PyOKR: Półautomatyczna metoda ilościowego określania zdolności śledzenia odruchów optokinetycznych

Stabilizacja obrazu opiera się na precyzyjnych reakcjach okoruchowych, aby skompensować globalny przepływ optyczny, który występuje podczas ruchu własnego. Stabilizacja ta jest napędzana przede wszystkim przez dwie reakcje motoryczne: odruch optokinetyczny (OKR) i odruch przedsionkowo-oczny (VOR)^1,2,3. Powolny globalny ruch w poprzek siatkówki indukuje OKR, który wywołuje odruchowy obrót oka w odpowiednim kierunku w celu ustabilizowania obrazu^1,2. Ten ruch, znany jako faza wolna, jest przerywany przez sakkady kompensacyjne, znane jako faza szybka, w której oko szybko resetuje się w przeciwnym kierunku, aby umożliwić nową wolną fazę. Tutaj definiujemy te szybkie sakkady jako ruchy śledzące ruch gałek ocznych (ETM). Podczas gdy VOR opiera się na układzie przedsionkowym w celu wywołania ruchów gałek ocznych w celu kompensacji ruchów głowy³, OKR jest inicjowany w siatkówce przez odpalenie ON, a następnie sygnalizację do dodatkowego systemu optycznego (AOS) w śródmózgowiu^4,5. Ze względu na bezpośrednie uzależnienie od obwodów siatkówki, OKR jest często używany do określania zdolności śledzenia wzrokowego zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych^6,7.

OKR został gruntownie przebadany jako narzędzie do oceny podstawowych zdolności wizualnych^2,6,8, DSGC development^9,10,11,12, reakcje okoruchowe¹³ i fizjologiczne różnice między środowiskami genetycznymi⁷. OKR jest oceniany u zwierząt z unieruchomionym bodźcem¹⁴. Reakcje okulomotoryczne są zwykle rejestrowane za pomocą różnych narzędzi wideo, a ruchy śledzące ruchy gałek ocznych są rejestrowane jako przebiegi OKR w kierunku poziomym i pionowym⁹. Aby określić ilościowo zdolność śledzenia, opisano dwa podstawowe wskaźniki: wzmocnienie śledzenia (prędkość oka w stosunku do prędkości bodźca) i częstotliwość ETM (liczba szybkich sakkad fazowych w danym przedziale czasowym). Obliczanie wzmocnienia było historycznie wykorzystywane do bezpośredniego pomiaru prędkości kątowej oka w celu oszacowania zdolności śledzenia; Obliczenia te są jednak pracochłonne i można je dowolnie wyprowadzić na podstawie metod zbierania danych wideookulograficznych i późniejszej kwantyfikacji. W celu szybszej oceny OKR-ów, zliczanie częstotliwości ETM zostało użyte jako alternatywna metoda pomiaru ostrości śledzenia⁷. Chociaż zapewnia to dość dokładne oszacowanie zdolności śledzenia, metoda ta opiera się na pośredniej metryce w celu ilościowego określenia odpowiedzi powolnej fazy i wprowadza szereg odchyleń. Należą do nich stronniczość obserwatora w określaniu sakkady, poleganie na czasowo spójnych reakcjach sakkadowych w określonej epoce oraz niemożność oceny wielkości odpowiedzi w wolnej fazie.

Aby rozwiązać te problemy za pomocą obecnych podejść do oceny OKR i umożliwić dogłębną kwantyfikację parametrów OKR o wysokiej przepustowości, opracowaliśmy nową metodę analizy do ilościowego określania przebiegów OKR. Nasze podejście wykorzystuje dostępną platformę oprogramowania opartą na języku Python o nazwie "PyOKR". Za pomocą tego oprogramowania można bardziej dogłębnie i z większą parametryzacją badać modelowanie i kwantyfikację reakcji OKR w wolnej fazie. Oprogramowanie zapewnia dostępną i powtarzalną ilościową ocenę reakcji na niezliczone bodźce wzrokowe, a także dwuwymiarowe śledzenie wizualne w odpowiedzi na ruch poziomy i pionowy.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w The Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w JHUSOM. Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez UCSF Institutional Animal Care and Use Program.

