To badanie opisuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i protokół ultradźwięków o niskiej intensywności (FUS), wykorzystujący żywe szczury z cewnikowaniem żyły szyjnej do monitorowania otwarcia bariery krew-mózg (BBB).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie otwarcia bariery krew-mózg u szczurów za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mózg posiada wysoce selektywną półprzepuszczalną barierę krwi, zwaną barierą krew-mózg (BBB), która uniemożliwia dostarczanie terapeutycznych środków makromolekularnych do mózgu. Integracja pulsacyjnego zogniskowanego ultradźwięków (FUS) pod kontrolą MR z wstępnym wstrzyknięciem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnej i nietoksycznej modulacji BBB. Rezonans magnetyczny może zapewnić lepszy kontrast tkanek miękkich i różne oceny ilościowe, takie jak przepuszczalność naczyń krwionośnych, perfuzja i przestrzenno-czasowy rozkład środków kontrastowych MRI. Warto zauważyć, że techniki MRI ze wzmocnieniem kontrastowym ze środkami kontrastowymi MR na bazie gadolinu okazały się złotym standardem w wykrywaniu otworów BBB. Badanie to przedstawia kompleksową metodologię obejmującą protokoły MRI i procedury na zwierzętach do monitorowania otwarcia BBB w modelu szczurzym. Model szczurzy zapewnia dodatkową korzyść w postaci wykorzystania cewnika do żyły szyjnej, co ułatwia szybkie podawanie leków. Przedkliniczny przetwornik FUS sterowany stereotaktycznie ułatwia udoskonalenie i usprawnienie procedur na zwierzętach i protokołów MRI. Uzyskane metody charakteryzują się powtarzalnością i prostotą, eliminując konieczność posiadania specjalistycznej wiedzy chirurgicznej. Badania te mają na celu przyczynienie się do optymalizacji procedur przedklinicznych z wykorzystaniem modeli szczurzych i zachęcenie do dalszych badań nad modulacją bariery krew-mózg w celu wzmocnienia interwencji terapeutycznych w zaburzeniach neurologicznych.
Wprowadzenie
BBB reguluje ruch jonów, molekuł i komórek między naczyniami krwionośnymi a tkankami mózgu1. Funkcja ta pozwala na utrzymanie funkcji i zdrowia neuronów, jednocześnie zapobiegając dostarczaniu terapeutycznych środków makromolekularnych do tkanek mózgowych. Ograniczona przepuszczalność bariery krew-mózg może skutkować zmniejszeniem skuteczności i efektywności leczenia guzów mózgu i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne i choroba Alzheimera2. W związku z tym badano różne podejścia, takie jak dostarczanie wspomagane konwekcją, bezpośrednie wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe, zakłócenia osmotyczne i ulepszone projektowanie leków, aby ominąć barierę krew-mózg w celu kontrolowanego dostarczania środków terapeutycznych3,4,5.
Jednak te podejścia mają wewnętrzne ograniczenia, takie jak inwazyjność, ryzyko infekcji, ryzyko krwotoku, niejednorodność i szybki wypływ leków. Zogniskowane ultradźwięki pulsacyjne (FUS) o niskiej intensywności z wstrzyknięciem mikropęcherzyków są obiecującą nieinwazyjną techniką pozwalającą na miejscowe i odwracalne przerwanie bariery krew-mózg. Mechaniczne efekty ultradźwięków w połączeniu z mikropęcherzykami mogą przejściowo zmienić przepuszczalność BBB (tj. otwarcie BBB)6,7. Dla dalszych postępów w zastosowaniach leczniczych wykorzystujących otwarcie bariery krew-mózg niezbędne są eksperymenty in vivo na małych zwierzętach.
