Ten protokół przedstawia przystępny przewodnik do zbierania, przechowywania i rozmrażania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, odpowiedni do dalszych analiz i procesów takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Zademonstrowano również kolekcje płaszczy plazmowych i buffy.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i kriokonserwacja wysoce żywotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej: przewodnik dla początkujących
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są powszechnie używane w badaniach biomedycznych nad układem odpornościowym i jego reakcją na choroby i patogeny. Ten szczegółowy protokół opisuje sprzęt, materiały eksploatacyjne i etapy izolacji, kriokonserwacji i rozmrażania wysokiej jakości i wysoce żywotnych PBMC z całych komórek krwi, odpowiednich do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Opisano również protokoły przetwarzania osocza i kożucha z krwi pełnej równolegle i równocześnie z PBMC. Temu łatwemu do naśladowania protokołowi krok po kroku, który wykorzystuje wirowanie w gradiencie gęstości do izolowania PBMC, towarzyszy lista kontrolna materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i etapów przygotowania. Protokół ten jest odpowiedni dla osób z wcześniejszym doświadczeniem z technikami laboratoryjnymi i może być stosowany w laboratoriach klinicznych lub badawczych. Wysokiej jakości żywotność komórek i sekwencjonowanie RNA wynikało z PBMC pobranych przez operatorów bez wcześniejszego doświadczenia laboratoryjnego przy użyciu tego protokołu.
Wprowadzenie
Ten protokół demonstruje przystępną metodę i przebieg pracy do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej. Protokół ten jest szczególnie skierowany do początkujących techników badawczych, studentów i personelu laboratoriów klinicznych w celu ułatwienia pobierania i kriokonserwacji PBMC bez wcześniejszego szkolenia w zakresie technik laboratoryjnych.
Ten protokół wykorzystuje wirowanie do oddzielania składników krwi pełnej według gęstości. Krew pełna składa się z czterech głównych składników wymienionych w kolejności malejącej gęstości: czerwone krwinki/erytrocyty (~45% objętości), białe krwinki (<1% objętości), płytki krwi (<1% objętości) i osocze (~55% objętości)1,2,3,4,5,6. Białe krwinki można podzielić na dwie kategorie w zależności od charakterystyki ich jąder: okrągłe lub wielojądrowe6. PBMC są definiowane jako białe krwinki z okrągłymi jądrami i składają się z następujących typów komórek: limfocyty (limfocyty T, limfocyty B, komórki NK), komórki dendrytyczne i monocyty6. Wielojądrkowe białe krwinki obejmują granulocyty, które składają się z następujących typów komórek: neutrofile, bazofile i eozynofile6. Wielojądrowe białe krwinki są gęstsze niż PBMCs6. Gęstość każdego składnika krwi pełnej jest wyszczególniona w Tabeli 1.
W tym protokole, pełna krew jest zbierana w probówkach wirujących z gradientem gęstości. Probówki te zawierają wstępnie upakowane podłoże o gradiencie gęstości o gęstości 1,077 g/ml. Po odwirowaniu gęstsze komórki, w tym wielojądrzaste białe krwinki i erytrocyty, są oddzielane od PBMC i płytek krwi za pomocą pożywki gradientu gęstości (Rysunek 1A) < sup class = "xref" >6,< sup class = "xref">7. PBMC i frakcja płytek krwi są następnie zbierane, przemywane i odwirowywane w celu usunięcia płytek krwi. Powstałe w ten sposób oczyszczone PBMC są zbierane i przechowywane w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie. Kriokonserwowane PBMC mogą być realnie rozmrażane i bezpośrednio wykorzystywane w dalszych analizach lub dodatkowo przetwarzane w celu wyizolowania określonych typów komórek składowych.
Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem wysokiej jakości sekwencjonowania RNA z wysoce żywotnych PBMC. W tym artykule PBMC zostały wyizolowane i kriokonserwowane od pacjentów w przychodni. Następnie monocyty wyizolowano z PBMC za pomocą FACS i przeanalizowano za pomocą sekwencjonowania RNA. Protokół można jednak szeroko dostosować do innych potrzeb eksperymentalnych, takich jak hodowla komórek, edycja genów, badania funkcjonalne ex-vivo, analizy pojedynczych komórek, fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej lub cytometrii według czasu lotu, izolacja DNA/RNA lub białek, preparaty immunohistochemiczne, między innymi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.
