Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66823

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, 2MOE Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, Institute of Molecular Medicine, College of Future Technology, Peking University, 4Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 5College of Engineering, Peking University, 6Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Streszczenie

Technologie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) były szeroko stosowane w odkrywaniu leków, modelowaniu chorób i medycynie regeneracyjnej. Jednak dostępne systemy różnicowania komórek PSC do funkcjonalnego są utrudnione przez problemy z dużą zmiennością między liniami i między partiami. Dlatego tak ważna jest precyzyjna kontrola różnicowania komórek w czasie rzeczywistym. W tym protokole opisujemy nieinwazyjną i inteligentną strategię, która pokonuje zmienność różnicowania komórek za pomocą uczenia maszynowego opartego na obrazie w jasnym polu. Biorąc za przykład różnicowanie PSC do kardiomiocytów, metodologia ta dostarcza szczegółowych informacji na temat kontroli początkowego stanu PSC, wczesnej oceny i interwencji w warunkach różnicowania oraz eliminacji nieprawidłowo zróżnicowanego zanieczyszczenia komórek, razem realizując niezmiennie wysoką jakość różnicowania od PSC do funkcjonalnych komórek. Zasadniczo strategia ta może zostać rozszerzona na inne systemy różnicowania lub przeprogramowania komórek z wieloma etapami wspierającymi produkcję komórek, a także pogłębiającymi zrozumienie mechanizmów podczas przekształcania losu komórki.

Wprowadzenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) posiadają niezwykłą zdolność do różnicowania się w wiele typów komórek in vitro. Te zróżnicowane funkcjonalne komórki mogą być wykorzystywane do terapii komórkowej, modelowania chorób i opracowywania leków, a wszystko to jest cenne dla badań lub zastosowań klinicznych1,2,3. Na przykład opracowano różne metody różnicowania PSC w kardiomiocyty (CM)4,5,6,7. Te CM mogą być stosowane do badań kardiotoksyczności leków, modelowania chorób serca i przeszczepiania komórek8,9,10,11.

Jednak konwersja z PSC do końcowych komórek zróżnicowanych jest procesem stopniowym, a wielokrotne zakłócenia podczas procesu różnicowania mogą prowadzić komórki do rozbieżnych losów komórek. Różne tła genetyczne i cechy epigenetyczne linii PSC wpływają na potencjał różnicowania do określonej linii12,13,14,15; liczba pasaży PSC i skumulowane mutacje genów są również źródłem niejednorodności PSC; Różnice w operacjach eksperymentalnych stosowanych przez różnych eksperymentatorów mogą również prowadzić do zupełnie różnych wyników różnicowania16,17,18,19,20. Dlatego obecnie jednym z głównych problemów w produkcji komórek pochodzących z PSC jest niestabilność między liniami komórkowymi i partiami21,22,23,24,25. Niestabilność w różnicowaniu PSC często prowadzi do wielu powtarzających się eksperymentów, co pochłania znaczne ilości czasu i zasobów pracy. Aby rozwiązać ten problem, konieczne jest opracowanie strategii, która zminimalizuje zmienność między liniami komórkowymi i partiami, zwiększając w ten sposób stabilność i odporność różnicowania.

Ostatnio postępy w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości i uczeniu maszynowym (ML) ułatwiły zastosowanie ilościowej analizy obrazu opartej na ML w biologii komórki, umożliwiając wykorzystanie cennych informacji w funkcjach obrazowania komórek26,27,28,29,30,31,32,33,34. W naszej poprzedniej pracy zaproponowaliśmy strategię uczenia maszynowego opartą na obrazie żywych komórek, aby monitorować i interweniować w stan różnicowania PSC w czasie rzeczywistym w celu poprawy stabilności i wydajności różnicowania PSC (Rysunek 1)35. Biorąc za przykład różnicowanie PSC do kardiomiocytów, oceniliśmy początkowy stan PSC za pomocą losowych modeli lasu, przewidzieliśmy optymalny warunek różnicowania za pomocą modeli regresji logistycznej i rozpoznaliśmy pomyślnie zróżnicowane komórki za pomocą opartego na głębokim uczeniu Grad-CAM36 i pix2pix37. Modele uczenia maszynowego nauczyły się identyfikować linie komórkowe na podstawie szeregu cech morfologicznych jasnego pola, w tym cech obszaru, obwodu, wypukłości, solidności, jasności, prędkości ruchu i innych niejawnych cech wyodrębnionych przez głębokie konwolucyjne sieci neuronowe. Opierając się na wnioskach z tych ustalonych modeli uczenia maszynowego, zrealizowaliśmy kontrolę początkowego stanu PSC, wczesną ocenę i interwencję w warunkach różnicowania oraz eliminację nieprawidłowo zróżnicowanego zanieczyszczenia komórek, zapewniając razem kompleksową i dokładną modulację procesu różnicowania serca. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący opracowania strategii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Różnicowanie i charakterystyka komórek

  1. Przygotowanie odczynników do hodowli i płytek hodowlanych
    1. Przygotować pożywkę hodowlaną PSC, dodając 2 ml suplementu i 0,2% penicyliny-streptomycyny do 48 ml podłoża podstawowego. Porcję i przechowywać suplement w temperaturze -20 °C. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
    2. Przygotować pożywkę do przygotowania PSC, dodając 1 ml suplementu i 0,2% penicyliny-streptomycyny do 500 ml podłoża podstawowego. Podczas używania podgrzej podłoże do jednorazowego użycia i przechowuj je w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.