W tym badaniu wprowadziliśmy protokoły MRI i procedury na zwierzętach do monitorowania otwarcia BBB w modelu szczurzym. Protokół zawierał model szczura z cewnikiem do żyły szyjnej kaniulowanym przez organizację komercyjną (patrz tabela materiałów). Szczurzy model cewnikowania żyły szyjnej ma potencjalne korzyści w postaci szybkiego podawania leków, testów monitorowania hemodynamicznego i stabilnego cewnikowania. Otwarcie bariery krew-mózg zostało osiągnięte przy użyciu przedklinicznego systemu FUS. Zaprojektowany specjalnie do otwierania BBB w małych modelach zwierzęcych, takich jak szczury i myszy, system ten zawiera niezbędne komponenty, takie jak system laboratoryjny, komputer sterujący, przetwornik, odgazowywacz wody i towarzyszące akcesoria. Zastosowanie tego stereotaktycznego przedklinicznego systemu FUS nie tylko zwiększa precyzję, ale także usprawnia procedury na zwierzętach i protokoły MRI, przyczyniając się do odtwarzalności i prostoty całego protokołu eksperymentalnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco (UCSF) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W badaniu wykorzystano samce szczurów rasy Sprague-Dawley (200-250 g). Szczury były trzymane i opiekowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Office of Animal Care and Use Guidelines u myszy i szczurów. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
UWAGA: W przypadku procedur wewnętrznych, zwierzęta były transportowane do pomieszczenia przygotowawczego, a procedury były przeprowadzane w następujący sposób:
- Umieść szczury pojedynczo w komorze Lucite i wystawij izofluran (2%-3%) zmieszany z tlenem wyekstrahowanym ze zbiornika tlenu medycznego, aż stracą przytomność (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
UWAGA: Znieczulenie z użyciem izofluranu umożliwia realizację długoterminowego protokołu MRI. - Usuń szczury z komory i zgol włosy z przedniej i tylnej części szyi za pomocą kremu do depilacji (depilacji).
- Nałóż maść nawilżającą na oczy.
- Umieść nos w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie przy spontanicznym oddychaniu (parownik izofluranu między 2%-2,5%, miernik przepływu tlenu do 1-1,5 l/min).
- Umieść znieczulonego szczura na podgrzewanym stole chirurgicznym i potwierdź szczyptą palca.
UWAGA: Protokół MRI zawierał sekwencje ze wzmocnieniem kontrastowym, takie jak obrazowanie echa gradientowego zależnego od T1 i obrazowanie echa spinowego zależnego od T2. Sekwencje te przeprowadzono zarówno przed, jak i po wstrzyknięciu środków kontrastowych na bazie gadolinu () w celu oceny przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB). Polega to na podawaniu środków kontrastowych, gdy szczur znajduje się w skanerze MRI7. Aby ułatwić ten proces, zastosowano rurkę cewnika wystającą z cewnika kaniulowanego u szczura. Przedłużenie obejmowało łącznik cewnika i rurkę polietylenową o długości 30 cm. Aby zapewnić drożność i zapobiec wyciekom, rurkę przedłużającą przepłukano heparynizowanym glicerolem (250 j.m. heparyny/1 ml glicerolu).
2. Stereotaktyczny system ultrasonograficzny
UWAGA: Zwierzęta zostały przeniesione i umieszczone na stole w stereotaktycznym systemie FUS. Nos szczura umieszczono w stożku nosowym w celu utrzymania znieczulenia. System FUS składa się z generatora funkcyjnego, wzmacniacza RF i oscyloskopu. Przed ustawieniem przetwornika upewniliśmy się, że wszystkie urządzenia są prawidłowo połączone z systemem. Konfiguracja przetwornika została zakończona przy użyciu następujących kroków:
- Umieść ostry wskaźnik w pozycji Bregmy w czaszce i zapisz pozycję. Położenie Bregmy można zidentyfikować, wskazując położenie 9,0 mm przed Lambdą na linii środkowej8. Lambda znajduje się w środku linii między obustronnymi błonami bębenkowymi9.
- Umieść żel ultradźwiękowy na głowie szczura, torbie do łączenia wody i przetworniku (częstotliwość 1 MHz). Upewnij się, że między skórą szczura, torbą do łączenia wody i przetwornikiem nie ma pęcherzyków powietrza.
- Podłącz koncentryczny BNC przetwornika do wejścia modułu systemu FUS.
- W komputerze sterującym) Kliknij na załadunek, aby zobaczyć wstępnie zarejestrowane zdjęcia szczurów; Wybiera się szereg punktów ogniskowych i ciśnienia akustycznego.
- W komputerze sterującym) Kliknij test ruchu w module zabiegowym, aby upewnić się, że przetwornik może przełączać się między punktami w okresie serii.
