Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

6 września 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Streszczenie

Mikroglej, jako makrofagi rezydujące w mózgu, są niezbędne do utrzymania homeostazy mózgu. Kształtują obwody neuronalne podczas rozwoju, badają swoje środowisko pod kątem szczątków lub martwych komórek, a także reagują na infekcje i urazy w mózgu, a także wiele innych funkcji. Jednak ich ważna rola w rozwoju neurologicznym oraz plastyczności synaptycznej i patofizjologii nie została w pełni zdefiniowana, co podkreśla potrzebę dalszych badań. Aby uzyskać bardziej kompleksowe zrozumienie roli mikrogleju w tych procesach, musimy wyizolować mikroglej i scharakteryzować go genetycznie, metabolicznie i funkcjonalnie. Jednak izolacja mikrogleju od dorosłych myszy, zwłaszcza od małych struktur mózgu, jest wyzwaniem, ponieważ stanowią one niewielki procent wszystkich komórek mózgowych, a wydajność izolowanego mikrogleju jest często zbyt niska. W tym przypadku magnetyczna izolacja mikrogleju za pomocą mikrogranulek CD11b+ pozwala nam sortować komórki mikrogleju z podwzgórza świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy. Obecna metoda pozwala nam osiągnąć stosunkowo wysoką czystość i plon w krótkim czasie przy zachowaniu żywotności komórek.

Wprowadzenie

Mikroglej odpowiada 5-20% wszystkich komórek nerwowych i są jedynymi komórkami glejowymi, które pochodzą od komórek progenitorowych erytromieloidalnych w woreczku żółtkowym i zaczynają kolonizować rozwijający się mózg około dnia embrionalnego E9.51,2. Są to długowieczne komórki, które mają zdolność do powolnej samoodnowy, niezależnie od komórek pochodzących ze szpiku kostnego3. Jako jedne z najbardziej dynamicznych komórek, są zdolne do pozyskiwania różnych fenotypów w odpowiedzi na sygnały kontekstowe i środowiskowe2,4. Wśród sygnałów zdolnych do modulowania ich aktywności najsilniejsze są uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN), aktywność neuronów, a także składniki odżywcze. Coraz więcej badań wykazało kluczową rolę mikrogleju w urazach, chorobach neurodegeneracyjnych i otyłości2,5,6. Niemniej jednak dokładna rola mikrogleju zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patofizjologii wymaga dalszych badań. Dlatego ich charakterystyka transkrypcyjna, metaboliczna i funkcjonalna w różnych warunkach ma ogromne znaczenie i wymaga ich izolacji, ponieważ badania in situ są odpowiednie do lokalizacji DNA, RNA i białek oraz porównań jakościowych, a także charakterystyki morfologicznej mikrogleju.

Istnieją różne techniki opisane do izolacji mikrogleju, wśród których są metoda gradientu Percolla7, sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej (FACS)8, oraz sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS). Wybór odpowiedniej metody zależy od celów badania i poziomu czystości wymaganego dla dalszych zastosowań. Wyizolowanie czystego mikrogleju z mózgu dorosłej myszy, zwłaszcza z małych struktur mózgu, takich jak podwzgórze, jest trudne ze względu na ograniczoną liczbę komórek mikrogleju. Zautomatyzowana delikatna dysocjacja podwzgórza przy użyciu technologii Miltenyi pozwala na oczyszczenie stosunkowo wysokiej wydajności mikrogleju w krótkim czasie z możliwością przetwarzania do ośmiu próbek w tym samym czasie za pomocą dysocjatora GentleMACS Octo.

Po homogenizacji tkanek następuje oczyszczanie mikrogleju za pomocą technologii opartej na kolumnach MACS i supermagnetycznych nano-rozmiarowych kulkach CD11b+. Dlatego wszystkie próbki są przetwarzane dokładnie w ten sam sposób, uzyskując nienaruszone komórki CD11b+. Warto zauważyć, że CD11b jest obecny nie tylko w mikrogleju, ale ulega również ekspresji w innych komórkach linii szpikowej, w tym makrofagach i monocytach9. Aby to ograniczyć, perfuzja mózgu lodowatym roztworem soli fizjologicznej przed ekstrakcją podwzgórza (patrz krok protokołu 2.6) zapewnia eliminację większości komórek szpikowych, pozostawiając tylko potencjalnie niewielką frakcję rezydujących makrofagów lub tych przylegających do naczyń krwionośnych. Makrofagi i monocyty w zdrowym stanie stacjonarnym OUN stanowią niewielki procent wszystkich komórek odpornościowych mózgu (odpowiednio ~10% i <2%)10,11. Dlatego, gdy komórki mózgowe są sortowane za pomocą kulek CD11b +, można wyizolować zarówno mikroglej, jak i makrofagi, chociaż zdecydowana większość to mikroglej.

