Artykuł metodologiczny

Izolacja i kriokonserwacja wysoce żywotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej: przewodnik dla początkujących

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia przystępny przewodnik do zbierania, przechowywania i rozmrażania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, odpowiedni do dalszych analiz i procesów takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Zademonstrowano również kolekcje płaszczy plazmowych i buffy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są powszechnie używane w badaniach biomedycznych nad układem odpornościowym i jego reakcją na choroby i patogeny. Ten szczegółowy protokół opisuje sprzęt, materiały eksploatacyjne i etapy izolacji, kriokonserwacji i rozmrażania wysokiej jakości i wysoce żywotnych PBMC z całych komórek krwi, odpowiednich do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Opisano również protokoły przetwarzania osocza i kożucha z krwi pełnej równolegle i równocześnie z PBMC. Temu łatwemu do naśladowania protokołowi krok po kroku, który wykorzystuje wirowanie w gradiencie gęstości do izolowania PBMC, towarzyszy lista kontrolna materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i etapów przygotowania. Protokół ten jest odpowiedni dla osób z wcześniejszym doświadczeniem z technikami laboratoryjnymi i może być stosowany w laboratoriach klinicznych lub badawczych. Wysokiej jakości żywotność komórek i sekwencjonowanie RNA wynikało z PBMC pobranych przez operatorów bez wcześniejszego doświadczenia laboratoryjnego przy użyciu tego protokołu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje przystępną metodę i przebieg pracy do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej. Protokół ten jest szczególnie skierowany do początkujących techników badawczych, studentów i personelu laboratoriów klinicznych w celu ułatwienia pobierania i kriokonserwacji PBMC bez wcześniejszego szkolenia w zakresie technik laboratoryjnych.

Ten protokół wykorzystuje wirowanie do oddzielania składników krwi pełnej według gęstości. Krew pełna składa się z czterech głównych składników wymienionych w kolejności malejącej gęstości: czerwone krwinki/erytrocyty (~45% objętości), białe krwinki (<1% objętości), płytki krwi (<1% objętości) i osocze (~55% objętości)1,2,3,4,5,6. Białe krwinki można podzielić na dwie kategorie w zależności od charakterystyki ich jąder: okrągłe lub wielojądrowe6. PBMC są definiowane jako białe krwinki z okrągłymi jądrami i składają się z następujących typów komórek: limfocyty (limfocyty T, limfocyty B, komórki NK), komórki dendrytyczne i monocyty6. Wielojądrkowe białe krwinki obejmują granulocyty, które składają się z następujących typów komórek: neutrofile, bazofile i eozynofile6. Wielojądrowe białe krwinki są gęstsze niż PBMCs6. Gęstość każdego składnika krwi pełnej jest wyszczególniona w Tabeli 1.

W tym protokole, pełna krew jest zbierana w probówkach wirujących z gradientem gęstości. Probówki te zawierają wstępnie upakowane podłoże o gradiencie gęstości o gęstości 1,077 g/ml. Po odwirowaniu gęstsze komórki, w tym wielojądrzaste białe krwinki i erytrocyty, są oddzielane od PBMC i płytek krwi za pomocą pożywki gradientu gęstości (Rysunek 1A) < sup class = "xref" >6,< sup class = "xref">7. PBMC i frakcja płytek krwi są następnie zbierane, przemywane i odwirowywane w celu usunięcia płytek krwi. Powstałe w ten sposób oczyszczone PBMC są zbierane i przechowywane w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie. Kriokonserwowane PBMC mogą być realnie rozmrażane i bezpośrednio wykorzystywane w dalszych analizach lub dodatkowo przetwarzane w celu wyizolowania określonych typów komórek składowych.

Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem wysokiej jakości sekwencjonowania RNA z wysoce żywotnych PBMC. W tym artykule PBMC zostały wyizolowane i kriokonserwowane od pacjentów w przychodni. Następnie monocyty wyizolowano z PBMC za pomocą FACS i przeanalizowano za pomocą sekwencjonowania RNA. Protokół można jednak szeroko dostosować do innych potrzeb eksperymentalnych, takich jak hodowla komórek, edycja genów, badania funkcjonalne ex-vivo, analizy pojedynczych komórek, fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej lub cytometrii według czasu lotu, izolacja DNA/RNA lub białek, preparaty immunohistochemiczne, między innymi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Oprócz zbierania PBMC z probówek wirujących z gradientem gęstości, ten protokół omawia, jak zbierać osocze i kożuchy za pomocą wirowania za pomocą probówki EDTA. Po odwirowaniu krew pełna jest rozdzielana na osocze, erytrocyty i cienką warstwę interfejsu zwaną kożuchem zawierającą leukocyty ( Rysunek 1B) < sup class = "xref">6. Płaszcz kożuchowy jest powszechnie używany do ekstrakcji DNA i późniejszych analiz genomicznych19,20. Warstwa osocza zawiera bezkomórkowe składniki krwi pełnej i może być używana do testów biomarkerów21,22.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony przez Program Ochrony Człowieka UCSD i KUMC i jest zgodny z Deklaracją Helsińską. Wszystkie osoby wyraziły świadomą zgodę na udział w badaniu i pobranie krwi.

1. Przetwarzanie i kriokonserwacja PBMC

  1. Na dzień przed pobraniem krwi należy wydrukować listę kontrolną materiałów i odczynników wymienionych w tabeli 2 oraz odpowiednio przygotować i oznaczyć odpowiednią etykietę.
    UWAGA: Ten protokół został opracowany do zbierania 6 probówek wirujących z gradientem gęstości. Każda probówka daje około 12 milionów PBMC, z których około 50% i 20% będą stanowić odpowiednio żywe limfocyty i monocyty. Skaluj odpowiednio do potrzeb eksperymentalnych. Należy pamiętać, że bezwzględna liczba komórek może się znacznie różnić w zależności od pacjenta lub stanu leczenia.
  2. Stosując standardową technikę flebotomii, zbierz krew pełną w 6 probówkach wirowych z gradientem gęstości i 1 probówce EDTA do napełnienia, około 6 ml objętości.
    UWAGA: Jeśli wymagane są próbki od wielu pacjentów lub warunki leczenia, pobrane probówki mogą być przechowywane do 4 godzin, a następnie przetwarzane jednocześnie.
  3. Po zebraniu odwirować wszystkie probówki o sile 1 800 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zapoznaj się z dodatkowym filmem 1, aby zapoznać się z demonstracją obsługi wirówki.
  4. Po odwirowaniu ostrożnie otwórz probówkę wirówkową z gradientem gęstości. Za pomocą pipety transferowej usunąć i wyrzucić półprzezroczystą żółtą warstwę zawierającą osocze. Nie należy naruszać zamglonej warstwy komórek bezpośrednio nad podłożem o gradiencie gęstości. Zachowaj ostrożność, pozostawiając nadmiar osocza, zamiast wyrzucać PBMC. Powtórz dla wszystkich tubes.
    UWAGA: Po odwirowaniu probówki zawierającej ośrodek gradientu gęstości, osocze i PBMC znajdą się powyżej ośrodka o gradiencie gęstości; Erytrocyty i granulocyty osiądą na dnie. Zapoznaj się z Rysunek 1A dla wizualizacji.
  5. Za pomocą nowej pipety transferowej delikatnie odpipetować pozostałą objętość zawierającą komórki i resztki osocza w każdej probówce w górę i w dół, kilkakrotnie powyżej pożywki o gradinie gęstości.
  6. Po ponownym wymieszaniu odpipetować zawieszoną zawartość probówki do oznaczonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz dla wszystkich probówek.
  7. Wlej roztwór 1 (pożywka RPMI) do probówki o pojemności 50 ml, aż osiągnie linię o pojemności 50 ml.
  8. W razie potrzeby powtórz kroki od 1.4 do 1.7 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
    UWAGA: Upewnij się, że różne próbki nie są mieszane i użyj nowej pipety transferowej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  9. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym czasie można wypełnić protokół pobierania osocza i buffy wyszczególniony w sekcji 2.
  10. Odrzucić jak najwięcej supernatantu. Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli.
    UWAGA: Po odwirowaniu osad zawiera PBMC, a supernatant zawiera płytki krwi i resztki osocza.
  11. Wlać 15 ml probówkę roztworu 2 (pożywka RPMI + 12,5% albuminy surowicy ludzkiej + 1 μM flawopirydolu) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad PBMC. Delikatnie odwróć rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
  12. Odessać 15 ml roztworu 3 (pożywka RPMI + 11,25% albuminy surowicy ludzkiej + 1 μM flawopirydolu + 10% DMSO) za pomocą pipety transferowej. Dodawać kroplami do probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Roztwór 3 zawiera DMSO, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej. Nie dodawaj roztworu 3, dopóki nie będzie gotowy do natychmiastowego przetworzenia.
  13. Delikatnie odwróć probówkę 3 razy, aby wymieszać.
  14. Napełnij każdy wstępnie oznakowany i schłodzony kriowial 1 ml PBMC za pomocą pipety wielodozownikowej.
    UWAGA: Zapoznaj się z filmem uzupełniającym 2, aby zapoznać się z instrukcją obsługi pipety wielodozownikowej.
  15. Umieść kriowiale w wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Następnie przenieś pojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
  16. W razie potrzeby powtórz kroki od 1,9 do 1,13 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
  17. Przechowuj kriowiale w pojemniku do zamrażania przez co najmniej 12 godzin, a następnie przenieś je do oznaczonego pudełka do przechowywania w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Alternatywnie, przenieś zamrożone kriowiale do ciekłego azotu (<-135 °C) w celu długotrwałego przechowywania.

