PyOKR: Półautomatyczna metoda ilościowego określania zdolności śledzenia odruchów optokinetycznych

Podsumowanie

Opisujemy tutaj PyOKR, półautomatyczną metodę analizy ilościowej, która bezpośrednio mierzy ruchy gałek ocznych wynikające z wizualnych reakcji na dwuwymiarowy ruch obrazu. Interfejs użytkownika i algorytm analizy oparty na języku Python pozwalają na większą przepustowość i dokładniejsze pomiary ilościowe parametrów śledzenia ruchu gałek ocznych niż poprzednie metody.

Streszczenie

Badanie reakcji behawioralnych na bodźce wzrokowe jest kluczowym elementem zrozumienia funkcji systemu wzrokowego. Jedną z godnych uwagi reakcji jest odruch optokinetyczny (OKR), wysoce konserwatywne wrodzone zachowanie niezbędne do stabilizacji obrazu na siatkówce. OKR zapewnia solidny odczyt zdolności śledzenia obrazu i został szeroko przebadany w celu zrozumienia obwodów i funkcji układu wzrokowego u zwierząt z różnych środowisk genetycznych. OKR składa się z dwóch faz: fazy powolnego śledzenia, w której oko podąża za bodźcem do krawędzi płaszczyzny widzenia, oraz kompensacyjnej szybkiej sakkady fazowej, która resetuje pozycję oka na orbicie. Poprzednie metody kwantyfikacji przyrostu, choć niezawodne, były pracochłonne i mogły być subiektywne lub arbitralnie wyprowadzone. Aby uzyskać szybszą i bardziej powtarzalną kwantyfikację zdolności śledzenia ruchu gałek ocznych, opracowaliśmy nowatorski półautomatyczny program do analizy, PyOKR, który pozwala na ilościowe określenie dwuwymiarowego ruchu gałek ocznych w odpowiedzi na dowolny bodziec kierunkowy, a także można go dostosować do każdego rodzaju sprzętu wideookulograficznego. Metoda ta zapewnia automatyczne filtrowanie, wybór faz powolnego śledzenia, modelowanie pionowych i poziomych wektorów gałek ocznych, kwantyfikację zysków ruchu gałek ocznych w stosunku do prędkości bodźca oraz organizację danych wynikowych w użyteczny arkusz kalkulacyjny do porównań statystycznych i graficznych. Ten ilościowy i usprawniony potok analizy, łatwo dostępny za pośrednictwem importu PyPI, zapewnia szybki i bezpośredni pomiar odpowiedzi OKR, ułatwiając w ten sposób badanie wizualnych reakcji behawioralnych.

Wprowadzenie

Stabilizacja obrazu opiera się na precyzyjnych reakcjach okoruchowych, aby skompensować globalny przepływ optyczny, który występuje podczas ruchu własnego. Stabilizacja ta jest napędzana przede wszystkim przez dwie reakcje motoryczne: odruch optokinetyczny (OKR) i odruch przedsionkowo-oczny (VOR)^1,2,3. Powolny globalny ruch w poprzek siatkówki indukuje OKR, który wywołuje odruchowy obrót oka w odpowiednim kierunku w celu ustabilizowania obrazu^1,2. Ten ruch, znany jako faza wolna, jest przerywany przez sakkady kompensacyjne, znane jako faza szybka, w której oko szybko resetuje się w przeciwnym kierunku, aby umożliwić nową wolną fazę. Tutaj definiujemy te szybkie sakkady jako ruchy śledzące ruch gałek ocznych (ETM). Podczas gdy VOR opiera się na układzie przedsionkowym w celu wywołania ruchów gałek ocznych w celu kompensacji ruchów głowy³, OKR jest inicjowany w siatkówce przez odpalenie ON, a następnie sygnalizację do dodatkowego systemu optycznego (AOS) w śródmózgowiu^4,5. Ze względu na bezpośrednie uzależnienie od obwodów siatkówki, OKR jest często używany do określania zdolności śledzenia wzrokowego zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych^6,7.

OKR został gruntownie przebadany jako narzędzie do oceny podstawowych zdolności wizualnych^2,6,8, DSGC development^9,10,11,12, reakcje okoruchowe¹³ i fizjologiczne różnice między środowiskami genetycznymi⁷. OKR jest oceniany u zwierząt z unieruchomionym bodźcem¹⁴. Reakcje okulomotoryczne są zwykle rejestrowane za pomocą różnych narzędzi wideo, a ruchy śledzące ruchy gałek ocznych są rejestrowane jako przebiegi OKR w kierunku poziomym i pionowym⁹. Aby określić ilościowo zdolność śledzenia, opisano dwa podstawowe wskaźniki: wzmocnienie śledzenia (prędkość oka w stosunku do prędkości bodźca) i częstotliwość ETM (liczba szybkich sakkad fazowych w danym przedziale czasowym). Obliczanie wzmocnienia było historycznie wykorzystywane do bezpośredniego pomiaru prędkości kątowej oka w celu oszacowania zdolności śledzenia; Obliczenia te są jednak pracochłonne i można je dowolnie wyprowadzić na podstawie metod zbierania danych wideookulograficznych i późniejszej kwantyfikacji. W celu szybszej oceny OKR-ów, zliczanie częstotliwości ETM zostało użyte jako alternatywna metoda pomiaru ostrości śledzenia⁷. Chociaż zapewnia to dość dokładne oszacowanie zdolności śledzenia, metoda ta opiera się na pośredniej metryce w celu ilościowego określenia odpowiedzi powolnej fazy i wprowadza szereg odchyleń. Należą do nich stronniczość obserwatora w określaniu sakkady, poleganie na czasowo spójnych reakcjach sakkadowych w określonej epoce oraz niemożność oceny wielkości odpowiedzi w wolnej fazie.