Końcowy plon mikrogleju i utrzymanie jego żywotności pozwalają nam przeprowadzać testy ex vivo, jak również in vitro, z korzyścią analizy konkretnych obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania. Najnowsze dowody wykazały, że populacja mikrogleju jest wysoce niejednorodna, reprezentując specyficzną dla regionu ekspresję genów oraz cechy morfologiczne i funkcję2,12,13. Dlatego obecny protokół ma na celu wyizolowanie i analizę dorosłego mikrogleju w sposób specyficzny dla regionu. Rzeczywiście, możemy scharakteryzować profile genetyczne, transkrypcyjne i translacyjne dorosłego mikrogleju podwzgórza za pomocą metod takich jak sekwencjonowanie RT-qPCR i RNA, a także przeprowadzając analizę funkcjonalną in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami Unii Europejskiej (2013/63/UE) i zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną Uniwersytetu w Bordeaux (CEEA50) oraz francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Badań i Innowacji (nietechniczne podsumowanie zatwierdzonego projektu NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Następujący protokół jest wykonywany na dorosłych myszach C57BL/6 o średnim wieku 2-4 miesięcy. Można go jednak przeprowadzić u wszystkich myszy w każdym wieku i w różnych warunkach, biorąc pod uwagę, że krajobraz komórek odpornościowych OUN może ulec zmianie, a odsetek rezydujących makrofagów i monocytów może być zwiększony (np. w procesie starzenia się i neurodegeneracji).

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Następujące objętości i roztwory są ściśle związane z izolacją komórek Cd11b+.

  1. Określić całkowitą objętość D-PBS/0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wymaganą na podstawie liczby próbek. Przygotować roztwór, używając dostępnego w handlu D-PBS z wapniem i magnezem oraz proszkiem BSA (patrz Tabela Materiałów).
  2. Przygotować znakowane probówki dysocjacyjne (C-Tubes) i napełnić każdą z nich 1 900 μl buforu Z, dostarczonego w zestawie do dysocjacji tkanki mózgowej dla dorosłych (patrz Tabela Materiałów). Rozmrozić enzymy i trzymać je na lodzie wraz ze wszystkimi wymaganymi w poniższych krokach.
  3. Przygotować i umieścić na lodzie odpowiednią objętość 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz Tabela Materiałów) potrzebnej do perfuzji (krok 2.6). Obliczyć 10 ml na każde zwierzę plus 10% w nadmiarze.
  4. Do analizy RT-qPCR należy przygotować bufor qPCR na próbkę: 2,5 μl tioglicerolu + 250 μl buforu do lizy, używając dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA (patrz tabela materiałów).
  5. W celu ilościowego oznaczania białek należy przygotować bufor do lizy, rozcieńczając koktajl inhibitora fosfatazy i koktajl inhibitora proteazy w stosunku 1:100 w buforze do ekstrakcji ssaków (patrz tabela materiałów).
  6. Do wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) i testu fagocytozy należy przygotować 1x HBSS z dostępnych na rynku 10x HBSS (patrz Tabela materiałów). Następnie przygotuj bufor FACS, dodając 0,2% BSA do 1x HBSS.