- Ustaw parametry sonikacji opisane w kroku 3.
3. Napar z mikropęcherzyków i sonikacja
- Aktywuj mikropęcherzyk.
UWAGA: Mikropęcherzyk użyty w tym badaniu charakteryzował się średnicą 1,7 μm i stężeniem 0,2 × 109 cząstek na mililitr10. Fiolka z mikropęcherzykami została aktywowana na podstawie instrukcji przepisywania dostarczonych przez sprzedawcę oraz wcześniej opublikowanego raportu11.- Przygotować strzykawkę o pojemności 5 ml z końcówką typu luer lock i wypełnić ją 5 ml 0,9% roztworu chlorku sodu do wstrzykiwań bez dodatków.
- Zdjąć zieloną nasadkę i podłączyć strzykawkę do odpowietrzonego kołka dozującego (patrz Tabela materiałów), przykręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
- Zdjąć osłonę kołka i umieścić ją na środku gumowego korka fiolki. Dociśnij mocno, aż kolec zostanie całkowicie włożony do korka.
- Opróżnij całą strzykawkę o pojemności 5 ml do fiolki, naciskając tłok.
- Potrząsać energicznie fiolką przez 20 sekund, aby wymieszać całą zawartość. Spójna biała, mleczna ciecz pokaże, że utworzyły się mikrosfery lipidowe sześciofluorku siarki.
- Aby uzyskać wymaganą dawkę, należy odwrócić strzykawkę i powoli pobrać zamierzoną objętość zawiesiny do strzykawki o pojemności 5 ml.
- Użyj pompy infuzyjnej.
UWAGA: Metoda infuzji 12 została użyta do dostarczenia mikropęcherzyków szczurom za pomocą pompy strzykawkowej. Strzykawka zawierająca mikropęcherzyki została podłączona do łącznika cewnika wprowadzonego do szczura. Mikropęcherzyki przeprowadzono przez rurki polietylenowe, a natężenie przepływu pompy infuzyjnej ustawiono na 0,66 ml/min. Ta szybkość infuzji pozwala na wstrzyknięcie 2 ml mikropęcherzyków ze strzykawki o pojemności 3 ml w ciągu 3 minut. Wlew rozpoczynał się przed sonikacją przez 1 minutę i trwał przez cały 2-minutowy okres sonikacji. - Wykonaj sonikację.
UWAGA: W tym badaniu impulsy FUS zostały wybrane z następującymi parametrami: (1) Region docelowy: lewy hipokamp; (2) Liczba miejsc: 6 pokrywających hipokamp w mózgu; (3) Długość serii: 10 ms; (4) Okres serii: 1200 ms; (5) Ciśnienie akustyczne: 0,65 MPa; (6) "Tryb zdjęć seryjnych" w menu trybu sonikacji w systemie FUS; (7) Czas sonikacji: 120 s.
4. Procedura MRI z użyciem skanera przedklinicznego 3T
- Po sonikacji przenieś zwierzęta na stół w przedklinicznym skanerze 3T bez kriogenu.
- Ustaw szczury w pozycji leżącej. Utrzymuj temperaturę poduszki grzewczej w skanerze i monitoruj częstość oddechów za pomocą pneumatycznego czujnika poduszkowego. Wykonaj protokół MRI, aby przetestować różne rodzaje obrazowania MR (Tabela 1).
- Uwzględnij inne techniki obrazowania ilościowego, takie jak obrazowanie dyfuzyjne (DWI), mapowanie T2*, mapowanie T1 i dynamiczny rezonans magnetyczny ze wzmocnieniem kontrastowym (DCE), a także MRI ze wzmocnieniem kontrastowym, aby wykazać jego potencjalną praktyczność w różnych badaniach obrazowych. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z protokołami MRI zastosowanymi w tym badaniu.
- Wstrzyknąć środki kontrastowe MRI na bazie (Gadavist, 1 mmol/kg) po sekwencji echa gradientowego MR ważonej T1 i uzyskać obrazy po.
UWAGA: W przypadku szczura o wadze 200 g wstrzyknęliśmy 200 μl środka kontrastowego do rezonansu magnetycznego, a następnie 200 μl roztworu soli fizjologicznej, aby przepłukać rurkę.
