowania izolowanych komórek mózgowych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie lub immunomagnetycznych.

W szczególności FACS opiera się na znakowanych fluorescencyjnie przeciwciałach biochemicznych do znakowania komórek i rozróżniania ich według dużej liczby zmiennych, które wykraczają poza markery powierzchniowe, takich jak ich rozmiar i status metaboliczny. Niemniej jednak proces oczyszczania komórek może być wolniejszy i nie tak delikatny, co zwiększa liczbę martwych komórek, a także wymaga znacznej początkowej wydajności. Dlatego niewielka liczba mikrogleju podwzgórza jest już czynnikiem ograniczającym. MACS wykorzystuje kulki magnetyczne sprzężone z pewnymi przeciwciałami przeciwko określonym epitopom komórkowym i może pracować ze skromną początkową wydajnością, ułatwiając specyficzne dla regionu badania dynamiki mikrogleju. Ze względu na silne pole magnetyczne mikrogranulek wymagane jest minimalne oznakowanie; w związku z tym jest łagodniejszy niż FACS, zapewniając utrzymanie integralności komórek. Ponadto MACS jest szybszy niż FACS, gdy konieczna jest jednoczesna obsługa wielu próbek. Zapewnia to wyraźną zaletę polegającą na utrzymaniu wysokiej żywotności komórek, która może również wynikać z niewielkiego plonu początkowego (Tabela 3).

Podstawowe wyzwania związane z izolacją mikrogleju z podwzgórza, którym można skutecznie sprostać za pomocą technologii MACS, obejmują osiągnięcie wystarczającej wydajności końcowej i zapewnienie zachowania integralności komórek. Wymagana ilość komórek zależy od charakteru wybranej analizy po izolacji. Na przykład badanie funkcjonalnej roli mikrogleju in vitro wymaga znacznej liczby komórek. Podkreśla to znaczenie początkowej puli tego samego regionu mózgu od różnych myszy z identycznymi schorzeniami przed przystąpieniem do procesu izolacji. I odwrotnie, techniki takie jak precyzyjne sekwencjonowanie pojedynczych komórek nie wymagają dużej populacji komórek, a co za tym idzie, łączenie kilku myszy nie jest wymagane.

Aby zmaksymalizować wydajność komórek, ważne jest, aby przestrzegać określonych kroków w protokole. Skuteczna dysocjacja jest inicjowana przez pocięcie podwzgórza na małe kawałki, a następnie poprzez zapewnienie, że są one utrzymywane w buforze na dnie rurki podczas procesu. Następnie, połączenie dysocjacji mechanicznej z enzymatyczną degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej zapewnia znacznie wysoką wydajność komórkową. Powinniśmy jednak być bardzo ostrożni z interpretacją wyników, ponieważ dysocjacja enzymatyczna przeprowadzona w temperaturze 37 °C może wywołać zmiany transkrypcyjne i translacyjne¹⁹. Aby zapobiec zmianom o pośrednictwie technicznym, można zastosować odpowiednie kontrole z inhibitorami transkrypcji i translacji¹⁹. Możliwe jest również przejście do dysocjacji enzymatycznej w niższej temperaturze, na przykład w chłodni (skuteczność może być zmniejszona), chociaż dysocjacja może polegać bardziej na działaniu mechanicznym niż enzymatycznym. Po dysocjacji zawiesina komórek jest wstępnie myta i przenoszona do filtrów siatkowych, a następnie wykonywane są dwa dokładniejsze płukania probówek, aby zapobiec utracie komórek. Jeszcze jednym krytycznym krokiem jest usunięcie zanieczyszczeń i mieliny osiągnięte przez wirowanie w gradiencie gęstości i tworzenie różnych warstw. W związku z tym osiągnięcie znacznego plonu końcowego wymaga skrupulatnego obchodzenia się zarówno z tkanką podwzgórza, jak i zawiesiną komórkową, utrzymując je zawsze na lodzie, aby spowolnić metabolizm i utrzymać ich fenotyp in vivo .

Ponadto istnieją pewne punkty, w których powinniśmy być bardzo ostrożni, aby osiągnąć najwyższą czystość mikrogleju i utrzymać fenotyp komórek mikrogleju. Początkowo perfuzja przeprowadzana w temperaturze 4 °C ma kluczowe znaczenie dla eliminacji wszystkich krążących komórek CD11b⁺ , zapewniając najwyższą potencjalną czystość mikrogleju. Jednak w przypadku przerwania bariery krew-mózg wyższy odsetek krążących komórek odpornościowych może skolonizować mózg, zakłócając badanie samego mikrogleju. Aby złagodzić ten problem, alternatywne podejście polega na wdrożeniu wtórnej rundy izolacji magnetycznej z wykorzystaniem mikrogranulek, które są sprzężone z przeciwciałem CD45. CD45 jest markerem powierzchni komórki wykazującym wysoką ekspresję w makrofagach²⁰ , a późniejszy przepływ tej rundy obejmuje tylko komórki mikrogleju. Ta strategia polegająca na zastosowaniu dwóch rund izolacji magnetycznej zwiększa specyfikę procesu; Niemniej jednak zajmuje to dodatkowy czas, co stwarza potencjalne ryzyko zakłócenia integralności komórkowej i/lub fenotypu mikrogleju. W związku z tym kluczowym czynnikiem dla zachowania cech funkcjonalnych i integralności komórek jest szybkie wyizolowanie tkanki mózgowej i utrzymanie jej na lodzie do momentu zainicjowania procesu dysocjacji. Podsumowując, to podejście analityczne zwiększa zrozumienie funkcji i zachowania mikrogleju, dostarczając cennych informacji na temat ich dynamicznych reakcji w podwzgórzu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych	Miltenyi	130-107-677	Zestaw zawiera bufor Z, bufor Y, enzymy A i P, roztwór do usuwania zanieczyszczeń, bufor A (do rozpuszczania enzymu A).
Albumina bydlęca FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (mikroglej) Mikrogranulki, ludzkie i mysie - mały rozmiar	Miltenyi	130-093-636
Zestaw do oznaczania cytometrii przepływu zielonego CellROX	Invitrogen	C10492
pokrywka Snap-Pop 15 ml	CellTreat	978449
DPBS, wapń, magnez, glukoza, pirogronian	Gibco	14287-072
GentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo Disocator z grzałkami	Miltenyi	130-096-427
Koktajl inhibitorów fosfatazy Halt (100x)	Thermofisher	78420
Koktajl inhibitorów proteazy Halt, bez EDTA (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej	Thermofisher	14065056
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany karboksylanem, czerwony fluorescencyjny	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler  480 SYBR Zielony I Mistrz	Roche	4707516001	Ten odczynnik został użyty do przeprowadzenia PCR.
Filtry siatkowe MACS SmartStrainer (70 &mikro; m)	Miltenyi	130-110-916
Zestaw do oznaczania białek Micro BCA	Thermofisher	23235
M-PER Bufor do ekstrakcji ssaków	Kolumny Thermofisher	78503
MS	Miltenyi	130-042-201	Określane w protokole jako małe kolumny.
Separator MultiMACS Cell24 Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7,4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	Zestaw służył do syntezy cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	Zestaw zawiera 1-tioglicerol i bufor BL (określany w protokole jako bufor do lizy) i służył do izolacji całkowitego RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282

Probówka wirówkowa ,