2. Usunięcie mózgu

  1. Uspokoić zwierzę dawką 20 mg/kg ksylazyny, a następnie poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania 400 mg/kg pentobarbitalu i umieścić ją na wznak na tacy sekcyjnej.
    UWAGA: Inne kombinacje środków znieczulających do eutanazji zwierzęcia również mogą działać.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 10 ml lodowatego 1x PBS i podłącz ją do igły motylkowej 21 G.
  3. Gdy mysz jest całkowicie znieczulona (sprawdź, szczypiąc łapy, aby upewnić się, że brak reakcji), oddech ustał, a serce jest w migotaniu, nałóż skórę kleszczami i otwórz klatkę piersiową nożyczkami, na poziomie ostatnich żeber i mostka.
  4. Użyj nożyczek, aby wykonać głębokie nacięcie wzdłuż boków klatki piersiowej w kierunku górnej części klatki piersiowej, aby odsłonić serce.
  5. Wprowadzić igłę 21 G w dystalną część lewej komory (upewnić się, że około 1/3 igły znajduje się wewnątrz komory). Natychmiast wykonaj nacięcie przez prawy przedsionek za pomocą nożyczek.
  6. Wlej 10 ml lodowatego 1x PBS, aby oczyścić mózg z krążących komórek odpornościowych.
    UWAGA: Sprawdź wzrokowo mózg, aby upewnić się, że jest czysty i dobrze ukrwiony.
  7. Odetnij głowę myszy, ostrożnie wyjmij mózg i umieść go na szalce Petriego wypełnionej lodem i pokrytej folią aluminiową.
    UWAGA: Szalka Petriego i folia pomagają w zobaczeniu fragmentów mózgu. Korzystne jest utrzymanie chłodnego środowiska podczas siekania kawałków mózgu, aby ograniczyć aktywność metaboliczną.
  8. Odizoluj podwzgórze za pomocą kleszczy i pokrój je na małe kawałki żyletkami.
    1. Aby zidentyfikować i wypreparować podwzgórze, umieść mózg do góry nogami, tak aby kora była brzuszna, a podwzgórze było widoczne grzbietowo na górnej powierzchni. Oddziel podwzgórze, które znajduje się na dnie mózgu po obu stronach trzeciej komory, za pomocą zakrzywionych kleszczy. Średnia masa podwzgórza u dorosłych myszy C57BL/6 wynosi 15 mg.
      UWAGA: Fragmenty mózgu muszą być jak najmniejsze (<0,5 mm). Cięcie na małe kawałki jest krytycznym krokiem, ponieważ pozwala na lepszą dysocjację i wyższą wydajność komórek.
  9. Zbierz kawałki podwzgórza w probówkach dysocjacyjnych (rurkach C) uprzednio wypełnionych 1,900 μl buforu Z (krok 1.2).
    UWAGA: Aby uzyskać dobrą wydajność komórek mikrogleju, która jest wystarczająca do przeprowadzenia testów, należy zebrać co najmniej dwa (w przypadku oznaczania ilościowego białka) lub trzy (w przypadku qPCR i RNAseq) podwzgórze na probówkę.

3. Dysocjacja tkanek

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane na lodzie. Nie należy wirować zawiesiny komórek na żadnym etapie; Dokładnie mieszać tylko pipetą o pojemności 1 000 μl.

  1. Przygotować mieszaninę enzymów 2 zgodnie z tabelą 1 (obliczając całkowitą objętość dla wszystkich probówek + 10% w nadmiarze). Do każdej probówki C dodać 50 μl enzymu zawartego w mieszance 1 (patrz tabela 1) i 30 μl mieszaniny enzymów 2. Wszystkie enzymy znajdują się w zestawie do dysocjacji tkanki mózgowej dla dorosłych (patrz tabela materiałów).
  2. Zamknij C-rurki i umieść je do góry nogami w dysocjatorze ze wspornikami grzewczymi zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom program 37C_ABDK_02.
  3. Przygotuj probówki zatrzaskowe o pojemności 15 ml (patrz tabela materiałów) z sitkami o średnicy 70 μm na wierzchu. Zwilż sitko 2 ml D-PBS.
  4. Po zakończeniu programu dysocjacji/trawienia opróżnij rurkę C na sitko i podrap końcówką o pojemności 200 μl, aby zmniejszyć utratę komórek poprzez zwiększenie filtracji komórkowej i zmniejszenie przylegania homogenatu tkankowego do filtra.
  5. Umyj probówkę 2 x 5 ml D-PBS, opróżnij popłuczyny na sitko i zarysuj końcówką o pojemności 200 μl między praniami.
  6. Odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z odpowiednią objętością zimnego D-PBS zgodnie z tabelą 1.
  7. Natychmiast dokładnie wymieszać z 450 μl odczynnika do pomiaru gradientu gęstości (roztwór do usuwania zanieczyszczeń, patrz tabela materiałów) i bardzo delikatnie nałożyć na 2 ml zimnego D-PBS (patrz tabela 1).
    UWAGA: Aby uzyskać warstwy gradientu o różnej gęstości, D-PBS należy delikatnie nakładać kropla po kropli, z jak najmniejszymi "zakłóceniami", po 1 ml na raz za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  8. Wirować przy 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z powolnym przyspieszaniem i powolnym hamowaniem (jeśli 9 jest równoznaczne z pełnym, należy użyć 5).
  9. Powstają trzy fazy. Całkowicie zassać dwie górne fazy i wyrzucić je. Upewnij się, że nie zasysasz trzeciej dolnej fazy.
  10. Napełnij 1800 μl zimnego D-PBS i delikatnie odwróć probówkę 3 razy.
  11. Wirować przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu, a następnie całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie zawiesić ponownie osad komórkowy, pipetując powoli w górę i w dół za pomocą 2 ml D-PBS/BSA.

