Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Streszczenie

Miejscowy mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) z elastazy jest wzmocniony w połączeniu z wodą pitną uzupełnianą ß-aminopropionitrylem (BAPN), aby niezawodnie wytwarzać prawdziwe tętniaki podnerkowe z zachowaniami naśladującymi ludzkie tętniaki aorty. Miejscowe zastosowanie elastazy do przydanki aorty podnerkowej powoduje strukturalne uszkodzenie elastycznych warstw ściany aorty i inicjuje rozszerzenie tętniaka. Jednoczesne podawanie BAPN, inhibitora oksydazy lizylowej, sprzyja trwałemu zwyrodnieniu ścian poprzez zmniejszenie sieciowania kolagenu i elastyny. Ta kombinacja powoduje powstawanie dużych tętniaków, które stopniowo rozszerzają się, tworzą śródświetlną skrzeplinę i są zdolne do pęknięcia. Udoskonalenie technik chirurgicznych, takich jak izolacja obwodowa całego odcinka aorty podnerkowej, może pomóc w standaryzacji procedury w celu spójnego i dokładnego stosowania elastazy trzustkowej świń pomimo różnych operatorów i różnic anatomicznych między myszami. Dlatego model elastazy/BAPN jest wyrafinowanym podejściem do chirurgicznej indukcji AAA u myszy, które może lepiej podsumować ludzkie tętniaki i zapewnić dodatkowe możliwości badania wzrostu tętniaka i ryzyka pęknięcia.

Wprowadzenie

Tętniak jest definiowany jako patologiczne rozszerzenie naczynia krwionośnego większe niż 50% średnicy zdrowego naczynia¹. Pomimo tego, że tętniaki aorty brzusznej (AAA) są powszechnie spotykanym schorzeniem w starzejącej się populacji, z częstością występowania około >5% mężczyzn > 65 roku życia, nie ma ukierunkowanych strategii terapeutycznych w leczeniu AAA¹. Obecne leczenie AAA ogranicza się do redukcji czynników ryzyka i naprawy chirurgicznej za pomocą chirurgii otwartej lub wewnątrznaczyniowej w oparciu o średnicę aorty lub szybkość wzrostu². Największym zagrożeniem związanym z AAA jest pęknięcie tętniaka, które jest śmiertelne, jeśli nie jest leczone, a naprawa w tym nagłym przypadku może nieść ze sobą ryzyko śmiertelności nawet o 90%¹.

Patofizjologia AAA jest skomplikowana, wieloczynnikowa i nie do końca zrozumiała³. Cechy ludzkiego AAA obejmują prawdziwe tętniakowe rozszerzenie ściany aorty z naciekiem komórek zapalnych, obecność skrzepliny śródświetlnej i postępujące poszerzenie, które prowadzi do ostatecznego pęknięcia^3,4. Ponadto AAA są związane z zaawansowanym wiekiem, mają przewagę płci męskiej i żeńskiej 9:1 i najczęściej występują w aorcie podnerkowej⁵. Modelowanie wszystkich cech i zachowań ludzkich AAA u zwierząt pozostaje ciągłym wyzwaniem⁶.

Obecne modelowanie AAA jest głównie prowadzone u myszy, a tętniaki są zwykle indukowane przy użyciu jednej z trzech metod - przez infuzję angiotensyny II (AngII) przez podskórnie wszczepioną pompę osmotyczną, oraz przez bezpośrednie zastosowanie chlorku wapnia (CaCl₂) lub elastazy do aorty⁷. W tej drugiej metodzie elastaza trzustkowa świni (PPE) jest nakładana na odcinek aorty podnerkowej i powoduje enzymatyczną degradację włókien elastyny w elastycznej blaszce osłonki środkowej. To uszkodzenie strukturalne powoduje osłabienie ściany aorty i rozszerzenie tętniaka na zewnątrz. Stosowanie samej elastazy miejscowej powoduje jednak powstawanie stosunkowo małych tętniaków podnerkowych, które z czasem nie powiększają się ani nie pękają. Niedawno Lu i in. ulepszyli ten model, dodatkowo podając β-aminopropionitryl (BAPN), nieodwracalny inhibitor oksydazy lizylowej, myszom leczonym elastazą⁸. Zapobiegając sieciowaniu włókien elastyny i kolagenu, suplementacja BAPN powoduje stopniowe rozszerzanie się aort uszkodzonych przez elastazę aż do momentu pęknięcia. Model elastazy/BAPN ma dodatkowo wyższy wskaźnik zapadalności na AAA niż miejscowy model elastazy, a wytwarzane tętniaki są również większe i zawierają skrzeplinę wewnątrzświetlną⁸.

W modelu elastazy/BAPN, stopień chirurgicznego rozwarstwienia i wystawienie aorty na elastazę może mieć wpływ na sukces i powtarzalność tego modelu. W tym artykule opisujemy, że jednoczesne podawanie wody pitnej BAPN i miejscowe stosowanie elastazy do aorty po obwodowej izolacji całego podnerkowego odcinka aorty poprawia powtarzalność, uwzględnia różnice anatomiczne między zwierzętami i skutkuje większą częstością indukcji AAA, rozmiarami tętniaków i częstością pęknięć. W tym artykule opiszemy ustandaryzowane podejście do niezawodnego wywoływania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy przy użyciu kombinacji miejscowej wody uzupełnionej elastazą i BAPN.

Protokół

Protokoły dla zwierząt są zatwierdzone przez University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (M005792).