2. Przetwarzanie plazmy i kożucha z probówek EDTA

  1. Wirować przy 1.800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Po odwirowaniu górna warstwa składa się z osocza, dolna zawiera erytrocyty, a interfejsem będzie kożuchowy płaszcz. Zobacz wizualizację Rysunek 1B.
  2. Za pomocą nowej pipety transferowej pobrać jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy kożuchowca. Następnie dozować 0,5 ml porcji do wstępnie znakowanych kriowialiów. Odessać warstwę kożucha i przenieść ją do odpowiednio oznakowanego cryovial.
    UWAGA: Niektóre osocze i erytrocyty mogą zanieczyścić kolekcję kożucha kożuchowego.
  3. W razie potrzeby powtórz krok 2.2 dla każdego pacjenta lub stanu leczenia.
  4. Po zebraniu przechowuj kriowiale w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Alternatywnie przechowywać w ciekłym azocie (<-135 °C) do długotrwałego przechowywania.

3. Rozmrażanie PBMC

  1. Na dzień przed rozmrożeniem wydrukuj listę kontrolną materiałów i odczynników wymienionych w tabeli 3 i przygotuj i odpowiednio oznacz.
    UWAGA: Ten protokół został opracowany do rozmrażania 1 1,5 ml probówki zawierającej 1 ml PBMC. Każda probówka daje około 2 miliony PBMC, z których około 50% i 20% będą stanowić odpowiednio żywe limfocyty i monocyty. Skaluj odpowiednio do potrzeb eksperymentalnych. Należy pamiętać, że bezwzględna liczba komórek może się znacznie różnić w zależności od pacjenta lub stanu leczenia.
  2. Zamrożone PBMC przenieść z magazynu za pomocą suchego lodu i rozmrozić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty lub tuż przed ostatnim rozmrożeniem kryształków lodu.
    UWAGA: W razie potrzeby można pobrać podwielokrotność do zliczania komórek i pomiarów żywotności, jak opisano w sekcji 4.
  3. Po rozmrożeniu dodać 1 ml roztworu 4 (PBS + 2 mM EDTA) do każdego kriowialu. Następnie wlej zawartość do wstępnie oznakowanej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml roztworu 4 na każdą rozmrożoną probówkę PBMC. Stuknij, aby usunąć resztki kropli.
  4. Umieść sitko na pustej probówce o pojemności 50 ml, a następnie przelej zawiesinę komórek przez sitko do komórek.
    UWAGA: W razie potrzeby lekko stuknij, aby złamać napięcie powierzchniowe.
  5. Odwirować każdą probówkę zawierającą odcedzone komórki o masie 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Po odwirowaniu wylać supernatant zawierający DMSO. Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli.
  7. Zawiesić osad komórkowy w żądanym podłożu odpowiednim dla dalszych potrzeb doświadczalnych (np. pożywka do hodowli komórkowych, koktajl przeciwciał cytometrii przepływowej itp.).