4. Izolacja magnetyczna komórek CD11b+

  1. Odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie zassać supernatant. Ostrożnie zawiesić ponownie osad komórek w 90 μl buforu D-PBS/BSA.
  2. Dodać 10 μl mieszaniny CD11b z mikrogranulkami i dobrze wymieszać pipetą.
  3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C w lodówce, nie na lodzie; umyć komórki dodając 1 ml D-PBS/BSA i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; całkowicie odessać supernatant. Ostrożnie zawiesić w 500 μl D-PBS/BSA.
  4. Uruchom program POSSEL2 na separatorze, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Umieść małe kolumny (patrz Tabela materiałów) w polu magnetycznym.
    UWAGA: Do sortowania komórek magnetycznych można wybrać zarówno małe, jak i duże kolumny, zgodnie z oczekiwaną średnią liczbą komórek. Małe kolumny mają pojemność do 1 × 107 oznaczonych komórek, a duże kolumny do 1 × 108. Podczas izolowania komórek od małych struktur, takich jak podwzgórze, zaleca się stosowanie małych kolumn. Objętości odczynników są różne w przypadku stosowania dużych kolumn (patrz instrukcje producenta).
  5. Zwilżyć kolumny (patrz tabela materiałów) 500 μl D-PBS/BSA. Jeżeli do dalszej analizy potrzebna jest ujemna frakcja komórek (CD11b-), należy umieścić płytkę zbiorczą pod kolumnami, a następnie nałożyć zawiesinę komórek w kolumnach.
  6. Wykonaj trzy etapy mycia, dodając jednorazowo 500 μl D-PBS/BSA do kolumny, za każdym razem czekając, aż bufor przejdzie przez kolumnę.
    UWAGA: ważne jest, aby zapobiec wysychaniu górnej części kolumny, dlatego zaleca się, aby nie czekać, aż cały bufor przejdzie przez nią.
  7. Przenieść całkowite ścieki frakcji CD11b z dołków płytki zbiorczej do 15-mililitrowych probówek.
  8. Wyjąć kolumnę z separatora, umieścić ją w probówce o pojemności 5 ml i odpipetować 1 ml D-PBS/BSA do kolumny.
  9. Natychmiast wypłukać magnetycznie znakowaną frakcję komórkową, mocno naciskając tłok dostarczony z kolumną.
  10. W końcu policz komórki CD11b + za pomocą hemacytometru lub dowolnej innej metody; spodziewaj się ~ 15 000 komórek na podwzgórze.
  11. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.