1. Utrzymanie zwierząt

1. Wychowuj myszy na standardowej karmie konserwacyjnej. Użyj dorosłych myszy lub młodych dorosłych myszy (w wieku 8-12 tygodni).
   UWAGA: Wykorzystanie dorosłych osobników zapewnia, że zwierzęta osiągnęły pełną dojrzałość i ogranicza wszelkie szanse, że zmiany średnicy aorty mogą być związane ze wzrostem zwierząt. W tym badaniu wykorzystaliśmy samce i samice myszy C57BL / 6J w wieku 22-24 tygodni w momencie operacji. Lu i współpracownicy nie zaobserwowali istotnych różnic w odpowiedzi tętniaka między młodszymi i starszymi myszami⁸. Dodatkowo, podczas gdy większość modelowania tętniaka jest wykonywana u samców myszy, ten model z powodzeniem indukuje AAA zarówno u samców, jak i samic myszy⁹.
2. Określ czas trwania badania i przypisz zwierzęta do grup leczonych lub pozorowanych (kontrolnych). Podaj 0,2% wody pitnej BAPN myszom z grupy leczonej i poddaj je operacji z miejscowym zastosowaniem aktywnej elastazy do aorty podnerkowej. Podawaj nieuzdatnioną wodę zwierzętom kontrolnym i poddaj je zabiegowi chirurgicznemu z zastosowaniem denaturowanej elastazy do aorty podnerkowej.

2. Rozpoczęcie wody pitnej z dodatkiem B-aminopropionitrylu (BAPN)

1. Dwa dni przed zabiegiem należy rozpocząć leczenie myszy od wody pitnej o stężeniu 0,2% BAPN. Przygotuj wodę BAPN w większych ilościach i przechowuj ją w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 28 dni. Upewnij się, że woda BAPN osiągnie temperaturę pokojową przed podaniem jej myszom.
   UWAGA: Zalecamy wymianę wody BAPN w klatkach co 7 dni przez cały czas trwania badania.

3. Dzień przygotowania materiału do zabiegu

1. Pokrój rękawice chirurgiczne na paski o wymiarach 5 mm x 10 mm, które będą później używane do izolacji aorty przed leczeniem elastazą. Przygotuj serwetę chirurgiczną, wycinając owal o wymiarach ~ 1,5 cm x 3 cm na środku serwety chirurgicznej. Rozłóż gazę 2 cale x 2 cale i przetnij na pół, aby utworzyć paski gazy o wymiarach około 2,5 cm x 10 cm, które można później wykorzystać do wycofania treści brzusznej. Zautoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (patrz Tabela Materiałów) i ustaw sterylne pole chirurgiczne, jak pokazano w przykładzie w Rysunek 1.

Rysunek 1: Przykład sterylnego zestawu chirurgicznego w ramach przygotowań do mysiego modelu AAA z elastazy/BAPN. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotuj klatkę do rekonwalescencji pooperacyjnej, umieszczając czystą klatkę pod lampą grzewczą i umieść sól fizjologiczną w pobliżu lampy, aby ogrzać się do temperatury ciała (37 °C). Upewnij się, że lampa grzewcza jest bezpiecznie umieszczona tak, aby klatka rekuperacji i sól fizjologiczna były ciepłe, ale nie przekraczały 37 °C. Włącz pompę wodną, aby rozpocząć cyrkulację ciepłej wody przez poduszkę grzewczą.

4. Przygotowanie zwierząt do operacji

1. Umieść myszy w komorze indukcyjnej i znieczulij je 5% izofluranem w tempie 200 ml/min za pomocą elektronicznego waporyzatora o niskim przepływie. Podczas znieczulenia zważ każdą mysz i podaj podskórnie 0,6 mg/kg buprenorfiny ER i 20 mg/kg karprofenu w celu znieczulenia. Użyj elektrycznych trymerów do włosów, aby przyciąć futro na brzuchu, od dolnej części brzucha do dolnej części wyrostka ksyloidalnego. Użyj gazy lub chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar włosów. Wróć myszy do klatki i odczekaj co najmniej 20 minut, aż analgezja zacznie działać przed przystąpieniem do operacji.
2. Po co najmniej 20 minutach od podania środka przeciwbólowego umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i ponownie podawaj 5% izofluranu w tempie 200 ml/min za pomocą elektronicznego waporyzatora o niskim przepływie, aż mysz zostanie uspokojona.
3. Wyjmij uspokojoną mysz z komory indukcyjnej i połóż ją na wznak na polu operacyjnym. Nałóż żel pod oczy i zabezpiecz stożek nosowy taśmą chirurgiczną. Dawkę podawanego wziewnego izofluranu należy zmniejszyć do 1-2% w dawce 50 ml/min. Zabezpiecz przednie i tylne łapy myszy taśmą chirurgiczną.
4. Zbadaj dolną część brzucha myszy pod kątem pęcherza. Delikatnie wywieraj zewnętrzny nacisk na pęcherz między kciukiem, palcem wskazującym i środkowym, aby wywołać mikcję; W międzyczasie użyj kawałka gazy, aby usunąć mocz.
   UWAGA: Uważaj, aby nie zanieczyścić pola operacyjnego.
5. Rozpocznij dezynfekcję brzucha, nakładając peeling na bazie jodu lub chlorheksydyny i 70% alkoholu za pomocą wacików z bawełnianą końcówką. Zacznij od środka brzucha i pracuj na zewnątrz okrężnymi ruchami 3x. Pozostaw obszar do krótkiego wyschnięcia między aplikacjami.
6. Sprawdź, czy nie ma reakcji na przytrzaśnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że znieczulenie jest odpowiednie. Upewnij się, że stożek nosa i kończyny są zabezpieczone. Umieść serwetę chirurgiczną na myszy, tak aby otwór znajdował się bezpośrednio nad chirurgicznie przygotowanym brzuchem.
   UWAGA: Nie przeciągaj zasłony po myszy, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia.

