Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66785

⸱

19 kwietnia 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Streszczenie

Większość modeli in vitro nie jest w stanie w pełni zbadać fenotypów bakteryjnych powstających w wyniku złożonych interakcji obserwowanych w rzeczywistych środowiskach. Jest to szczególnie prawdziwe w kontekście trudnych do leczenia, przewlekłych i wielomikrobiologicznych zakażeń opartych na biofilmie wykrywanych w drogach oddechowych osób żyjących z mukowiscydozą (CF), wielonarządową chorobą genetyczną. Podczas gdy wiele badań mikrobiomu określiło skład mikrobiologiczny wykrywany w drogach oddechowych osób z mukowiscydozą (pwCF), żadne modele in vitro do tej pory nie uwzględniały w pełni krytycznych cech płuc istotnych dla mukowiscydozy. W związku z tym istnieje znaczna luka w wiedzy na temat możliwości badania mechanizmów kierujących patogenezą zakażeń płuc mukowiscydozą mieszanych gatunków. W tym miejscu opisujemy niedawno opracowany model zbiorowiska drobnoustrojów czterogatunkowych, w tym Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis i Prevotella melaninogenica uprawianych w warunkach podobnych do mukowiscydozy. Dzięki zastosowaniu tego systemu zaobserwowano i zbadano klinicznie istotne fenotypy, takie jak oporność kilku patogenów na środki przeciwdrobnoustrojowe. Użyteczność tego modelu in vitro polega na jego ustandaryzowanym przebiegu pracy, który może ułatwić badanie interakcji międzygatunkowych w kontekście przewlekłych infekcji płuc związanych z mukowiscydozą.

Wprowadzenie

Strategie mające na celu wyeliminowanie drobnoustrojów chorobotwórczych, takich jak te wykryte w torkowiscydozie (CF), wielonarządowej chorobie genetycznej, często zawodzą1. Oznacza to, że obecność odpornych zbiorowisk mikrobiologicznych podobnych do biofilmu rosnących w bogatym w śluz środowisku płuc mukowiscydozy może powodować przewlekłe infekcje trwające przez wiele dziesięcioleci2. Ponadto, mimo że zastosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych pierwszego rzutu (Abx) i modulatorów spowodowało poprawę wyników u osób z mukowiscydozą (pwCF), podejście kliniczne "jeden błąd, jedna infekcja" zwykle stosowane przeciwko kanonicznym patogenom mukowiscydozy, takim jak Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, okazało się nieskuteczne w leczeniu trudnych do leczenia zakażeń wykrytych w płucach tych osób3, 4,5,6,7.

W ciągu ostatnich dwóch dekad liczne badania zmieniły nasze rozumienie przewlekłej choroby płuc w mukowiscydozie8. Oznacza to, że raporty wskazują, że infekcje wykryte w drogach oddechowych osoby z pwCF nie są wywoływane wyłącznie przez pojedynczy patogen, ale mają raczej charakter wielodrobnoustrojowy8. Ponadto, chociaż patogeneza zakażeń płuc mukowiscydozą mieszanych gatunków jest nadal słabo poznana, dowody kliniczne wskazują, że pwCF, które są jednocześnie zakażone zarówno S. aureus, jak i P. aeruginosa w swoich drogach oddechowych, pogarszają czynność płuc niż osoby skolonizowane przez którykolwiek z tych dwóch patogenów9.

Przypuszcza się, że interakcje międzygatunkowe między patogenami mukowiscydozy są powodem, dla którego infekcje oparte na biofilmie wielomikrobiologicznym nie są łatwo eliminowane poprzez zastosowanie terapii mukowiscydozy, co ostatecznie wpływa na wyniki pacjentów3. Potwierdzając to, badania in vitro wykazały, że interakcje między drobnoustrojami, takimi jak P. aeruginosa, S. aureus i inne, mogą wpływać na klinicznie istotne fenotypy, takie jak odpowiedź Abx na leki pierwszego rzutu na mukowiscydozę, w tym wankomycynę i tobramycynę6,10,11. W związku z tym nie osiągnięto jeszcze możliwości ponownego przeanalizowania obecnych strategii leczenia mających na celu wyeliminowanie patogenów mukowiscydozy w kontekście zakażeń mieszanych.

