Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę analizy naprawy kości żuchwy. Opisujemy powtarzalną technikę nieustabilizowanego złamania żuchwy w modelu mysim, pozwalającą na analizę procesu naprawy kości śródchrzęstnej przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i ubytku kości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mniej inwazyjna technika niestabilizowanego złamania żuchwy w modelach mysich
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieustabilizowane złamania mogą być wykonywane w miejscach żuchwy u myszy, co umożliwia analizę naprawy kości przy użyciu trybu kostnienia endochrzęstnego. Aby jak najdokładniej odzwierciedlić ten proces in vivo, konieczne jest posiadanie ustandaryzowanego protokołu, aby uniknąć nadmiernej utraty masy kostnej i uszkodzenia tkanek miękkich, szczególnie w miejscu żuchwy, miejscu anatomicznym charakteryzującym się minimalnym dostępem. Według naszej wiedzy po raz pierwszy opisujemy mniej inwazyjny protokół nieustabilizowanego złamania żuchwy u myszy. Dorosłe myszy są znieczulane izofluranem i otrzymują przedoperacyjną dawkę buprenorfiny we wstrzyknięciu podskórnym. Wykonuje się dostęp podżuchwowy, z nacięciem skóry wykonanym wzdłuż dolnej granicy żuchwy. Mięsień żwacza jest uniesiony w płaszczyźnie podokostnowej wzdłuż ramusa żuchwy z windą okostnową. Pionowe i całkowite złamanie ramusa wykonuje się od granicy podstawy do wcięcia dziobiastego (między wyrostkami kłykciowymi i dziobiastymi), przy użyciu piezoelektrycznego urządzenia do chirurgii kości pod irygacją surowicy soli fizjologicznej na krawędzi podstawy i nożyczek w celu zakończenia złamania ramusa żuchwy. Dostęp skórny zamykają szwy jedwabne. Ta szczegółowa procedura w przypadku nieustabilizowanych złamań żuchwy oferuje skuteczną procedurę pozwalającą na minimalną utratę kości i uszkodzenie tkanek miękkich. Technika ta zapewnia pomyślne i spójne wyniki, które dokładnie odzwierciedlają proces naprawy kości śródchrzęstnej w modelach mysich.
Wprowadzenie
Naprawa kości obejmuje zarówno procesy kostnienia błoniastego, jak i śródchrzęstnego, w zależności od stabilizacji złamania lub osteotomii. Naprawa kości po ustabilizowanej osteotomii lub złamaniach kości opiera się na kostnieniu błoniastym, podczas gdy nieustabilizowane złamania lub słabo ustabilizowane osteotomie utrwalają się zgodnie z trybem kostnienia śródchrzęstnego1. Błoniaste naprawa kości charakteryzuje się tworzeniem kości przez bezpośrednie różnicowanie komórek mezenchymalnych w osteoblasty, podczas gdy endochrzęstna naprawa kości polega na tworzeniu przejściowego chrzęstnego szablonu, który różnicuje się w osteoblasty, tworząc kalus kostny2.
Naprawa kości zależy od wielu interakcji tkankowych i komórkowych; wpływają na nią również czynniki specyficzne dla danego miejsca oraz siła wywierana na kalus3. Kość żuchwy jest ruchomą kością podtrzymującą siły żucia, utworzoną głównie przez kość korową. Na proces naprawy kości żuchwy ma wpływ miejsce i kierunek złamania. Powszechnie wiadomo, że urazy mięśni i okostnej mogą wpływać na konsolidację kości, a także na istotną utratę kości w miejscu złamania4,5,6.
Analiza naprawy kości śródchrzęstnej żuchwy zakłada ustandaryzowane i powtarzalne protokoły dla wartościowych, bezstronnych porównań. Jeśli chodzi o literaturę, tylko kilku autorów podaje protokoły dla nieustabilizowanych złamań żuchwy w modelach myszy3,7, a głównie z kierunkiem przednim na poziomie trzonowców8. Opracowując tę technikę, dążymy do uniknięcia urazów mięśni i okostnej oraz ograniczenia utraty masy kostnej w miejscu złamania, aby jak najlepiej przeanalizować proces naprawy kości śródchrzęstnej bez czynników zakłócających. Ponadto celem opracowania nowej techniki łamania żuchwy u myszy było zminimalizowanie bólu pooperacyjnego i śmierci zwierząt częstych podczas takich operacji u małych zwierząt. Po raz pierwszy opisujemy mniej inwazyjny protokół nieustabilizowanego złamania żuchwy na poziomie ramusa u myszy. Ten protokół in vivo pozwala uniknąć nadmiernego uszkodzenia mięśni i okostnej lub utraty kości w miejscu złamania oraz pomaga zmniejszyć poziom bólu pooperacyjnego i ryzyko śmierci zwierzęcia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Imagine Institute dotyczącymi opieki nad zwierzętami i został zatwierdzony przez komisje etyczne oraz francuskie ministerstwo (APAFIS 26995).