Oprócz zbierania PBMC z probówek wirujących z gradientem gęstości, ten protokół omawia, jak zbierać osocze i kożuchy za pomocą wirowania za pomocą probówki EDTA. Po odwirowaniu krew pełna jest rozdzielana na osocze, erytrocyty i cienką warstwę interfejsu zwaną kożuchem zawierającą leukocyty ( Rysunek 1B) < sup class = "xref">6. Płaszcz kożuchowy jest powszechnie używany do ekstrakcji DNA i późniejszych analiz genomicznych19,20. Warstwa osocza zawiera bezkomórkowe składniki krwi pełnej i może być używana do testów biomarkerów21,22.
Protokół
Protokół badania został zatwierdzony przez Program Ochrony Człowieka UCSD i KUMC i jest zgodny z Deklaracją Helsińską. Wszystkie osoby wyraziły świadomą zgodę na udział w badaniu i pobranie krwi.
1. Przetwarzanie i kriokonserwacja PBMC
- Na dzień przed pobraniem krwi należy wydrukować listę kontrolną materiałów i odczynników wymienionych w tabeli 2 oraz odpowiednio przygotować i oznaczyć odpowiednią etykietę.
UWAGA: Ten protokół został opracowany do zbierania 6 probówek wirujących z gradientem gęstości. Każda probówka daje około 12 milionów PBMC, z których około 50% i 20% będą stanowić odpowiednio żywe limfocyty i monocyty. Skaluj odpowiednio do potrzeb eksperymentalnych. Należy pamiętać, że bezwzględna liczba komórek może się znacznie różnić w zależności od pacjenta lub stanu leczenia. - Stosując standardową technikę flebotomii, zbierz krew pełną w 6 probówkach wirowych z gradientem gęstości i 1 probówce EDTA do napełnienia, około 6 ml objętości.
UWAGA: Jeśli wymagane są próbki od wielu pacjentów lub warunki leczenia, pobrane probówki mogą być przechowywane do 4 godzin, a następnie przetwarzane jednocześnie. - Po zebraniu odwirować wszystkie probówki o sile 1 800 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Zapoznaj się z dodatkowym filmem 1, aby zapoznać się z demonstracją obsługi wirówki. - Po odwirowaniu ostrożnie otwórz probówkę wirówkową z gradientem gęstości. Za pomocą pipety transferowej usunąć i wyrzucić półprzezroczystą żółtą warstwę zawierającą osocze. Nie należy naruszać zamglonej warstwy komórek bezpośrednio nad podłożem o gradiencie gęstości. Zachowaj ostrożność, pozostawiając nadmiar osocza, zamiast wyrzucać PBMC. Powtórz dla wszystkich tubes.
UWAGA: Po odwirowaniu probówki zawierającej ośrodek gradientu gęstości, osocze i PBMC znajdą się powyżej ośrodka o gradiencie gęstości; Erytrocyty i granulocyty osiądą na dnie. Zapoznaj się z Rysunek 1A dla wizualizacji. - Za pomocą nowej pipety transferowej delikatnie odpipetować pozostałą objętość zawierającą komórki i resztki osocza w każdej probówce w górę i w dół, kilkakrotnie powyżej pożywki o gradinie gęstości.
- Po ponownym wymieszaniu odpipetować zawieszoną zawartość probówki do oznaczonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz dla wszystkich probówek.
- Wlej roztwór 1 (pożywka RPMI) do probówki o pojemności 50 ml, aż osiągnie linię o pojemności 50 ml.
- W razie potrzeby powtórz kroki od 1.4 do 1.7 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
UWAGA: Upewnij się, że różne próbki nie są mieszane i użyj nowej pipety transferowej, aby uniknąć zanieczyszczenia. - Odwirować probówkę o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: W tym czasie można wypełnić protokół pobierania osocza i buffy wyszczególniony w sekcji 2. - Odrzucić jak najwięcej supernatantu. Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli.