4. Liczenie komórek i żywotność

  1. Natychmiast po rozmrożeniu zamrożonych PBMC w kroku 3.2 należy odpipetować 20 μl komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj równą objętość 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-4 razy, aby wymieszać.
  2. Korzystając z automatycznego licznika komórek, postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby policzyć komórki i ocenić żywotność. Upewnij się, że uwzględniony jest współczynnik rozcieńczenia wynoszący 2.
    UWAGA: Jak opisano w innym miejscu, hemocytometr może być używany jako alternatywna metoda oceny liczby komórek i żywotności23.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pobraniu PBMC i krioprezerwacji, żywotność rozmrożonych PBMC, monocytów i limfocytów z 56 unikalnych próbek została oceniona za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu odczynników wymienionych w Tabeli 4 zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 2A-F). Osiągnięto średnią ± żywotności SD PBMC, monocytów i limfocytów wynoszącą odpowiednio 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% i 93 ± 5,6% ( Figura 2G). Pomiar żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego wykazał średnią żywotność 88 ± 7,5% i liczbę komórek 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Analiza cytometrii przepływowej wykazała również, że żywe monocyty stanowiły 17 ± 5,9%, a limfocyty stanowiły od 53 ± 13,0% wszystkich PBMC.

Następnie, monocyty zostały posortowane z rozmrożonych PBMC z 59 unikalnych próbek za pomocą cytometrii przepływowej i przekazane do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania RNA, jak opisano gdzie indziej24. Średnia ± całkowita liczba sekwencji SD wynosząca 18,0 ± 16,3 miliona została osiągnięta przy wyrównaniu 93 ± odczytu 6,3% i zawartości GC 49,6 ± 1,4% (Rysunek 3A-B). Średni odsetek odczytów ± unikalnie zmapowanych SD wynoszący 88 ± 3,6% stwierdzono w podzbiorze 56 unikalnych próbek. Parametry te pokazują, że wysoce żywotne PBMC odpowiednie do dalszych zastosowań, w tym do sekwencjonowania wysokiej jakości RNA, mogą być uzyskiwane przez operatorów na dowolnym poziomie przeszkolenia laboratoryjnego przy użyciu tego protokołu.

składnikgęstość cytat
plazma1,022 g/ml do 1,026 g/ml1
Płytek krwi<1,061 g/ml do >1,070 g/mlcyfra arabska
PBMC (ang. PBMC)<1,077 g/ml6
Granulocyty obojętnochłonne o małej gęstości*<1,077 g/ml3
Granulocyty (neutrofile*, bazofile i eozynofile)>1,077 g/ml6
Erytrocytów1,11 g/ml4

Tabela 1: Składniki krwi pełnej wymienione według kolejności malejącej gęstości.

