Opisujemy tutaj PyOKR, półautomatyczną metodę analizy ilościowej, która bezpośrednio mierzy ruchy gałek ocznych wynikające z wizualnych reakcji na dwuwymiarowy ruch obrazu. Interfejs użytkownika i algorytm analizy oparty na języku Python pozwalają na większą przepustowość i dokładniejsze pomiary ilościowe parametrów śledzenia ruchu gałek ocznych niż poprzednie metody.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
PyOKR: Półautomatyczna metoda ilościowego określania zdolności śledzenia odruchów optokinetycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie reakcji behawioralnych na bodźce wzrokowe jest kluczowym elementem zrozumienia funkcji systemu wzrokowego. Jedną z godnych uwagi reakcji jest odruch optokinetyczny (OKR), wysoce konserwatywne wrodzone zachowanie niezbędne do stabilizacji obrazu na siatkówce. OKR zapewnia solidny odczyt zdolności śledzenia obrazu i został szeroko przebadany w celu zrozumienia obwodów i funkcji układu wzrokowego u zwierząt z różnych środowisk genetycznych. OKR składa się z dwóch faz: fazy powolnego śledzenia, w której oko podąża za bodźcem do krawędzi płaszczyzny widzenia, oraz kompensacyjnej szybkiej sakkady fazowej, która resetuje pozycję oka na orbicie. Poprzednie metody kwantyfikacji przyrostu, choć niezawodne, były pracochłonne i mogły być subiektywne lub arbitralnie wyprowadzone. Aby uzyskać szybszą i bardziej powtarzalną kwantyfikację zdolności śledzenia ruchu gałek ocznych, opracowaliśmy nowatorski półautomatyczny program do analizy, PyOKR, który pozwala na ilościowe określenie dwuwymiarowego ruchu gałek ocznych w odpowiedzi na dowolny bodziec kierunkowy, a także można go dostosować do każdego rodzaju sprzętu wideookulograficznego. Metoda ta zapewnia automatyczne filtrowanie, wybór faz powolnego śledzenia, modelowanie pionowych i poziomych wektorów gałek ocznych, kwantyfikację zysków ruchu gałek ocznych w stosunku do prędkości bodźca oraz organizację danych wynikowych w użyteczny arkusz kalkulacyjny do porównań statystycznych i graficznych. Ten ilościowy i usprawniony potok analizy, łatwo dostępny za pośrednictwem importu PyPI, zapewnia szybki i bezpośredni pomiar odpowiedzi OKR, ułatwiając w ten sposób badanie wizualnych reakcji behawioralnych.
Wprowadzenie
Stabilizacja obrazu opiera się na precyzyjnych reakcjach okoruchowych, aby skompensować globalny przepływ optyczny, który występuje podczas ruchu własnego. Stabilizacja ta jest napędzana przede wszystkim przez dwie reakcje motoryczne: odruch optokinetyczny (OKR) i odruch przedsionkowo-oczny (VOR)1,2,3. Powolny globalny ruch w poprzek siatkówki indukuje OKR, który wywołuje odruchowy obrót oka w odpowiednim kierunku w celu ustabilizowania obrazu1,2. Ten ruch, znany jako faza wolna, jest przerywany przez sakkady kompensacyjne, znane jako faza szybka, w której oko szybko resetuje się w przeciwnym kierunku, aby umożliwić nową wolną fazę. Tutaj definiujemy te szybkie sakkady jako ruchy śledzące ruch gałek ocznych (ETM). Podczas gdy VOR opiera się na układzie przedsionkowym w celu wywołania ruchów gałek ocznych w celu kompensacji ruchów głowy3, OKR jest inicjowany w siatkówce przez odpalenie ON, a następnie sygnalizację do dodatkowego systemu optycznego (AOS) w śródmózgowiu4,5. Ze względu na bezpośrednie uzależnienie od obwodów siatkówki, OKR jest często używany do określania zdolności śledzenia wzrokowego zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych6,7.