UWAGA: Po odwirowaniu osad zawiera PBMC, a supernatant zawiera płytki krwi i resztki osocza. - Wlać 15 ml probówkę roztworu 2 (pożywka RPMI + 12,5% albuminy surowicy ludzkiej + 1 μM flawopirydolu) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad PBMC. Delikatnie odwróć rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
- Odessać 15 ml roztworu 3 (pożywka RPMI + 11,25% albuminy surowicy ludzkiej + 1 μM flawopirydolu + 10% DMSO) za pomocą pipety transferowej. Dodawać kroplami do probówki o pojemności 50 ml.
UWAGA: Roztwór 3 zawiera DMSO, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej. Nie dodawaj roztworu 3, dopóki nie będzie gotowy do natychmiastowego przetworzenia. - Delikatnie odwróć probówkę 3 razy, aby wymieszać.
- Napełnij każdy wstępnie oznakowany i schłodzony kriowial 1 ml PBMC za pomocą pipety wielodozownikowej.
UWAGA: Zapoznaj się z filmem uzupełniającym 2, aby zapoznać się z instrukcją obsługi pipety wielodozownikowej. - Umieść kriowiale w wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Następnie przenieś pojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
- W razie potrzeby powtórz kroki od 1,9 do 1,13 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
- Przechowuj kriowiale w pojemniku do zamrażania przez co najmniej 12 godzin, a następnie przenieś je do oznaczonego pudełka do przechowywania w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Alternatywnie, przenieś zamrożone kriowiale do ciekłego azotu (<-135 °C) w celu długotrwałego przechowywania.
2. Przetwarzanie plazmy i kożucha z probówek EDTA
- Wirować przy 1.800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Po odwirowaniu górna warstwa składa się z osocza, dolna zawiera erytrocyty, a interfejsem będzie kożuchowy płaszcz. Zobacz wizualizację Rysunek 1B. - Za pomocą nowej pipety transferowej pobrać jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy kożuchowca. Następnie dozować 0,5 ml porcji do wstępnie znakowanych kriowialiów. Odessać warstwę kożucha i przenieść ją do odpowiednio oznakowanego cryovial.
UWAGA: Niektóre osocze i erytrocyty mogą zanieczyścić kolekcję kożucha kożuchowego. - W razie potrzeby powtórz krok 2.2 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
- Po zebraniu przechowuj kriowiale w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
UWAGA: Alternatywnie przechowywać w ciekłym azocie (<-135 °C) do długotrwałego przechowywania.
3. Rozmrażanie PBMC
- Na dzień przed rozmrożeniem wydrukuj listę kontrolną materiałów i odczynników wymienionych w tabeli 3 i przygotuj i odpowiednio oznacz.
UWAGA: Ten protokół został opracowany do rozmrażania 1 1,5 ml probówki zawierającej 1 ml PBMC. Każda probówka daje około 2 miliony PBMC, z których około 50% i 20% będą stanowić odpowiednio żywe limfocyty i monocyty. Skaluj odpowiednio do potrzeb eksperymentalnych. Należy pamiętać, że bezwzględna liczba komórek może się znacznie różnić w zależności od pacjenta lub stanu leczenia. - Zamrożone PBMC przenieść z magazynu za pomocą suchego lodu i rozmrozić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty lub tuż przed ostatnim rozmrożeniem kryształków lodu.
UWAGA: W razie potrzeby można pobrać podwielokrotność do zliczania komórek i pomiarów żywotności, jak opisano w sekcji 4. - Po rozmrożeniu dodać 1 ml roztworu 4 (PBS + 2 mM EDTA) do każdego kriowialu. Następnie wlej zawartość do wstępnie oznakowanej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml roztworu 4 na każdą rozmrożoną probówkę PBMC. Stuknij, aby usunąć resztki kropli.
- Umieść sitko na pustej probówce o pojemności 50 ml, a następnie przelej zawiesinę komórek przez sitko do komórek.
UWAGA: W razie potrzeby lekko stuknij, aby złamać napięcie powierzchniowe. - Odwirować każdą probówkę zawierającą odcedzone komórki o masie 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Po odwirowaniu wylać supernatant zawierający DMSO. Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli.
- Zawiesić osad komórkowy w żądanym podłożu odpowiednim dla dalszych potrzeb doświadczalnych (np. pożywka do hodowli komórkowych, koktajl przeciwciał cytometrii przepływowej itp.).
4. Liczenie komórek i żywotność
- Natychmiast po rozmrożeniu zamrożonych PBMC w kroku 3.2 należy odpipetować 20 μl komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj równą objętość 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-4 razy, aby wymieszać.