Aby rozwiązać te problemy za pomocą obecnych podejść do oceny OKR i umożliwić dogłębną kwantyfikację parametrów OKR o wysokiej przepustowości, opracowaliśmy nową metodę analizy do ilościowego określania przebiegów OKR. Nasze podejście wykorzystuje dostępną platformę oprogramowania opartą na języku Python o nazwie "PyOKR". Za pomocą tego oprogramowania można bardziej dogłębnie i z większą parametryzacją badać modelowanie i kwantyfikację reakcji OKR w wolnej fazie. Oprogramowanie zapewnia dostępną i powtarzalną ilościową ocenę reakcji na niezliczone bodźce wzrokowe, a także dwuwymiarowe śledzenie wizualne w odpowiedzi na ruch poziomy i pionowy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w The Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w JHUSOM. Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez UCSF Institutional Animal Care and Use Program.

1. Zbieranie danych behawioralnych

1. Rejestruj ruchy gałek ocznych OKR za pomocą wybranej metody wideookulusografii w celu wygenerowania danych falowych (tj. szeregu czasowego kąta patrzenia oka we współrzędnych sferycznych).
   UWAGA: Reprezentatywne dane zebrane w JHUSOM uzyskano za pomocą operacji wszczepienia implantu głowy i wideookulografii, jak opisano wcześniej^9,13 (Rysunek 1). Reprezentatywne dane zebrane z UCSF uzyskano za pomocą operacji implantacji głowy i metody wideookulograficznej, jak opisano w before¹⁰ (Figura 7).
   1. Zanotuj parametry bodźca i nagrywania: liczbę klatek na sekundę nagrywania, prędkość i kierunek bodźca oraz długość czasu między epokami bodźca i po nich. W przypadku bodźców sinusoidalnych należy również zwrócić uwagę na amplitudę i częstotliwość fali bodźców.
2. Eksport zebranych danych grupy czynności jako pliku . Plik CSV zawierający dane o falach poziomych i pionowych (azymut i elewacja).
   1. Organizowanie danych grupy czynności jako rozdzielanych tabulatorami . Plik CSV z dwiema kolumnami zawierającymi dane poziome (epxWave) i dane pionowe (epyWave).

2. Instalacja oprogramowania analitycznego

1. Pobierz i zainstaluj Pythona.
   1. Aby nadzorować grafy, zainstaluj Spyder przez Anacondę.
   2. Aby upewnić się, że wykresy działają poprawnie w Spyder, przejdź do Narzędzia > Preferencje > Konsoli Ipython > Grafika > Backend grafiki. Ustaw opcję Inline (Wbudowana) na Automatic (Automatycznie).
2. Utwórz nowe środowisko Anaconda za pomocą języka Python.
3. Zainstaluj PyOKR za pośrednictwem PyPi za pomocą install PyOKR, aby zainstalować najnowszą wersję wraz z zależnościami pakietów (Dodatkowy plik kodowania 1 i Uzupełniający plik kodowania 2)
4. Jeśli używany jest komputer z systemem Windows, uruchom z PyOKR import OKR_win jako o, a następnie o.run().
5. Jeśli używany jest komputer Mac, uruchom z PyOKR import OKR_osx jako o, a następnie o.run().