5. Chirurgiczna indukcja AAA

1. Wejście do jamy brzusznej:
   1. Umyj ręce i załóż czyste nitrylowe lub sterylne rękawice chirurgiczne. Przed kontaktem z polem operacyjnym zawsze spryskaj rękawice 70% EtOH i pocieraj dłonie w rękawiczkach aż do wyschnięcia.
   2. Użyj kleszczy, aby namiotować skórę w linii środkowej brzucha. Użyj skalpela, aby wykonać podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej o długości około 2-3 cm.
   3. Użyj kleszczy, aby podnieść mięśnie proste, aby zidentyfikować półprzezroczystą linię białką. Użyj nożyczek, aby wejść do jamy brzusznej przez kresę białą, a następnie rozciągnij wzdłuż kresy białej proksymalnie i dystalnie.
2. Odsłanianie aorty brzusznej:
   1. Zwilż pasek gazy i dwa waciki z bawełnianą końcówką podgrzaną solą fizjologiczną. Utwórz rolkę brzuszną, mocno zwijając jeden koniec gazy do połowy, pozostawiając obfity ogon.
   2. Użyj retraktora skóry, aby cofnąć prawą ścianę brzucha.
   3. Za pomocą zwilżonych wacików z bawełnianą końcówką wykonaj rotację trzewną prawo-przyśrodkową, delikatnie przesuwając jelito cienkie i grube do lewego górnego kwadrantu i uwidocznij aortę i żyłę główną dolną (IVC). Użyj rolki brzusznej, aby cofnąć jelito poza pole widzenia – wsuń zwinięty koniec gazy pod jelito, a następnie przesuń koniec ogona wokół i na zewnątrz ciała, aby delikatnie owinąć jelita. Delikatnie napnij ogon gazy, aby utrzymać jelito poza polem widzenia. Dostosuj zwijacz brzucha i zwijacz skóry, aby uzyskać optymalny widok narządów zaotrzewnowych, jak pokazano na Rysunek 2A.
      UWAGA: Rolka brzuszna pomaga utrzymać wilgotność jelita i chronić je przed przypadkowym uszkodzeniem przez narzędzia chirurgiczne. Upewnij się, że gaza pozostaje wilgotna podczas zabiegu, aby zapobiec wysuszeniu jelit. Uważaj, aby nie cofać jelita na siłę, ponieważ może to spowodować załamanie tętnicy krezkowej górnej i unaczynienia jelit, co może potencjalnie spowodować uszkodzenie niedokrwienne. Ponadto, podczas początkowego zamiatania jelita cienkiego, należy uważać na cienkie, półprzezroczyste połączenie między jelitem grubym a dolną wątrobą (więzadło wątrobowo-kolkowe), które, jeśli nie będziesz ostrożny, może łatwo oderwać torebkę wątrobową i spowodować krwawienie. Jeśli podczas zwijania występuje napięcie tego więzadła, podziel je ostro nożyczkami.

Rysunek 2: Przedstawienie retrakcji brzusznej i optymalnego widoku chirurgicznego dla odsłonięcia aorty podnerkowej myszy. (A) Umieszczenie rolki brzusznej z gazy pomaga w cofnięciu narządów wewnątrzbrzusznych, podczas gdy przeciwstawny retraktor pomaga w zapewnieniu wizualizacji zaotrzewnowej. Sterylna serweta chirurgiczna (przezroczysta, aby pokazać orientację zwierzęcia) jest umieszczana na znieczulonym zwierzęciu, aby pomóc utrzymać sterylność. (B) Powięź zaotrzewnowa (zielona ramka) pokrywa aortę z przodu. (C) Przykład aorty podnerkowej po rozwarstwieniu powięzi zaotrzewnowej. Izolację aorty od IVC można osiągnąć, zaczynając od potencjalnej przestrzeni między aortą a IVC, położonej tuż dystalnie do lewej żyły nerkowej, gdy przecina się ona do przodu (żółte kółko). Skrót: IVC = żyła główna dolna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Rozwarstwienie obwodowe i izolacja aorty podnerkowej:
   1. Upewnij się, że IVC i aorta podnerkowa są w pełni widoczne. Rozpocznij odsłanianie aorty, najpierw wchodząc i dzieląc powięź zaotrzewnową (RP) (Rysunek 2B). Zidentyfikuj tętnice gonadalne (jądrowe lub jajnikowe), które biegną równolegle wzdłuż przedniej aorty podnerkowej (Rysunek 2B i Rysunek 3). Użyj kleszczy, aby tępo podzielić powięź między tętnicami gonadalnymi i kontynuuj wzdłużnie, aby odsłonić aortę do przodu (Rysunek 2C).
      UWAGA: Powięź RP to cienka, półprzezroczysta warstwa tkanki łącznej, która zawiera naczynia limfatyczne i splot splanchniczny. Konieczne jest wypreparowanie przez powięź RP, aby odsłonić aortę. Nie należy jednak przeprowadzać sekcji przez tkankę łączną przydanki aortalnej. Rozdarcie przydanki (biała tkanka łączna) odsłoni pożywkę (wydaje się jaskrawoczerwona), a aorta prawdopodobnie pęknie w tym miejscu po zastosowaniu elastazy.
   2. Następnie zacznij izolować aortę brzuszną od IVC. Rozpocznij tę sekcję w małej szczelinie między IVC a aortą, znajdującej się tuż poniżej dolnej krawędzi lewej żyły nerkowej, gdy przecina ona aortę (Rysunek 2C). Użyj końcówek kleszczy, aby delikatnie rozsunąć włókna tkanki łącznej między aortą a IVC i kontynuuj pracę obwodowo wokół aorty na tym poziomie.
      UWAGA: IVC jest bardzo cienkościenny i ściśle przylega do aorty za pomocą cienkiej warstwy włóknistej tkanki łącznej. Zachowaj ostrożność, aby w miarę możliwości unikać obchodzenia się z IVC lub czyszczenia IVC. Wypreparowanie prawej strony aorty z IVC (przed wycięciem lewej strony aorty z otaczających mięśni) pomoże aorcie "odpaść" od IVC.
   3. Kontynuuj preparowanie płaszczyzny między aortą a IVC, pracując doogonowo w kierunku rozwidlenia aorty. Zatrzymaj dalsze rozwarstwienie dystalne po dotarciu do rozwidlenia aorty.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas preparacji wokół tętnicy krezkowej dolnej (IMA), która zwykle znajduje się w pobliżu środkowego odcinka aorty podnerkowej i biegnie bocznie przez IVC.
   4. Po oddzieleniu prawej krawędzi aorty od IVC wróć proksymalnie do poziomu lewej żyły nerkowej. Wypreparuj powięź RP z bocznej lewej krawędzi aorty, pracując obwodowo dookoła, aż aorta zostanie całkowicie odizolowana. Zobacz Rysunek 3 dla odpowiedniej anatomii rozwarstwienia zaotrzewnowego.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas preparowania za aortą, ponieważ istnieje duża zmienność lokalizacji i liczby żył lędźwiowych i tętnic. Zobacz Rysunek 4 dla odniesienia do obszarów o wysokim ryzyku krwawienia z tej sekcji.
   5. Dokładnie sprawdź, czy aorta jest obwodowo odizolowana od IVC i otaczających mięśni tak bardzo, jak to możliwe, z dokładnym wypreparowaniem wokół segmentów aorty połączonych przez IMA i tętnic lędźwiowych.
   6. Umieść pasek rękawicy wzdłuż prawej i lewej krawędzi aorty, jak pokazano na rysunku Rysunek 5A. Postaraj się pokryć jak największą część IVC.
   7. Użyj suwmiarki ręcznej, aby zmierzyć najszerszą średnicę aorty i zapisz trzy pomiary. Spryskaj końcówki suwmiarki 70% EtOH przed i po pomiarach. Unikaj bezpośredniego kontaktu aorty z końcówkami zacisku, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
      UWAGA: Można również wykorzystać zdjęcia wykonane za pomocą skalibrowanego mikroskopu wyposażonego w aparat.