5. Makroskopowe badanie mózgu szczura
UWAGA: Po skanowaniu MRI, wstrzyknięto 2 ml niebieskiego roztworu Evansa (2% rozcieńczonego solą fizjologiczną buforowaną fosforanem), a szczurowi pozwolono odpocząć przez co najmniej 30 minut, aby roztwór mógł się rozprzestrzenić i krążyć po całym ciele. Następnie szczury zostały poddane eutanazji przy użyciu przedawkowania izofluranu (5%) w celu makroskopowego badania mózgu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Aby potwierdzić eutanazję, konieczne było uderzenie palcami u nóg i zaobserwowano, że zwierzę ustaje w oddychaniu przez co najmniej 1 minutę. Przeprowadzono procedurę perfuzji, a następnie badanie mózgu szczura. Procedura perfuzji jest podsumowana w następujący sposób:
- Wykonaj torakotomię za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić narządy w klatce piersiowej i uwidocznić obszar serca.
- Naciąć (~5 mm) prawe przedsionek.
- Wprowadzić roztwór soli fizjologicznej do lewej komory w celu perfuzji.
- Otwórz kość czaszki nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić i zaprezentować mózg.
UWAGA: Odpowiednia perfuzja powinna skutkować jednolicie jasnym wyglądem mózgu, podczas gdy utrzymujące się niebieskie obszary wskazują na wyciek albuminy związany z BBB, jak wykryto w kolorze niebieskim Evansa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejsza praca przedstawia protokół przedkliniczny monitorowania otwierania BHE w modelu szczura z wykorzystaniem komercyjnego systemu FUS dla zwierząt. System FUS został ustawiony na stole laboratoryjnym lub dużym wózku transportowym (Rysunek 1). Szczury znieczulono izofluranem zmieszanym z tlenem za pomocą maski nosowej w ramie z uchwytem przetwornika. W celu wykrywania kawitacji akustycznej do przetwornika FUS o częstotliwości rezonansowej 1,0 MHz wprowadzono hydrofon rezonujący przy 500...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowano protokół i procedurę na zwierzętach wykorzystującą szczurzy model cewnikowania żyły szyjnej do badań otwarcia BBB. Chociaż istnieje wiele protokołów przedklinicznych, protokół ten obejmuje dostępny na rynku system FUS i model szczura, minimalizując procedury przygotowania zwierząt, a tym samym zapewniając odtwarzalność eksperymentalną.
W tym protokole wybór mikropęcherzyków opierał się na jego stabilności i przechowywaniu w temperaturze pokojowej. Inne komercyjne mikropęcherzyki mog...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania istotnych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie było częściowo wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Grant K99DE032397, UCSF Department Seed Grant (nr 7504831), UCSF RAP grant (kierownik: Kazim Narsinh, MD) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (DFG, GA 3535/1-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1 ml | BD plastipak | ||
| 20 mL, Chlorek sodu 0,9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| Strzykawka 3 ml | BD plastipak | ||
| Strzykawka 5 ml | BD plastipak | ||
| igła, 21 G | Technologie infuzyjne SAI | B21-50 | |
| Łącznik cewnika, 21 G | SAI infuzja technologie | CC-25-25 | |
| Rozwiązanie do blokady cewnika | Technologie infuzji SAI | SKU # HGS-10 | (500 &mikro;/mL) Glicerol |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Izrael | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE Waporyzator izofluranu | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Pompa strzykawkowa | Inovenso | IPS-12 | |
| izofluran USP | Vet jeden | 501017 | |
| mikrobatut Lumason | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| Samce szczurów Sprague-Dawley (200– 250 g) | Igła Charles River Laboratories | ||
| , 18 G | BD Precisionglide | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Rurka polietylenowa | BD Intramedic | ||
| Przedkliniczny 3T bezkriogeniczny skaner Bruker Biospin | Bruker | Biospec3T | |
| Szczur z cewnikowaniem żyły szyjnej | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 zogniskowany przetwornik ultradźwiękowy | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| Stacjonarny system ultrasonograficzny RK-50 | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, USA | ||
| Wentylowany trzpień dozujący | B Braun | 4550560 |
Bibliografia
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