    3. Przygotować pożywkę różnicującą CM, dodając 1x suplement B27 minus insulinę i 1% penicyliny-streptomycyny do RPMI 1640. Przygotuj pożywkę podtrzymującą CM, dodając 1x suplement B27 i 1% penicyliny-streptomycyny do RPMI 1640. Przechowywać te dwa rodzaje pożywki w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
    4. Zanurz Matrigel w lodzie i utrzymuj go w temperaturze 4 °C przez noc. Upewnij się, że Matrigel jest całkowicie rozmrożony; następnie podzielić podwielokrotność na 1 ml podwielokrotności przechowywanych w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia i dodać 1 ml Matrigel do 49 ml DMEM/F12 w temperaturze 4 °C w celu przygotowania roztworu roboczego Matrigel. Dodać 850 μl roztworu roboczego Matrigel do dołka na 6-dołkowej płytce hodowlanej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Do 96-dołkowej płytki hodowlanej stosowanej w różnicowaniu CM dodać 35 μl roztworu roboczego Matrigel na studzienkę.
      UWAGA: Trzymaj Matrigel na lodzie przez cały czas; Końcówki i probówki do pipet powinny być wstępnie schłodzone w temperaturze 4 °C. Roztwór roboczy Matrigel można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas pipetowania roztworu roboczego Matrigel.
  2. Konserwacja i przejazd PSC
    1. Utrzymuj PSC w 6-dołkowych płytkach hodowlanych. Potwierdź gęstość komórek pod mikroskopem i przygotuj się do przejścia, gdy zbieg osiągnie ~70% (Rysunek 2A).
    2. Użyj EDTA do trawienia komórek w celu pasażowania. Ogrzać pożywkę PSC, PBS i EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dodać Y27632 do pożywki do końcowego stężenia 5 μM.
    3. Przemyć PSC 1 ml PBS, dodać 1 ml EDTA do dołka i inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    4. Odessać EDTA, zanim komórki oderwą się od płytki hodowlanej, a następnie użyć 1 ml pożywki hodowlanej PSC, aby delikatnie przepłukać dno studzienki 3-4x w celu ponownego zawieszenia komórek.
      UWAGA: Pozwala nam to pominąć etap wirowania i zmniejszyć uszkodzenia komórek podczas operacji pasażowania.
    5. Odessać DMEM/F12 z dołka pokrytego Matrigelem na 6-dołkowej płytce hodowlanej i dodać 2 ml świeżej pożywki hodowlanej PSC na basenik (dodano Y27632). Dodaj zawiesinę komórek do studzienek w stosunku podziału 1:6 do 1:12. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    6. Zmień pożywkę hodowlaną PSC (bez Y27632) od 12 do 24 godzin po pasażowaniu; następnie zmień pożywkę i codziennie sprawdzaj stan komórek i konfluencję.
  3. Różnicowanie sercowe PSC
    1. W celu różnicowania CM należy wysiać PSC na 96-dołkową płytkę hodowlaną w pożywce przygotowawczej PSC (dodano Y27632). W celu różnicowania CM wykonaj te same kroki powyżej (kroki 1.2.2-1.2.6), aby wysiać PSC na 96-dołkową płytkę hodowlaną w pożywce przygotowawczej PSC (dodano Y27632).
      UWAGA: Na tym etapie czas trwania leczenia EDTA może być odpowiednio wydłużony (5 minut lub więcej), aby wystarczająco zdysocjować PSC, tak aby klony mogły być mniejsze po pasażu. Nasze badanie wykazało, że na tym samym obszarze mniejsze kolonie sprzyjają różnicowaniu.
    2. Etap I: Gdy PSC osiągną zbieżność 80-90%, zmień pożywkę na pożywkę różnicującą CM z 2-20 μM CHIR99021 (CHIR) (Rysunek 2B). Punkt czasowy przełączania medium jest określany jako dzień 0. Po 24-48 h zabiegu CHIR zmienić pożywkę na świeżą pożywkę różnicującą CM.
      UWAGA: CHIR jest inhibitorem GSK3beta do indukcji mezodermy. Optymalna dawka CHIR dla różnicowania CM zmienia się w zależności od różnych linii komórkowych i partii. Na przykład optymalna dawka CHIR wynosi 8-10 μM, 48 godzin dla iPS-B1. Aby zebrać różnorodne obrazy w jasnym polu do trenowania modelu uczenia maszynowego, tutaj miareczkowaliśmy stężenia CHIR dla każdej partii eksperymentów dla różnych wydajności różnicowania.
    3. Etap II: Po 72 godzinach (dzień 3) zastąpić pożywkę pożywką różnicującą CM uzupełnioną 5 μM IWR1 i hodować przez 48 godzin (dzień 5). Zmień pożywkę na pożywkę różnicującą CM na 1-2 dni (do 6-7 dni). W tym momencie PSC różnicują się w komórki progenitorowe serca (CPC).
    4. Etap III: Wymień pożywkę na pożywkę konserwacyjną CM i wymieniaj pożywkę co 3 dni. W dniu 10 lub 12 zbierz CM do dalszej analizy.
  4. Barwienie immunofluorescencyjne CM
    1. W dniu 10 lub 12 umyj komórki PBS i utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj CM 2x PBS i przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C do ~1 tygodnia.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksycznym odczynnikiem o ostrym zapachu. Używaj w kapturze chemicznym i chroń oczy i ręce.
    2. W czasie barwienia potraktuj komórki roztworem przepuszczalnym (0,1% Triton X-100 w PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej; następnie inkubuj komórki w roztworze blokującym (0,1% Triton X-100 zawierający 3% surowicy osła w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem troponiny sercowej T (cTnT) (1:300) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C w celu identyfikacji CM.
      1. Zebrać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć komórki PBS 3x. Inkubować próbkę z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemnym otoczeniu.
        UWAGA: Pobrane przeciwciało pierwszorzędowe może być ponownie użyte 2-3 razy w ciągu 1 tygodnia.
    4. Usuń przeciwciało drugorzędowe z komórek i przemyj komórki 3x PBS. Użyj Hoechst 33342 (1:1,000 w PBS) do barwienia jąder przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórkę 3x za pomocą PBS i dodaj 100 μl PBS na studzienkę, aby uniknąć wysuszenia. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu i uzyskać obrazy fluorescencyjne w ciągu 1 tygodnia.