1. Zbieranie danych behawioralnych

1. Rejestruj ruchy gałek ocznych OKR za pomocą wybranej metody wideookulusografii w celu wygenerowania danych falowych (tj. szeregu czasowego kąta patrzenia oka we współrzędnych sferycznych).
   UWAGA: Reprezentatywne dane zebrane w JHUSOM uzyskano za pomocą operacji wszczepienia implantu głowy i wideookulografii, jak opisano wcześniej^9,13 (Rysunek 1). Reprezentatywne dane zebrane z UCSF uzyskano za pomocą operacji implantacji głowy i metody wideookulograficznej, jak opisano w before¹⁰ (Figura 7).
   1. Zanotuj parametry bodźca i nagrywania: liczbę klatek na sekundę nagrywania, prędkość i kierunek bodźca oraz długość czasu między epokami bodźca i po nich. W przypadku bodźców sinusoidalnych należy również zwrócić uwagę na amplitudę i częstotliwość fali bodźców.
2. Eksport zebranych danych grupy czynności jako pliku . Plik CSV zawierający dane o falach poziomych i pionowych (azymut i elewacja).
   1. Organizowanie danych grupy czynności jako rozdzielanych tabulatorami . Plik CSV z dwiema kolumnami zawierającymi dane poziome (epxWave) i dane pionowe (epyWave).

2. Instalacja oprogramowania analitycznego

1. Pobierz i zainstaluj Pythona.
   1. Aby nadzorować grafy, zainstaluj Spyder przez Anacondę.
   2. Aby upewnić się, że wykresy działają poprawnie w Spyder, przejdź do Narzędzia > Preferencje > Konsoli Ipython > Grafika > Backend grafiki. Ustaw opcję Inline (Wbudowana) na Automatic (Automatycznie).
2. Utwórz nowe środowisko Anaconda za pomocą języka Python.
3. Zainstaluj PyOKR za pośrednictwem PyPi za pomocą install PyOKR, aby zainstalować najnowszą wersję wraz z zależnościami pakietów (Dodatkowy plik kodowania 1 i Uzupełniający plik kodowania 2)
4. Jeśli używany jest komputer z systemem Windows, uruchom z PyOKR import OKR_win jako o, a następnie o.run().
5. Jeśli używany jest komputer Mac, uruchom z PyOKR import OKR_osx jako o, a następnie o.run().