Rysunek 3: Anatomia dopływu krwi do dolnej części brzucha, miednicy i zaotrzewnowej myszy. Skróty: R = prawo; L = w lewo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Miejsca wysokiego ryzyka urazów i krwotoków podczas rozwarstwienia zaotrzewnowego i obwodowej izolacji aorty podnerkowej. Skróty: L = lewo; IMA = tętnica krezkowa dolna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Śródoperacyjne reakcje na aplikację elastazy lub pozorowanie podczas mysiego modelu AAA elastazy/BAPN. (A) Segmenty rękawicy są umieszczane wzdłuż aorty przed zastosowaniem elastazy, aby pomóc chronić IVC i jelita przed narażeniem na elastazę, jednocześnie utrzymując aortę nasączoną elastazą (B) Zastosowanie denaturowanej elastazy nie powoduje rozszerzenia aorty (blue box). Maksymalna średnica aorty wynosiła 0,627 mm na linii podstawowej, a następnie 0,607 mm po 5 minutach miejscowej denaturowanej elastazy. (C) Zastosowanie elastazy powoduje rozszerzenie aorty po 5 minutach leczenia. W tym przykładzie aorta (zielona) rozszerzyła się do 0,953 mm z 0,607 mm, co oznacza wzrost średnicy o 57%. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Aplikacja elastazy:
   1. Użyj wacika z bawełnianą końcówką, aby zetrzeć nadmiar krwi lub płynu z aorty.
   2. Następnie umieść kawałek suchej gazy o wymiarach 10 mm x 2 mm na wierzchu aorty. Za pomocą pipety dozuj 5 μl elastazy (lub kontroluj zdenaturowaną elastazę) w celu nasycenia gazy i aorty. Delikatnie zawiń kawałki rękawicy wokół aorty.
      UWAGA: Aby przygotować elastazę denaturowaną do stosowania w grupach pozorowanych lub kontrolnych, elastazę należy gotować w temperaturze 100 °C przez 30 minut.
   3. Odczekaj 5 minut, aby elastaza zaczęła oddziaływać na aortę. Podczas tego okresu inkubacji, jeśli jest to wymagane, należy uwolnić część napięcia wytwarzanego przez wałek brzuszny i zwijacz skóry.
      UWAGA: Ze względu na efekt wsadowy z elastazą, zachęcamy badaczy do używania tej samej butelki elastazy do wszystkich eksperymentów w ramach danego badania. Z każdą nową butelką elastazy zalecamy wykonanie reakcji na dawkę, aby upewnić się, że nie ma przytłaczającej liczby wczesnych pęknięć (przed 4 tygodniami). Czas aplikacji elastazy można również regulować w zakresie od 4 do 6 minut, w zależności od reakcji na elastazę.
   4. Po 5 minutach zresetuj retrakcję jelit i rozłóż kawałki rękawicy. Przepłukać jamę brzuszną 1 ml ciepłej 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, jednocześnie ostrożnie usuwając gazę i kawałki rękawicy z aorty. Wchłonąć sól fizjologiczną znajdującą się w jamie brzusznej za pomocą gazy o wymiarach 10 mm x 10 mm. Powtórz irygację jamy brzusznej, w sumie 3 x 1 ml.
   5. Użyj suwmiarki ręcznej, aby ponownie zmierzyć najszerszą średnicę aorty po nałożeniu elastazy i nagraj 3x. Zobacz Rysunek 5B,C dla przykładów rozszerzenia aorty do leczenia pozorowaną i aktywną elastazą.
      UWAGA: Średnie z trzech pomiarów przed i po elastazie można wykorzystać do obliczenia procentowej zmiany średnicy aorty podczas leczenia. Zazwyczaj bezpośrednio po leczeniu elastazą występuje zauważalne rozszerzenie ~ 30-50%, co może pomóc w zapewnieniu, że elastaza jest funkcjonalna, a aorta była odpowiednio leczona. Średnica aorty nie powinna zmieniać się po zastosowaniu denaturowanej elastazy lub może być nieco mniejsza (prawdopodobnie z powodu skurczu).
5. Zamknięcie jamy brzusznej:
   1. Ostrożnie wyjmij rolkę brzuszną spod jelita i wyjmij ją z ciała. W razie potrzeby nałóż dodatkową sól fizjologiczną na jelita, aby zapobiec przywieraniu do wału brzusznego podczas usuwania. Sprawdź, czy jelito jest różowe i odpowiednio ukrwione.
      UWAGA: Nie ma potrzeby próbowania przestawienia jelita z powrotem na jego pierwotne miejsce; Próba tego może grozić skręceniem jelit lub przepuklinami wewnętrznymi.
   2. Wykonaj reaproksymację powięzi brzusznej za pomocą niewchłanialnego szwu monofilamentowego 5-0. Zamknij skórę za pomocą 3-4 zszywek do skóry.

6. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami

1. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej z lampą grzewczą. Upewnij się, że temperatura klatki jest ciepła, a nie gorąca.
2. Podawać 0,5-1 ml bolusa płynu podskórnego z 0,9% soli fizjologicznej.
3. Pozwól myszy samodzielnie dojść do siebie w ogrzanej klatce przez ~ 20 minut, aż stanie się aktywna zgodnie z protokołem instytucjonalnym, a następnie wróć do klatki w pomieszczeniu.
4. Zgodnie z protokołem instytucjonalnym karprofen należy podawać w dawce 20 mg/kg mc. po 24 godzinach po zabiegu w 1. dniu po operacji i kontynuować codziennie przez 3 dni.

7. Pomiar aorty i pobieranie tkanek

1. Po eutanazji z izofluranem i zwichnięciu szyjki macicy należy ponownie otworzyć jamę brzuszną. Przedłuż nacięcie przez mostek, aby uzyskać dostęp do klatki piersiowej. Wyciąć prawe przedsionki i przetoczyć lewą komorę 10 ml zimnego 1% roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco przez 2 minuty. Wyciąć płuca, wątrobę i śledzionę.
   UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić jelita; Rozlanie zawartości jelitowej może mieć wpływ na analizę tkanek.
2. Odsłoń aortę brzuszną i zmierz maksymalną średnicę aorty podnerkowej, jak opisano powyżej. Kontynuuj sekcję całej aorty i serca. Po odizolowaniu serca i aorty przetnij wszystkie gałęzie tętnicze i wspólne tętnice biodrowe, pozostawiając nienaruszone krótkie odcinki na aorcie. Umieść serce i aortę na kontrastowym tle obok linijki i obrazu.

8. Analiza danych i raportowanie

1. Aby uwzględnić błąd ludzki, zmierz średnicę aorty co najmniej 3 razy każda podczas korzystania z suwmiarki ręcznej, a następnie podaj średnicę jako wartość uśrednioną.
2. Zdefiniuj AAA jako 50% wzrost zdrowej średnicy aorty. Pamiętaj, aby w wynikach badania uwzględnić zarówno średnicę brutto aorty, jak i procentową zmianę średnicy.

Wyniki

W tym badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6J w wieku 22-24 tygodni. Aorty podnerkowe leczono 5 μl enzymu elastazy (6,9 mg białka/ml, 6 jednostek/mg białka) lub denaturowaną elastazą przez 5 minut. Samce myszy leczone elastazą wykazały 43,4% wzrost średnicy aorty po 5 minutach ekspozycji na elastazę w porównaniu z nieleczoną wyjściową średnicą aorty, podczas gdy leczone aorty żeńskie wzrosły o 33,6% (P = 0,0342). Średnice aorty pozorów nie wykazywały względnie żadnych zmian w ciągu 5 minut ekspozycji na denaturowaną elastazę (mężczyźni 0,5%; kobiety -2,8%). Nie było zgonów związanych z chirurgią wśród 12 leczonych i 6 pozorowanych myszy. Dane dotyczące 28-dniowego badania przedstawiono w Tabeli 1. Spośród leczonych samic myszy 3 z 6 zmarły z powodu pęknięcia AAA; jeden w 20 dniu po operacji i dwa w 25 dniu (Ryc. 6). Nie stwierdzono pęknięć AAA wśród leczonych mężczyzn. AAA (zdefiniowane jako wzrost >50% wyjściowej średnicy aorty lub śmierć w wyniku pęknięcia AAA) zostały skutecznie wywołane u wszystkich leczonych myszy (12 z 12). Po 28 dniach średnia średnica AAA leczonych samców wynosiła 2,86 ± 0,31 mm, ze średnią zmianą procentową zmiany wynoszącą 257 ± 54%, podczas gdy średnice AAA u leczonych samic myszy, które przeżyły, wynosiły 3,60 ± 1,87 mm, ze średnią zmianą procentową 417 ± 286% (Ryc. 7). Myszy pozorowane nie wykazywały stosunkowo żadnych zmian w średnicach aorty.