5. Analizy

  1. W przypadku analizy RT-qPCR należy ponownie zawiesić osady komórkowe za pomocą buforu qPCR (w celu przygotowania, patrz krok 1.3) i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do ekstrakcji mRNA. Wyizoluj całkowite RNA, a następnie przetwórz je i przeanalizuj zgodnie z wytycznymi MIQE14. Na koniec zsyntetyzuj cDNA i wykonaj qPCR za pomocą urządzenia RT-PCR. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze wszystkimi dostępnymi na rynku zestawami.
  2. W celu ilościowego określenia białka przemyj granulki komórkowe D-PBS (bez BSA) co najmniej 2x, aby wyeliminować BSA. Następnie ponownie zawieś osady komórkowe z dwóch podwzgórz za pomocą 20 μl buforu do lizy. Przystąpić do oznaczania ilościowego białka za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Postępowaliśmy zgodnie z instrukcjami producenta15, aby określić ilościowo białka do przeprowadzenia testu aktywności kinaz serynowo-treoninowych.
  3. W celu wykrycia reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach mikrogleju, ponownie zawieś osad w 1x HBSS. Komórki należy traktować zgodnie z protokołem producenta zestawu do testu cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Następnie ponownie zawieś leczone komórki w 200 μl buforu FACS (w celu przygotowania, patrz krok 1.5) i wykonaj FACS w celu wykrycia komórek zestresowanych oksydacyjnie.
  4. W przypadku testu fagocytozy inkubuj posortowane komórki w D-PBS/BSA z fluorescencyjnymi kulkami lateksowymi (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut. Dostosuj liczbę kulek tak, aby wynosiła średnio 4 kulki na komórkę. Następnie odwirować przy 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS i odczytać emisję fluorescencji za pomocą FACS (λex 575 nm; λem 610 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena końcowej wydajności opiera się na poziomie czystości oraz ilości wyizolowanych komórek i może być określona za pomocą RT-qPCR, zliczania komórek oraz oznaczania ilości białka. Czystość wyizolowanych magnetycznie komórek z podwzgórza potwierdzono poprzez analizę ekspresji genów CD11b, C1qa, Gad1 oraz GFAP za pomocą RT-qPCR (Rycina 1). CD11b i C1qa są ekspresjonowane głównie przez mikroglej w ośrodkowym układzie nerwowym w stanie spoczynku16, natomiast Gad1 i GFAP...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół przedstawia izolację mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie. Przedstawione powyżej wyniki potwierdzają czystość i żywotność izolowanych komórek, a także skuteczność tej metody w funkcjonalnym charakterystyce mikrogleju ex vivo, np. poprzez aktywność fagocytarną i kwantyfikację produkcji ROS. Klasyczne metody izolacji określonej populacji komórek mogą być również stosowane w przypadku komórek mikrogleju. Frakcjonow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

AN jest wspierany przez Institut Universitaire de France (IUF), Uniwersytet w Bordeaux, Francuską Fundację Badań nad Mózgiem (FRC), GLN (Lipid-Nutrition Group) i Narodową Agencję Badawczą (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA była wspierana przez Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Projekt ten otrzymał dofinansowanie z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont Europa w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie" Doctoral Networks 2021, nr 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłychMiltenyi130-107-677Zestaw zawiera bufor Z, bufor Y, enzymy A i P, roztwór do usuwania zanieczyszczeń, bufor A (do rozpuszczania enzymu A).
Albumina bydlęca FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (mikroglej) Mikrogranulki, ludzkie i mysie - mały rozmiarMiltenyi130-093-636
Zestaw do oznaczania cytometrii przepływu zielonego CellROXInvitrogenC10492
pokrywka Snap-Pop 15 mlCellTreat978449
DPBS, wapń, magnez, glukoza, pirogronianGibco14287-072
GentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
GentleMACS Octo Disocator z grzałkamiMiltenyi130-096-427
Koktajl inhibitorów fosfatazy Halt (100x)Thermofisher78420
Koktajl inhibitorów proteazy Halt, bez EDTA (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejThermofisher14065056
Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany karboksylanem, czerwony fluorescencyjnySigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Zielony I MistrzRoche 4707516001Ten odczynnik został użyty do przeprowadzenia PCR.
Filtry siatkowe MACS SmartStrainer (70 &mikro; m)Miltenyi130-110-916
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermofisher23235
M-PER Bufor do ekstrakcji ssakówKolumny Thermofisher78503
MSMiltenyi130-042-201Określane w protokole jako małe kolumny.
Separator MultiMACS Cell24 PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7,4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177Zestaw służył do syntezy cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011Zestaw zawiera 1-tioglicerol i bufor BL (określany w protokole jako bufor do lizy) i służył do izolacji całkowitego RNA.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282
Probówka wirówkowa ,

Bibliografia

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja mikroglejumagnetyczne sortowanie komórekkuleczki magnetyczne CD11bhomeostaza mózgukomunikacja mikroglej-neuronzachowanie żywieniowewarunki metaboliczneżywotność komórek
Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.