- Korzystając z automatycznego licznika komórek, postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby policzyć komórki i ocenić żywotność. Upewnij się, że uwzględniony jest współczynnik rozcieńczenia wynoszący 2.
UWAGA: Jak opisano w innym miejscu, hemocytometr może być używany jako alternatywna metoda oceny liczby komórek i żywotności23.
Wyniki
Po pobraniu i kriokonserwacji PBMC, żywotność rozmrożonych PBMC, monocytów i limfocytów z 56 unikalnych próbek oceniono metodą cytometry la przepływowej z użyciem odczynników wymienionych w Tabeli 4 zgodnie z instrukcjami producentów (Rysunek 2A-F). Osiągnięto średnią żywotność (± SD) PBMC, monocytów i limfocytów wynoszącą odpowiednio 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% i 93 ± 5,6% (Rysunek 2G). Pomiar żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu dał średnią żywotność na poziomie 88 ± 7,5% oraz liczbę komórek 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Analiza cytometry la przepływowa wykazała również, że żywe monocyty stanowiły 17 ± 5,9%, a limfocyty 53 ± 13,0% całkowitej liczby PBMC.
Następnie monocyty oddzielono za pomocą cytometrii przepływowej z rozmrożonych PBMC z 59 unikalnych próbek, a następnie poddano je przygotowaniu bibliotek i sekwencjonowaniu RNA zgodnie z opisem zawartym w innej publikacji24. Osiągnięto średnią liczbę sekwencji (średnia ± SD) wynoszącą 18,0 ± 16,3 mln, przy dopasowaniu odczytów na poziomie 93 ± 6,3% i zawartości GC wynoszącej 49,6 ± 1,4% (Rysunek 3A-B). W podzbiorze 56 unikalnych próbek stwierdzono średni procent unikalnie zmapowanych odczytów (średnia ± SD) wynoszący 88 ± 3,6%. Parametry te dowodzą, że stosując niniejszy protokół, operatorzy o dowolnym stopniu przeszkolenia laboratoryjnego mogą uzyskać wysoką żywotność PBMC odpowiednich do dalszych zastosowań, w tym do wysokojakościowego sekwencjonowania RNA.
| Komponent | Gęstość | Cytowanie |
| Osocze | 1,022 g/ml do 1,026 g/ml | 1 |
| Płytki krwi | <1,061 g/ml do >1,070 g/mL | 2 |
| monocyty i limfocyty krwi obwodowej | <1,077 g/ml | 6 |
| Neutrofile o niskiej gęstości | <1,077 g/ml | 3 |
| Granulocyty (neutrofile*, bazofile i eozynofile) | >1,077 g/mL | 6 |
| Erytrocyty | 1,11 g/ml | 4 |
Tabela 1: Składniki krwi pełnej wymienione w kolejności malejącej gęstości.
| Odczynnik/Materiał | Ilość (na 6 probówek CPT i 1 probówkę EDTA) | Wskazówki | Ostrzeżenia | ||||||
| Probówki CPT | 6 | Oznaczyć zgodnie z identyfikatorem pacjenta lub próbki. | |||||||
| Probówka EDTA | 1 | Oznaczyć zgodnie z identyfikatorem pacjenta lub próbki. | |||||||
| Probówka stożkowa 50 mL | 2 | Oprócz identyfikatora pacjenta lub próbki, oznaczyć jedną probówkę na PBMC i jedną na odpady. | |||||||
| Krioprobówki | 39 | Oznaczyć 30 na PBMC, 8 na osocze EDTA i 1 na warstwę leukocytarną (buffy coat). Nie wszystkie krioprobówki mogą zostać wykorzystane. | |||||||
| Mr. Frosty | 2 | Wypełnić izopropanolem do połowy i schłodzić przez noc w temperaturze -20°C. | Izopropanol jest łatwopalnym czynnikiem drażniącym. Przechowywać z dala od iskier i otwartego ognia. Unikać wdychania; używać rękawic i zachować ostrożność. | ||||||