3. Analiza danych falowych

1. Inicjalizacja analiz i importów plików
   1. Uruchom o.run() w skrypcie .py, aby otworzyć interfejs użytkownika.
   2. W obszarze Plik użyj funkcji Otwórz lub polecenia Ctrl+O [polecenie iOS], aby otworzyć przeglądarkę, która pozwoli użytkownikowi wybrać żądany plik grupy czynności.
   3. W obszarze Plik użyj przycisku Eksportuj folder lub polecenia Ctrl+E, aby otworzyć przeglądarkę folderów, która pozwoli wybrać folder wyjściowy, do którego zostaną wyeksportowane analizy końcowe.
   4. Wprowadź końcową nazwę pliku analizy w polu Plik wyjściowy w zalecanym formacie, takim jak AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Ustaw program dla pojedynczego zwierzęcia za pomocą polecenia Ustaw temat w obszarze Plik lub polecenia Ctrl+S, aby zainicjować zestaw danych dla pojedynczego zwierzęcia.
2. Definicja parametrów pliku grupy czynności
   1. Aby rozpocząć ustawianie parametrów bodźca, zdefiniuj kierunkowość w obszarze Wybierz kierunek bodźca, wybierając jeden z czterech głównych kierunków. W przypadku bodźców sinusoidalnych wybierz taki, który zawiera odpowiednio (Poziomy) lub (Pionowy), przy czym kierunek kardynalny określa początkowy kierunek fali sinusoidalnej.
   2. Ustaw typ bodźca w obszarze Wybierz typ bodźca jako jednokierunkowy, oscylacyjny lub ukośny.
   3. Po ustawieniu kierunkowości zaimportuj własny zestaw danych o położeniu bodźca (Importuj własne dane wektora bodźca) lub automatycznie wygeneruj wektor na podstawie parametrów (Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów). Jeśli importujesz wektor bodźca, przejdź do punktu 3.2.3.1, a następnie przejdź do kroku 3.3. Jeśli generujesz wektor bodźca, przejdź do kolejnych kroków.
      1. W przypadku importowania własnych danych wektorowych należy zaimportować wartości odległości bodźca (tj. szereg czasowy opisujący, jak daleko bodziec przemieszcza się między każdą sąsiednią ramką akwizycji) w tym samym formacie, który opisano w kroku 3.2.1. Ponadto analizuj cały zestaw danych jako jedną epokę, zamiast dzielić go na poszczególne epoki, ponieważ funkcja podzbioru importowanej wartości bodźca nie została dodana od PyOKR v1.1.2.
   4. W obszarze Parametry bodźca ustaw parametry bodźca używanego do zbierania danych.
      1. Ustaw czas braku bodźca na początku (głowa) i na końcu (ogonie) danej próby za pomocą Orzeł i Reszka.
      2. Ustaw czas, przez jaki bodziec jest wyświetlany, czas bez bodźca po nim oraz liczbę całkowitych epok w danej próbie za pomocą odpowiednio długości epoki, długości po bodźcu i liczby epok.
      3. W przypadku bodźców jednokierunkowych i ukośnych ustaw prędkość bodźca w stopniach na sekundę za pomocą prędkości poziomej i prędkości pionowej.
      4. Ustaw częstotliwość przechwytywania kamery zbierającej dane za pomocą opcji Szybkość przechwytywania klatek.
      5. W przypadku bodźców sinusoidalnych wygeneruj falę sinusoidalną do modelowania bodźców oscylacyjnych z częstotliwością i amplitudą.
   5. Po parametryzacji utwórz odpowiedni model na podstawie wprowadzonych powyżej informacji o bodźcu za pomocą opcji Generuj wektor bodźca na podstawie parametrów.
   6. Wybierz daną epokę dla wprowadzonego bodźca za pomocą opcji Wybierz epokę, aby przeskanować plik całej fali.
3. Nadzorowany wybór faz śledzenia
   1. Aby zidentyfikować obszary powolnego śledzenia, automatycznie wybierz szybkie sakady fazowe z korektą wstępną, klikając opcję Dane niefiltrowane lub Dane filtrowane, co spowoduje oznaczenie potencjalnych sakkad na podstawie maksymalnych zmian prędkości.
   2. W obszarze Dane niefiltrowane upewnij się, że sakkady są dokładnie wybrane za pomocą niebieskiej kropki. Jeśli automatyczny wybór nie jest dokładny, ręcznie usuń punkty za pomocą lewego przycisku myszy (LPM) lub dodaj punkty za pomocą prawego przycisku myszy (PPM). Gdy szybkie sakkady fazowe są odpowiednio wybrane, zapisz punkty za pomocą środkowego przycisku myszy (MMB) i zamknij wykres.