OKR został gruntownie przebadany jako narzędzie do oceny podstawowych zdolności wizualnych2,6,8, DSGC development9,10,11,12, reakcje okoruchowe13 i fizjologiczne różnice między środowiskami genetycznymi7. OKR jest oceniany u zwierząt z unieruchomionym bodźcem14. Reakcje okulomotoryczne są zwykle rejestrowane za pomocą różnych narzędzi wideo, a ruchy śledzące ruchy gałek ocznych są rejestrowane jako przebiegi OKR w kierunku poziomym i pionowym9. Aby określić ilościowo zdolność śledzenia, opisano dwa podstawowe wskaźniki: wzmocnienie śledzenia (prędkość oka w stosunku do prędkości bodźca) i częstotliwość ETM (liczba szybkich sakkad fazowych w danym przedziale czasowym). Obliczanie wzmocnienia było historycznie wykorzystywane do bezpośredniego pomiaru prędkości kątowej oka w celu oszacowania zdolności śledzenia; Obliczenia te są jednak pracochłonne i można je dowolnie wyprowadzić na podstawie metod zbierania danych wideookulograficznych i późniejszej kwantyfikacji. W celu szybszej oceny OKR-ów, zliczanie częstotliwości ETM zostało użyte jako alternatywna metoda pomiaru ostrości śledzenia7. Chociaż zapewnia to dość dokładne oszacowanie zdolności śledzenia, metoda ta opiera się na pośredniej metryce w celu ilościowego określenia odpowiedzi powolnej fazy i wprowadza szereg odchyleń. Należą do nich stronniczość obserwatora w określaniu sakkady, poleganie na czasowo spójnych reakcjach sakkadowych w określonej epoce oraz niemożność oceny wielkości odpowiedzi w wolnej fazie.
Aby rozwiązać te problemy za pomocą obecnych podejść do oceny OKR i umożliwić dogłębną kwantyfikację parametrów OKR o wysokiej przepustowości, opracowaliśmy nową metodę analizy do ilościowego określania przebiegów OKR. Nasze podejście wykorzystuje dostępną platformę oprogramowania opartą na języku Python o nazwie "PyOKR". Za pomocą tego oprogramowania można bardziej dogłębnie i z większą parametryzacją badać modelowanie i kwantyfikację reakcji OKR w wolnej fazie. Oprogramowanie zapewnia dostępną i powtarzalną ilościową ocenę reakcji na niezliczone bodźce wzrokowe, a także dwuwymiarowe śledzenie wizualne w odpowiedzi na ruch poziomy i pionowy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w The Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w JHUSOM. Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez UCSF Institutional Animal Care and Use Program.
1. Zbieranie danych behawioralnych
- Rejestruj ruchy gałek ocznych OKR za pomocą wybranej metody wideookulusografii w celu wygenerowania danych falowych (tj. szeregu czasowego kąta patrzenia oka we współrzędnych sferycznych).
UWAGA: Reprezentatywne dane zebrane w JHUSOM uzyskano za pomocą operacji wszczepienia implantu głowy i wideookulografii, jak opisano wcześniej9,13 (Rysunek 1). Reprezentatywne dane zebrane z UCSF uzyskano za pomocą operacji implantacji głowy i metody wideookulograficznej, jak opisano w before10 (Figura 7).- Zanotuj parametry bodźca i nagrywania: liczbę klatek na sekundę nagrywania, prędkość i kierunek bodźca oraz długość czasu między epokami bodźca i po nich. W przypadku bodźców sinusoidalnych należy również zwrócić uwagę na amplitudę i częstotliwość fali bodźców.
- Eksport zebranych danych grupy czynności jako pliku . Plik CSV zawierający dane o falach poziomych i pionowych (azymut i elewacja).
- Organizowanie danych grupy czynności jako rozdzielanych tabulatorami . Plik CSV z dwiema kolumnami zawierającymi dane poziome (epxWave) i dane pionowe (epyWave).
2. Instalacja oprogramowania analitycznego
- Pobierz i zainstaluj Pythona.
- Aby nadzorować grafy, zainstaluj Spyder przez Anacondę.
- Aby upewnić się, że wykresy działają poprawnie w Spyder, przejdź do Narzędzia > Preferencje > Konsoli Ipython > Grafika > Backend grafiki. Ustaw opcję Inline (Wbudowana) na Automatic (Automatycznie).
- Utwórz nowe środowisko Anaconda za pomocą języka Python.
- Zainstaluj PyOKR za pośrednictwem PyPi za pomocą install PyOKR, aby zainstalować najnowszą wersję wraz z zależnościami pakietów (Dodatkowy plik kodowania 1 i Uzupełniający plik kodowania 2)
- Jeśli używany jest komputer z systemem Windows, uruchom z PyOKR import OKR_win jako o, a następnie o.run().
- Jeśli używany jest komputer Mac, uruchom z PyOKR import OKR_osx jako o, a następnie o.run().
3. Analiza danych falowych
- Inicjalizacja analiz i importów plików
- Uruchom o.run() w skrypcie .py, aby otworzyć interfejs użytkownika.