| Flavopiridol | 100 µL roztworu stokowego 1000X | Aby przygotować roztwór stokowy flavopiridolu 1000X, zawiesić 5 mg flavopiridolu w 1,14 mL DMSO, aby uzyskać stężenie 10 mM. Odmierzyć alikwoty po 200 µL do oddzielnych pojemników, a następnie zamrozić. W celu użycia rozmrozić poszczególne alikwoty i rozcieńczyć 1:10 w destylowanej wodzie wolnej od DNazy/RNazy, a następnie stosować jako roztwór 1000X. | Flavopiridol jest czynnikiem drażniącym. Używać rękawic i zachować ostrożność. | ||||||
| Roztwór 1 | 50 mL | Pożywka RPMI. Aby przygotować 50 mL roztworu stokowego, użyć 50 mL pożywki RPMI. | |||||||
| Roztwór 2 | 15 mL | Pożywka RPMI + 12,5% ludzkiej albuminy surowiczej + 1 µM flavopiridolu. Aby przygotować 50 mL roztworu stokowego, użyć 25 mL pożywki RPMI + 25 mL ludzkiej albuminy surowiczej + 50 µL flavopiridolu 1000X. | Flavopiridol jest czynnikiem drażniącym. Używać rękawic i zachować ostrożność. | ||||||
| Roztwór 3 | 15 mL | Pożywka RPMI + 11,25% ludzkiej albuminy surowiczej + 1 µM flavopiridolu + 10% DMSO. Aby przygotować 50 mL roztworu stokowego, użyć 22,5 mL pożywki RPMI + 22,5 mL HSA + 5 mL DMSO + 50 µL flavopiridolu 1000X. | Flavopiridol jest czynnikiem drażniącym, a DMSO jest toksyczny i łatwo wchłania się przez skórę. Używać rękawic i zachować ostrożność. | ||||||
Tabela 2: Lista kontrolna odczynników i materiałów do przygotowania i oznakowania w celu pobierania i kriokonserwacji PBMC.
| Odczynniki/Materiały | Ilość (na 1 ml alikwotu zamrożonych PBMC) | Wskazówka | Ostrzeżenia dotyczące bezpieczeństwa | |
| Roztwór 4 | 10 ml | PBS + 2 mM EDTA Aby przygotować 50 ml roztworu zapasu, należy użyć 5 ml 10X PBS + 200 µL 0,5 M EDTA + 44,8 ml destylowanej wody wolnej od DNaz/RNaz | ||
| probówka stożkowa 50 ml | 3 | Oprócz identyfikatora pacjenta lub próbki, należy opisać trzy probówki: jedną dla PBMC przed filtrowaniem, jedną dla PBMC po filtrowaniu oraz jedną na odpady. Probówkę przeznaczoną dla PBMC przed filtrowaniem należy napełnić roztworem 4 w ilości 9 ml na każdy 1 ml zamrożonych PBMC. | ||
| probówka 1,5 ml | 1 | Do liczenia komórek; oznaczyć identyfikatorem pacjenta lub próbki | ||
| 0,4% roztwór błękitu trypanu | 20 µL | Do zliczania komórek; można dodać do probówki 1,5 ml z wyprzedzeniem w dniu poprzedzającym. | Błękit trypanu jest kancerogenem. Należy z nim obchodzić się ostrożnie i w rękawiczkach. | |
Tabela 3: Lista kontrolna odczynników i materiałów do przygotowania i oznakowania w celu rozmrożenia i policzenia PBMC.
| Odczynniki/Materiały | Ilość (na milion komórek) |
| Barwienie żywe-martwe | 5 μL |
| Ludzki Trustain FcX | 5 μL |
| Przeciwciało anty-CD3 | 5 μL |
| Przeciwciało anty-CD19 | 5 μL |
| Przeciwciało anty-CD56 | 5 μL |
| Przeciwciało CD66b | 5 μL |
| Przeciwciało przeciwko HLA-DR | 5 μL |
| Przeciwciało przeciwko CD14 | 5 μL |
| Przeciwciało przeciwko CD16 | 2.5 μL |
| RNAsin | 100 jednostek |
Tabela 4: Tabela odczynników do izolacji monocytów z PBMC za pomocą cytometrii przepływowej.