   3. Jeśli wymagane jest automatyczne filtrowanie, ustaw próg wskaźnika Z-Score i kliknij opcję Filtrowane dane, aby automatycznie filtrować sakkady. W razie potrzeby użyj tego samego ręcznego nadzoru, jak opisano w kroku 3.3.2, aby usunąć wszelkie szumy.
   4. Po prawidłowym wybraniu sakkad naciśnij Dopasowanie punktowe, aby wybrać obszar do usunięcia. Zmień górny i dolny punkt za pomocą podobnego schematu sterowania, jak opisano wcześniej w kroku 3.3.2. Edytuj górne (zielone) punkty za pomocą LPM lub PPM i edytuj dolne (czerwone) punkty za pomocą Shift+LPM lub Shift+PPMB. Gdy punkty są prawidłowo umieszczone, użyj MMB, aby zapisać punkty.
      UWAGA: jeśli używasz komputera Mac, regulacja dolnego i górnego punktu znajduje się w dwóch oddzielnych przyciskach i jest zgodna z tym samym schematem sterowania, jak opisano w kroku 3.3.2.
4. Analiza faz powolnego śledzenia
   1. Ustaw kolejność modelu wielomianowego za pomocą opcji Ustaw kolejność wielomianów, aby zdefiniować model wielomianowy, który zostanie dopasowany do poszczególnych wolnych faz.
      UWAGA: W przypadku bodźców jednokierunkowych lub ukośnych wartość domyślna to 1, ponieważ liniowość jest niezbędna do obliczenia wzmocnienia śledzenia. W przypadku bodźców sinusoidalnych do modelowania krzywej fali potrzebny jest wyższy porządek, z wartością domyślną 15.
   2. Aby przeanalizować ślad, wybierz opcję Analiza końcowa, aby wygenerować modele wolnej fazy (Rysunek 2) dla wybranych wolnych faz (patrz Rysunek 2A-D) i oblicz odległości, prędkości i uśrednione zyski śledzenia w całej epoce (Rysunek 2E).
   3. Aby wyświetlić wykres dwuwymiarowy (2D) lub trójwymiarowy (3D) wybranych regionów, wybierz odpowiednio opcję Wyświetl wykres 2D lub Wyświetl wykres 3D.
   4. Wybierz opcję Dodaj epokę, aby zapisać zebrane wartości wygenerowane w kroku 3.4.2. Aby wyświetlić wszystkie dodane wartości dla danego zwierzęcia, a także średnie dla zebranych prób, wybierz opcję Wyświetl bieżący zestaw danych.
   5. Po dodaniu epoki przejdź przez pozostałą część pliku za pomocą opcji Wybierz epokę, wykonując kroki od 3.3.1 do 3.4.4.
   6. Gdy plik wave zostanie w pełni przeanalizowany, powtórz ten proces dla wszystkich innych plików dla danego zwierzęcia, otwierając nowe pliki, ustawiając odpowiednie parametry i odpowiednio je analizując. Powtarzając kroki 3.2.1-3.4.5 dla każdego pliku, wygeneruj końcowy zestaw danych zawierający wszystkie dane dotyczące fal dla danego zwierzęcia.
5. Końcowy eksport danych
   1. Po zakończeniu analizy danych dla danego zwierzęcia, z przeanalizowanymi wszystkimi kierunkami lub bodźcami, wyeksportuj zestaw danych za pomocą opcji Eksport danych.
      UWAGA: Surowy zestaw danych zostanie wyeksportowany na podstawie nazwy pliku wyjściowego i zapisany wzdłuż ścieżki ustawionej przez folder wyjściowy jako plik CSV zawierający dane poszczególnych epok z łączną średnią dla każdego parametru bodźca.
   2. Po wyeksportowaniu pojedynczego zwierzęcia ponownie zainicjuj zestaw danych za pomocą Ctrl+S, a następnie powtórz wszystkie poprzednie kroki, aby przeanalizować nowe zwierzę.
   3. W razie potrzeby ponownie uporządkuj wszystkie dane wyjściowe zebrane dla wielu zwierząt, aby ułatwić analizę, za pomocą polecenia Sortuj dane na karcie Analiza.
      UWAGA: Ta funkcja skompiluje i posortuje wszystkie średnie wartości dla wszystkich analizowanych plików zwierząt przechowywanych w folderze wyjściowym, aby umożliwić łatwiejsze generowanie wykresów i porównań statystycznych. Sortowanie zależy od nazewnictwa plików od wersji 1.1.2. Użyj zalecanego schematu nazewnictwa opisanego w kroku 3.1.4 dla każdego pliku (np. WT_123_Analysis).