1. Zwierzęta
- Określ liczbę zwierząt w grupie. Zalecamy 12 zwierząt w grupie. Określ płeć i wiek myszy. Protokół ten jest dostosowany do 6-tygodniowych myszy C57BL/6J (samca lub samicy).
- Podawać zwierzętom, co najmniej 1 tydzień przed zabiegiem, suplement diety w żelu do aklimatyzacji.
2. Zabieg chirurgiczny
- Przygotuj wymagany materiał. Autoklaw narzędzi: nożyczki, wkrętak igły, kleszcze, wkładkę i rękojeść piezoelektrycznego urządzenia do chirurgii kostnej oraz windę. Przygotuj sterylne rękawiczki, jedwabne szwy (4/0), golarkę, gazę bawełnianą, 10% roztwór jodu powidonu, stół grzewczy, izofrubran i maskę na pysk do inhalacji izofluranu.
- Przygotować buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg, rozcieńczoną w sterylnej surowicy fizjologicznej do wstrzykiwań. Buprenorfinę należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym za pomocą igły 25G na 30 minut przed zabiegiem.
- Przygotuj płytę grzewczą (37 °C), umieść na niej piankową podpórkę i przymocuj maskę do pyska za pomocą małych igieł lub taśmy klejącej.
- Umieść mysz w zbiorniku z izofluranem w celu indukcji, z dyfuzją izofluranu (4%). Przetestuj głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. W przypadku wystarczającej indukcji zaobserwuje się brak odruchu pedałowania.
- Znieczuloną mysz ułożyć na plecach na płycie grzewczej pokrytej sterylnym polem utrzymywanym w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. Umieścić maskę na pysku w celu ciągłego wdychania izofluranu (utrzymanie w dawce 2,5%). Przymocuj kończyny myszy taśmą klejącą.
- Smar do oczu nakładać obustronnie, aby zapobiec suchości oczu wywołanej znieczuleniem ogólnym. Ogolić włosy podżuchwowe, założyć sterylne rękawiczki i zdezynfekować skórę kilkoma pociągnięciami 10% roztworu jodu powidonu i alkoholu.
- Wykonaj podżuchwowe podejście skórne, jak opisano poniżej.
- Wykonaj nacięcie skóry od kąta żuchwy do 1/3 tylnego - 2/3 przedniego połączenia poziomej gałęzi żuchwy za pomocą mikronożyczek.
- Wypreparuj tkanki podskórne, aby odsłonić mięsień żwaczy.
- Odsunąć przyczepy mięśnia żwacza za pomocą windy okostnej od dolnej granicy żuchwy.
- Podnieś mięsień żwaczowy w płaszczyźnie podokostnowej wzdłuż ramienia żuchwy za pomocą windy.
- Utworzyć małą osteotomię (o długości 3 mm) na dolnej granicy żuchwy za pomocą piezoelektrycznego urządzenia do chirurgii kostnej pod irygacją surowicy soli fizjologicznej (maksymalnie 10 ml / min) na dolnej granicy żuchwy, przed kątem żuchwy, w tylnej części wklęsłości (Rysunek 1, Rysunek 2).
- Zlokalizuj tylną granicę żuchwy i wcięcie dziobiastego (za pomocą mikronożyczek lub kleszczy) i zakończ złamanie za pomocą małych prostych nożyczek wprowadzonych wzdłuż ramusa żuchwy, aby uniknąć dodatkowego otworu mięśnia żwacza i urazu. Aby umożliwić prawidłową orientację złamania, należy ułożyć nożyczki prostopadle do dolnej granicy żuchwy.
- Sprawdź, czy złamanie jest całkowicie całkowite: podczas miękkiej mobilizacji 2 segmentów za pomocą kleszczy należy zaobserwować całkowitą ruchomość między dwoma segmentami.
- Zamknij podejście skórne szwami jedwabnymi (4/0) z oddzielonymi szwami. Nie jest potrzebny szew w okostnej.
UWAGA: Alternatywnie, podejście skórne może być zszyte innymi szwami nieadsorbowalnymi (np. Szwy polipropylenowe). - Wykonaj boczne prześwietlenie głowowe, aby potwierdzić kierunek złamania (Rysunek 3).
- Umieść mysz ponownie w zbiorniku z izofluranem w celu krótkiej reindukcji przed wykonaniem promieniowania rentgenowskiego. Następnie umieść mysz w wyprostu, po bocznej stronie, z głową lekko w przeprostowanym do analizy rentgenowskiej.
- W przypadku złamania umieszczonego zbyt przodem na poziomie zęba trzonowego żuchwy lub gdy złamanie oderwało kąt żuchwy (Ryc. 4), należy zaobserwować nieprawidłowy wzrost objętości modzela kostnego. W takich przypadkach należy wykluczyć zwierzęta z badania, aby uniknąć błędu systematycznego w analizie.