3. Analiza danych falowych

1. Inicjalizacja analiz i importów plików
   1. Uruchom o.run() w skrypcie .py, aby otworzyć interfejs użytkownika.
   2. W obszarze Plik użyj funkcji Otwórz lub polecenia Ctrl+O [polecenie iOS], aby otworzyć przeglądarkę, która pozwoli użytkownikowi wybrać żądany plik grupy czynności.
   3. W obszarze Plik użyj przycisku Eksportuj folder lub polecenia Ctrl+E, aby otworzyć przeglądarkę folderów, która pozwoli wybrać folder wyjściowy, do którego zostaną wyeksportowane analizy końcowe.
   4. Wprowadź końcową nazwę pliku analizy w polu Plik wyjściowy w zalecanym formacie, takim jak AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Ustaw program dla pojedynczego zwierzęcia za pomocą polecenia Ustaw temat w obszarze Plik lub polecenia Ctrl+S, aby zainicjować zestaw danych dla pojedynczego zwierzęcia.
2. Definicja parametrów pliku grupy czynności
   1. Aby rozpocząć ustawianie parametrów bodźca, zdefiniuj kierunkowość w obszarze Wybierz kierunek bodźca, wybierając jeden z czterech głównych kierunków. W przypadku bodźców sinusoidalnych wybierz taki, który zawiera odpowiednio (Poziomy) lub (Pionowy), przy czym kierunek kardynalny określa początkowy kierunek fali sinusoidalnej.
   2. Ustaw typ bodźca w obszarze Wybierz typ bodźca jako jednokierunkowy, oscylacyjny lub ukośny.
   3. Po ustawieniu kierunkowości zaimportuj własny zestaw danych o położeniu bodźca (Importuj własne dane wektora bodźca) lub automatycznie wygeneruj wektor na podstawie parametrów (Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów). Jeśli importujesz wektor bodźca, przejdź do punktu 3.2.3.1, a następnie przejdź do kroku 3.3. Jeśli generujesz wektor bodźca, przejdź do kolejnych kroków.
      1. W przypadku importowania własnych danych wektorowych należy zaimportować wartości odległości bodźca (tj. szereg czasowy opisujący, jak daleko bodziec przemieszcza się między każdą sąsiednią ramką akwizycji) w tym samym formacie, który opisano w kroku 3.2.1. Ponadto analizuj cały zestaw danych jako jedną epokę, zamiast dzielić go na poszczególne epoki, ponieważ funkcja podzbioru importowanej wartości bodźca nie została dodana od PyOKR v1.1.2.
   4. W obszarze Parametry bodźca ustaw parametry bodźca używanego do zbierania danych.
      1. Ustaw czas braku bodźca na początku (głowa) i na końcu (ogonie) danej próby za pomocą Orzeł i Reszka.
      2. Ustaw czas, przez jaki bodziec jest wyświetlany, czas bez bodźca po nim oraz liczbę całkowitych epok w danej próbie za pomocą odpowiednio długości epoki, długości po bodźcu i liczby epok.
      3. W przypadku bodźców jednokierunkowych i ukośnych ustaw prędkość bodźca w stopniach na sekundę za pomocą prędkości poziomej i prędkości pionowej.
      4. Ustaw częstotliwość przechwytywania kamery zbierającej dane za pomocą opcji Szybkość przechwytywania klatek.
      5. W przypadku bodźców sinusoidalnych wygeneruj falę sinusoidalną do modelowania bodźców oscylacyjnych z częstotliwością i amplitudą.
   5. Po parametryzacji utwórz odpowiedni model na podstawie wprowadzonych powyżej informacji o bodźcu za pomocą opcji Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów.
   6. Wybierz daną epokę dla wprowadzonego bodźca za pomocą opcji Wybierz epokę, aby przeskanować plik całej fali.
3. Nadzorowany wybór faz śledzenia
   1. Aby zidentyfikować obszary powolnego śledzenia, automatycznie wybierz szybkie sakady fazowe z korektą wstępną, klikając opcję Dane niefiltrowane lub Dane filtrowane, co spowoduje oznaczenie potencjalnych sakkad na podstawie maksymalnych zmian prędkości.
   2. W obszarze Dane niefiltrowane upewnij się, że sakkady są dokładnie wybrane za pomocą niebieskiej kropki. Jeśli automatyczny wybór nie jest dokładny, ręcznie usuń punkty za pomocą lewego przycisku myszy (LPM) lub dodaj punkty za pomocą prawego przycisku myszy (PPM). Gdy szybkie sakkady fazowe są odpowiednio wybrane, zapisz punkty za pomocą środkowego przycisku myszy (MMB) i zamknij wykres.
   3. Jeśli wymagane jest automatyczne filtrowanie, ustaw próg wskaźnika Z-Score i kliknij opcję Filtrowane dane, aby automatycznie filtrować sakkady. W razie potrzeby użyj tego samego ręcznego nadzoru, jak opisano w kroku 3.3.2, aby usunąć wszelkie szumy.
   4. Po prawidłowym wybraniu sakkad naciśnij Dopasowanie punktowe, aby wybrać obszar do usunięcia. Zmień górny i dolny punkt za pomocą podobnego schematu sterowania, jak opisano wcześniej w kroku 3.3.2. Edytuj górne (zielone) punkty za pomocą LPM lub PPM i edytuj dolne (czerwone) punkty za pomocą Shift+LPM lub Shift+PPMB. Gdy punkty są prawidłowo umieszczone, użyj MMB, aby zapisać punkty.
      UWAGA: jeśli używasz komputera Mac, regulacja dolnego i górnego punktu znajduje się w dwóch oddzielnych przyciskach i jest zgodna z tym samym schematem sterowania, jak opisano w kroku 3.3.2.
4. Analiza faz powolnego śledzenia
   1. Ustaw kolejność modelu wielomianowego za pomocą opcji Ustaw kolejność wielomianów, aby zdefiniować model wielomianowy, który zostanie dopasowany do poszczególnych wolnych faz.
      UWAGA: W przypadku bodźców jednokierunkowych lub ukośnych wartość domyślna to 1, ponieważ liniowość jest niezbędna do obliczenia wzmocnienia śledzenia. W przypadku bodźców sinusoidalnych do modelowania krzywej fali potrzebny jest wyższy porządek, z wartością domyślną 15.
   2. Aby przeanalizować ślad, wybierz opcję Analiza końcowa, aby wygenerować modele wolnej fazy (Rysunek 2) dla wybranych wolnych faz (patrz Rysunek 2A-D) i oblicz odległości, prędkości i uśrednione zyski śledzenia w całej epoce (Rysunek 2E).
   3. Aby wyświetlić wykres dwuwymiarowy (2D) lub trójwymiarowy (3D) wybranych regionów, wybierz odpowiednio opcję Wyświetl wykres 2D lub Wyświetl wykres 3D.
   4. Wybierz opcję Dodaj epokę, aby zapisać zebrane wartości wygenerowane w kroku 3.4.2. Aby wyświetlić wszystkie dodane wartości dla danego zwierzęcia, a także średnie dla zebranych prób, wybierz opcję Wyświetl bieżący zestaw danych.
   5. Po dodaniu epoki przejdź przez pozostałą część pliku za pomocą opcji Wybierz epokę, wykonując kroki od 3.3.1 do 3.4.4.
   6. Gdy plik wave zostanie w pełni przeanalizowany, powtórz ten proces dla wszystkich innych plików dla danego zwierzęcia, otwierając nowe pliki, ustawiając odpowiednie parametry i odpowiednio je analizując. Powtarzając kroki 3.2.1-3.4.5 dla każdego pliku, wygeneruj końcowy zestaw danych zawierający wszystkie dane dotyczące fal dla danego zwierzęcia.
5. Końcowy eksport danych
   1. Po zakończeniu analizy danych dla danego zwierzęcia, z przeanalizowanymi wszystkimi kierunkami lub bodźcami, wyeksportuj zestaw danych za pomocą opcji Eksport danych.
      UWAGA: Surowy zestaw danych zostanie wyeksportowany na podstawie nazwy pliku wyjściowego i zapisany wzdłuż ścieżki ustawionej przez folder wyjściowy jako plik CSV zawierający dane poszczególnych epok z łączną średnią dla każdego parametru bodźca.
   2. Po wyeksportowaniu pojedynczego zwierzęcia ponownie zainicjuj zestaw danych za pomocą Ctrl+S, a następnie powtórz wszystkie poprzednie kroki, aby przeanalizować nowe zwierzę.
   3. W razie potrzeby ponownie uporządkuj wszystkie dane wyjściowe zebrane dla wielu zwierząt, aby ułatwić analizę, za pomocą polecenia Sortuj dane na karcie Analiza.
      UWAGA: Ta funkcja skompiluje i posortuje wszystkie średnie wartości dla wszystkich analizowanych plików zwierząt przechowywanych w folderze wyjściowym, aby umożliwić łatwiejsze generowanie wykresów i porównań statystycznych. Sortowanie zależy od nazewnictwa plików od wersji 1.1.2. Użyj zalecanego schematu nazewnictwa opisanego w kroku 3.1.4 dla każdego pliku (np. WT_123_Analysis).