Reagant/MateriałIlość (na 6 probówek CPT i 1 probówkę EDTA)KońcówkaOstrzeżenia
Rurki CPT6Oznacz zgodnie z identyfikatorem pacjenta lub próbki.
Rurka EDTA1Oznacz zgodnie z identyfikatorem pacjenta lub próbki.
Probówka stożkowa 50 mlcyfra arabskaOprócz identyfikatora pacjenta lub próbki, oznacz 1 probówkę dla PBMC i 1 dla odpadów.
Kriofiale39 Rozdział 39Etykieta 30 dla PBMCs, 8 dla OSOCZA EDTA i 1 dla buffy coat. Nie wszystkie kriowiale mogą być używane.
Pan Mrózcyfra arabskaNapełnij do połowy izopropanolem i wstępnie schładzaj przez noc w temperaturze -20°C.Izopropanol jest łatwopalnym substancją drażniącą. Przechowywać z dala od iskier/płomieni. Unikaj wdychania i obchodź się w rękawiczkach i ostrożnie.
Flawopirydol100 μl zapasu 1000XAby przygotować 1000X bulion flavopiridolu, zawiesij 5 mg flawopirydolu w 1,14 ml DMSO dla stężenia 10 mM. Porcjować 200 μl do pojedynczych pojemników, a następnie zamrażać. Aby użyć, rozmrozić poszczególne porcje i rozcieńczyć 1:10 w wodzie destylowanej wolnej od DNaz/RNaz, a następnie użyć jako roztworu 1000X.Flawopiridol jest substancją drażniącą. Obchodź się w rękawiczkach i ostrożnie.
Rozwiązanie 150 mlRPMI Średni.
Aby przygotować 50 ml roztworu podstawowego, użyj 50 ml pożywki RPMI.
Rozwiązanie 215 mlRPMI Medium + 12,5% albuminy surowicy ludzkiej + 1 μM Flawopirydol.
Aby przygotować 50 ml roztworu podstawowego, użyj 25 ml pożywki RPMI + 25 ml albuminy surowicy ludzkiej + 50 μl 1000X flawopirydolu.		Flawopiridol jest substancją drażniącą. Obchodź się w rękawiczkach i ostrożnie.
Rozwiązanie 315 mlRPMI Medium + 11,25% albuminy ludzkiej surowicy + 1 μM Flavopiridol + 10% DMSO.
Aby przygotować 50 ml roztworu podstawowego, użyj 22,5 ml pożywki RPMI + 22,5 ml HSA + 5 ml DMSO + 50 μl 1000X Flawopirydolu.		Flavopiridol jest substancją drażniącą, a DMSO jest toksyczny i łatwo wchłania się przez skórę. Obchodź się w rękawiczkach i ostrożnie.

Tabela 2: Lista kontrolna odczynników i materiałów do przygotowania i oznakowania do zbierania i kriokonserwacji PBMC.

Reagant/MateriałIlość (na 1 ml podwielokrotności zamrożonych PBMC)KońcówkaOstrzeżenia
Rozwiązanie 410 mlPBS + 2 mM EDTA

Aby przygotować 50 ml roztworu podstawowego, użyj 5 ml 10X PBS + 200 μL 0,5 M EDTA + 44,8 ml wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz
Probówka stożkowa 50 ml3Oprócz identyfikatora pacjenta lub próbki, oznacz 1 probówkę dla wstępnie odkształconych PBMC, 1 dla PBMC po odkształceniu i 1 dla odpadów. Napełnij probówkę oznaczoną dla wstępnie zabarwionych PBMC 9 ml roztworu, 4 na ml zamrożonych PBMC
Probówka 1,5 ml1Do zliczania komórek; etykieta z identyfikatorem pacjenta lub próbki
0,4% roztwór błękitu trypanowego20 μLDo liczenia komórek; można dodać do probówki 1,5 ml z wyprzedzeniem dzień wcześniej.Błękit trypanowy jest substancją rakotwórczą. Obchodź się w rękawiczkach i ostrożnie.

Tabela 3: Lista kontrolna odczynników i materiałów do przygotowania i oznaczenia do rozmrażania i liczenia PBMC.

Odczynnik/MateriałIlość (na milion komórek)
Żywa martwa plama5 μL
Zaufanie człowieka FcX5 μL
Przeciwciało CD35 μL
Przeciwciało CD195 μL
Przeciwciało CD565 μL
Przeciwciało CD66b5 μL
Przeciwciało HLA-DR5 μL
Przeciwciało CD145 μL
Przeciwciało CD162,5 μl
RNAzyny100 jednostek

Tabela 4: Tabela odczynników do izolacji monocytów z PBMC metodą cytometrii przepływowej.