Rysunek 1: Składniki krwi pełnej po rozdzieleniu przez wirowanie w gradiencie gęstości lub w probówkach z EDTA. (A) Wirowanie krwi pełnej w probówkach do wirowania w gradiencie gęstości prowadzi do oddzielenia osocza, płytek krwi i PBMC nad medium gradientu gęstości oraz komórek wielojądrowych i erytrocytów poniżej medium gradientu gęstości. (B) Wirowanie krwi pełnej w probówkach z EDTA prowadzi do oddzielenia osocza w najwyższej warstwie, erytrocytów w warstwie dolnej oraz warstwy leukocytarnej (buffy coat) na styku tych warstw. Stworzono za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Żywotność rozmrożonych kriozachowanych PBMC oceniono za pomocą barwienia żywe/martwe i cytometrii przepływowej. (A) Odpady, oznaczone gwiazdką *, są wykluczane z PBMC poprzez bramkowanie rozproszonego światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). (B) Reprezentatywna analiza żywotności (żywe/martwe) wszystkich PBMC (C) Pan-monocyty są bramkowane jako HLA-DR pozytywne i negatywne dla następujących znakowanych FITC antygenów powierzchniowych: CD3, CD19, CD56 i CD66b. (D) Reprezentatywna analiza żywotności (żywe/martwe) monocytów. (E) Limfocyty bramkowane za pomocą następujących znakowanych FITC antygenów powierzchniowych: CD3, CD19, CD56 i CD 66b. (F) Reprezentatywna analiza żywotności (żywe/martwe) limfocytów. (G) Procent żywotności każdego typu komórek określony na podstawie 56 próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Jakość sekwencjonowania RNA monocytów wyizolowanych z kriokonserwowanych PBMC. Zsekwencjonowano 56 unikalnych próbek, generując średnio 18,0 ± 16,3 mln (± SD) całkowitych sekwencji. (A) Odnotowano wysoki stopień dopasowania, przy czym 92,5% ± 6,3% sekwencji dopasowano do genomu referencyjnego. (B) Zawartość GC w tych sekwencjach wynosiła 49,6 ± 1,4%. Utworzono za pomocą FastQC25. Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.
Wideo uzupełniające 1: Instruktaż obsługi wirówki Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Wideo uzupełniające 2: Demonstracja obsługi pipety wielokanałowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Ten protokół pobierania i kriokonserwacji PBMC został z powodzeniem wdrożony przez osoby z wcześniejszym przeszkoleniem w laboratoriach badawczych i bez niego. W naszej aplikacji sekwencjonowanie FACS i RNA wysoce żywotnych monocytów oczyszczonych z przechowywanych PBMC zaowocowało uzyskaniem sekwencji wysokiej jakości.
Główną zaletą tego protokołu jest jego dostępność. Technika przedstawiona w protokole wykorzystuje probówki wstępnie wypełnione medium gradientowym o stałej gęstości. W rezultacie krew pełna może zostać pobrana bezpośrednio do probówki, a następnie natychmiast przetworzona w celu wyizolowania PBMC. Potrzebna jest stosunkowo niewielka liczba gotowych roztworów i specjalistycznego sprzętu, ułatwiająca współpracę między laboratorium badawczym, w którym mogą być przygotowywane odczynniki, a laboratorium klinicznym, w którym pobierane i przetwarzane są próbki. Protokoły pisemne i wideo są dostosowane do operatorów na każdym poziomie szkolenia.
Chociaż protokół ten wykorzystuje świeżą krew pełną do izolacji PBMC, a zatem ma stosunkowo wysoką oczekiwaną wydajność i czystość >90%, może nie być odpowiedni do zastosowań wymagających wyjątkowo wysokiej czystości >98%26,27. Co więcej, probówki do wirowania w gradiencie gęstości mogą być kosztowne do uzyskania, zwłaszcza jeśli konieczne jest pobranie dużej liczby próbek.
Alternatywne metody zbierania PBMC obejmują zastosowanie pożywki o gradiencie gęstości cieczy lub zubożenie immunomagnetyczne28,29. Krótko mówiąc, pierwsza z nich polega na nałożeniu warstw wcześniej przygotowanego podłoża o gradiencie gęstości pod heparynizowaną krwią pełną, a następnie odwirowaniu. Ten ostatni wykorzystuje znakowane magnetycznie przeciwciała do znakowania przeciwciał innych niż PBMC, które są następnie zatrzymywane w kolumnie magnetycznej, podczas gdy nieznakowane PBMC przechodzą bez zmian.