Wyniki

Aby zwalidować opisaną powyżej metodę analizy, ilościowo oceniliśmy wzmocnienie śledzenia OKR na podstawie śladów falowych zebranych od myszy typu dzikiego oraz mutanta z warunkowym nokautem, u którego występuje znany deficyt śledzenia. Dodatkowo, aby sprawdzić szerszą przydatność naszej metody analizy, przeanalizowano ślady pochodzące od oddzielnej kohorty myszy typu dzikiego, pozyskane za pomocą innej metody wideookulografii. Automatyczne filtrowanie sakad ułatwia przetwarzanie i analizę danych OKR (Rycina 3). Wykorzystując rejestracje z bodźców jednokierunkowych i sinusoidalnych (Rycina 1D), obliczyliśmy wzmocnienia śledzenia OKR w czterech kierunkach głównych (Rycina 2F) dla zwierząt typu dzikiego (n = 13) w odpowiedzi na bodźce jednokierunkowe, a także wzmocnienia śledzenia w odpowiedzi na poziome i pionowe bodźce sinusoidalne (Rycina 4). Rozbieżność w zdolności śledzenia w zależności od kierunku bodźca, zarówno dla bodźców jednokierunkowych, jak i sinusoidalnych, jest konsekwentnie obserwowana u wszystkich myszy typu dzikiego, przy równie silnych odpowiedziach poziomych, które wykazują znacznie wyższe wzmocnienia śledzenia niż odpowiedzi pionowe, co zostało opisane². Ponadto, asymetryczne wzmocnienia śledzenia między odpowiedziami w górę i w dół są również obserwowane u myszy typu dzikiego przy zastosowaniu obu metod wideookulografii, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami^2,10. Względne wartości i spójność wzmocnień śledzenia w porównaniu z opublikowaną charakterystyką odpowiedzi OKR wskazują, że wzmocnienia śledzenia obliczone za pomocą oprogramowania dokładnie odzwierciedlają zdolność śledzenia. Oprócz obliczeń wzmocnienia w jednym kierunku, można jednocześnie modelować poziome i pionowe ruchy gałek ocznych (Rycina 5), co pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję ruchu oka w odpowiedzi na dany bodziec. Zapewnia to dodatkową możliwość ilościowej oceny, która jest przydatna w przyszłych badaniach nad sprzężonymi odpowiedziami poziomymi i pionowymi⁹.

Aby zweryfikować użyteczność oprogramowania w identyfikacji istotnych zmian behawioralnych w różnych warunkach eksperymentalnych, dokonaliśmy reanalizy naszych opublikowanych danych⁹, aby potwierdzić, że deficyty w śledzeniu pionowym, oceniane w tamtym badaniu poprzez manualne liczenie sakkad fazy szybkiej, odzwierciedlone są w zyskach śledzenia z zastosowaniem przedstawionej tutaj metodologii. Poprzednie prace wykazały, że genetyczna inaktywacja czynnika transkrypcyjnego T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) w siatkówce poprzez warunkowy knockout z użyciem Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre) powoduje specyficzną utratę zorientowanych w górę komórek zwojowych siatkówki selektywnych kierunkowo typu ON (up-oDSGCs), a mutanty Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); Pcdh9-Cre wykazują specyficzną utratę śledzenia pionowego w odruchu optokinetycznym (OKR)⁹. Analiza ilościowa z zastosowaniem opisanej tutaj metody pokazuje, że zwierzęta Tbx5f/f; Pcdh9-Cre zachowują prawidłowe zyski śledzenia poziomego (Rysunek 6A), podobne do tych opisanych wcześniej i uzyskanych poprzez manualne liczenie sakkad fazy szybkiej (ETMs) (Rysunek 2F); jednak myszy te wykazują znaczną utratę śledzenia pionowego, z zyskami bliskimi zeru w odpowiedzi na bodźce zarówno górne, jak i dolne (Rysunek 6B,C). Dodatkowo analiza odpowiedzi sinusoidalnych potwierdza, że zwierzęta z cKO Tbx5 wykazują większe zyski śledzenia poziomego przy jednocześnie znacząco zmniejszonym śledzeniu pionowym (Rysunek 6D-F). Reanaliza tego wcześniej opisanego fenotypu z wykorzystaniem PyOKR wykazuje precyzję i czułość tej nowej metodologii, która umożliwia ilościowe porównania odpowiedzi OKR u myszy różnych szczepów genetycznych.