Aby potwierdzić opisaną powyżej metodę analizy, określiliśmy ilościowo zysk śledzenia OKR na śladach fal pobranych od myszy typu dzikiego i mutanta warunkowego nokautu ze znanym deficytem śledzenia. Ponadto, aby przetestować szersze zastosowanie naszej metody analizy, przeanalizowaliśmy ślady pochodzące z oddzielnej kohorty myszy typu dzikiego nabytych przy użyciu innej metody zbierania wideookulografii. Automatyczne filtrowanie sakkad ułatwia przetwarzanie i analizę danych OKR (Rysunek 3). Korzystając z nagrań bodźców jednokierunkowych i sinusoidalnych (Rysunek 1D), obliczyliśmy zyski śledzenia OKR w czterech głównych kierunkach (Rysunek 2F) dla zwierząt typu dzikiego (n = 13) do bodźców jednokierunkowych, a także śledząc zyski w odpowiedzi na poziome i pionowe bodźce sinusoidalne (Rysunek 4). Rozbieżność w zdolności śledzenia w stosunku do kierunku bodźca zarówno dla bodźców jednokierunkowych, jak i sinusoidalnych jest konsekwentnie obserwowana u wszystkich myszy typu dzikiego, z równie silnymi odpowiedziami poziomymi, które wykazują znacznie wyższe zyski ze śledzenia niż odpowiedzi pionowe, jak opisano w 2. Co więcej, asymetryczne zyski ze śledzenia między reakcjami w górę i w dół obserwuje się również u myszy typu dzikiego przy użyciu obu metod zbierania danych wideo-okulograficznych, jak wcześniej informowano2,10. Względne wielkości i spójność korzyści ze śledzenia w porównaniu z opublikowaną charakterystyką odpowiedzi OKR wskazują, że zyski ze śledzenia obliczone za pomocą oprogramowania dokładnie odzwierciedlają możliwości śledzenia. Oprócz jednokierunkowych obliczeń wzmocnienia, poziomy i pionowy ruch gałek ocznych może być modelowany jednocześnie (Rysunek 5), co pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję ruchu gałek ocznych w odpowiedzi na dany bodziec. Zapewnia to dodatkową możliwość kwantyfikacji, która jest przydatna w przyszłych badaniach badających sprzężone krzyżowo odpowiedzi poziome i pionowe9.