Złoty standard w leczeniu zakażeń płuc mukowiscydozą na tle mikrobiologicznym w dużym stopniu opiera się na wykorzystaniu testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) do kierowania interwencjami klinicznymi12. Jednak AST jest zwykle wykonywany przy użyciu monokultur bakteryjnych hodowanych w bogatych i dobrze wymieszanych kulturach, co nie odzwierciedla warunków wzrostu drobnoustrojów wykrytych w drogach oddechowych CF3,13. Biorąc pod uwagę znaczną rozbieżność między wynikami leczenia a sukcesem leczenia, raporty kliniczne opowiadają się obecnie za opracowaniem nowatorskich podejść integrujących krytyczne cechy mukowiscydozy płuc12,14.

Niewiele badań opracowało wielogatunkowe systemy bakteryjne in vitro związane z mukowiscydozą, zawierające więcej niż dwa patogeny15,16. Jednak modele te (1) nie odzwierciedlają w pełni wielomikrobiologicznej i biofilmowej natury płuc z mukowiscydozą oraz (2) nie wykorzystują warunków żywieniowych i środowiskowych zbliżonych do tych wykrytych w drogach oddechowych mukowiscydozy15,16. Dzięki eksploracji dużych zestawów danych genów 16S rRNA pochodzących z płuc mukowiscydozy i obliczeniom, Jean-Pierre i współpracownicy opracowali niedawno model wspólnej hodowli in vitro integrujący wyżej wymienione cechy10. System ten obejmuje P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. i Prevotella spp. uprawiane w warunkach podobnych do mukowiscydozy i stabilne do 14 dni. Autorzy poinformowali również o specyficznym dla społeczności wzroście Prevotella spp. i kilku zmianach w reagowaniu tych patogenów na Abx poprzez mechanizmy, które pozostają do zidentyfikowania10. Ten wykonalny system in vitro dał również możliwość zagłębienia się w mechanistycznie ukierunkowane pytania związane z opornością Abx na powszechny wariant P. aeruginosa, często wykrywany w drogach oddechowych pwCF10. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie społeczności badawczej zajmującej się mukowiscydozą ustandaryzowanego eksperymentalnego przepływu pracy w celu wyhodowania biofilmu in vitro, który może być dalej rozwijany w celu rozwiązania szeregu pytań związanych z mukowiscydozą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły wszystkich odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie sztucznej pożywki z plwociny

UWAGA: W całym tym protokole, sztuczna pożywka do plwociny (ASM) jest definiowana jako pożywka istotna dla CF, zmodyfikowana z SCFM2, wcześniej opublikowanej przez Turnera i współpracowników17. Poniżej znajduje się opis kroków, które należy wykonać, aby przygotować to podłoże. Zobacz tabelę materiałów, aby przygotować roztwory podstawowe i warunki przechowywania. Ta wersja ASM różni się od Turner et al., 17 tym, że pojemność buforowa w oryginalnej wersji nie pozwala na stabilne pH w czasie. Oznacza to, że aktywność fermentacyjna przeprowadzana przez Streptococcus spp. i beztlenowce, takie jak Prevotella spp., powoduje zakwaszenie pożywki wzrostowej (obserwacje niepublikowane). W związku z tym stężenie kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) zostało dostosowane z 10 mM do 100 mM.

UWAGA: Przygotowanie roztworu podstawowego 2x ASM (ASMb) ułatwia dodawanie składników takich jak mucyna, agar, woda itp., bez wpływu na końcowe stężenie cząsteczek obecnych w ASM10,18. 2x ASMb można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni w ciemnym miejscu. Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty, wyrzuć.