Na koniec przeanalizowano ślady pionowego OKR u osobników typu dzikiego, zebrane w UCSF, aby zwalidować użyteczność aplikacji programowej przy różnych metodach wideookulografii i parametrach bodźców. Dane z UCSF zostały zebrane przy użyciu systemu projekcji półsferycznej, w którym ruchome siatki są prezentowane myszy poprzez odbicie projektora o długości fali 405 nm na półsferze otaczającej zwierzę z unieruchomioną głową¹⁰ (Rysunek 7A). Jednokierunkowe siatki pionowe prezentowano myszom z prędkością 10 stopni na sekundę, a odpowiedzi OKR rejestrowano w odstępach 60 s (Rysunek 7B,C). Ślady pionowe poddano analizie ilościowej za pomocą PyOKR, a odpowiedzi skierowane w górę porównano z odpowiedziami skierowanymi w dół (Rysunek 7D). Odpowiedzi w górę były znacząco silniejsze niż odpowiedzi w dół, zgodnie z oczekiwaniami¹⁰; jednak wzmocnienia śledzenia były nieco mniejsze w porównaniu do śladów zarejestrowanych w JHUSOM (Rysunek 2F). Dodatkowo za pomocą PyOKR przeanalizowano ilościowo odpowiedzi sinusoidalne (Rysunek 7E), a znacząca asymetria w odpowiedziach pionowych na bodźce poruszające się sinusoidalnie odzwierciedlona jest w obliczonych wzmocnieniach (Rysunek 7F). Różnice między wartościami wzmocnień zebranymi w JHUSOM i UCSF można przypisać różnicom w parametrach bodźców, w tym różnym prędkościom, typom i długościom fal bodźca; niemniej jednak ogólna spójność zaobserwowana w analizie danych uzyskanych każdą z metod wskazuje, że program PyOKR może być łatwo dostosowany poza system zbierania danych OKR w JHUSOM i zastosowany do innych rejestracji OKR, niezależnie od metod wideookulografii. Wyniki te pokazują, że opisana tutaj platforma programowa jest dokładna i może być ogólnie stosowana w badaniu odpowiedzi okulomotorycznych, umożliwiając precyzyjne porównania ilościowe między zwierzętami z różnych grup w celu dalszego badania obwodów stabilizacji obrazu wzrokowego.