2. Akwizycja strumienia obrazu w całym procesie różnicowania

  1. Przygotowanie eksperymentalnego projektu do zbierania obrazów
    1. Użyj zautomatyzowanego mikroskopu wspierającego hodowlę żywych komórek i obrazowanie, aby zebrać obrazy w jasnym polu różnych etapów różnicowania CM i immunofluorescencyjne obrazy cTnT wyniku różnicowania (Figura 2A-E). Użyj oprogramowania obsługującego mikroskop, aby zaprojektować program eksperymentu i sterować mikroskopem.
    2. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy projekt eksperymentalny. Wybierz obiektyw 5x i tubus 2x do obrazowania. Sprawdź opcje Kafelki i Z-stack
      3. .
    3. Dodaj kanał TL Brightfield do obrazowania w jasnym polu w menu Kanały. Dodaj kanały AF488 i H3342 do obrazowania immunofluorescencyjnego. Zmodyfikuj ścieżkę światła w menu Imaging Setup (Ustawienia obrazowania) w celu obrazowania za pomocą zewnętrznej kamery cyfrowej CMOS.
    4. Otwórz menu Tryb akwizycji i ustaw binning 2 x 2, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
    5. Otwórz menu Z-stack i wybierz model Center. Ustawianie liczby plasterków i interwałów podczas skanowania. Wybierz 3-5 plasterków w odstępach 3-6 μm, aby uzyskać ostre obrazy podczas analizy.
    6. W oknie Nawigacja i kafelki skonfiguruj regiony kafelków według przewoźnika i ustaw 25 kafelków (5 kolumn x 5 wierszy) dla jednej studni. W menu Kafelki wybierz szablon Multiwell 96 w Sample Carrier (Nośnik próbki) i ustaw nakładanie się 5%-15% na sąsiednie regiony.
    7. Jeśli wymagane jest ciągłe obrazowanie, zaznacz opcję Seria Time i ustaw czas trwania oraz interwał w menu Szeregi czasowe. W celu zbierania strumienia obrazu na etapie I należy ustawić czas trwania 12 godzin bez interwałów.
  2. Akwizycja obrazów w jasnym polu i obrazów immunofluorescencyjnych
    1. Aby uzyskać obrazy, najpierw umieść płytkę z kulturą komórkową w tacce na próbkę i załaduj próbkę do mikroskopu. Wybierz szablon Multiwell 96, aby dopasować go do projektu eksperymentalnego. Jeżeli próbka składa się z żywych komórek, należy otworzyć system grzewczy i pompę CO2 w celu utrzymania odpowiednich warunków do hodowli (37 °C, 5 % CO2 ).
    2. Otwórz wstępnie ustawiony projekt eksperymentalny i zapisz go jako nowy. Otwórz menu Kafelki i ręcznie skalibruj położenie płytki. W oknie Nawigacja i kafelki wybierz potrzebne studnie i kliknij przycisk Utwórz, aby utworzyć regiony kafelków dla tych studni.
    3. Kliknij opcję Sprawdź regiony kafelków w menu Kafelki i uruchom autofokus, aby zweryfikować wszystkie studnie. Następnie ręcznie skoryguj ostrość każdej studzienki pod jasnym polem, przewijając kółko myszy.
    4. Zaznacz potrzebne kanały i ustaw czasy ekspozycji w menu Kanały. Zalecane czasy naświetlania to 1,625 ms dla jasności, 100 ms dla H3342 i 550 ms dla AF488. Wykonaj pojedynczy snap, aby sprawdzić obrazy wszystkich kanałów.
    5. Na koniec kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment i poczekaj na automatyczne obrazowanie. Zazwyczaj ukończenie skanowania całej 96-dołkowej płytki hodowlanej zajmuje ~1,2 godziny (96 dołków, trzy warstwy, 25 płytek na każdą studzienkę pod jasnym polem). W obszarze Processing framework (Struktura przetwarzania) wybierz opcję Image Export (Eksport obrazu), wybierz typ pliku w nieskompresowanym formacie TIFF lub formacie PNG i zastosuj. Użyj obrazów 9 płytek (3 x 3) w środku studni do dalszej analizy (Rysunek 2A-E).

3. Ustalanie strategii ML opartej na obrazie na każdym etapie procesu różnicowania

  1. Przygotowanie oprogramowania
    1. Zainstaluj środowisko języka Python z pakietami pytorch (1.9.0), numpy, scipy, scikit-learn, pandas, visdom, scikit-image, opencv-python i matplotlib.
    2. Zainstaluj Jupyter Notebook.
    3. Zainstaluj program MATLAB.
    4. Pobierz kod i przykładowe zestawy danych z https://github.com/zhaoyanglab/ML-for-PSC-differentiation.
      UWAGA: Wydajność uczenia maszynowego zależy od jakości zestawów danych oraz wyboru modeli i hiperparametrów. Nie ma gwarancji, że przykładowa implementacja będzie optymalna we wszystkich okolicznościach. Inżynierowie ML powinni dostosować kod i dostosować model oraz hiperparametry do swoich konkretnych potrzeb.
  2. Strategia ML na etapie PSC: Kontrola początkowych stanów kolonii PSC
    Zestaw danych: pary obrazów w jasnym polu po 0 godzinach (przed obróbką CHIR) i końcowa skuteczność różnicowania
    Model: losowy las
    1. Przygotuj zestaw danych składający się z obrazów w jasnym polu po 0 godzinach (przed leczeniem CHIR) i końcowych obrazów fluorescencyjnych cTnT. Aby zwiększyć różnorodność profili morfologicznych obrazów jasnego pola 0 h, należy upewnić się, że zestaw danych obejmuje kolonie PSC z różnych linii komórkowych, z różnicowaniem zainicjowanym w odstępie czasu po pasażu. Traktowanie studni w zbiorze danych optymalnymi warunkami CHIR na etapie I.
      UWAGA: Aby zapewnić, że kolonie są traktowane optymalnymi warunkami CHIR, studzienki w tej samej partii mogą być traktowane miareczkowanymi dawkami CHIR. W zbiorze danych uwzględniono tylko odwierty o wysokiej sprawności CHIR.