  1. Aby przygotować 2x olej bazowy ASM, w czystej zlewce zawierającej 400 ml diH2O, dodać mieszając:
    1. Dodać 6,50 ml 0,2 M NaH2PO4. H2O stado; 6,25 ml 0,2 M Na2HPO4 bulionu; 348 μl 1 M zapasu KNO3; 1,084 ml wywaru 0,25 M K2SO4.
    2. Dodać 4,0 g syntetycznego dropoutu drożdży bez tryptofanu, 3,032 g NaCl, 20,92 g MOPS, 1,116 g KCl i 0,124 g NH4Cl.
    3. Dodać 9,30 ml 1 M bulionu L-mlekowego, 2,70 ml 1,1 M zapasu glukozy, 1,75 ml 1 M CaCl 2,2H 2O, 1,20 ml 0,25 M N-acetyloglukozaminy i 1,00 ml 3,6 mM FeSO4,7H2O.
    4. Dodać 660 μl 0,1 M wywaru tryptofanu; 606 μl 1 M MgCl2,6H 2O wywaru; 0,60 g kwasu dezoksyrybonukleinowego z nasienia śledzia; 400 μl 250 mg/ml zapasu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC).
    5. Po dodaniu wszystkich składników dostosuj pH do 6,80 za pomocą 5 M zapasu NaOH. Uzupełnij do 500 ml z diH2O. Wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  2. Aby przygotować bulion 10 mg/ml (2x) mucyny, użyj czystej szklanej butelki zawierającej 250 ml diH2O i mieszając:
    1. Dodać 5,0 g mucyny z żołądka wieprzowego - Typ II. Mieszać zawiesinę przez 10 minut. Uzupełnij do 500 ml z diH2O.
    2. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Odtworzenie ASM.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu eksperymentu.
    1. Wymieszaj stosunek objętościowy 1:1 2x ASMb i 10 mg/ml mucyny.
    2. Dokładnie wymieszać przed użyciem.

2. Przygotowanie selektywnych pożywek dla społeczności wielomikrobiologicznej

UWAGA: Poniżej znajdują się ilości niezbędne do przygotowania objętości 1 L nośnika.

  1. Aby przygotować agar z solą mannitol (MSA) i agar izolacyjny Pseudomonas (PIA), postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Aby przygotować selektywny agar Prevotella (PSA), w czystej szklanej butelce, dodaj następujące składniki:
    1. 30,0 g bulionu sojowego tryptycznego (TSB). 15,0 g agaru. 5,00 g ekstraktu drożdżowego. 0,50 g chlorowodorku L-cysteiny.
    2. 10,0 ml bulionu heminowego 0,5 mg/ml. 100 μl bulionu 10 mg/ml menadionu.
    3. Dodać 940 ml diH2O i wymieszać. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.
    4. Po schłodzeniu (tzn. butelce można trzymać gołymi rękami) dodać mieszając: 50,0 ml odżelazionej krwi owczej. 2,00 ml zapasu kanamycyny 50 mg/mL. 150 μl bulionu 50 mg/ml wankomycyny. 500 μL bulionu 10 mg/ml polimiksyny B.
  3. Aby przygotować selektywny agar Streptococcus (SSA), w czystej szklanej butelce, dodaj następujące elementy:
    1. 30,0 g TSB. 15,0 g agaru.
    2. Dodać 950 ml diH2O i wymieszać. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.
    3. Po schłodzeniu (tzn. butelkę można trzymać gołymi rękami) dodać mieszając: 50,0 ml odżelazionej krwi owczej. 1,00 ml bulionu 10 mg/ml polimiksyny B. 1,00 ml bulionu 10 mg/ml kwasu oksolinowego.
      UWAGA: Wlej talerze i trzymaj w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1 miesiąc. Przed użyciem pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej do 24 godzin przed ich zaszczepieniem. PSA zostało zwalidowane z P. melaninogenica i Prevotella intermedia. SSA został zwalidowany z S. sanguinis i grupą Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius i Streptococcus anginosus, oznaczane jako SMG). Zdecydowanie zaleca się walidację de novo tych selektywnych pożywek, jeśli mają być testowane nowe szczepy.

3. Przygotowanie płynnych pożywek bakteryjnych i warunki wzrostu

  1. Aby rutynowo uprawiać P. aeruginosa i S. aureus, użyj sterylnego, bogatego podłoża (np. bulionu lizogenicznego (LB) lub TSB).
    1. Rozpocznij płynne noce, zbierając pojedynczą kolonię wcześniej wyhodowaną na płytce agarowej LB/TSB przez 20-24 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Kultury bulionu uprawiać w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 16-18 godzin.
  2. Do uprawy Streptococcus spp. należy użyć sterylnego bulionu Todd Hewitt Bulion uzupełnionego 0,5% ekstraktem drożdżowym (THB-YE).
    1. Rozpocznij płynną hodowlę przez noc z pojedynczej rodziny wyhodowanej wcześniej na płytce agarowej TSB uzupełnionej 5% zdefibrynowaną krwią owczą (płytka z agarem z krwią) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .
    2. Kultury THB-YE należy uprawiać beztlenowo lub w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez noc bez wstrząsania przez 18-22 godziny.
  3. Aby wyhodować Prevotella spp., przygotuj 1 l podłoża wzrostowego Prevotella (PGM), dodając następujące składniki do czystej butelki:
    1. 30,0 g TSB. 5,00 g ekstraktu drożdżowego. 0,50 g chlorowodorku L-cysteiny. 10,0 ml bulionu 0,5 mg/ml heminy i 100 μl 10 mg/ml bulionu menadionu.
    2. Dodać 990 ml diH2O. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min. Zawinąć butelkę w folię aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
    3. Hodować kolonie Prevotella spp. na płytce z agarem z krwią inkubowaną beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    4. Zaszczepić pojedynczą kolonię w PGM i rosnąć przez noc bez wstrząsania w temperaturze 37 °C beztlenowo przez 24 godziny
      UWAGA: PGM można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni. Przed użyciem zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie testów sterylności na każdej pożywce wzrostowej. Jeśli nie korzysta się z komory beztlenowej, może być konieczne rozpoczęcie nocnego podawania płynu Prevotella spp. z płata kolonii.