W porównaniu z przedstawionym protokołem, zastosowanie pożywki o gradiencie gęstości cieczy jest zarówno mniej kosztowne, jak i wymaga znacznie mniejszej ilości materiału ze względu na brak probówek wirujących z gradientem gęstości; Izolację PBMC można wykonać w standardowej probówce o pojemności 50 ml8. Jednak ta technika jest bardziej skomplikowana, ma dłuższy czas przetwarzania i może być obarczona większym ryzykiem błędu użytkownika. Heparyna musi być precyzyjnie dodana, aby uniknąć nadmiernego rozcieńczenia, a podłoże o gradiencie gęstości musi być starannie ułożone warstwami w odpowiednich ilościach, aby zapewnić dobrą separację PBMC26.
W porównaniu z przedstawionym protokołem, zastosowanie zubożenia immunomagnetycznego zapewnia wyższą wydajność i czystość, ograniczoną obsługę z powodu braku wirowania, szybszy czas przetwarzania i wymaga znacznie mniejszej ilości materiału 30,31,32. Jednak głównym minusem jest to, że ta metoda jest najdroższa z trzech opisanych metod, zwłaszcza na dużą skalę.
Chociaż ten protokół jest solidny, niektóre krytyczne kroki mogą wymagać dodatkowej uwagi. W całym protokole upewnij się, że próbki nie są mieszane i są umieszczane w odpowiednio oznakowanych probówkach, zwłaszcza podczas jednoczesnej pracy z wieloma pacjentami lub stanami. W kroku 1.4 upewnij się, że żadne PBMC nie zostały odrzucone; nadmiar osocza zmniejszy jedynie stężenie PBMC, co jest mniej krytyczne dla utrzymania żywotności i jakości próbki. Niezależnie od tego, obecność osadów w zebranych PBMC sugeruje, że fragmenty ośrodka gradientu gęstości zostały przemieszczone. Delikatnie pipetuj w kroku 1.5, aby zapobiec temu problemowi. W krokach 1.10 i 3.6 upewnij się, że odwirowane osady komórkowe nie zostały wyrzucone. Szybka praca ma kluczowe znaczenie dla kroków 1.12 i 3.3, ponieważ roztwór 3 zawiera DMSO, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej33. Należy również zauważyć, że przechowywanie PBMC w ciekłym azocie jest zalecane zamiast przechowywania w temperaturze -80°C. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze -80°C wiąże się ze zmniejszoną żywotnością komórek i zmienioną ekspresją genów34,35.
Protokół ten może być dostosowywany do potrzeb eksperymentalnych. Dodanie flawopirydolu, inhibitora polimerazy RNA i syntezy mRNA, do roztworów 2 i 3 ma na celu zapobieżenie wszelkim artefaktom wywołanym przez obchodzenie się i stres z sekwencjonowaniem RNA36. Flawopirydol można jednak pominąć, jeśli pożądane są badania funkcjonalne lub badania ex vivo z wykorzystaniem PBMC.
Osocze pobrane z probówek EDTA zostanie zanieczyszczone EDTA, czynnikiem chelatującym. W rezultacie osocze EDTA nie nadaje się do oznaczania obejmującego krzepnięcie lub jony wapnia37,38. W razie potrzeby warstwa plazmy w probówkach z gradientem gęstości po odwirowaniu może zostać zebrana w kroku 1.4. Probówki te zawierają heparynę sodową jako antykoagulant, który można usunąć z dodatkiem heparynazy39. Warto zauważyć, że heparyna hamuje odwrotną transkryptazę i amplifikację PCR, co sprawia, że pobrane osocze nie nadaje się do eksperymentów PCR bez dodatku środka blokującego heparynę40.
Zebrana kożuchowa sierść z probówek EDTA nie jest przechowywana w roztworze zawierającym DMSO lub flawopirydol. DMSO jest ważne w zmniejszaniu tworzenia się kryształków lodu i śmierci komórek41. Flawopirydol jest ważny dla hamowania syntezy RNA36. W związku z tym kożuchowa sierść nie nadaje się do analiz ex vivo i transkryptomicznych. W razie potrzeby kroki od 1,6 do 1,15 można wykonać przy użyciu zebranego płaszcza kożuchowego w celu maksymalizacji żywotności komórek i zahamowania syntezy RNA.