Rysunek 1: Zbiór danych odpowiedzi OKR. (A) Aparatura wirtualnej areny OKR do stymulacji behawioralnej, opisana wcześniej^9,13. Cztery monitory otaczają zwierzę z unieruchomioną głową (1), wyświetlając stale poruszający się bodziec w formie szachownicy (2). Wirtualny bęben może prezentować ruch jednokierunkowy we wszystkich czterech kierunkach głównych, a także oscylacyjne bodźce sinusoidalne. Lewe oko myszy jest oświetlane światłem podczerwonym (IR) i rejestrowane kamerą (3) w celu zapisu odpowiedzi układu wzrokowego odzwierciedlonych w śledzeniu ruchu oka. (B) Analiza śledzenia ruchu oka odbywa się poprzez przechwytywanie obrazu źrenicy oraz odbicia rogówki generowanego przez światło IR. Gromadzenie danych i obliczanie ruchów oka w odpowiedzi na wirtualny bęben przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem^9,13. (C) Schemat wektorów oka poruszających się pionowo (fala Y) i poziomo (fala X). (D) Przykładowe przebiegi odpowiedzi śledzenia oka na jednokierunkowy ruch w górę i w tył, a także na sinusoidalny ruch pionowy i poziomy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza śledzenia jednokierunkowych reakcji wizualnych. (A-D) Identyfikacja i wybór faz powolnego śledzenia do analizy wzmocnienia (gain). Przedstawiono przykładowe ślady jednokierunkowe dla reakcji wizualnych na ruch do przodu (A), do tyłu (B), w górę (C) i w dół (D) w odniesieniu do oka myszy. Fazy powolne są identyfikowane poprzez dodanie czerwonych i zielonych punktów opisanych w Kroku 3 w celu usunięcia sakkad; wybrane fazy powolne są zaznaczone na żółto. Regresje wielomianowe naniesiono na ślady w formie linii. (E) Ilościowa analiza przykładowych śladów (A-D) zorganizowana zgodnie z odczytem PyOKR. Dla każdego śladu obliczono całkowite prędkości XY i odpowiadające im wzmocnienia, niezależnie od kierunkowości. W reakcjach jednokierunkowych całkowite prędkości te zazwyczaj odzwierciedlają indywidualną prędkość w określonym kierunku; jednak w przypadku odpowiedzi sinusoidalnych wartość ta odzwierciedla średnią całkowitą prędkość oka. Poziome i pionowe składowe prędkości zostały rozdzielone, aby pokazać prędkość w każdym z tych kierunków. Następnie obliczono wzmocnienie na podstawie przedstawionych prędkości bodźca. (F) Obliczone wzmocnienia śledzenia u zwierząt typu dzikiego (n = 13) w czterech kierunkach głównych w porównaniu z powiązaną ilościową analizą ETM. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Automatyczne filtrowanie sakad ułatwia przetwarzanie i analizę danych OKR. (A-D) Automatyczne filtrowanie śladów z Rysunku 2A-D usuwa sakady i modeluje wyłącznie ruch w fazie powolnej poprzez eliminację gwałtownych zmian prędkości i łączenie faz powolnych. Końcowe nachylenie reprezentuje całkowity ruch oka w danym okresie. (E) Ilościowe określenie wzmocnień z przefiltrowanych danych próbnych, zorganizowane w odczycie PyOKR. (F) Porównanie wartości wzmocnienia między nieprzefiltrowanymi a przefiltrowanymi próbkami śladów ruchu oka nie wykazuje istotnych różnic. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Dane przeanalizowano testem U Manna-Whitneya pomiędzy wynikami nieprzefiltrowanymi i przefiltrowanymi. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 4: Wyznaczenie wzmocnień śledzenia w odpowiedzi na oscylacyjne bodźce wzrokowe. (A,B) Pionowe (A) i poziome (B) reakcje ruchów gałek ocznych na sinusoidalnie poruszające się bodźce mogą być modelowane względem zdefiniowanych parametrów oscylacyjnych bodźca. Wybrane obszary są zaznaczone na żółto z nałożoną aproksymacją wielomianową na zapis. Model bodźca przedstawiony jest jako pomarańczowa fala sinusoidalna za zapisem, aby umożliwić odniesienie do stanu bodźca w każdym punkcie. (C) Obliczenia wzmocnień dla odpowiedzi sinusoidalnych typu dzikiego (n = 7) odzwierciedlają asymetryczne reakcje między poziomą a pionową zdolnością śledzenia. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. **p<0.01,***p<0.005. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Śledzenie kierunkowe można modelować w jego komponentach poziomych i pionowych. (A) Komponent pionowy fali śledzenia ruchu oka w odpowiedzi na bodziec skierowany w górę. (B) Komponent poziomy fali śledzenia ruchu oka w odpowiedzi na bodziec skierowany w górę. (C) Ogólna trajektoria oka w kierunkach pionowym i poziomym. (D) Trójwymiarowy model wektora ruchu oka w czasie w odpowiedzi na ruch w dół. Surowe dane śladu przedstawiono na czerwono, a model regresji trajektorii na niebiesko. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Analiza OKR u myszy Tbx5f/f; Pcdh9-Cre wykazuje istotne deficyty we wzmocnieniu jednokierunkowego śledzenia pionowego. (A) Zwierzęta Tbx5f/f; Pcdh9-Cre nie wykazują istotnych zmian we wzmocnieniu śledzenia poziomego. (B,C) Zwierzęta Tbx5f/f; Pcdh9-Cre wykazują istotną redukcję wzmocnienia w odpowiedziach pionowych: w górę (B) i w dół (C). (D,E) Odpowiedzi sinusoidalne zwierząt Tbx5f/f; Pcdh9-Cre w odpowiedzi na oscylacyjne bodźce poziome (D) i pionowe (E). (F) Ilościowa ocena odpowiedzi oscylacyjnych Tbx5f/f; Pcdh9-Cre wykazuje istotne wzrosty wzmocnienia śledzenia poziomego, ale spadki w odpowiedziach pionowych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Dane analizowano testami U Manna-Whitneya. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7: Zastosowanie PyOKR do danych pozyskanych z alternatywnych metod wideookulografii. (A) Aparatura do stymulacji wirtualnym bębnem w OKR, opisana w ¹⁰. Projektor DLP o długości fali 405 nm odbija światło za pomocą zwierciadła wypukłego na półkulę, tworząc wirtualny bęben otaczający pole widzenia zwierzęcia. Ruchy gałek ocznych są mierzone za pomocą kamery NIR umieszczonej poza półkulą. Jednokierunkowe i sinusoidalne kratki pasowe są wyświetlane zwierzęciu z unieruchomioną głową w kierunkach pionowych. (B,C) Fazy śledzenia w górę (B) i w dół (C) zostają zidentyfikowane i wybrane do analizy ilościowej. Fazy wolne są zaznaczone na żółto. (D) Wzmocnienia śledzenia obliczone z pionowego śledzenia u zwierząt typu dzikiego (n=5) przy użyciu opisanych tutaj metod. Obserwowana jest asymetryczna zdolność śledzenia, ze znacznym spadkiem w śledzeniu w dół. (E) Odpowiedź oscylacyjna na bodźce sinusoidalne zamodelowana w celu ilościowego określenia wzmocnień śledzenia u zwierząt typu dzikiego (n=8). Fazy wolne są zaznaczone na żółto. (F) Ilościowe oznaczenie wzmocnień sinusoidalnych wykazuje obniżone wzmocnienia śledzenia w dół w porównaniu do wzmocnień w górę. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Dane analizowano za pomocą testów U Manna-Whitneya. *p<0.05. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Uzupełniający plik z kodem 1: PyOKR Windows Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 2: PyOKR Mac Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

PyOKR zapewnia kilka korzyści w zakresie badania reakcji wizualnych odzwierciedlonych w ruchach gałek ocznych. Obejmują one dokładność, dostępność i opcje gromadzenia danych, a także możliwość uwzględnienia parametryzacji i zmiennych prędkości bodźców.