    2. Określ ilościowo efektywność różnicowania każdego dołka za pomocą wskaźnika efektywności różnicowania obliczonego na podstawie obrazów fluorescencyjnych cTnT, który jest zdefiniowany przez figure-protocol-1 (where figure-protocol-2 reprezentuje intensywność fluorescencji w lokalizacji piksela (i, j) w × Wobraz fluorescencyjny, a suma jest pobierana we wszystkich lokalizacjach pikseli o intensywności powyżej progu α, zwykle ustawionego na 0,5). W każdej linii komórkowej oblicz maksymalny wskaźnik efektywności różnicowania dla wszystkich studzienek w tej linii komórkowej i znormalizuj ich wskaźniki efektywności różnicowania o maksymalną wartość.
      UWAGA: Ponieważ potencjał różnicowania każdej linii komórkowej jest z natury różny, taka normalizacja położy większy nacisk na cechy morfologiczne kolonii wspólne dla różnych linii komórkowych, które przyczyniają się do wyniku różnicowania. Normalizacja rzeczywiście sprawia, że kolonie PSC z różnych linii komórkowych są porównywalne i łagodzi odchylenia wywołane przez linie komórkowe.
    3. Określ ilościowo profile morfologiczne obrazów jasnego pola 0 godzin za pomocą cech wielowymiarowych, które ujawniają właściwości kształtu kolonii. Aby obrysować regiony kolonii na obrazach w jasnym polu, oblicz lokalną entropię (o promieniu r); Piksele o lokalnej entropii większej niż próg σ są identyfikowane przez pokryte komórkami. Użyj ustawienia parametrów r = 10 pikseli i σ = 3. Przełącz katalog roboczy na "./colony_control"; zapisz obrazy jasnego pola, binarne obrazy obszarów komórek i obrazy fluorescencji cTnT w "colony_control/ image_data/CD00-*/[brightfield|cell_region|ctnt]/S*.png"; i uruchom Jupyter Notebook "Compute_features.ipynb", aby obliczyć obiekty związane między innymi z powierzchnią kolonii, obwodem, bryłą, wypukłością, kołowością i odległościami między środkiem ciężkości a konturem.
    4. Losowo podziel zestaw danych na zestaw treningowy i zestaw testowy, przy czym zestaw treningowy zawiera od 50% do 80% ogólnych danych. Uruchom ostatni blok Podziel zestaw danych w Jupyter Notebook, aby podzielić zestaw danych (Rysunek 3A).
    5. Trenowanie modelu regresji lasu losowego na zestawie treningowym w celu przewidywania wydajności różnicowania na podstawie funkcji obrazu w jasnym polu 0 godzin. Uruchom Jupyter Notebook "Machine_learning.ipynb", aby wytrenować i przetestować model.
    6. Oceń wytrenowany losowy model lasu w zestawie testowym. Potwierdź, że przewidywana efektywność różnicowania jest wysoce skorelowana z prawdziwą, używając współczynnika korelacji Pearsona (Rysunek 3B).
      UWAGA: Ponieważ zestaw testowy nie bierze udziału w fazie uczenia, wysoka spójność między przewidywaną a rzeczywistą wydajnością różnicowania w zestawie testowym wskazuje, że model może dobrze uogólniać na niewidocznych próbkach.
    7. Uzyskaj ważność funkcji z wytrenowanego modelu lasu losowego i wybierz 8 obiektów o największej ważności. Zwizualizuj ich związek z końcową efektywnością różnicowania, dzieląc zakres funkcji na pojemniki i obliczając średnią efektywność różnicowania w każdym pojemniku. Uruchom Jupyter Notebook "Feature_importance.ipynb", aby wykonać wizualizację (Rysunek 3C).
      UWAGA: Wizualizacja może pomóc zrozumieć, w jaki sposób zmiany w kształcie kolonii PSC przyczyniają się do różnicowania.
    8. Zastosuj wytrenowany model w nowych partiach, aby monitorować stany kolonii PSC w czasie rzeczywistym. Rejestruj obraz w jasnym polu co godzinę, przekazuj obraz do wytrenowanego modelu i uzyskuj przewidywaną wydajność różnicowania. Gdy przewidywana wydajność przekroczy próg (np. 50%), rozpocznij proces różnicowania. Jeśli przewidywana wydajność nie mogła osiągnąć wartości progowej, należy wyrzucić te próbki.
      UWAGA: W fazie PSC potencjał różnicowania kolonii PSC najpierw wzrośnie, a następnie spadnie. Monitorowanie w czasie rzeczywistym umożliwia eksperymentatorom zidentyfikowanie najbardziej sprzyjającego punktu czasowego do zainicjowania różnicowania.
  3. Strategia ML na etapie I: wczesna ocena i dostosowanie dawek CHIR
    Zbiór danych: pary strumieni obrazu w jasnym polu przy 0-12 h i znaczniki stężenia CHIR (niskie/optymalne/wysokie)
    Model: regresja logistyczna
    1. Przygotuj zestaw danych składający się ze strumieni obrazów w całym jasnym polu, w których obrazy są pozyskiwane co godzinę między godziną 0 a 12 godziną. Zapisz dawki CHIR (tj. kombinacje stężeń CHIR i czasu trwania) każdego dołka. Upewnij się, że zbiór danych zawiera różne partie i studzienki z miareczkowanymi dawkami CHIR (np. stężenie = 2, 4, 6, 8, 10 i 12 μM; czas trwania = 24, 36 i 48 godzin) w celu zwiększenia różnorodności. Przełącz katalog roboczy na "./stage_I"; zapisz obrazy jako "./data/image/CD01-*/S*/T*.png", gdzie CD01-* (CD01-1, CD01-2, CD01-3, CD01-4) to nazwa partii, S* (S1, S2, ..., S96) to indeks studni, a T*.png (T1.png, T2.png, ..., T10.png) to wstępnie przetworzony obraz studni w jasnym polu na różnych etapach czasowych strumienia obrazu.