Separacja składników krwi na diagramie wirowania w gradionym przepływie gęstości; plazma, PBMCs, warstwy kożucha kożbkowatego.
Rysunek 1: Składniki krwi pełnej oddzielone przez odwirowanie w wirówkach z gradientem gęstości lub probówkach EDTA. (A) Wirowanie krwi pełnej w probówkach wirówek z gradientem gęstości powoduje oddzielenie osocza, płytek krwi i PBMC powyżej pożywki gradientu gęstości z wielojądrowymi i erytrocytami poniżej pożywki o gradiencie gęstości. (B) Wirowanie krwi pełnej w probówkach EDTA powoduje oddzielenie osocza w najwyższej warstwie, erytrocytów w dolnej warstwie i kożucha w granicy faz. Stworzony z Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy punktowe cytometrii przepływowej; PBMC, monocyty, limfocyty; analiza żywotności, wykres typu komórki.
Rysunek 2: Żywotność rozmrożonych kriokonserwowanych PBMC została oceniona za pomocą barwienia żywym/martwym przepływem i cytometrii przepływowej. (A) Szczątki, oznaczone gwiazdką *, są wyłączone z PBMC przez bramkowanie rozproszenia przedniego i bocznego. (B) Reprezentatywna analiza żywych/martwych całych PBMC (C) Panmonocyty są bramkowane jako HLA-DR dodatnie i ujemne dla następujących antygenów powierzchniowych znakowanych FITC: CD3, CD19, CD56 i CD66b. (D) Reprezentatywna analiza żywych/martwych monocytów. (E) Limfocyty bramkowane następującymi antygenami powierzchniowymi znakowanymi FITC: CD3, CD19, CD56 i CD 66b. (F) Reprezentatywna analiza limfocytów żywych/martwych. (G) Procent żywotności każdego typu komórki określony ilościowo z 56 próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy analizy danych FastQC; Milion sekwencji a możliwość wyrównania, dystrybucja treści GC.
Rysunek 3: Jakość sekwencjonowania RNA monocytów posortowanych z kriokonserwowanych PBMC. Zsekwencjonowano 56 unikalnych próbek i wygenerowano średnią ± SD 18,0 ± 16,3 miliona sekwencji. (A) Dopasowanie było wysokie, przy czym 92,5% ± 6,3% sekwencji było zgodnych z genomem referencyjnym. (B) Zawartość GC w tych sekwencjach wynosiła 49,6 ± 1,4%. Utworzono za pomocą FastQC25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Demonstracja korzystania z wirówki Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 2: Demonstracja obsługi pipety z wieloma dozownikami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pobierania i kriokonserwacji PBMC został z powodzeniem wdrożony przez osoby z wcześniejszym przeszkoleniem w laboratoriach badawczych i bez niego. W naszej aplikacji sekwencjonowanie FACS i RNA wysoce żywotnych monocytów oczyszczonych z przechowywanych PBMC zaowocowało uzyskaniem sekwencji wysokiej jakości.

Główną zaletą tego protokołu jest jego dostępność. Technika przedstawiona w protokole wykorzystuje probówki wstępnie wypełnione medium gradientowym o stałej gęstości. W rezultacie krew pełna może zostać pobrana bezpośrednio do probówki, a następnie natychmiast przetworzona w celu wyizolowania PBMC. Potrzebna jest stosunkowo niewielka liczba gotowych roztworów i specjalistycznego sprzętu, ułatwiająca współpracę między laboratorium badawczym, w którym mogą być przygotowywane odczynniki, a laboratorium klinicznym, w którym pobierane i przetwarzane są próbki. Protokoły pisemne i wideo są dostosowane do operatorów na każdym poziomie szkolenia.

Chociaż protokół ten wykorzystuje świeżą krew pełną do izolacji PBMC, a zatem ma stosunkowo wysoką oczekiwaną wydajność i czystość >90%, może nie być odpowiedni do zastosowań wymagających wyjątkowo wysokiej czystości >98%26,27. Co więcej, probówki do wirowania w gradiencie gęstości mogą być kosztowne do uzyskania, zwłaszcza jeśli konieczne jest pobranie dużej liczby próbek.

Alternatywne metody zbierania PBMC obejmują zastosowanie pożywki o gradiencie gęstości cieczy lub zubożenie immunomagnetyczne28,29. Krótko mówiąc, pierwsza z nich polega na nałożeniu warstw wcześniej przygotowanego podłoża o gradiencie gęstości pod heparynizowaną krwią pełną, a następnie odwirowaniu. Ten ostatni wykorzystuje znakowane magnetycznie przeciwciała do znakowania przeciwciał innych niż PBMC, które są następnie zatrzymywane w kolumnie magnetycznej, podczas gdy nieznakowane PBMC przechodzą bez zmian.