4. Przygotowanie eksperymentu z kokulturą

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia podsumowany eksperymentalny przebieg pracy. Przygotowanie eksperymentu można przeprowadzić w warunkach tlenowych, jeśli czas przygotowania trwa krócej niż 1 godzina. Jeśli oczekuje się, że potrwa to dłużej, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentu przy użyciu komory beztlenowej (z mieszanką 10% CO2 , 10% H2 i 80% N2 gazu). Słoiki beztlenowe mogą być również używane do inkubacji próbek doświadczalnych.

  1. Przygotowanie monokultur i kokultur
    UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy wirowania przy 10 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. W przypadku kokultur należy wymieszać próbki bakterii tuż przed zaszczepieniem 96-dołkowych płytek. Zazwyczaj objętość 1 ml szczepów P. aeruginosa i S. aureus pobiera się z nocnych kultur. W przypadku Streptococcus spp. i Prevotella spp. objętości w ciągu nocy mogą wahać się od 2 do 4 ml. Objętości te można regulować w zależności od liczby warunków, które mają być testowane.
    1. Używając płynu bakteryjnego z nocnych kultur, wykonaj następujące czynności:
      1. W przypadku szczepów P. aeruginosa i S. aureus przemyć dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      2. W przypadku Streptococcus spp. i Prevotella spp. przemyć raz sterylnym PBS.
        UWAGA: Użyj pipety, aby ostrożnie usunąć supernatanty, ponieważ granulki mogą łatwo zostać utracone.
      3. Po umyciu ponownie zawiesić każdą granulkę w 1 ml 1x rozcieńczonego wodą ASMb.
      4. Rozcieńczyć każdą próbkę w stosunku 1:10 w sterylnym PBS i zmierzyć OD600.
      5. Dostosuj wszystkie kultury do OD600 0,2 w ASM.
      6. Stosując zawiesiny OD600 = 0,2, rozcieńczyć próbki bakteryjne w ASM do końcowego OD600 0,01 (dla każdego drobnoustroju) dla monokultur i kokultur.
      7. Dokładnie wirować przez 5 s.
        UWAGA: Na przykład, aby przygotować łącznie 1 ml zawiesiny ASM monokultury P. aeruginosa o OD600 = 0,01, dodaj 50 μL P. aeruginosa przy OD600 = 0,2 do objętości 950 μL ASM. Do kokultury należy pobrać 50 μl każdej zawiesiny P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. i Prevotella spp. przy OD600 = 0,2 i dodać do 800 μL ASM.
      8. Za pomocą pipety dodać 100 μl zawiesiny monokultury i kokultury do trzech oddzielnych dołków sterylnej plastikowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem.
      9. Inkubować płytkę (bez wytrząsania) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.
        UWAGA: Można tu również stosować inne napięcia tlenowe (np. microxia, normoxia). Model został jednak opracowany i zweryfikowany w warunkach beztlenowych. Potwierdzić inokulację początkową poprzez seryjne rozcieńczanie zawiesin bakterii mono i kokulturowych, a posiewanie na PIA, MSA, SSA i PSA jest zdecydowanie zalecane. Docelowe stężenie wyjściowe dla każdego gatunku bakterii wynosi 1 × 107 jtk/ml (P. aeruginosa), 3,5 × 106 jtk/ml (S. aureus), 1,2 × 106 jtk/ml (Streptococcus spp.) i 4,6 × 106 jtk/ml (Prevotella spp.). Inokulacja bakteryjna może być również modyfikowana, zgodnie z opisem Jean-Pierre i współpracownicy10.
  2. Wymień pożywkę po utworzeniu biofilmu.
    1. Po 24 godzinach inkubacji usunąć nieprzyłączone (planktonowe) komórki przez aspirację za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Uzupełnij wstępnie utworzone biofilmy 100 μl świeżego ASM lub pożądaną obróbką (np. antybiotykami, metabolitami itp.).
    3. Inkubować płytkę przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.
      UWAGA: Te kroki można wykonać tlenowo, jeśli zostaną wykonane szybko (tj. krócej niż 1 minuta). W przeciwnym razie należy użyć komory beztlenowej.