- W obszarze Plik użyj funkcji Otwórz lub polecenia Ctrl+O [polecenie iOS], aby otworzyć przeglądarkę, która pozwoli użytkownikowi wybrać żądany plik grupy czynności.
- W obszarze Plik użyj przycisku Eksportuj folder lub polecenia Ctrl+E, aby otworzyć przeglądarkę folderów, która pozwoli wybrać folder wyjściowy, do którego zostaną wyeksportowane analizy końcowe.
- Wprowadź końcową nazwę pliku analizy w polu Plik wyjściowy w zalecanym formacie, takim jak AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
- Ustaw program dla pojedynczego zwierzęcia za pomocą polecenia Ustaw temat w obszarze Plik lub polecenia Ctrl+S, aby zainicjować zestaw danych dla pojedynczego zwierzęcia.
- Definicja parametrów pliku grupy czynności
- Aby rozpocząć ustawianie parametrów bodźca, zdefiniuj kierunkowość w obszarze Wybierz kierunek bodźca, wybierając jeden z czterech głównych kierunków. W przypadku bodźców sinusoidalnych wybierz taki, który zawiera odpowiednio (Poziomy) lub (Pionowy), przy czym kierunek kardynalny określa początkowy kierunek fali sinusoidalnej.
- Ustaw typ bodźca w obszarze Wybierz typ bodźca jako jednokierunkowy, oscylacyjny lub ukośny.
- Po ustawieniu kierunkowości zaimportuj własny zestaw danych o położeniu bodźca (Importuj własne dane wektora bodźca) lub automatycznie wygeneruj wektor na podstawie parametrów (Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów). Jeśli importujesz wektor bodźca, przejdź do punktu 3.2.3.1, a następnie przejdź do kroku 3.3. Jeśli generujesz wektor bodźca, przejdź do kolejnych kroków.
- W przypadku importowania własnych danych wektorowych należy zaimportować wartości odległości bodźca (tj. szereg czasowy opisujący, jak daleko bodziec przemieszcza się między każdą sąsiednią ramką akwizycji) w tym samym formacie, który opisano w kroku 3.2.1. Ponadto analizuj cały zestaw danych jako jedną epokę, zamiast dzielić go na poszczególne epoki, ponieważ funkcja podzbioru importowanej wartości bodźca nie została dodana od PyOKR v1.1.2.
- W obszarze Parametry bodźca ustaw parametry bodźca używanego do zbierania danych.
- Ustaw czas braku bodźca na początku (głowa) i na końcu (ogonie) danej próby za pomocą Orzeł i Reszka.
- Ustaw czas, przez jaki bodziec jest wyświetlany, czas bez bodźca po nim oraz liczbę całkowitych epok w danej próbie za pomocą odpowiednio długości epoki, długości po bodźcu i liczby epok.
- W przypadku bodźców jednokierunkowych i ukośnych ustaw prędkość bodźca w stopniach na sekundę za pomocą prędkości poziomej i prędkości pionowej.
- Ustaw częstotliwość przechwytywania kamery zbierającej dane za pomocą opcji Szybkość przechwytywania klatek.
- W przypadku bodźców sinusoidalnych wygeneruj falę sinusoidalną do modelowania bodźców oscylacyjnych z częstotliwością i amplitudą.
- Po parametryzacji utwórz odpowiedni model na podstawie wprowadzonych powyżej informacji o bodźcu za pomocą opcji Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów.
- Wybierz daną epokę dla wprowadzonego bodźca za pomocą opcji Wybierz epokę, aby przeskanować plik całej fali.
- Nadzorowany wybór faz śledzenia
- Aby zidentyfikować obszary powolnego śledzenia, automatycznie wybierz szybkie sakady fazowe z korektą wstępną, klikając opcję Dane niefiltrowane lub Dane filtrowane, co spowoduje oznaczenie potencjalnych sakkad na podstawie maksymalnych zmian prędkości.
- W obszarze Dane niefiltrowane upewnij się, że sakkady są dokładnie wybrane za pomocą niebieskiej kropki. Jeśli automatyczny wybór nie jest dokładny, ręcznie usuń punkty za pomocą lewego przycisku myszy (LPM) lub dodaj punkty za pomocą prawego przycisku myszy (PPM). Gdy szybkie sakkady fazowe są odpowiednio wybrane, zapisz punkty za pomocą środkowego przycisku myszy (MMB) i zamknij wykres.