W porównaniu z przedstawionym protokołem, zastosowanie pożywki o gradiencie gęstości cieczy jest zarówno mniej kosztowne, jak i wymaga znacznie mniejszej ilości materiału ze względu na brak probówek wirujących z gradientem gęstości; Izolację PBMC można wykonać w standardowej probówce o pojemności 50 ml8. Jednak ta technika jest bardziej skomplikowana, ma dłuższy czas przetwarzania i może być obarczona większym ryzykiem błędu użytkownika. Heparyna musi być precyzyjnie dodana, aby uniknąć nadmiernego rozcieńczenia, a podłoże o gradiencie gęstości musi być starannie ułożone warstwami w odpowiednich ilościach, aby zapewnić dobrą separację PBMC26.

W porównaniu z przedstawionym protokołem, zastosowanie zubożenia immunomagnetycznego zapewnia wyższą wydajność i czystość, ograniczoną obsługę z powodu braku wirowania, szybszy czas przetwarzania i wymaga znacznie mniejszej ilości materiału 30,31,32. Jednak głównym minusem jest to, że ta metoda jest najdroższa z trzech opisanych metod, zwłaszcza na dużą skalę.

Chociaż ten protokół jest solidny, niektóre krytyczne kroki mogą wymagać dodatkowej uwagi. W całym protokole upewnij się, że próbki nie są mieszane i są umieszczane w odpowiednio oznakowanych probówkach, zwłaszcza podczas jednoczesnej pracy z wieloma pacjentami lub stanami. W kroku 1.4 upewnij się, że żadne PBMC nie zostały odrzucone; nadmiar osocza zmniejszy jedynie stężenie PBMC, co jest mniej krytyczne dla utrzymania żywotności i jakości próbki. Niezależnie od tego, obecność osadów w zebranych PBMC sugeruje, że fragmenty ośrodka gradientu gęstości zostały przemieszczone. Delikatnie pipetuj w kroku 1.5, aby zapobiec temu problemowi. W krokach 1.10 i 3.6 upewnij się, że odwirowane osady komórkowe nie zostały wyrzucone. Szybka praca ma kluczowe znaczenie dla kroków 1.12 i 3.3, ponieważ roztwór 3 zawiera DMSO, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej33. Należy również zauważyć, że przechowywanie PBMC w ciekłym azocie jest zalecane zamiast przechowywania w temperaturze -80°C. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze -80°C wiąże się ze zmniejszoną żywotnością komórek i zmienioną ekspresją genów34,35.

Protokół ten może być dostosowywany do potrzeb eksperymentalnych. Dodanie flawopirydolu, inhibitora polimerazy RNA i syntezy mRNA, do roztworów 2 i 3 ma na celu zapobieżenie wszelkim artefaktom wywołanym przez obchodzenie się i stres z sekwencjonowaniem RNA36. Flawopirydol można jednak pominąć, jeśli pożądane są badania funkcjonalne lub badania ex vivo z wykorzystaniem PBMC.

Osocze pobrane z probówek EDTA zostanie zanieczyszczone EDTA, czynnikiem chelatującym. W rezultacie osocze EDTA nie nadaje się do oznaczania obejmującego krzepnięcie lub jony wapnia37,38. W razie potrzeby warstwa plazmy w probówkach z gradientem gęstości po odwirowaniu może zostać zebrana w kroku 1.4. Probówki te zawierają heparynę sodową jako antykoagulant, który można usunąć z dodatkiem heparynazy39. Warto zauważyć, że heparyna hamuje odwrotną transkryptazę i amplifikację PCR, co sprawia, że pobrane osocze nie nadaje się do eksperymentów PCR bez dodatku środka blokującego heparynę40.

Zebrana kożuchowa sierść z probówek EDTA nie jest przechowywana w roztworze zawierającym DMSO lub flawopirydol. DMSO jest ważne w zmniejszaniu tworzenia się kryształków lodu i śmierci komórek41. Flawopirydol jest ważny dla hamowania syntezy RNA36. W związku z tym kożuchowa sierść nie nadaje się do analiz ex vivo i transkryptomicznych. W razie potrzeby kroki od 1,6 do 1,15 można wykonać przy użyciu zebranego płaszcza kożuchowego w celu maksymalizacji żywotności komórek i zahamowania syntezy RNA.