5. Pobieranie i powlekanie próbek

  1. Po dodatkowych 24 godzinach inkubacji odessać nieprzyłączone (planktonowe) komórki za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Frakcja planktonowa może być przechowywana, seryjnie rozcieńczana i powlekana na selektywnych podłożach lub odrzucana.
  2. Delikatnie umyj biofilmy dwukrotnie za pomocą 125 μl sterylnego PBS i wyrzuć objętości.
  3. Dodać 50 μl sterylnego PBS i oderwać biofilmy, delikatnie zeskrobując komórki z płytki za pomocą 96-pinowego replikatora.
  4. Przenieść zawieszone komórki biofilmu do rzędu A nowej sterylnej płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Płytka 96-dołkowa będzie zawierała sterylny PBS w rzędach od B do H.
  5. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie frakcji planktonowej (w razie potrzeby) i biofilmu.
  6. Umieścić 3-5 μl każdej próbki rozcieńczonej na PIA, MSA, SSA i PSA.
  7. Pozostaw miejsca inokulacji do wyschnięcia.

6. Inkubacja selektywnych płytek i liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU)

  1. W przypadku P. aeruginosa i S. aureus inkubować w temperaturze 37 °C przez 18–20 godzin.
  2. W przypadku Streptococcus spp. inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych przez 24 godziny.
  3. W przypadku Prevotella spp. inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych przez 48 godzin.
  4. Po inkubacji policz kolonie (~10-35 na miejsce) i oblicz jtkownik na ml.
  5. Wykreśl dane za pomocą narzędzia do wizualizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak przedstawiono na Rysunku 2, zgłoszono kilka fenotypów, w tym (1) redukcję liczby żywych komórek P. aeruginosa oraz S. aureus w przypadku uprawy w mieszanych społecznościach planktonicznych w porównaniu do monokultury, (2) wzrost polimikrobowego wzrostu komórek S. sanguinis oraz (3) wzrost mieszanej społeczności P. melaninogenica, co zostało wcześniej opisane przez Jeana-Pierre'a i współpracowników10.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Użyteczność tego klinicznie opartego na wiedzy klinicznej systemu kohodowli in vitro polega na jego zdolności do wykrywania funkcji bakterii specyficznych dla drobnoustrojów. Oznacza to, że dzięki wykorzystaniu tego modelu opisaliśmy fenotypy drobnoustrojów, począwszy od specyficznego dla społeczności wzrostu Prevotella spp. (ryc. 2) po zmiany podatności na pierwszą linię CF Abx P. aeruginosa, S. aureus i S. sanguinis (ryc. 3<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak ujawnień.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. George'owi A. O'Toole'owi i Dr. Thomasowi H. Hamptonowi za ich znaczącą rolę w projektowaniu i rozwoju modelu społeczności polimikrobiologicznej in vitro. Dziękujemy dr Sophie Robitaille za jej pomocne komentarze na temat manuskryptu. Praca ta była wspierana przez grant Fundacji Mukowiscydozy JEAN21F0 dla F.J-P. Rysunek 1 manuskryptu został stworzony przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Fisher Scientific NC0387928Przygotować bulion o stężeniu 250 mg/ml w chloroformie bezpośrednio w butelce. Przechowywać w temperaturze -20& C. Stężenie końcowe 200 μ g / ml w 2x bazie ASM.
Kwas 3-morfolinopropan-1-sulfonowy (MOPS)SigmaM1254Stężenie końcowe 200 mM w bazie 2X ASM.
96-pinowy replikatorFisher Scientific05-450-9Można również stosować replikatory jednorazowe. Kot #NC1567338.
96-dołkowa sterylna standardowa płytka z pokrywkąFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2,5 l Prostokątny słoikFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Przygotuj 1 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 3,5 mM w bazie 2x ASM.
Defryryniowana krewDo przygotowania płytek wzrostowych dla Streptococcus i Prevotella.
Kwas dezoksyrybonukleinowy z plemników śledziowychSigmaD7290Stężenie końcowe 1,2 mg/ml w 2x zasada ASM.