Rysunek 6: Przeżywalność samców i samic myszy B6 podczas 28-dniowego modelu AAA z elastazą/BAPN. (A) Pęknięcie AAA wystąpiło u 3 z 6 leczonych samic myszy (jedna mysz po 20 dniach, a następnie dwie myszy po 25 dniach), podczas gdy nie było pęknięć wśród 6 leczonych samców myszy po 28 dniach. (B) Reprezentatywne zdjęcia podczas sekcji zwłok samicy myszy, która zmarła z powodu pęknięcia AAA. O pęknięciu tętniaka opłucnowego świadczy duży krwiak zaotrzewnowy (po lewej) i obecność tętniaka podnerkowego z ubytkiem ściany (po prawej). Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Maksymalne średnice aorty u elastazy/BAPN oraz pozorowanych samców i samic myszy B6 po 28 dniach. (A) Leczone myszy wykazują znacznie większe średnice podnerkowe po 28 dniach w porównaniu do myszy pozorowanych. (B) Połączenie elastazy i BAPN z powodzeniem wytwarza duże podnerkowe AAA zarówno u samców, jak i samic myszy B6. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

			B6 piesek Sham	B6 samica Sham	B6 mężczyzna Elastaza/BAPN	B6 samica Elastaza/BAPN
Liczba myszy			3	3	6	6
Wiek (tygodnie)			22,3 ± 0,0	22,7 ± 0,7	23,1 ± 0,2	23,2 ± 0,2
Waga (g; podczas operacji)			36,3 ± 2,5	23,7 ± 1,2	32,8 ± 1,7*	23,7 ± 0,8
Średnica aorty przed leczeniem (mm)			0,89 ± 0,02	0,75 ± 0,04	0,81 ± 0,07	0,73 ± 0,09
Średnica aorty po leczeniu (mm)			0,90 ± 0,03	0,73 ± 0,01	1,15 ± 0,03**	0,98 ± 0,12**
Procentowa zmiana po 5 minutowym leczeniu (%)			0,5 ± 4,4	-2,8 ± 5,3	43,4 ± 10,2***	33,6 ± 4,5***
częstość występowania AAA (%)			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
AAA pęka o 28 dni			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
Czas przeżycia do 28 dni			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
Maksymalna średnica aorty po 28 dniach (mm)			0,85 ± 0,01	0,64 ± 0,01	2,86 ± 0,31*	3,60 ± 1,87**
Procentowa zmiana średnicy aorty po 28 dniach (%)			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

Tabela 1: Wyniki 28-dniowego modelu mysiego modelu AAA z elastazy/BAPN. Dane są średnie ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 w porównaniu z pozorowanym u tej samej płci za pomocą jednoczynnikowego testu Fischera ANOVA. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej.

Dyskusja

Zrozumienie złożonej patofizjologii tętniaka aorty ma kluczowe znaczenie dla poprawy leczenia choroby tętniaka aorty. Podczas gdy nowsze strategie są aktywnie opracowywane w celu poprawy wyników chirurgicznych, AAA pozostają powszechne w naszym starzejącym się społeczeństwie, a pęknięcie tętniaka pozostaje główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych¹⁰. W związku z tym niezaspokojone potrzeby w zakresie strategii wykrywania, zapobiegania i leczenia tętniaków AAA uzasadniają dalsze podstawowe badania nad tętniakami¹¹.

Modele zwierzęce, które dokładnie i skutecznie podsumowują cechy i zachowania ludzkich AAA, są niezbędne do mechanistycznych badań patofizjologii tętniaków i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Podczas gdy obecne modele zwierzęce mogą naśladować główne aspekty zmian tętniakowych, które występują w chorobach ludzkich, żaden pojedynczy model nie reprezentuje w pełni prawdziwej złożoności ludzkich tętniaków. Obecnie myszy są najszerzej akceptowanym gatunkiem do modelowania AAA u zwierząt. Badacze powinni rozważyć różne mocne i słabe strony każdego modelu mysiego dla konkretnego badania tętniaka, takie jak te fachowo opisane w przeglądach Daugherty'ego i wsp. oraz Buscha i ^wsp.12,13.

Zastosowanie elastazy do indukcji AAA u gryzoni zostało po raz pierwszy opisane przez Anidjara i wsp. w 1990^roku. Perfuzja aorty elastazą trzustkową świni za pomocą pompy strzykawkowej powoduje początkowe rozszerzenie w przybliżeniu od 50% do 70%, a rozszerzone segmenty korzystnie wykazują podobne cechy patologiczne ludzkich tętniaków, takie jak zwyrodnienie przyśrodkowe i zapalenie przybyszowe. Klasyczny model perfuzji jest jednak prawdopodobnie najtrudniejszym technicznie modelem tętniaka, a tętniaki, które zwykle powstają w drugim tygodniu, zaczynają stopniowo ustępować. Bhamidipati i in. w 2012 roku wykazali, że przypadkowe stosowanie elastazy może również z powodzeniem wywołać podobne tętniaki, które są bardziej powtarzalne w rozmiarze¹⁵. Znacznie mniej wymagający model, miejscowy model elastazy stał się szeroko stosowany w badaniach nad tętniakami. Dodatkowa metodologia i zalety miejscowego modelu elastazy zostały omówione w artykule metodowym autorstwa Xue i współpracowników¹⁶.

Model elastazy/BAPN mysiego AAA został opracowany przez Lu i współpracowników w 2017 roku⁸. Wprowadzenie wody pitnej o stężeniu 0,2% BAPN poprawiło wiele krytycznych uwag dotyczących klasycznego modelu elastazy miejscowej, obecnie powodując tętniaki, które stale się rozszerzają, aż do punktu pęknięcia AAA. W badaniu z 2017 r. wykazali, że myszy w grupie leczonej elastazą/BAPN miały znacznie wyższe wskaźniki tworzenia AAA w porównaniu z grupą elastazy (93% vs 65%, P < 0,01), które były również bardziej zaawansowanymi AAA. W ciągu 100-dniowego okresu badania AAA w grupie elastazy/BAPN nadal rozszerzały się do >800% średnicy wyjściowej i tworzyły skrzeplinę śródświateł (53,8%), a 46,2% spontanicznie pękło przed końcem eksperymentu. Model ten pozwolił naukowcom na zbadanie czynników, które mogą wpływać na postęp tętniaka i stabilność w czasie.