Bezpośrednia ocena wzmocnienia śledzenia gałek ocznych zapewnia dokładną charakterystykę ruchu gałek ocznych, która jest bardziej bezpośrednią metryką ilościową niż tradycyjne ręczne liczenie sakkad szybkiej fazy (ETM). Chociaż jest to przydatne, liczenie sakkad zapewnia pośrednią ocenę rzeczywistego ruchu śledzenia. Platforma oprogramowania PyOKR zapewnia bezpośrednią kwantyfikację prędkości śledzenia, biorąc pod uwagę dodatkowe parametry, w tym amplitudy sakad i długość wolnych faz. Ponadto szybkie liczenie sakad opiera się na ocenie częstotliwości sakad w określonym czasie, co wymaga, aby każdy ślad miał niewielki lub żaden dźwięk, w tym losowe sakkady spowodowane stresem zwierzęcym. Czynniki te powodują, że wiele zebranych śladów jest bezużytecznych, a tym samym wydłużają czas zbierania danych w celu dokładnej oceny śledzenia ruchu gałek ocznych. Jednak opisane tutaj oprogramowanie rozwiązuje ten problem, bezpośrednio określając ilościowo poszczególne powolne fazy w ramach danej ścieżki i obliczając zyski w chwilowych punktach wzdłuż ścieżki. Osiąga to poprzez porównanie prędkości ruchu gałek ocznych z prędkością bodźca w danym punkcie. Ponieważ częstotliwość sakkad nie jest już parametrem definiującym analizę, szum może być łatwo usunięty przez nadzór użytkownika, zmniejszając wpływ szumu na jakość analizy. Pozwala to na uzyskanie bardziej użytecznych zebranych danych i większą moc statystyczną podczas analizy tych danych, zwiększenie dokładności i odtwarzalności podczas ilościowego określania śledzenia ruchu gałek ocznych i charakteryzowania parametrów OKR dla poszczególnych myszy i różnych grup myszy. Automatyczne filtrowanie sakkad w oparciu o gwałtowne zmiany prędkości oka znalezione za pomocą metody Z-score zostało również wykorzystane do scharakteryzowania wzmocnienia śledzenia¹⁰. Aby włączyć tę metodę filtrowania do oprogramowania, dołączyliśmy ten typ filtrowania prędkości, ale z dodatkowymi narzędziami, takimi jak parametryzacja progowa i ręczny nadzór sakkadyczny, aby zmniejszyć potencjalne błędy generowane przez to podejście. Jeśli do analizy używa się surowych śladów zamiast automatycznego filtrowania, szybkie zmiany w ruchu gałek ocznych spowodowane sakkadami, mrugnięciami lub niepokojem myszy są identyfikowane poprzez maksymalne zmiany prędkości za pomocą oszacowania gęstości jądra Gaussa prędkości śladowej. Pozwala to na automatyczny wybór regionów segmentacji i ostatecznie usunięcie w oparciu o ręczny nadzór użytkownika. Ręczny nadzór zapewnia wyższą tolerancję na hałaśliwe ślady, umożliwiając użytkownikom szybkie korygowanie wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych w celu uzyskania szybkich zmian w oku. Dodatkowo, ponieważ PyOKR wykorzystuje aproksymacje wielomianowe do modelowania ogólnego ruchu gałek ocznych w danym kierunku, szum w poszczególnych punktach jest wygładzany, co pozwala na ocenę prędkości trajektorii z pewną tolerancją dla szumu w ścieżce. Tylko w przypadku wyjątkowo niskiej jakości danych na całej ścieżce lub niewłaściwej kalibracji podczas zbierania danych oprogramowanie nie będzie w stanie wygenerować dokładnej analizy danych. Podsumowując, dzięki włączeniu nadzoru użytkownika, filtrowania i narzędzi do obliczania natychmiastowego wzmocnienia, opisana tutaj aplikacja PyOKR generuje zyski śledzenia z dużą dokładnością i bardziej bezpośrednimi wskaźnikami niż poprzednie metody.