    2. W każdej partii należy obliczyć procentową zawartość komórek cTnT+ dla każdej studzienki, którą oblicza się, dzieląc liczbę komórek cTnT+ przez całkowitą liczbę komórek Hoechst+ w obrazie fluorescencyjnym. Uśrednić procent komórek cTnT+ w równoległych studzienkach o tym samym warunku dawki CHIR. Zapisz warunek dawki CHIR i procent komórek cTnT+ dla każdej studzienki w pliku csv "./data/image/CD01-*/CD01-?_exp_config.csv".
    3. W każdej partii należy określić "niski", "optymalny" i "wysoki" zakres stężeń CHIR w każdym czasie trwania CHIR zgodnie z poniższymi kryteriami. Stężenia CHIR ze średnim odsetkiem komórek cTnT+ powyżej progu (np. 20%) określa się jako "optymalne". Stężenia CHIR wykraczające poza optymalny zakres są określane jako "niskie" lub "wysokie". W każdym okresie CHIR oznacz studzienki jako "niskie", "optymalne" i "wysokie" zgodnie z odpowiadającymi im stężeniami CHIR.
      UWAGA: Empirycznie istnieje ujemna korelacja między stężeniami CHIR a czasem trwania odwiertów o wysokiej sprawności w partii: im dłuższy czas trwania CHIR, tym optymalne stężenia maleją. Innymi słowy, optymalność stężeń CHIR zależy od czasu trwania CHIR, a zatem etykiety studni różnią się w zależności od czasu trwania CHIR.
    4. W każdej partii, w każdym czasie trwania CHIR, należy obliczyć stężenie ΔCHIR dla każdego stężenia c, aby określić ilościowo jego odchylenie od optymalnego. Optymalny zakres stężeń CHIR należy oznaczyć przez [c1, c2], a następnie stężenie ΔCHIR (c) = c - c1 (jeśli c < c1), 0 (jeśli c1 ≤ c ≤ c2) lub c - c2 (jeśli c > c2).
    5. Wyodrębnij cechy strumieni obrazu w zbiorze danych, upewniając się, że odzwierciedlają one zmiany morfologiczne komórek na etapie I. Aby obliczyć cechy obrazu dotyczące lokalnej entropii, obszaru, obwodów, jasności, przepływu optycznego i wymiaru fraktalnego, uruchom
      cd ./data
      python compute_features.py
      płyta CD..
      UWAGA: Aby uwydatnić zmiany morfologiczne, wartości niektórych cech (np. powierzchnia, obwody i przepływ optyczny) można znormalizować za pomocą ich początkowych wartości bazowych w strumieniach obrazu.
    6. Losowo podziel zestaw danych na zestaw treningowy i zestaw testowy. Uruchom Jupyter Notebook "./data/prepare_dataset.ipynb", aby podzielić zestaw danych i zorganizować zestawy danych jako ramki danych (Rysunek 3D).
    7. Dla każdego czasu trwania CHIR wytrenuj model regresji logistycznej, aby przewidzieć etykietę stężenia CHIR (niską/optymalną/wysoką) na podstawie funkcji strumienia obrazu w zestawie treningowym. Oceń wydajność klasyfikacji wytrenowanego modelu regresji logistycznej w zestawie testowym przy użyciu dokładności, precyzji, kompletności, wyniku F1 i pola pod krzywą (AUC). Uruchom Jupyter Notebook "machine_learning.ipynb" w celu trenowania i testowania (Rysunek 3E).
    8. Oceń działanie modelu w ocenie dawki CHIR. W zestawie testowym połącz przewidywane etykiety równoległych studni o tym samym stężeniu CHIR za pomocą wyników odchylenia (w zakresie od -1 do 1), zdefiniowanych przez figure-protocol-3 , gdzie Nc oznacza liczbę studzienek o stężeniu c i figure-protocol-4 oraz figure-protocol-5 dołki wśród nich są przewidywane odpowiednio jako "niskie" i "wysokie". Potwierdź, że przewidywane wyniki odchylenia są wysoce skorelowane z rzeczywistym stężeniem ΔCHIR dla każdej dawki CHIR przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona.
    9. Wykonaj walidację krzyżową partii, aby przetestować wydajność uogólnienia modelu. W każdej rundzie pozostaw jedną partię do testów, a inne użyj do treningu. Porównaj przewidywane wyniki odchylenia i rzeczywiste stężenie ΔCHIR dla każdej dawki CHIR w każdej badanej partii, używając współczynnika korelacji Pearsona. Uruchom Jupyter Notebook "cross_batch_validation.ipynb", aby zaimplementować walidację między partiami (Rysunek 3F).
      UWAGA: Dla wybranego czasu trwania CHIR h, prognoza dla wszystkich odwiertów ze stężeniem z modelu regresji logistycznej wytrenowanego w czasie trwania h zostanie przekształcona w wynik odchylenia, odzwierciedlający optymalność stężenia CHIR c. Wynik odchylenia bliski 0 sugeruje, że przewiduje się, że stężenie c będzie optymalne w czasie trwania h, podczas gdy ujemny lub dodatni wynik odchylenia sugeruje stan niedodawkowania lub przedawkowania, co może służyć jako sygnał do późniejszej korekty dawek CHIR. Należy pamiętać, że ponieważ prognoza jest dokonywana wcześnie (12 godzin), ostateczny czas trwania CHIR i stężenie CHIR w pozostałej części etapu I można nadal dostosować.
    10. Zastosuj wytrenowane modele regresji logistycznej do oceny dawek CHIR w nowych partiach. Dla danego stężenia CHIR należy obliczyć cechy strumienia obrazu 0-12 godzin dla odwiertów równoległych o stężeniu, przekazać cechy do modeli regresji logistycznej wytrenowanych w różnych czasach trwania CHIR i odpowiednio uzyskać przewidywane etykiety dla każdego dołka. Na podstawie przewidywań modeli oblicz wyniki odchylenia, aby ocenić każde stężenie CHIR w różnych czasach trwania CHIR.