- Sprawdzaj myszy, dopóki nie odzyskają przytomności, zanim umieścisz je z powrotem w klatce.
3. Opieka pooperacyjna
- Przygotuj klatkę dla myszy bez krokietów i twardego wzbogacania, aby uniknąć wszelkich sił żucia.
- Izoluj operowaną mysz w jednej klatce przez 1 tydzień, aż skóra całkowicie się zagoi. W 1 tygodniu po operacji grupa operowała samice myszy razem w tej samej klatce.
- Buprenorfinę (0,1 mg/kg) podaje się we wstrzyknięciach podskórnych po 4 godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach po zabiegu.
- Karm myszy miękkim żelem dietetycznym we wszystkich okresach pooperacyjnych od dnia 0 do końca okresu konsolidacji (tj. 28 dni), aby uniknąć bólu i wtórnego przemieszczenia złamania.
- Codziennie waż myszy od dnia 0 do dnia 4 po złamaniu, rano, przed wstrzyknięciem buprenorfiny, a następnie 3 razy w tygodniu, aż do uśmiercenia zwierzęcia (14 dni po złamaniu).
- Oceń pooperacyjny dobrostan zwierząt, aby zoptymalizować pooperacyjną opiekę nad zwierzętami. Skorzystaj ze skali punktacji w Tabeli 1, aby ocenić stan pooperacyjny zwierzęcia i dostosować obserwację. Gdy wynik wynosi > 1, podaje się wstrzyknięcie buprenorfiny, a gdy wynik wynosi > 3 i/lub w przypadku utraty masy ciała > 20% masy ciała sprzed operacji pomimo wzbogacenia pokarmu, należy omówić eutanazję (tab. 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W odniesieniu do zabiegów chirurgicznych in vivo, aby optymalnie przeprowadzić tę procedurę niestabilnego złamania żuchwy w modelu mysim, wymagane jest specjalistyczne przeszkolenie i praktyka.
Ta technika dla niestabilnego złamania żuchwy pozwala na badanie procesu chrzęstnej naprawy kości. Po eutanazji pobrano próbki żuchwy i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie (24 h). Po całkowitej dekalcyfikacji w EDTA pH 8, preparaty zatopiono w parafinie. Wykonano seryjne przekroje strzałkowe, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika ta pozwala na realizację nieustabilizowanych złamań żuchwy w modelu mysim przy minimalnym otwartym podejściu w krótkim czasie zabiegu (około 10 minut lub mniej). Ta krótkotrwała procedura ogranicza ryzyko zachorowalności i śmierci zwierząt, zwłaszcza u małych zwierząt, takich jak myszy. W celu uzyskania porównywalnych wyników w analizie procesu naprawy kości śródchrzęstnej należy zwrócić szczególną uwagę na wykonywanie złamań żuchwy w tym samym kierunku bez nieprawidłowego podziału kąta żuchwy, ponieważ to niepo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Badanie jest częściowo wspierane przez Departament Filantropii Mutuelles AXA poprzez Katedrę Głowy i Serca oraz ANR BonyBrain. Dziękujemy wszystkim członkom platformy SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Paryż, Francja, za ich wkład w realizację procedury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina : Buprecare 0,3 mg/kg | Elewator do pielęgnacji | ||
| OBWEGESER szerokość 6mm Długość 17,5cm | Collin Medical | HA 5905 | |
| Kleszcze : Podkładka MORIA 11 cm N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Stół grzewczy Bioseblab 55 cm x 33 cm | Bioseblab | 707 | |
| UCHWYT IGŁY : Uchwyt na igłę Micro Halsey - Metal | LABODERM | 21,100 | |
| Neo Clear | Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy | 109843 | |
| Ocry Gel Tube 10 g (lubrykant do oczu) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Wkładka piezotomowa Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Nożyczki mikro | MORIA | MC52 | |
| Nici jedwabne PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Nożyczki proste | MORIA | 4877A | |
| Vetflurane (izofluran) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Bibliografia
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Ortho Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
- Landry, P. S., Marino, A. A., Sadasivan, K. K., Albright, J. A. Effect of soft-tissue trauma on the early periosteal response of bone to injury. J Trauma. 48 (3), 479-483 (2000).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nat Commun. 12 (1), 2860(2021).
- McGuire, C., Boudreau, C., Prabhu, N., Hong, P., Bezuhly, M. Piezosurgery versus conventional cutting techniques in craniofacial surgery: A systematic review and meta-analysis. Plast Reconstr Surg. 149 (1), 183-195 (2022).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Vercellotti, T. Technological characteristics and clinical indications of piezoelectric bone surgery. Minerva Stomatol. 53, 207-214 (2004).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Tian, Y., et al. HIF-1α regulates osteoclast activation and mediates osteogenesis during mandibular bone repair via CT-1. Oral Dis. 28 (2), 428-441 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