Aby zweryfikować przydatność oprogramowania do identyfikowania znaczących zmian w zachowaniu w różnych warunkach eksperymentalnych, ponownie przeanalizowaliśmy nasze opublikowane dane9, aby potwierdzić, że deficyty w śledzeniu pionowym ocenione w tym badaniu przez ręczne liczenie szybkich faz sakkad są odzwierciedlone w śledzeniu zysków przy użyciu przedstawionej tutaj metodologii. Wcześniejsze prace pokazują, że inaktywacja genetyczna w siatkówce czynnika transkrypcyjnego T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) poprzez warunkowy nokaut przy użyciu protokadheryny 9-Cre (Pcdh9-Cre) powoduje specyficzną utratę dostrojonych do góry komórek zwojowych selektywnych kierunkowo ON (up-oDSGC) oraz że Tbx5 Flox / Flox (Tbx5f / f); Mutanty Pcdh9-Cre wykazują specyficzną utratę pionowego śledzenia OKR-ów9. Analiza ilościowa przy użyciu opisanej tutaj metody wykazuje, że Tbx5f/f; Zwierzęta Pcdh9-Cre zachowują normalne poziome zyski śledzenia (Rysunek 6A), podobne do tych opisanych wcześniej i uzyskane przez ręczne liczenie szybkich sakkad fazowych (ETM) (Rysunek 2F); jednak myszy te wykazują znaczną utratę śledzenia pionowego, z prawie zerowymi zyskami w odpowiedzi zarówno na bodźce w górę, jak i w dół (Rysunek 6B, C). Dodatkowo, analiza odpowiedzi sinusoidalnych potwierdza, że zwierzęta Tbx5 cKO wykazują większe zyski ze śledzenia poziomego, wykazując jednocześnie znacznie zmniejszone śledzenie pionowe (Rysunek 6D-F). Ponowna analiza tego wcześniej opisanego fenotypu przy użyciu PyOKR pokazuje precyzję i czułość tej nowej metodologii, która pozwala na ilościowe porównania odpowiedzi OKR u myszy o różnych szczepach genetycznych.

Na koniec, przeanalizowaliśmy pionowe ślady OKR typu dzikiego zebrane na UCSF, aby zweryfikować użyteczność aplikacji za pomocą różnych metod wideo-okulistyki i parametrów bodźca. Dane z UCSF zostały zebrane przy użyciu półkulistego systemu projekcji, w którym ruchome siatki są prezentowane myszy poprzez odbicie projektora o długości fali 405 nm na półkulę otaczającą zwierzę z unieruchomioną głową10 (Rysunek 7A). Myszom zaprezentowano jednokierunkowe siatki pionowe z prędkością 10 stopni na sekundę, a odpowiedzi OKR rejestrowano w odstępach 60-sekundowych (Rysunek 7B, C). Ślady pionowe analizowano ilościowo za pomocą PyOKR, a odpowiedzi w górę porównano z odpowiedziami w dół (Rysunek 7D). Zgodnie z oczekiwaniami odpowiedzi w górę były znacznie silniejsze niż w dół10; jednak zyski ze śledzenia były nieznacznie zmniejszone w porównaniu ze śladami zarejestrowanymi w JHUSOM (Rysunek 2F). Ponadto kwantyfikację odpowiedzi sinusoidalnych analizowano za pomocą PyOKR (Rysunek 7E), a znaczna asymetria w odpowiedziach pionowych na bodźce poruszające się sinusoidalnie znajduje odzwierciedlenie w obliczonych zyskach (Rysunek 7F). Różnice między wartościami wzmocnienia zebranymi w JHUSOM i UCSF można przypisać różnicom między parametrami bodźca, w tym różnymi prędkościami, typami i długościami fal bodźca; jednak ogólna spójność, którą obserwujemy w naszej analizie danych uzyskanych za pomocą każdej metody zbierania, pokazuje, że nasz PyOKR można łatwo zaadaptować poza nasz system zbierania danych OKR JHUSOM i zastosować do innych nagrań OKR, niezależnie od metod wideookulograficznych. Wyniki te pokazują, że opisana tutaj platforma oprogramowania jest dokładna i może być ogólnie stosowana do badania reakcji okoruchowych, umożliwiając precyzyjne porównania ilościowe między zwierzętami należącymi do różnych grup w celu dalszego badania obwodów wizualnej stabilizacji obrazu.