FeSO4*7H2O Fisher Scientific AA1449830Przygotuj zapas 1 mg/ml (3,6 mM) w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Przechowywać zawinięte w folię aluminiową. Stężenie końcowe 0,0072 mM w 2x bazie ASM.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlukozaFisher ScientificD16-3Przygotować jako 20% zapas (1,1 M) w wodzie i wysterylizować w autoklawie. Stężenie końcowe 6 mM w 2x bazie ASM.
HeminSigma51280Rozpuścić 100 mg heminy w 2 ml 1 M NaOH, a następnie zwiększyć objętość do 200 ml wodą. Przechowywać w bursztynowej butelce lub zwykłej butelce owiniętej folią aluminiową w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Przygotuj 0,25 M zapas w wodzie i filtruj sterylizuj za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 0,54 mM w bazie 2x ASM.
KanamycynaPrzygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml w wodzie. Filtr sterylizować za pomocą 0,22 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
KClFisher ScientificP217-500Stężenie końcowe 30,0 mM w 2x bazie ASM.
KNO3Fisher ScientificP263-500Przygotuj 1 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 0,70 mM w bazie 2x ASM.
Chlorowodorek L-cysteinyFisher ScientificAAA1038922
Kwas L-mlekowy SigmaL1750Przygotuj 1 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. pH dostosować do 7,0. Stężenie końcowe 18,6 mM w 2x bazie ASM.
L-TryptofanSigmaT0254Przygotuj 0,1 M zapas w 0,2 M NaOH i filtruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 & stopni; C owinięty folią aluminiową. Stężenie końcowe 0,132 mM w bazie 2x ASM.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
MenadioneSigmaM5625Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml rozpuszczony w 96-100% etanolu. Konserwować w temperaturze 4 stopni; C zawinięty w folię aluminiową. Wirować przed użyciem.
MgCl2*6H2O Fisher Scientific AA12288A9Przygotuj 1 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 1,21 mM w 2x baza ASM.
Mucyna z żołądka wieprzowego - Typ II SigmaM2378Przygotuj zapas 10 mg/ml (2x) w wodzie; dokładnie wymieszaj przed autoklawowaniem. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Przygotuj 0,2 M zapasu w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 2,5 mM w 2x baza ASM.
N-acetyloglukozamina SigmaA8625Przygotuj 0,25 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Przechowywać towar w lodówce w temperaturze 4 & st. C. Stężenie końcowe 0,6 mM w 2x bazie ASM.
NaClFisher ScientificS271-500Stężenie końcowe 103,7 mM w bazie 2x ASM.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Przygotuj 0,2 M zapas w wodzie i przefiltruj sterylizację za pomocą 0,22 μ m filtr. Stężenie końcowe 2,6 mM w 2x bazie ASM.
NaOHFisher ScientificS318-500Przygotować 5 M roztwór podstawowy. Służy do regulacji pH 2x oleju bazowego ASM.
NH4ClFisher ScientificA661-500Stężenie końcowe 4,6 mM w bazie 2x ASM.
oksolinowyPrzygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml 0,5 M NaOH. Filtr sterylizować za pomocą 0,22 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Polymixin BPrzygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml w wodzie. Filtr sterylizować za pomocą 0,22 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
Tryptic Soy BulthFisher ScientificDF0370-17-3Przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
WankomycynaPrzygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml w wodzie. Filtr sterylizować za pomocą 0,22 μ m przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Ekstrakt z drożdżyFisher ScientificB11929
Syntetyczny odpad drożdżowy bez tryptofanu SigmaY1876Stężenie końcowe 8,0 mg/ml w 2x bazie ASM.
owcza Kwas

Bibliografia

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Biofilm w mukowiscydoziemodel społeczności mikrobowejmodel in vitroPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusStreptococcus sanguinisPrevotella melaninogenicaoporność na środki przeciwdrobnoustrojoweinterakcje mikrobiomu
Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.