    11. Dzięki opartej na modelu ocenie dawki CHIR należy odpowiednio wykonać studnie ratunkowe pod każdym nieoptymalnym stężeniem CHIR, dostosowując ich czas trwania CHIR lub stężenie do optimum przed 48 godzinami.
      1. Regulacja czasu trwania: zgodnie z przewidywaniami modelu dotyczącymi optymalnego czasu trwania CHIR, dostosuj punkt czasowy, w którym medium zawierające CHIR w tych studzienkach jest przełączane na medium różnicujące CM. W przypadku przekroczenia optymalnego punktu czasowego należy wyrzucić te próbki.
      2. Regulacja stężenia: przy ustawionym czasie trwania CHIR, jeśli obecne stężenie jest przewidywane jako "niskie", bezpośrednio dodaj wysokie stężenie CHIR do pożywki, aby zwiększyć stężenie CHIR. W razie potrzeby rozcieńczyć CHIR w DMSO (50 mM) za pomocą PBS, dodać odpowiednią objętość płynu i delikatnie wstrząsnąć płytką. Jeśli obecne stężenie jest przewidywane jako "wysokie", należy zassać pewną objętość pożywki zawierającej CHIR i uzupełnić tą samą objętością pożywki różnicującej CM.
        UWAGA: W ciągu pierwszych 48 godzin różnicowania komórki będą wydzielać czynniki poprawiające wzrost i różnicowanie komórek, więc nie należy całkowicie zmieniać pożywki. Ponadto konieczne jest utrzymanie stałej objętości medium w różnicowaniu. Dlatego podczas regulacji stężenia CHIR upewnij się, że objętość dodawanego płynu jest jak najmniejsza.
  4. Strategia ML na etapie II: uznanie CPCs zaangażowanych w CM
    Zestaw danych: pary obrazów w jasnym polu w dniu 6 i ręcznie opatrzone adnotacjami maski CPCs
    Model: ResNeSt38 with Grad-CAM36 dla słabo nadzorowanego uczenia
    1. Przygotuj zestaw danych składający się z obrazów w jasnym polu w dniu 6. Ręcznie dodawaj adnotacje do CPC zatwierdzonych przez CM na obrazach w jasnym polu, śledząc komórki cTnT+ w strumieniach obrazów od 12 dnia do dnia 6.
    2. Przytnij obrazy w jasnym polu i odpowiadające im ręczne adnotacje (nazywane maskami) CPC zatwierdzonych przez CM w łaty, przy czym każda łatka ma rozmiar 1/5,5 rozmiaru obrazu całej studzienki. Wyodrębnij łaty w sposób nakładający się, gdzie sąsiednie łaty pokrywają się w 50% w zestawie treningowym i w 75% w zestawie testowym. Łatki z ≥30% CPC zatwierdzonymi przez CM oznaczaj jako "pozytywne". Oznaczaj poprawki bez CPC zatwierdzonych przez CM jako "negatywne". Przełącz katalog roboczy na "stage_II". Uruchom "./Crop_and_Reconstruct/mask_crop.m", aby przyciąć obrazy. Uruchom "./Crop_and_Reconstruct/classification.m", aby przypisać etykiety (0: negatywne; 1: pozytywne) do plam jasnego pola (Rysunek 3G).
    3. Losowo podziel oznaczone łaty obrazu na zestaw treningowy i zestaw testowy.
    4. Wytrenuj głęboką konwolucyjną sieć neuronową, ResNeSt38, aby nauczyć się klasyfikować te poprawki. Oceń wytrenowany ResNeSt na zestawie testowym, aby potwierdzić, że model wykazuje wysoką dokładność klasyfikacji. Uruchom odpowiednio "train.py" i "test.py" do trenowania i testowania (Rysunek 3H).
    5. Użyj Grad-CAM36, aby wyróżnić regiony, które najbardziej przyczyniają się do wnioskowania ResNeSt, reprezentowane przez mapy cieplne. Podziel mapy cieplne na dwa czynniki (przy użyciu progu, np. 10% × maksimum), aby uzyskać przewidywane regiony CPC zatwierdzone przez CM, które są nazywane regionami CPC rozpoznawanymi przez obrazy (IR-CPC).
    6. Porównaj regiony IR-CPC z ręcznie opisanymi maskami w zestawie testowym przy użyciu dokładności, wyniku F1, precyzji, kompletności, swoistości i przecięcia nad sumą (IoU). Porównaj proporcję regionów IR-CPC ze wskaźnikami efektywności różnicowania (obliczonymi na podstawie końcowych obrazów fluorescencyjnych cTnT) przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona. Uruchom "./Evaluation/index_calculate.m" i "./Evaluation/Pearson_correlation.m" w celu oceny wydajności (Rysunek 3I).
    7. Zastosuj wytrenowany model, aby rozpoznać CPC dla nowych partii na etapie II. Kadruj obrazy całego jasnego pola w łaty, przekazuj łaty do wyszkolonego ResNeSt i uzyskuj regiony IR-CPC na poziomie łaty, które są następnie łączone w celu uzyskania całych obszarów IR-CPC. Oblicz frakcję regionów IR-CPC jako wskaźnik końcowej skuteczności różnicowania. Oczyść IR-CPC, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek (opisane poniżej).
      UWAGA: Ponieważ model rozpoznawania CPC może dokonać wczesnej oceny końcowej skuteczności różnicowania, może on również służyć jako wysokoprzepustowy odczyt do badań przesiewowych małych cząsteczek, które sprzyjają procesowi różnicowania, co może jeszcze bardziej zoptymalizować protokół różnicowania35.
  5. Selektywne oczyszczanie CPC
    w zależności od regionu UWAGA: Eksperymenty fotoaktywacyjne opierają się na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wspomaganym przez zmotoryzowany stolik.
    1. Zgodnie z regionami IR-CPC przewidzianymi przez wytrenowany model, odrzuć studnie, które nie były w stanie wygenerować żadnych IR-CPC. Aby oczyścić te CPC zaangażowane przez CM, użyj niecytotoksycznej, fotoaktywowanej sondy, Dual-Activatable Cell Tracker 1 (DACT-1), aby selektywnie oznaczyć region non-CPC39.