Rysunek 1: Zbiór danych odpowiedzi OKR. (A) Wirtualna arena OKR do stymulacji behawioralnej, jak wcześniej opisano9,13. Cztery monitory otaczają zwierzę z unieruchomioną głową (1), wyświetlając stale poruszający się bodziec szachownicy (2). Wirtualny bęben może prezentować jednokierunkowy ruch we wszystkich czterech głównych kierunkach, a także oscylacyjne bodźce sinusoidalne. Lewe oko myszy jest oświetlane światłem podczerwonym (IR) i rejestrowane za pomocą kamery (3) w celu zarejestrowania reakcji układu wzrokowego odzwierciedlonych w śledzeniu ruchu gałek ocznych. (B) Analiza śledzenia ruchu gałek ocznych odbywa się poprzez uchwycenie źrenicy i odbicia rogówki generowanego przez światło podczerwone. Zbieranie danych i obliczanie ruchów gałek ocznych w odpowiedzi na wirtualny bęben zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem9,13. (C) Schemat wektorów oka poruszających się w pionie (fala Y) i w poziomie (fala X). (D) Przykładowe ślady reakcji śledzenia oka na jednokierunkowy ruch w górę i do tyłu, a także pionowy i poziomy ruch sinusoidalny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza śledzenia jednokierunkowych reakcji wizualnych. (A-D) Identyfikacja i wybór faz powolnego śledzenia do analizy wzmocnienia. Przykładowe ślady jednokierunkowe są pokazane z wizualnymi reakcjami na ruch do przodu (A), do tyłu (B), w górę (C) i w dół (D) w stosunku do oka myszy. Powolne fazy są identyfikowane przez dodanie czerwonych i zielonych punktów opisanych w kroku 3 w celu usunięcia sakkad, a wybrane powolne fazy są podświetlone na żółto. Regresje wielomianowe są nakładane na ślady jako linie. (E) Kwantyfikacja śladów próbki (A-D) zgodnie z organizacją w odczycie PyOKR. Dla każdej ścieżki obliczane są całkowite prędkości XY i odpowiednie wzmocnienia, niezależnie od kierunkowości. W reakcjach jednokierunkowych te całkowite prędkości będą zwykle odzwierciedlać indywidualną prędkość w określonym kierunku; Jednak w przypadku odpowiedzi sinusoidalnych wartość ta będzie odzwierciedlać średnią ogólną prędkość oka. Składowe prędkości poziomej i pionowej są podzielone, aby pokazać prędkość w każdym odpowiednim kierunku. Wzmocnienie jest następnie obliczane na podstawie przedstawionych prędkości bodźca. (F) Obliczone zyski ze śledzenia zwierząt typu dzikiego (n = 13) w czterech głównych kierunkach w porównaniu z powiązaną z nimi kwantyfikacją ETM. Dane są prezentowane jako średnia ± SD. Dane analizowane za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z wieloma porównaniami. *p<0,05, **p<0,01,***p<0,005, ****p<0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Automatyczne filtrowanie sakkad ułatwia przetwarzanie i analizę danych OKR. (A-D) Automatyczne filtrowanie śladów z Rysunek 2A-D usuwa sakkady i modeluje tylko ruch w wolnej fazie, usuwając gwałtowne zmiany prędkości i łącząc ze sobą wolne fazy. Końcowe nachylenie reprezentuje całkowity ruch gałek ocznych w danej epoce. (E) Kwantyfikacja zysków z przefiltrowanych danych próbki, zgodnie z danymi z odczytu PyOKR. (F) Porównanie wartości wzmocnienia między próbkami niefiltrowanymi a przefiltrowanymi śladami oczu nie wykazuje istotnych różnic. Dane są prezentowane jako średnia ± SD. Dane analizowane za pomocą testu U Manna-Whitneya między wynikami niefiltrowanymi i filtrowanymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyprowadzanie zysków śledzenia w odpowiedzi na oscylacyjne bodźce wzrokowe. (A,B) Pionowe (A) i poziome (B) reakcje ruchów gałek ocznych na sinusoidalnie poruszające się bodźce mogą być modelowane w odniesieniu do zdefiniowanych parametrów bodźca oscylacyjnego. Wybrane regiony są oznaczone kolorem żółtym z przybliżeniem wielomianu nałożonym na ślad. Model bodźca jest przedstawiony jako pomarańczowa fala sinusoidalna za śladem, aby umożliwić odniesienie się do tego, czym jest bodziec w każdym punkcie. (C) Obliczenia wzmocnienia odpowiedzi sinusoidalnych typu dzikiego (n = 7) odzwierciedlają asymetryczne odpowiedzi między zdolnością śledzenia poziomego i pionowego. Dane są prezentowane jako średnia ± SD. Dane analizowane za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z wieloma porównaniami. **p<0,01,***p<0,005. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Śledzenie kierunkowe może być modelowane w jego poziomych i pionowych komponentach. (A) Pionowa składowa fali śledzącej ruch gałek ocznych w odpowiedzi na bodziec skierowany w górę. (B) Składowa pozioma fali śledzącej ruch gałek ocznych w odpowiedzi na bodziec skierowany w górę. (C) Ogólna trajektoria lotu gałek ocznych zarówno w kierunku pionowym, jak i poziomym. (D) Trójwymiarowy model wektora ruchu oka w czasie w odpowiedzi na ruch w dół. Nieprzetworzone dane śledzenia są wyświetlane na czerwono, a model regresji trajektorii jest wyświetlany na niebiesko. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza OKR w Tbx5f/f; Myszy Pcdh9-Cre wykazują znaczne deficyty w jednokierunkowych zyskach śledzenia pionowego. a) Tbx5f/f; Zwierzęta Pcdh9-Cre nie wykazują znaczącej zmiany w poziomym wzmocnieniu śledzenia. b,c) Tbx5f/f; Zwierzęta Pcdh9-Cre wykazują znaczne zmniejszenie przyrostu w swoich reakcjach pionowych: w górę (B) i w dół (C). (D,E) Odpowiedzi sinusoidalne Tbx5f/f; Pcdh9-Cre zwierzęta w odpowiedzi na poziome (D) i pionowe (E) bodźce oscylacyjne. f) oznaczanie ilościowe Tbx5f/f; Odpowiedzi oscylacyjne Pcdh9-Cre wykazują znaczny wzrost zysków śledzenia poziomego, ale wykazują spadki odpowiedzi pionowych. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Dane analizowane za pomocą testów U Manna-Whitneya. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Zastosowanie PyOKR do danych uzyskanych z alternatywnych metod wideookulografii. (A) Aparatura do wirtualnej stymulacji bębna OKR, zgodnie z opisem10. Projektor DLP o długości fali 405 nm jest odbijany przez wypukłe lustro na półkuli, tworząc wirtualny bęben, który otacza pole widzenia zwierzęcia. Ruchy gałek ocznych są mierzone za pomocą kamery NIR umieszczonej na zewnątrz półkuli. Jednokierunkowe i sinusoidalne kraty prętowe są pokazane zwierzęciu z głową w kierunkach pionowych. (B,C) Fazy śledzenia w górę (B) i w dół (C) są identyfikowane i wybierane do analizy ilościowej. Powolne fazy są podświetlone na żółto. (D) Zyski ze śledzenia obliczone z pionowego śledzenia zwierząt typu dzikiego (n=5) przy użyciu metod opisanych tutaj. Obserwuje się asymetryczną zdolność śledzenia, ze znacznym spadkiem śledzenia w dół. (E) Odpowiedź oscylacyjna na bodźce sinusoidalne modelowana w celu ilościowego określenia korzyści ze śledzenia u zwierząt typu dzikiego (n = 8). Powolne fazy są podświetlone na żółto. (F) Kwantyfikacja zysków sinusoidalnych ujawnia zmniejszone zyski podążające w dół w porównaniu ze wzrostami. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Dane analizowane za pomocą testów U Manna-Whitneya. *p<0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy plik kodowania 1: PyOKR Windows Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 2: PyOKR Mac Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.