- Jeśli wymagane jest automatyczne filtrowanie, ustaw próg wskaźnika Z-Score i kliknij opcję Filtrowane dane, aby automatycznie filtrować sakkady. W razie potrzeby użyj tego samego ręcznego nadzoru, jak opisano w kroku 3.3.2, aby usunąć wszelkie szumy.
- Po prawidłowym wybraniu sakkad naciśnij Dopasowanie punktowe, aby wybrać obszar do usunięcia. Zmień górny i dolny punkt za pomocą podobnego schematu sterowania, jak opisano wcześniej w kroku 3.3.2. Edytuj górne (zielone) punkty za pomocą LPM lub PPM i edytuj dolne (czerwone) punkty za pomocą Shift+LPM lub Shift+PPMB. Gdy punkty są prawidłowo umieszczone, użyj MMB, aby zapisać punkty.
UWAGA: jeśli używasz komputera Mac, regulacja dolnego i górnego punktu znajduje się w dwóch oddzielnych przyciskach i jest zgodna z tym samym schematem sterowania, jak opisano w kroku 3.3.2.
- Analiza faz powolnego śledzenia
- Ustaw kolejność modelu wielomianowego za pomocą opcji Ustaw kolejność wielomianów, aby zdefiniować model wielomianowy, który zostanie dopasowany do poszczególnych wolnych faz.
UWAGA: W przypadku bodźców jednokierunkowych lub ukośnych wartość domyślna to 1, ponieważ liniowość jest niezbędna do obliczenia wzmocnienia śledzenia. W przypadku bodźców sinusoidalnych do modelowania krzywej fali potrzebny jest wyższy porządek, z wartością domyślną 15. - Aby przeanalizować ślad, wybierz opcję Analiza końcowa, aby wygenerować modele wolnej fazy (Rysunek 2) dla wybranych wolnych faz (patrz Rysunek 2A-D) i oblicz odległości, prędkości i uśrednione zyski śledzenia w całej epoce (Rysunek 2E).
- Aby wyświetlić wykres dwuwymiarowy (2D) lub trójwymiarowy (3D) wybranych regionów, wybierz odpowiednio opcję Wyświetl wykres 2D lub Wyświetl wykres 3D.
- Wybierz opcję Dodaj epokę, aby zapisać zebrane wartości wygenerowane w kroku 3.4.2. Aby wyświetlić wszystkie dodane wartości dla danego zwierzęcia, a także średnie dla zebranych prób, wybierz opcję Wyświetl bieżący zestaw danych.
- Po dodaniu epoki przejdź przez pozostałą część pliku za pomocą opcji Wybierz epokę, wykonując kroki od 3.3.1 do 3.4.4.
- Gdy plik wave zostanie w pełni przeanalizowany, powtórz ten proces dla wszystkich innych plików dla danego zwierzęcia, otwierając nowe pliki, ustawiając odpowiednie parametry i odpowiednio je analizując. Powtarzając kroki 3.2.1-3.4.5 dla każdego pliku, wygeneruj końcowy zestaw danych zawierający wszystkie dane dotyczące fal dla danego zwierzęcia.
- Ustaw kolejność modelu wielomianowego za pomocą opcji Ustaw kolejność wielomianów, aby zdefiniować model wielomianowy, który zostanie dopasowany do poszczególnych wolnych faz.
- Końcowy eksport danych
- Po zakończeniu analizy danych dla danego zwierzęcia, z przeanalizowanymi wszystkimi kierunkami lub bodźcami, wyeksportuj zestaw danych za pomocą opcji Eksport danych.
UWAGA: Surowy zestaw danych zostanie wyeksportowany na podstawie nazwy pliku wyjściowego i zapisany wzdłuż ścieżki ustawionej przez folder wyjściowy jako plik CSV zawierający dane poszczególnych epok z łączną średnią dla każdego parametru bodźca. - Po wyeksportowaniu pojedynczego zwierzęcia ponownie zainicjuj zestaw danych za pomocą Ctrl+S, a następnie powtórz wszystkie poprzednie kroki, aby przeanalizować nowe zwierzę.
- W razie potrzeby ponownie uporządkuj wszystkie dane wyjściowe zebrane dla wielu zwierząt, aby ułatwić analizę, za pomocą polecenia Sortuj dane na karcie Analiza.