Chociaż protokół ten został opracowany do sekwencjonowania RNA, dodatkowe potencjalne zastosowania PBMC pobranych i kriokonserwowanych przy użyciu tego protokołu obejmują między innymi hodowlę komórkową, edycję genów, badania funkcjonalne ex-vivo, analizy pojedynczych komórek, fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej lub cytometrii według czasu lotu, izolację DNA/RNA lub białek, szkiełka do immunohistochemii, między innymi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani niefinansowych, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować pacjentom, którzy dobrowolnie wyrazili swoją zgodę, czas i oddali próbki krwi. Dziękujemy również dr Patrickowi Moriarty'emu, Julie-Ann Dutton i Markowi McClellenowi z Centrum Medycznego Uniwersytetu Kansas za współpracę i wdrożenie tego protokołu w odległym miejscu. CY otrzymał wsparcie badawcze z grantu NIH 1K08HL150271.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1000 &mikro; L Końcówki | Gilson | F174501 | Około 3 końcówki potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 ml probówka | Biopioneeer | CNT-15 | Do przechowywania roztworów 2/3 2 potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 ml Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Około 40 kriowialiów potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µ L Końcówki | Gilson | F174201 | Do stosowania w liczeniu komórek; Potrzebna objętość zależy od zastosowanej metody liczenia komórek. Potrzebna końcówka jest potrzebna na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| 50 ml Probówka stożkowa | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 potrzebne na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| Przeciwciało CD14 Biolegend | 325621 | ||
| Przeciwciało CD16 | Biolegend | 360723 | |
| Przeciwciało CD19 | Biolegend | 363007 | |
| Przeciwciało CD3 | Biolegend | 300405 | |
| Przeciwciało CD56 | Biolegend | 318303 | |
| Przeciwciało CD66b | Biolegend | 305103 | |
| Sitko do komórek | Biopioneeer | DGN258367 | 1 potrzebna na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych CPT | Biosciences | 362753 | 6 probówek potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat |
| Collection Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Mieści 81 probówek 1 potrzebna na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat |
| Collection Stojak na krioprobówki | Fisherbrand | 05-669-45 | Mieści do 50 kriowialiów |
| DMSO | Invitrogen 15575020 | Około 2,5 ml potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection | |
| destylowana wolna od DNazy/RNaz | Invitrogen | 10977015 | Około 2 ml potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Około 9 ml na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| Probówki EDTA | BD Biosciences | 366643 | 1 probówka potrzebna na pacjenta/stan leczenia do kolekcji PBMC/Plasma/Buffy Coat |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Przeciwciało | Biolegend | 307609 | |
| Albumina surowicy ludzkiej | GeminiBio | 800-120 | Około 25 ml potrzebne na pacjenta lub stan leczenia do kolekcji PBMC/Plasma/Buffy Coat |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | Do użytku w |
| drukarce etykiet | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Mieści do 18 probówek. 2 Mr. Frostys potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Pipeta wielofunkcyjna | Brandtech | 705110 | |
| Końcówki do pipet wielodozujących | Brandtech | 705744 | Około 3 końcówki potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipeta | Gilson | F144059M | |
| Pipeta P20 | Gilson | F144056M | Do stosowania przy liczeniu komórek; wymagana objętość zależy od zastosowanej metody liczenia komórek. |
| Etykiety na drukarki | Phomemo | PM-M110-3020 | Około 45 etykiet potrzebnych na pacjenta/stan leczenia do PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Około 5 etykiet potrzebnych na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| EDTA bez RNaz (0,5 M) | Invitrogen | AM9260G | Około 40 &mikro; L potrzebne na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| PBS bez RNaz (10X) | Invitrogen | AM9625 | Około 1 ml potrzebne na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Około 80 ml potrzebne na pacjenta lub stan leczenia dla pipet transferowych PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Fisherbrand | 13-711-7M | Około 5 potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat | |
| Collection Uchwyt na probówki | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Mieści do 80 probówek CPT/EDTA |
Bibliografia
- Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
- Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
- Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
- Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
- Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
- Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
- Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
- He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
- Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
- Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
- Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
- Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
- Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
- Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
- Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
- Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
- Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
- Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
- Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
- Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
- Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
- Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
- Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
- Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
- Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
- Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
- abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
- Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
- Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
- Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
- Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
- Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80 °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).
Przedruki i uprawnienia