    2. Rozpuścić DACT-1 (10 mM) w DMSO i przechowywać go w temperaturze -20 °C. Inkubować komórki 6 dnia z 1 μM DACT-1 w pożywce różnicującej CM przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Sprawdź żywe komórki pod mikroskopem i wybierz obszar zainteresowania (ROI) jako wielokąty w MATLAB. Narysuj równoległe linie w odstępie 20 μm wewnątrz wielokąta i oblicz współrzędne punktów przecięcia.
    4. Ustaw ruchomą tor zmotoryzowanego stopnia zgodnie z liniami śledzenia, a następnie stopień poruszałby się z prędkością 0,12 mm / s, tak aby linia laserowa 405 nm (o średnicy 20 μm) zamontowana na stoliku mogła globalnie skanować zwrot z inwestycji w celu fotoaktywacji innych niż CPC w ograniczonym zakresie. Po napromieniowaniu wykryj komórki znakowane DACT-1 za pomocą linii laserowej 561 nm.
    5. Dysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA (rozcieńczonej PBS) w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut i delikatnie wstrząsać płytką w inkubatorze przez 2 minuty. Przefiltrować komórki przez sitko do komórek o wielkości 40 μm i odwirować przy 500 × g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w 0,5% BSA i trzymać probówkę na lodzie do czasu sortowania. Należy również przygotować nienapromieniowaną próbkę jako kontrolę ujemną do sortowania.
    6. Uruchom system sortowania metodą cytometrii przepływowej i skonfiguruj oprogramowanie sortownika. Wybierz lasery o długości fali 561 nm i użyj filtra pasmowoprzepustowego 610/20 do sortowania DACT1+. Dla każdej próbki użyj narzędzia do bramkowania wielokątnego, aby zakreślić populację komórek na wykresie dwuwymiarowym rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC) w celu wybrania pojedynczej komórki. Następnie uruchom kontrolę ujemną, aby potwierdzić fluorescencję tła, uruchom próbkę napromieniowaną selektywnie w regionie i narysuj bramkę dla populacji DACT1+.
    7. Zebrać i ponownie zawiesić posortowane komórki w pożywce konserwacyjnej CM z 10% FBS i 5 μM Y27632, a następnie wysiać posortowane komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem.
    8. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę konserwacyjną CM i poczekaj na zbiór CM o wysokiej czystości.
  6. Strategia ML na etapie III: uznanie CMs
    Zestaw danych: pary obrazów w jasnym polu w dniu 12 i końcowe obrazy fluorescencji cTnT
    Model: pix2pix37
    1. Przygotuj zestaw danych składający się z obrazów CM w jasnym polu i odpowiadających im obrazów fluorescencyjnych cTnT. Aby zwiększyć różnorodność, upewnij się, że zestaw danych zawiera studzienki o różnej wydajności różnicowania i liniach komórkowych.
    2. Losowo podziel zestaw danych na zestaw treningowy i zestaw testowy. Przełącz katalog roboczy na "stage_III". Zapisz obrazy jasnego pola i odpowiadające im obrazy fluorescencji cTnT odpowiednio w "./pix2pix/datasets/(CM|CM_new_cell_lines)/A/(train|test)/*.png" i ".../B/(train|test)/*.png". Uruchom następujące polecenie:
      cd pix2pix/zestawy danych
      python combine_A_and_B.py --fold_A ./CM/A --fold_B ./CM/B --fold_AB ./CM/ --no_multiprocessing
      płyta CD..
    3. Wytrenuj pix2pix model37 na zestawie treningowym. Uruchom następujące polecenie (Rysunek 3J):
      python train.py --dataroot ./datasets/CM --name brightfield2fluorescence --model pix2pix --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 256 --lr 2e-4 --n_epochs 1000 --n_epochs_decay 0 --norm instancja --netD n_layers --n_layers_D 1 --batch_size 16 --direction AtoB --save_epoch_freq 100 --dataset_mode wyrównany --use_resize_conv --seed 1234
    4. Zastosuj wytrenowany model pix2pix w zestawie testowym. Uruchom następujące polecenie:
      python test.py --dataroot ./datasets/CM --name brightfield2fluorescence --model pix2pix --direction AtoB --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 1536 --use_resize_conv --eval --num_test 1000
    5. Porównaj obrazy fluorescencji przewidywane przez model z prawdziwymi (tj. uzyskanymi eksperymentalnie). Na poziomie pikseli porównaj przewidywane intensywności i rzeczywiste intensywności, korzystając ze współczynnika korelacji Pearsona. Ponadto na poziomie obrazu porównaj przewidywane wskaźniki efektywności różnicowania z rzeczywistymi za pomocą współczynnika korelacji Pearsona. Uruchom "stage_III/evaluation/pixel_correlation.m" i "image_correlation.ipynb" dla tych porównań (Rysunek 3K,L).
    6. Zastosuj wytrenowany model do rozpoznawania CM w nowych partiach na etapie III. Przekaż nowe obrazy CM w jasnym polu do wytrenowanego modelu pix2pix i uzyskaj prognozę in-silico obrazów fluorescencyjnych i wydajności różnicowania.
      UWAGA: Aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek, sortowanie komórek fotoaktywowane oparte na DACT-1 ma również zastosowanie do oczyszczania CM rozpoznawanych przez model.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na podstawie obrazowania w jasnym polu i ML, cały proces różnicowania może być inteligentnie monitorowany i optymalizowany. Na etapie PSC opracowaliśmy model ML, który mógł przewidzieć ostateczną skuteczność różnicowania zgodnie z cechami morfologicznymi początkowych kolonii PSC, aby określić najbardziej odpowiedni lub odpowiedni punkt czasowy do zainicjowania różnicowania (Rysunek 4A,B). Efektywność różnicowania przewidywana przez model lasu losowego jest silnie skorelowana z rzeczy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy szczegółowy protokół mający na celu przezwyciężenie jednego z głównych problemów związanych z obecnym zastosowaniem i translacją PSC - zmienności różnicowania komórek. Wykorzystując obrazowanie w jasnym polu żywych komórek i uczenie maszynowe, iteracyjnie zoptymalizowaliśmy różnicowanie PSC, aby osiągnąć niezmiennie wysoką wydajność na liniach komórkowych i partiach. Jednak w powyższym procesie różnicowania kilka krytycznych etapów protokołu ma decydujący wpływ na to, czy zróżnicowanie zakończy s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Yang Zhao, Jue Zhang, Xiaochun Yang, Yao Wang i Daichao Chen składają wniosek patentowy na strategię różnicowania PSC opisaną w tym dokumencie (202210525166.X).