Chociaż protokół ten został opracowany do sekwencjonowania RNA, dodatkowe potencjalne zastosowania PBMC pobranych i kriokonserwowanych przy użyciu tego protokołu obejmują między innymi hodowlę komórkową, edycję genów, badania funkcjonalne ex-vivo, analizy pojedynczych komórek, fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej lub cytometrii według czasu lotu, izolację DNA/RNA lub białek, szkiełka do immunohistochemii, między innymi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani niefinansowych, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować pacjentom, którzy dobrowolnie wyrazili swoją zgodę, czas i oddali próbki krwi. Dziękujemy również dr Patrickowi Moriarty'emu, Julie-Ann Dutton i Markowi McClellenowi z Centrum Medycznego Uniwersytetu Kansas za współpracę i wdrożenie tego protokołu w odległym miejscu. CY otrzymał wsparcie badawcze z grantu NIH 1K08HL150271.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1000 &mikro; L KońcówkiGilsonF174501Około 3 końcówki potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 ml probówkaBiopioneeerCNT-15Do przechowywania roztworów 2/3
2 potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 ml CryovialsGlobe Scientific3012Około 40 kriowialiów potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L KońcówkiGilsonF174201Do stosowania w liczeniu komórek; Potrzebna objętość zależy od zastosowanej metody liczenia komórek. Potrzebna końcówka jest potrzebna na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia
50 ml Probówka stożkowaCEM Corporation50-187-76832 potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 potrzebne na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia
Przeciwciało CD14 Biolegend325621
Przeciwciało CD16Biolegend360723
Przeciwciało CD19Biolegend363007
Przeciwciało CD3Biolegend300405
Przeciwciało CD56Biolegend318303
Przeciwciało CD66bBiolegend305103
Sitko do komórekBiopioneeerDGN2583671 potrzebna na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia
Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych CPTBiosciences3627536 probówek potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Mieści 81 probówek
1 potrzebna na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Stojak na krioprobówkiFisherbrand05-669-45Mieści do 50 kriowialiów
DMSOInvitrogen 15575020Około 2,5 ml potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
destylowana wolna od DNazy/RNazInvitrogen10977015Około 2 ml potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Około 9 ml na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia
Probówki EDTABD Biosciences3666431 probówka potrzebna na pacjenta/stan leczenia do kolekcji PBMC/Plasma/Buffy Coat
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR PrzeciwciałoBiolegend307609
Albumina surowicy ludzkiejGeminiBio800-120Około 25 ml potrzebne na pacjenta lub stan leczenia do kolekcji PBMC/Plasma/Buffy Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KDo użytku w
drukarce etykietPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Mieści do 18 probówek.
2 Mr. Frostys potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Pipeta wielofunkcyjnaBrandtech705110
Końcówki do pipet wielodozującychBrandtech705744Około 3 końcówki potrzebne na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetaGilsonF144059M
Pipeta P20GilsonF144056MDo stosowania przy liczeniu komórek; wymagana objętość zależy od zastosowanej metody liczenia komórek.
Etykiety na drukarkiPhomemoPM-M110-3020Około 45 etykiet potrzebnych na pacjenta/stan leczenia do PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Około 5 etykiet potrzebnych na 1 ml niepołączonych zamrożonych PBMC do rozmrożenia
EDTA bez RNaz (0,5 M)InvitrogenAM9260GOkoło 40 &mikro; L potrzebne na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia
PBS bez RNaz (10X)InvitrogenAM9625Około 1 ml potrzebne na 1 ml zamrożonych PBMC do rozmrożenia
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVOkoło 80 ml potrzebne na pacjenta lub stan leczenia dla pipet transferowych PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Fisherbrand13-711-7MOkoło 5 potrzebnych na pacjenta/stan leczenia dla PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Uchwyt na probówkiEndicott-Seymour14-781-15Mieści do 80 probówek CPT/EDTA
BD Woda Mr. Frosty

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja PBMCwirowanie w gradiencie g sto cikriokonserwacja kom rekwarstwa leukocytarnaosocze z EDTAcytometria przep ywowasekwencjonowanie RNAywotno kom reksortowanie monocyt w

Powiązane artykuły