UWAGA: Ta funkcja skompiluje i posortuje wszystkie średnie wartości dla wszystkich analizowanych plików zwierząt przechowywanych w folderze wyjściowym, aby umożliwić łatwiejsze generowanie wykresów i porównań statystycznych. Sortowanie zależy od nazewnictwa plików od wersji 1.1.2. Użyj zalecanego schematu nazewnictwa opisanego w kroku 3.1.4 dla każdego pliku (np. WT_123_Analysis).
- Po zakończeniu analizy danych dla danego zwierzęcia, z przeanalizowanymi wszystkimi kierunkami lub bodźcami, wyeksportuj zestaw danych za pomocą opcji Eksport danych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zwalidować opisaną powyżej metodę analizy, ilościowo oceniliśmy wzmocnienie śledzenia OKR na podstawie śladów falowych zebranych od myszy typu dzikiego oraz mutanta z warunkowym nokautem, u którego występuje znany deficyt śledzenia. Dodatkowo, aby sprawdzić szerszą przydatność naszej metody analizy, przeanalizowano ślady pochodzące od oddzielnej kohorty myszy typu dzikiego, pozyskane za pomocą innej metody wideookulografii. Automatyczne filtrowanie sakad ułatwia przetwarzanie i analizę danych OKR (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
PyOKR zapewnia kilka korzyści w zakresie badania reakcji wizualnych odzwierciedlonych w ruchach gałek ocznych. Obejmują one dokładność, dostępność i opcje gromadzenia danych, a także możliwość uwzględnienia parametryzacji i zmiennych prędkości bodźców.
Bezpośrednia ocena wzmocnienia śledzenia gałek ocznych zapewnia dokładną charakterystykę ruchu gałek ocznych, która jest bardziej bezpośrednią metryką ilościową niż tradycyjne ręczne liczenie sakkad szybkiej fazy (ETM). Chociaż jest to przydatne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez R01 EY032095 (ALK), stypendium przeddoktoranckie VSTP 5T32 EY7143-27 (JK), F31 EY-033225 (SCH), R01 EY035028 (FAD i ALK) oraz R01 EY-029772 (FAD).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J myszy | Jackson Labs | 664 | |
| Igor Pro | WaveMetrics | RRID: SCR_000325 | |
| MATLAB | MathWorks | RRID: SCR_001622 | |
| Komora zapisu refleksu optokinetycznego - JHUSOM | Zbudowana na zamówienie | Nie dotyczy | Zgodnie z opisem w Al-Khindi i in. (2022)9 oraz Kodama i in. (2016)13 |
| Komora zapisu refleksu optokinetycznego - UCSF | Zbudowana na zamówienie | Nie dotyczy | Zgodnie z opisem w Harris and Dunn, 201510 |
| Python | Python Software Foundation | RRID: SCR_008394 | |
| Tbx5 flox/+ myszki | Prezent od B. Bruneau | N/A | Zgodnie z opisem w Al-Khindi et al.(2022)9 |
| Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd | MMRRC | MMRRC Nr magazynowe # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD |
Bibliografia
- Stahl, J. S. Using eye movements to assess brain function in mice. Vision Res. 44 (28), 3401-3410 (2004).
- Kretschmer, F., Tariq, M., Chatila, W., Wu, B., Badea, T. C. Comparison of optomotor and optokinetic reflexes in mice. J Neurophysiol. 118, 300-316 (2017).
- Bronstein, A. M., Patel, M., Arshad, Q. A brief review of the clinical anatomy of the vestibular-ocular connections - How much do we know. Eye. 29 (2), 163-170 (2015).
- Simpson, J. I. The accessory optic system. Ann Rev Neurosci. 7, 13-41 (1984).
- Hamilton, N. R., Scasny, A. J., Kolodkin, A. L. Development of the vertebrate retinal direction-selective circuit. Dev Biol. 477, 273-283 (2021).
- Dobson, V., Teller, D. Y. Visual acuity in human infants: a review and comparison of behavioral and electrophysiological studies. Vision Res. 18 (11), 1469-1483 (1978).
- Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), e2055(2008).
- Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. J Vis Exp. (80), e50832(2013).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, 81780(2015).
- Sun, L. O., et al. Functional assembly of accessory optic system circuitry critical for compensatory eye movements. Neuron. 86 (4), 971-984 (2015).
- Yonehara, K., et al. Congenital Nystagmus gene FRMD7 is necessary for establishing a neuronal circuit asymmetry for direction selectivity. Neuron. 89 (1), 177-193 (2016).
- Kodama, T., Du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. J Neurosci. 36 (25), 6836-6849 (2016).
- Stahl, J. S., Van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J Neurosci Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