Podziękowania

Dziękujemy Qiushi Sun, Yao Wang, Yu Xia, Jinyu Yang, Chang Lin, Zimu Cen, Dongdong Liang, Rong Wei, Ze Xu, Guangyin Xi, Gang Xue, Can Ye, Li-Peng Wang, Peng Zou, Shi-Qiang Wang, Pablo Rivera-Fuentes, Salome Püntener, Zhixing Chen, Yi Liu i Jue Zhang za stworzenie podstaw tej strategii. Prace te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2018YFA0800504, 2019YFA0110000) oraz Projekt Kosmicznego Eksperymentu Medycznego Chińskiego Załogowego Programu Kosmicznego (HYZHXM01020) dla Yang Zhao. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsin-EDTAGibco25200056Rozcieńczone roztwory zostały użyte do trawienia CPC i CM
4% paraformaldehydu w PBSKeyGEN BioTECHKGIHC016
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNEST703001
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNEST701001
B27 SuplementGibco17504044
B27 Suplement minus insulinaGibcoA1895601
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)GPC BIOTECHAA904-100G
Celldiscoverer 7Instrumenty Zeissużywane do wykonywania obrazów w jasnym polu podczas różnicowania i końcowych obrazów cTnT
CHIR99021SelleckS1263
DMEM/F12Gibco12634010
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488ThermoA-21202Przeciwciało drugorzędowe
FACSAria IIIBD BiosciencesSortownik cytometrii
Płodowa surowica bydlęca (FBS)VISTECHSE100-B
Hoechst 33342YEASEN40732ES03
Ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta Podłożezdefiniowane chemicznieCauliscell Inc400105Podstawowa pożywka do przygotowania PSC
iPS-18TaKaRaY00300
iPS-B1CellapyCA4025106
iPS-FNuwacellRC01001-B
iPS-MNuwacellRC01001-A
IWR1-1-endoSelleckS7086IWR1
Jupyter NotebookN/ Wersja6.4.0https://jupyter.org/
MATLABMathWorksWersja R2020aOprogramowanie do obliczeń naukowych i adnotacji obrazów
Matrigel MatrixCorning354230Matrigel
Mysz monoklonalna IgG1 anty-cTnTThermoMA5-12960cTnT przeciwciało pierwotne
Normalny Osioł SerumJackson017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC13440-20CUAparat cyfrowy zamontowany na Celldiscoverer7
PBSNEB21-040-CVR
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Pluripotencja Growth Mater 1 podłoże podstawoweCellapyCA1007500-1Podłoże podstawowe PSC pożywka hodowlana
Pluripotencja Growth Mater 1 suplementCellapyCA1007500-2Suplement pożywki hodowlanej PSC
PrismGraphpadWersja 8/9Oprogramowanie statystyczne do analizy statystycznej i kreślenia
PythonN/Awersja 3.6Środowisko Python 3 do obliczeń naukowych, z pakietami pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, OpenCV-Python i oprogramowanie Matplotlib do obliczeń naukowych i adnotacji obrazów.
RPMI 1640Gibco11875176
Suplement hPSC-CDM (500x)Cauliscell Inc00015Suplement pożywki do preparatu PSC
TiENikonOdwrócony mikroskop fluorescencyjny (z modyfikacją) do oczyszczania regionalnego
Triton  X-100Amresco9002-93-1
Versene SolutionThermo15040066EDTA roztwór do mineralizacji PSC
Y27632SelleckS6390
ZenZeissVersion 3.1Oprogramowanie wspomagające Celldiscoverer7 do  akwizycji, przetwarzania i analizy obrazów
przepływowej

Bibliografia

  1. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications. Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  4. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards. J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).
  6. Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions. Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).
  7. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).
  8. Li, J., et al. Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium. Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).
  9. Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).
  10. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).
  11. Mehta, A., et al. Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model. Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).
  12. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).
  13. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  14. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).
  15. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  16. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation. Differentiation. 104, 13-21 (2018).
  19. Volpato, V., et al. Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study. Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).
  20. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  21. Sepac, A., et al. Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines. Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).
  22. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  23. Volpato, V., Webber, C. Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility. Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).
  24. Hu, B. -Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  25. Huo, J., et al. Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers. Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).
  26. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based machine learning for identification of macrophage subsets. Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).
  27. Christiansen, E. M., et al. In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images. Cell. 173 (3), 792-803 (2018).
  28. Buggenthin, F., et al. Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning. Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).
  29. Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event. Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).
  30. Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction. Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).
  31. Kusumoto, D., et al. Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).
  32. Zhu, Y., et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).
  33. Qian, T., et al. Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation. Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).
  34. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).
  35. Yang, X., et al. A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems. Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).
  36. Selvaraju, R. R., et al. Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization. Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).
  37. Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. Image-to-image translation with conditional adversarial networks. Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).
  38. Zhang, H., et al. ResNeSt: Split-attention networks. Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).
  39. Halabi, E. A., et al. Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling). ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).
  40. Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).
  41. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).
  42. Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis. Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).
  43. Najm, F. J., et al. Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells. Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).
  44. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines. Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pluripotencjalne komórki macierzysteobrazowanie żywych komórekobrazowanie w jasnym polukonwersja losu komórkowegoróżnicowanie kardiomiocytówanaliza oparta na obrazachzmienność linii komórkowychobrazowanie wysokoprzepustowe
Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.