Berman i wsp. dalej badali model elastazy/BAPN, zmieniając stężenie miejscowej elastazy, czas trwania badania, czas podawania BAPN i wpływ płci zwierząt⁹. Leczenie 5 μl elastazy o wyższym stężeniu (5 mg/ml lub 10 mg/ml) powodowało większe tętniaki niż 2,5 mg/ml w ciągu 56 dni. Częstość powstawania skrzepliny wewnątrzświetlnej zależała również od stężenia elastazy, które wystąpiło u 28,6% myszy leczonych dawką 5 mg/ml i 62,5% myszy leczonych dawką 10 mg/ml. Wykazali również, że model elastazy/BAPN może indukować tętniaki u samic myszy. Chociaż badano tylko kilka samic myszy (n = 5), stwierdzono, że tętniaki u samic były bardziej podatne na pęknięcie (2 z 5 myszy) i były znacznie większe niż u samców AAA po 56 dniach.

W tym artykule staramy się przedstawić metodę rozwiązania jednego z największych ograniczeń modelowania chirurgicznego, jakim jest zmienność procedury chirurgicznej. Bez wyraźnego konsensusu co do stopnia rozwarstwienia i obszaru aorty poddanego działaniu elastazy, wyniki tego modelu mogą się znacznie różnić w zależności od zwierząt, badaczy i instytucji. Zaobserwowaliśmy liczne różnice anatomiczne między myszami, w tym między innymi liczbę i wielkość tętnic i żył lędźwiowych oraz lokalizację IMA, start lewej żyły gonadalnej, co może być ograniczające przy próbie leczenia tylko części lub określonego odcinka aorty podnerkowej. Tutaj pokazujemy, że obwodowe rozwarstwienie całej długości aorty podnerkowej od lewej tętnicy nerkowej proksymalnie do dystalnego rozwidlenia aorty pomaga zapewnić powtarzalne stopnie ekspozycji aorty pomimo różnic anatomicznych, jednocześnie zwiększając powodzenie indukcji tętniaka i zapewniając jasne granice dla operatora. Ponadto rozmiar i bardziej przednie położenie IVC ma tendencję do pokrywania większości aorty, co może wpływać na ilość leczonej aorty, jeśli nie zostanie odizolowana od IVC. Chociaż konieczne jest usunięcie powięzi zaotrzewnowej w celu odsłonięcia aorty, ważne jest, aby nie preparować w pełni tkanki łącznej przydanki z aorty i odsłaniać żadnej z warstw pożywki, ponieważ zwykle powoduje to pęknięcie podczas 5-minutowego okresu inkubacji elastazy. Może to służyć jako dodatkowa kontrola wewnętrzna stopnia rozbioru za pomocą tego modelu, ale może być frustrującą krzywą uczenia się przy przyjmowaniu tego modelu. Operatorzy dodatkowo poznają obszary podwyższonego ryzyka (ryc. 4), które mogą łatwo ulec uszkodzeniu podczas operacji i doprowadzić do niekontrolowanego krwotoku.

Chociaż ważne jest, aby kroki proceduralne tego modelu były spójne, czas trwania badania i czas ultrasonografii interwałowej mogą się różnić w zależności od celu badania. Rozszerzenie aorty rozpoczyna się natychmiast po zastosowaniu elastazy, jednak badania wykorzystujące ten model zwykle obserwuje myszy przez 28 dni po operacji⁷, jak w tym przykładowym eksperymencie. Wydłużenie czasu trwania badania powinno być brane pod uwagę w przypadku badania zaawansowanych tętniaków, długoterminowego wzrostu, tworzenia się skrzepliny śródświetlnej lub pęknięcia.

Dodatkowe środki okołooperacyjne, takie jak utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia i stanu nawodnienia, mogą pomóc w poprawie przeżywalności zwierząt po tej inwazyjnej procedurze. Użycie poduszki grzewczej podczas operacji i umieszczenie w ciepłej klatce rekonwalescencji może pomóc uniknąć hipotermii. Sól fizjologiczną należy podgrzać przed użyciem do płukania jamy brzusznej. Podskórny bolus płynowy bezpośrednio po operacji może odpowiadać za niewyczuwalne straty płynów podczas operacji i pomóc zwierzęciu w utrzymaniu odpowiedniego nawodnienia w bezpośredniej fazie rekonwalescencji. Dzięki starannemu obchodzeniu się z tkankami i konsekwentnemu podejściu metodycznym, model elastazy/BAPN może być wykonywany przez doświadczonego operatora od 30 do 45 minut na mysz i niezawodnie wytwarza AAA przy bardzo niskiej liczbie powikłań okołooperacyjnych.

Nasze wyniki pokazują, że połączenie BAPN wraz z obwodowym rozwarstwieniem aorty podnerkowej przed zastosowaniem elastazy powoduje powstawanie dużych, stale rozszerzających się tętniaków tętniaka o większych średnicach i częstości pęknięć w krótszych okresach. W tym eksperymencie AAA zostały z powodzeniem wywołane u wszystkich samców (6 z 6) i samic (6 z 6) myszy leczonych aktywną elastazą. Ekspozycja na elastazę przez 5 minut spowodowała natychmiastowy wzrost średnicy aorty o około 30-40%, co jest pomocne w potwierdzeniu skutecznego i konsekwentnego stosowania elastazy w grupach leczonych. Podobnie jak Berman i wsp., wykazaliśmy, że ten model może indukować AAA u samic myszy, które również mają większą reakcję na pęknięcie niż samce. Połowa samic myszy (3 z 6) pękła w ciągu 28 dni, w porównaniu do 0 z 6 samców, jednak samice myszy ważą mniej niż samce. Samce myszy wykazały wzrost średnicy AAA o 257% w porównaniu z -4% samców z grupy kontrolnej, podczas gdy samice, które przeżyły, wykazały wzrost średnicy o 417%, w porównaniu do -16% samic z grupy kontrolnej. Średnice aorty nie różniły się znacząco między samcami i samicami, które przeżyły po 28 dniach, ze względu na większą liczbę pęknięć w grupie żeńskiej. Spekulujemy, że myszy pozorowane wykazują mniejsze średnice aorty pod koniec badania, ponieważ aorta ma tendencję do niewielkiego rozszerzania się podczas początkowego rozwarstwienia, a następnie tworzy tkankę bliznowatą przez 28 dni.

Model elastaza/BAPN ma pewne ograniczenia. Obwodowe rozwarstwienie aorty wymaga doskonałych umiejętności chirurgicznych, ale pomaga poprawić powtarzalność i stopień indukcji tętniaka. Podobnie jak w przypadku miejscowego modelu elastazy, występuje również efekt wsadowy w aktywności enzymu elastazy, który, jak wspomniano wcześniej, jest dlatego ważne jest, aby użyć tej samej butelki elastazy dla wszystkich zwierząt w danym doświadczeniu. Chociaż częstość występowania zakrzepów śródświetlnych i pęknięcia tętniaka AAA wzrasta wraz z upływem czasu i nasileniem tętniaka, w tym modelu nie są one gwarantowane ani w pełni przewidywalne.

Podsumowując, model elastazy/BAPN wytwarza duże, prawdziwe podnerkowe tętniaki tętniakowe zarówno u samców, jak i samic myszy, które stopniowo rozszerzają się w czasie, tworzą śródświetlną skrzeplinę i są zdolne do pęknięcia. Te mocne strony tego mysiego modelu pomagają lepiej podsumować niektóre zachowania i cechy tętniaków u ludzi. Chociaż jest to technicznie trudne, staranne i dokładne rozwarstwienie aorty może zwiększyć odpowiedź tętniaka. Obecnie metoda elastazy/BAPN jest zaawansowanym modelem do badania tętniaków aorty brzusznej podnerkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora indukcyjna 0,5 l	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS	komora indukcyjna anestezjologiczna
0,9% chlorku sodu do wstrzykiwań, USP, 20 ml	Hospira	NDC 0409-4888-03	sól fizjologiczna zwykła
strzykawka 3 ml Końcówka Luer-Lok z igłą BD PrecisionGlide 22 G x 3/4	BD	REF 309569	strzykawka, igła 22 G
Fumaran 3-aminopropionitrylu	TCI	A0796	BAPN
3-aminopropionitryl sól fumaranu	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Avant Delux gąbki z gazy, 2" x 2" 4-warstwowe	gąbki z gazy	Medline	NON26224
Maszynka do strzyżenia łysienia	Whal Clipper Corporation	8110	maszynka do strzyżenia włosów
betadyna peeling chirurgiczny (powidon-jod, 7,5%)	Avrio	NCD 67618-154-16	betadyna szorowanie chirurgiczne
kleszcze	ROBOZ	RS-5130	kleszcze
Buprenorfina ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	buprenorfina
karprofen	Norbrook	NDC 55529-131-11	karprofen
CASTROVIEJO 5,75" prosty z zamkiem	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo igłownik
aplikatory drewniane z bawełnianą końcówką, 6"	Dynarex	nr 4302	aplikatory do drewna z końcówką bawełnianą
Kącik DESMARRES 5,5'	Ściągacz do skóry ROBOZ	RS-6672
suwmiarka cyfrowa, 0-150 mm	World Precision Instruments	501601	suwmiarka cyfrowa
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
Elastaza z trzonki świni Typ I	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	elastaza >4,0 jednostek/mg białka
Etanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701	etanol rozcieńczony do 70%
lubrykantu do oczu	Optixcare	14716	smar do oczu
Suchy sterylizator Germinator 500	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	sterylizator suchych kulek
mata do terapii cieplnej	Adroit Medical Systems	V016	mata do terapii cieplnej
do terapii cieplnej	Adroit Medical Systems	HTP-1500	pompa do terapii cieplnej
izofluran, USP	Akorn Animal Health	NCD 59399-106-01	izofluran
Pipeta L-10	Pipeta	Rainin LTS 0,5-10 uL
Niskoprofilowa maska anestezjologiczna, mała	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	znieczulenie stożek nosowy
nożyczki mikro dysektorowe	nożycowy mikro dyparowy	ROBOZ	RS-5619
	Mikroskop	Leica	S9i
Oświetlacz LED o wysokiej intensywności Oświetlacz LED o wysokiej intensywnościŚwiatło wyjściowe LED	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED	zewnętrzna preparacja lekka
nylonowa 5-0 monofilamentowa, niewchłanialna szew	Oasis	MV-661-V	5-0 nylonowe
rękawice chirurgiczne z poliizoprenu, GAMMEX Non-Latex PI Micro, rozmiar 7,5		Nielateksowe rękawice chirurgiczne	Ansell
Klipsy do ran ze stali nierdzewnej Reflex 7 mm	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	rana Skala klipsów
		Ohaus Compass CR2200	skala
SomnofFlo Zestaw akcesoriów	Kent Scientific Corporation	10-8000-71	rurka do parownika elektronicznego
Waporyzator elektroniczny SomnoFlo	Scientific Corporation	SF2992	parownik elektroniczny o niskim przepływie
Przełącznik przepływu SomnoPath	Kent Scientific Corporation	SP1016	do parownika elektronicznego
Kleszcze ostre SS/45	Ostre		RS-4941
	Nożyczki
chirurgiczne ROBOZ RS-6010SCkleszcze do naczyń	Dumont	VES 0,35	kleszcze do naczyń