PyOKR posiada również wiele funkcji, które pozwalają na dostosowanie analiz OKR do potrzeb użytkownika. Wprowadzanie parametrów bodźca, a także surowych wektorów bodźców, pozwala użytkownikowi precyzyjnie zdefiniować dowolny pożądany bodziec. Mogą to być bodźce jednokierunkowe, sinusoidalne lub ukośne, z których wszystkie oprogramowanie może wykorzystać do generowania dokładnych korzyści śledzenia dla powiązanych reakcji wizualnych. Dzięki parametryzacji bodźca w tej metodologii, natychmiastowe zyski obliczone w każdej klatce mogą być niezawodnie generowane z dużą dokładnością, niezależnie od wprowadzonego bodźca. Chociaż dane dotyczące bodźców ukośnych nie były tutaj analizowane, dokładne wzmocnienia można obliczyć za pomocą rozłożonych wektorów prędkości XY w celu zrekonstruowania kąta ukośnego, co pozwala na dokładne obliczenia wzmocnienia bodźców ukośnych. Dzięki dostępnej parametryzacji ustawień bodźców, nasze narzędzie ma szerokie zastosowanie do śledzenia fal w odpowiedzi na dowolny bodziec wizualny. Ponadto oprogramowanie zapewnia większą przepustowość i powtarzalną ocenę ilościową w porównaniu z poprzednimi metodami. Sortowanie śladów OKR jest czasochłonne i pracochłonne; jednak uproszczony interfejs użytkownika PyOKR jest w stanie łatwo przefiltrować wiele śladów z większą szybkością niż było to wcześniej możliwe. Pozwala to nie tylko na szybszą kwantyfikację śladów, ale także ujawnia dodatkowe parametry OKR, w tym bezpośrednią kwantyfikację prędkości gałek ocznych, kierunkowe składowe wektora ruchu gałek ocznych oraz chwilowe zyski w stosunku do bodźca zarówno w poziomych, jak i pionowych składowych wektora ruchu. Ponadto, biorąc pod uwagę automatyczną identyfikację sakkad i obliczanie prędkości śledzenia zapewnianych przez naszą metodę, potencjalna stronniczość eksperymentatora w analizie danych jest znacznie zmniejszona w porównaniu z innymi metodami kwantyfikacji, takimi jak ręczne zliczanie ETM lub automatyczne filtrowanie śladów, które mogą generować fałszywie ujemne wyniki. Co więcej, można generować i automatycznie kompilować duże ilości danych behawioralnych w celu uproszczenia dalszej analizy. Dzięki funkcjom eksportu i sortowania danych dostępnym w PyOKR, dane śledzenia wielu zwierząt i warunków mogą być automatycznie przetwarzane, aby umożliwić zorganizowane przechowywanie danych, a także szybką analizę statystyczną. W przypadku przeprowadzania eksperymentów, w których stosuje się wiele warunków podczas tej samej sesji nagraniowej, takich jak manipulacja obwodami lub reakcje wizualne, zalecamy zbieranie danych w dyskretnych plikach fal lub podzbiorach epok, które pozwalają na przechowywanie oddzielnych zestawów danych w oparciu o niezależne zmienne będące przedmiotem zainteresowania pochodzące z tej pojedynczej sesji nagraniowej. Przykładem może być sytuacja, w której testujemy różnice w odpowiedziach na różne częstotliwości fal sinusoidalnych w ramach paradygmatu eksperymentalnego, zalecamy zapisanie różnych parametrów w różnych plikach fal do oddzielnej analizy, takich jak WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis i WT_1_Freq0.3Analysis. W bieżącej wersji, po przeanalizowaniu epok, nie ma funkcji wybierania poszczególnych wartości epok w zestawie danych, chociaż w razie potrzeby można ją dodać w przyszłości.

Wreszcie, nasza metoda może być dostosowana do wielu metod zbierania danych wideookulograficznych i zapewnia solidną platformę analityczną, którą można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb laboratorium. Poprzez analizę danych OKR typu dzikiego i istniejących zmutowanych, a także danych OKR typu dzikiego zebranych przy użyciu różnych metod i bodźców, pokazujemy tutaj, że nasze narzędzie analityczne jest w stanie a) ilościowo określić śledzenie OKR na podstawie dowolnego bodźca kierunkowego z dużą dokładnością i przepustowością; b) identyfikowanie różnic w zachowaniu układu wzrokowego wynikających z zaburzeń genetycznych; oraz c) ocena danych śledzenia wizualnego pochodzących z różnych metod wideookulografii. Dostępność i ogólna zdolność adaptacji naszej platformy analitycznej ułatwią dalsze badania nad reakcjami OKR i poprawią badania behawioralne, które charakteryzują tworzenie się i dynamikę obwodów nerwowych w kontekście reakcji okoruchowych.

Aby uzyskać dokładne pomiary i późniejsze przydatne analizy danych, konieczne jest zebranie danych w kilku krokach. Zalecamy zbieranie danych OKR przez wiele sesji, aby umożliwić zwierzęciu zaaklimatyzowanie się do aparatury do testów behawioralnych i zmniejszyć wpływ stresu zwierzęcia na reakcje behawioralne; jednak nadmierne rejestrowanie może prowadzić do nasilenia odpowiedzi OKR¹³, dlatego zaleca się ostrożność przy projektowaniu reżimów testowych. Podczas zbierania danych OKR właściwa kalibracja sprzętu wideookulograficznego ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji, ponieważ jakość analizowanych danych jest bezpośrednią funkcją przetwarzanego śladu. Co ważne, użycie Spyder IDE jest niezbędne do nadzoru nad grafami poprzez Matplotlib. Biorąc pod uwagę dostępność i konstrukcję naszej platformy, wszystkie niezbędne narzędzia są dostępne dla innych, aby rozszerzyć możliwości oprogramowania i dostosować tę platformę do różnych paradygmatów eksperymentów behawioralnych.

Podsumowując, opisujemy tutaj nowe, dostępne i wszechstronne narzędzie do analizy reakcji behawioralnych OKR bardziej dogłębnie i z większą mocą ilościową niż jest to obecnie dostępne przy użyciu istniejących metodologii. PyOKR może być łatwo używany przez początkujących użytkowników Pythona i zawiera sprawdzony potok analizy i interfejs do szybkiej i dokładnej analizy fal OKR ze zwiększonym rygorem i powtarzalnością. Zdolność adaptacji tego oprogramowania zapewnia elastyczną strukturę, którą użytkownicy mogą łatwo dostosować do swoich konkretnych potrzeb i procedur gromadzenia danych. Przewidujemy, że ta metoda ilościowa posunie naprzód badania nad reakcjami okoruchowymi i pogłębi nasze zrozumienie rozwoju i funkcji obwodów neuronalnych, które napędzają zachowania układu wzrokowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6J  myszy	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Komora zapisu refleksu optokinetycznego - JHUSOM	Zbudowana na zamówienie	Nie dotyczy	Zgodnie z opisem w Al-Khindi i in. (2022)9 oraz Kodama i in. (2016)13
Komora zapisu refleksu optokinetycznego - UCSF	Zbudowana na zamówienie	Nie dotyczy	Zgodnie z opisem w Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ myszki	Prezent od B. Bruneau	N/A	Zgodnie z opisem w Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Nr magazynowe # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD