Artykuł metodologiczny

Stosowanie podawania leków pod kontrolą mikropipet jako metody alternatywnej dla doustnego podawania przez zgłębnik w modelach gryzoni

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66836

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy podawanie leków za pomocą mikropipet (MDA) jako alternatywną metodę do doustnego podawania leków, która zachęca zwierzę badawcze do łatwego przyjmowania leków przy minimalnym stresie i dyskomforcie.

Streszczenie

Zgłębnik ustny (OG) za pomocą kaniuli dołączonej do strzykawki jest jedną z najczęstszych metod stosowanych do precyzyjnego dozowania związków do żołądka zwierząt badawczych. Niestety, metoda ta wiąże się z trudnościami zarówno dla operatora, jak i zwierzęcia badawczego. Badania wykazały, że OG może prowadzić do powikłań, w tym zapalenia przełyku, perforacji przełyku i nieumyślnego podania leku tchawicy. Ponadto OG wiąże się ze zwiększonym poziomem kortykosteronu w osoczu i kale (z powodu stresu), zmienionym ciśnieniem krwi i przyspieszonym tętnem, co może negatywnie wpłynąć lub zniekształcić wyniki badań. Wcześniej opracowana alternatywna metoda określana jako podawanie leków pod kontrolą mikropipet (MDA) zachęca zwierzę do łatwego spożywania leków w minimalnie inwazyjny sposób. W niniejszym artykule przedstawiamy przykłady zastosowania techniki MDA z zabiegami odtworzonymi w różnych nośnikach i demonstrujemy skuteczne dostarczanie różnych metod leczenia wielu różnym szczepom myszy. Ponadto wykazujemy, że MDA jest techniką, która skraca czas i inwazyjność podawania leków i nie wpływa na skład mikrobiomu jelitowego, jak oceniono za pomocą analizy ilościowej podstawowych gatunków drobnoustrojów jelitowych. Ogólnie rzecz biorąc, MDA może stanowić mniej stresującą i skuteczną alternatywę dla OG.

Wprowadzenie

Podawanie leków do modeli gryzoni jest zwykle realizowane za pomocą doustnego zgłębnika (OG), który polega na podawaniu płynnego preparatu bezpośrednio do żołądka za pomocą kaniuli dołączonej do strzykawki zawierającej roztwór. Technika ta skutkuje spójnym i precyzyjnym dawkowaniem leku zwierzęciu, ale niesie ze sobą również wiele wad. OG został przebadany pod kątem nieodpowiedniego modelowania narażenia na dietę u ludzi1,2. Ponadto OG zwiększa ryzyko niezamierzonych urazów górnego odcinka przewodu pokarmowego (perforacja przełyku i żołądka), aspiracji podawanego leczenia oraz zmian w drogach oddechowych3. OG jest również związane z dyskomfortem4, podwyższonym ciśnieniem krwi i częstością akcji serca5, a także stresem6,7, a czasami śmiercią8 z powodu zmniejszonej tolerancji zwierzęcia na zgłębnik. Te zmiany fizjologiczne mogą zakłócać lub zakłócać wyniki eksperymentalne; W związku z tym zbadano nowe procedury, aby uniknąć tych skutków ubocznych. W badaniach stosowano procedury alternatywne dla OG, takie jak stosowanie żelatyny jako nośnika leku9, paski rozpuszczające się w jamie ustnej (ODS)10, igły do zgłębników pokryte sacharozą11, elastyczne rurki do karmienia, ciasteczka pszeniczne12, honey13 i granulki masła orzechowego14. Niestety, istnieją ograniczenia związane z tymi modyfikacjami techniki OG, w tym niekompatybilność z lekami nierozpuszczalnymi w wodzie, dłuższy czas przygotowania do zabiegu15, smakowitość i stabilność leku15 oraz zapoznanie zwierzęcia z jedzeniem. Co więcej, istnieje możliwość mniej precyzyjnego dawkowania, gdy zwierzęta są karmione ad lib.

Scarborough et al.7 wcześniej opracowali alternatywną metodę doustnego leczenia u myszy, którą nazwali podawaniem leków pod kontrolą mikropipet (MDA). Ta metoda podawania opiera się na słodzonym roztworze mleka skondensowanego jako nośniku substancji farmakologicznych, motywując badane zwierzęta do łatwego spożycia przygotowanego nośnika i (lub) roztworów leków poprzez dozowanie roztworu za pomocą pipety jednokanałowej i końcówki do pipety. Aby wprowadzić tę technikę, gryzonie przechodzą sesję szkoleniową (minimum 2 dni), aby skrócić czas obsługi i umożliwić badanemu zwierzęciu zapoznanie się z piciem z końcówki pipety4. Wstępne badania walidacyjne przeprowadzone przez Scarborough et al.7 oraz Schalbetter et al.16 sugerują, że procedura MDA jest łatwa do wdrożenia, opłacalna, minimalnie inwazyjna i mniej stresująca dla zwierząt niż konwencjonalne metody doustnego podawania przez zgłębnik. Scarborough i wsp. wprowadzili zastosowanie techniki MDA w mysim modelu aktywacji immunologicznej matki (MIA) zaburzeń neurorozwojowych7. Badanie to wykazało, że profile farmakokinetyczne myszy leczonych lekiem przeciwpsychotycznym risperidonem przy użyciu MDA były porównywalne ze stosowaniem OG. Co więcej, MDA nie indukowało wzrostu poziomu kortykosteronu (hormonu stresu) u myszy, a przewlekłe leczenie rysperydonem przy użyciu techniki MDA prowadziło do zależnego od dawki zmniejszenia deficytów interakcji społecznych wywołanych przez MIA i nadwrażliwości na amfetaminę7. Dodatkowe badania dotyczyły skuteczności MDA w porównaniu z OG zarówno w modelach mouse17, jak i rat18. MDA porównano również z wstrzyknięciem dootrzewnowym i wykazano, że jest równie skuteczny w dostarczaniu N-tlenku klozapiny myszy16. Ze względu na zgłoszone sukcesy MDA w zmniejszaniu stresu u zwierząt i skuteczności terapeutycznej, obecnie dążymy do dalszego zbadania techniki MDA jako skutecznej metody dostarczania leków przy użyciu dodatkowych modeli mysich. W tym miejscu opisujemy implementację metody MDA w leczeniu różnych szczepów myszy, w tym szczepów FVB/NJ i C57BL/6J oraz szczepu NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) z obniżoną odpornością za pomocą różnych metod leczenia doustnego, w tym żywych bakterii, związków eksperymentalnych dostarczanych w roztworach nierozpuszczalnych w wodzie (olej kukurydziany) oraz kontroli nośników. Oceniliśmy aktywność i obecność różnych metod leczenia w surowicy i kale, a także oceniliśmy zmiany w mikrobiocie jelitowej w stosunku do metody MDA.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) M021M197 i M023M195. Użyte szczepy myszy (samce myszy w wieku 7 tygodni) opisano w Tabeli materiałów. Wykorzystanie samców myszy wynikało z ich wykorzystania w trwających badaniach nad rakiem prostaty. Wcześniej wykazano, że metoda MDA jest skuteczna również u samic myszy7,17. Myszy zostały losowo przydzielone do odpowiednich klatek/grup leczonych. Myszy były leczone w klatkach i w dowolnej kolejności. Eksperymentator podający leczenie był ślepy na grupę leczoną. Liczba przypisana myszy odnosiła się do jej identyfikatora, a nie do kolejności, w jakiej była traktowana. Dane były zbierane przez cały czas trwania badania i analizowane na końcu, aby uniknąć jakichkolwiek uprzedzeń. Testy eksperymentalne były zaślepione dla grupy leczonej, dopóki wszystkie dane nie zostały zebrane.

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany z Scarborough et al.7.

1. Przygotowanie zabiegów

  1. Przygotuj roztwór słodzonego mleka skondensowanego (składniki: mleko i cukier) i wody klasy biologii molekularnej, używając mleka do wody w proporcji 3:10. Odmierz słodzone mleko skondensowane za pomocą stożkowej rurki o pojemności 15 ml ze względu na lepkość mleka.
  2. Używając stożkowej probówki o pojemności 50 ml, wymieszaj wodę klasy biologii molekularnej ze słodzonym mlekiem skondensowanym, powoli mieszając 5 ml wody na raz z mlekiem.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany w sterylnych warunkach przy użyciu komory bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Przygotować podwielokrotności roztworu mleka (przechowywane jako podwielokrotności 500 μl) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C do czasu połączenia z obróbką będącą przedmiotem zainteresowania.
  4. Zawiesić podawanie w odpowiednich pojazdach w odpowiednim stężeniu opartym na masie ciała zwierzęcia przed połączeniem ich ze słodzonym roztworem mleka skondensowanego/wody.

2. Sesja szkoleniowa MDA

UWAGA: Ta sekcja opisuje modele myszy; jednak technika MDA może być skalowana w zależności od potrzeb z większymi objętościami/końcówkami pipet dla większych modeli gryzoni.

  1. OPCJONALNIE: Delikatnie przytrzymuj badane zwierzę, przytrzymując jedną ręką kark
    2. .
  2. Zaoferuj badanemu zwierzęciu 100 μl słodzonego roztworu mleka skondensowanego/wody (bez dodatku eksperymentalnego traktowania) za pomocą pipety jednokanałowej i końcówki do pipety o pojemności 200 μl, którą prowadzi się do ust.
  3. Dozuj roztwór mleka/wody powoli, aby uniknąć pominięcia pyska zwierzęcia. Upewnij się, że zwierzę łatwo spożywa roztwór mleka w ilości od 5 do 15 s.
    UWAGA: Ten trening trwa co najmniej 2 kolejne dni (jedna sesja treningowa dziennie), bez zmian w podawanej objętości. Podczas sesji treningowych MDA potrzebne było delikatne ograniczenie przez kark. Scarborough et al.7 zalecają pełne unieruchomienie zwierzęcia w pierwszym dniu treningu MDA, a następnie unieruchomienie za ogon w drugim dniu. Sposób unieruchamiania może się różnić w przypadku większych modeli gryzoni. Z kolei Vanhecke i in.17 trzymali myszy tylko lekko za ogon podczas treningu.

3. Leczenie myszy metodą MDA

  1. Połączyć badany zabieg z słodzonym roztworem mleka skondensowanego/wody (patrz przykłady z eksperymentami walidacyjnymi [sekcja 4 i sekcja 5] poniżej).
  2. OPCJONALNIE: Delikatnie przytrzymuj badane zwierzę, przytrzymując jedną ręką kark.
    UWAGA: Scarborough et al.7 donoszą, że myszy nie wymagają już ograniczeń poza okresem treningu i chętnie piją z końcówki pipety. W przeciwieństwie do tego, Vanhecke i in.17 podają, że w przypadku niektórych zabiegów (np. tamoksyfenu), które mogą mieć łagodną awersję do smaku, MDA najlepiej wykonywać poprzez delikatne krępowanie myszy za pomocą karku podczas wszystkich zabiegów. Badanie to wykazało również, że ułożenie zwierzęcia na grzbiecie z delikatnym karkiem poprawia czas i skuteczność stosowania leczenia.
  3. Podawać 100 μl leku za pomocą pipety jednokanałowej i końcówki pipety o pojemności 200 μl kierowanej do pyska zwierzęcia, tak jak podczas sesji treningowych.
  4. Traktuj pojedyncze zwierzę na raz.
  5. Po leczeniu umieścić każde zwierzę z powrotem w odpowiedniej klatce.
    UWAGA: Zabiegi metodą MDA mogą być wykonywane codziennie lub w sposób powtarzalny7,17.

4. Eksperyment walidacyjny #1 - doustne dostarczanie bakterii jelitowych myszom za pomocą MDA

UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie metody MDA do doustnego dostarczania żywych bakterii do badań kolonizacji jelit u myszy. W tym reprezentatywnym eksperymencie pilotażowym bakteria Gram-dodatnia Clostridium scindens jest dostarczana myszom C57BL / 6J. Myszy były leczone antybiotykami (cefofytyną) przez dwa kolejne dni w wodzie pitnej przed inokulacją bakteryjną MDA.

  1. Kultura bakteryjna
    1. Kultura C. scindens szczep ATCC 35704 we wzmocnionym bulionie clostridial (RCB) przy użyciu zamrożonego glicerolu do inokulacji 500 μl bakterii do probówki RCB o pojemności 7 ml. Rosnąć beztlenowo przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Użyj 500 μl nocnej kultury bakterii do zaszczepienia nowej probówki RCB i inkubuj beztlenowo przez 24 godziny. Wyjmij tę probówkę z komory beztlenowej i użyj jej do przygotowania leczenia bakteryjnego MDA. Użyj tej samej probówki, aby obliczyć jednostki tworzące kolonie na mililitr (CFU/ml).
  2. Obliczanie C. scindens jtk/ml
    1. Stworzyć rozcieńczenie 1:3 kultury C. scindens, używając 3,5 ml kultury zaszczepionej w 7 ml pożywki RCB. Z próbki tego rozcieńczenia sporządzić 20% 1 ml glicerolu (1:1), który jest przechowywany w temperaturze -80 °C.
    2. Umieścić 100 μl rozcieńczenia w stosunku 1:3 na wzmocnionych płytkach z agarem clostridialnym (RCA). Użyć pierwszego rozcieńczenia, aby następnie wykonać kolejne seryjne rozcieńczenia i płytkę, w sumie jeszcze trzy razy.
    3. Po inkubacji płytek RCA policz kolonie i oblicz CFU. Użyj poniższego równania, aby obliczyć stężenie komórek bakteryjnych w rozcieńczonych i oryginalnych próbkach:
      CFU w rozcieńczonej próbce (komórki/ml) = (liczba kolonii zliczonych na płytce RCA)/(ilość rozcieńczonej próbki dodanej do płytki RCA w ml)
      CFU w oryginalnej próbce (komórki/ml) = (jtk w rozcieńczonej próbce)/(rozcieńczenie płytki RCA)
  3. Przygotowanie leczenia C. scindens MDA
    1. Połączyć roztwór 50 μl (w tym przykładzie 1,265 x 106 jtk/ml) C. scindens + 50 μl słodzonego roztworu mleka skondensowanego/wody.
      UWAGA: Jeśli potrzebna jest konkretna jtkówka, można zastosować alternatywną metodę oznaczania ilościowego komórek bakteryjnych, taką jak utworzenie krzywej wzorcowej z pomiarami gęstości optycznej (OD) przy 600 nm.
  4. Doustne leczenie myszy C. scindens przy użyciu MDA
    1. W dniach 1-3 zapoznaj myszy z roztworem mleka, jak opisano w sekcji 2 (sesja treningowa MDA).
    2. W 4 dniu podaj 100 μl roztworu mleka C. scindens + lub roztworu PBS (kontrola) + mleko za pośrednictwem MDA myszom C57BL/6J. Myszy należy leczyć raz na czas trwania badania.
  5. Pobieranie próbek kału
    1. Chwyć mysz za delikatny kark i poczekaj, aż wypuszczą kał. Zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytnicy do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  6. C. scindens ilościowy PCR (qPCR)
    1. Wykonaj ekstrakcję DNA kału przy użyciu wcześniej opublikowanego protokołu19,20.
    2. Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru DNA do wykrywania o wysokiej czułości. Normalizować próbki DNA do 10 ng/μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    3. Użyj qPCR, aby zbadać liczebność: (i) bakterii C. scindens przy użyciu konserwatywnych starterów przeciwko genowi desA szczepu C. scindens ATCC 35704, (ii) bakterii ogółem przy użyciu starterów zaprojektowanych przeciwko hiperzmiennemu regionowi V6 bakteryjnego genu 16S rRNA, jak opisano wcześniej20,21.
      UWAGA: Warunki qPCR i użyte startery są wymienione w Tabeli 1. Krzywa standardowa wykorzystująca DNA szczepu C. scindens ATCC 35704 została wykorzystana do oszacowania kopii bakterii desA+.

5. Eksperyment walidacyjny #2 - eksperymentalne dostarczanie leku myszom za pomocą MDA

UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie metody MDA do dostarczania eksperymentalnego związku myszom. W tym reprezentatywnym eksperymencie pilotażowym metabolit sojowy equol (S-equol) jest dostarczany myszom NSG i FVB/NJ.

  1. Przygotowanie kuracji S-equol
    UWAGA: Zarówno S-efoli, jak i dimetylosulfotlenek (DMSO) są podawane i przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    1. Rozpuść S-equol w DMSO w połączeniu z olejem kukurydzianym (90%). Zmieszać podany na porcję S-equol w oleju kukurydzianym (220 μl) z 480 μl słodzonego roztworu mleka skondensowanego/wody. Połącz i wymieszaj ten roztwór w pomieszczeniu dla zwierząt, aby uniknąć oddzielenia oleju od mleka.
      UWAGA: Jeśli zaobserwuje się oddzielenie roztworu, wymieszaj roztwór przed zabiegiem. Podawana dawka S-equolu wynosi 25 mg/kg mc./dobę. Myszy użyte w tym badaniu miały podobną wagę, więc otrzymały tę samą dawkę. Może być konieczne dostosowanie dawki leku i przygotowanie jej w wielu preparatach w zależności od masy ciała badanego zwierzęcia.
    2. Połącz pojazd DMSO z olejem kukurydzianym (90%). Zmieszać porcjowane DMSO w oleju kukurydzianym (220 μl) z 480 μl słodzonego roztworu mleka skondensowanego/wody. Połącz i wymieszaj ten roztwór w pomieszczeniu dla zwierząt, aby uniknąć oddzielenia oleju od mleka.
      UWAGA: Jeśli zaobserwuje się oddzielenie roztworu, wymieszaj roztwór przed zabiegiem.
  2. Doustne leczenie myszy S-equol przy użyciu MDA
    1. W dniach 1 i 2 zapoznaj myszy z roztworem mleka, jak opisano w sekcji 2 (sesja treningowa MDA).
      UWAGA: W eksperymencie walidacyjnym #1 przestrzegano czasu treningu opisanego w Scarborough et al., który sugerował 3-dniowy czas aklimatyzacji. W tym eksperymencie przetestowano krótszy czas treningu (2 dni) i stwierdzono, że nie zmienił on podawania interesujących nas zabiegów.
    2. W dniach 3-43 potraktuj myszy (i) kontrolą PBS, (ii) nośnikiem DMSO lub (iii) S-equol, wszystkie w połączeniu ze słodzonym roztworem skondensowanego mleka / wody. Sporządzić wzorcową mieszankę roztworu, aby dostarczyć jednorodny roztwór substancji leczniczych wszystkim badanym zwierzętom. Podawać całkowitą objętość 100 μl każdej myszy raz dziennie, 5 dni w tygodniu, w sumie przez 43 dni.
  3. Pobieranie krwi
    1. Pobrać krew po eutanazji (przedawkowanie dwutlenku węgla) poprzez nakłucie serca. Przenieść krew do probówki z separatorem surowicy mikrotainera, wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do czasu dalszego przetwarzania.
    2. Odwirować próbkę krwi do całkowitego rozdzielenia w temperaturze 254 x g przez 5 minut. Zebrać surowicę (górna warstwa separacji) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  4. Chromatografia cieczowa S-equol z tandemową spektrometrią mas (LC/MS/MS)
    1. Zapoznaj się z plikiem Tabela materiałów, aby zapoznać się z chemikaliami i odczynnikami użytymi w tym eksperymencie.
    2. Wzorce kalibracyjne i kontrola jakości: Przygotować roztwory podstawowe S-equol i wzorca wewnętrznego (racemicznego equol-d4) w DMSO w stężeniach 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Rozcieńczyć podstawowe roztwory wzorcowe acetonitrylem:woda (50:50) w celu przygotowania zmieszanego roztworu roboczego o różnych stężeniach. Przygotować wzorzec wewnętrzny w octanie etylu jako roztwór ekstrakcyjny o stężeniu 100 ng/ml. Przechowywać roztwory podstawowe i robocze w temperaturze 4 °C i stosować codziennie, rozcieńczone lub bezpośrednio.
    4. Ekstrakcja próbki
      1. Przygotować próbkę, wytrącając białka przez roztwór ekstrakcyjny (octan etylu plus wzorzec wewnętrzny, patrz sekcja 5.4.3), a następnie odwirować i odparować supernatant w suchym azocie (50 °C).
      2. Rozpuść próbkę w 100 μl 50% acetonitrylu i przenieś do fiolek z automatycznym samplerem w celu analizy LC/MS/MS.
    5. Separacja próbek
      1. Osiągnąć separację za pomocą kolumny C18, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Użyj 0,1% kwasu mrówkowego jako ruchomej fazy A i 0,1% kwasu mrówkowego w ruchomej fazie B acetonitrylu.
      2. Użyj gradientu i utrzymuj ruchomą fazę B na poziomie 40% z natężeniem przepływu 0,3 ml/min przez 0,5 minuty. Następnie zwiększ natężenie przepływu do 100% w ciągu 1 minuty, przytrzymaj tam przez 2 minuty, a następnie wróć do 40% B przez 1 minutę.
      3. Monitorować ścieki z kolumny za pomocą detektora spektrometrycznego mas wykorzystującego jonizację elektronrozpylającą, który działa w trybie ujemnym. Zaprogramuj spektrometr do monitorowania następujących przejść monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM): 241 → 119.1 dla S-equol i 245 → 123 dla wzorca wewnętrznego, equol-d4.
      4. Oblicz krzywą kalibracyjną dla S-equol przy użyciu piku stosunku powierzchni analizy do wzorca wewnętrznego, używając równania kwadratowego z funkcją ważenia 1/x2 przy użyciu zakresów kalibracji 5-500 ng/ml.

6. Pomiar wpływu leczenia MDA na mikrobiotę jelita grubego

UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie qPCR do pomiaru poziomu mikrobioty jelitowej po leczeniu MDA.

  1. Przeprowadzić pobieranie próbki kału i ekstrakcję DNA zgodnie z opisem w krokach 4.5.1 i 4.6.1.
  2. Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru DNA do wykrywania o wysokiej czułości. Normalizować próbki DNA do 10 ng/μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  3. Użyj qPCR, aby zbadać liczebność członków mikrobioty jelitowej: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. oraz (v) bakterie ogółem przy użyciu starterów zaprojektowanych przeciwko hiperzmiennemu regionowi V6 bakteryjnego genu 16S rRNA, jak opisano wcześniej20,21,22.
    UWAGA: Warunki qPCR i użyte startery są wymienione w Tabeli 2.

Wyniki

MDA może być używane do doustnego dostarczania szczepów bakteryjnych w modelach mysich. Myszy C57BL/6J były leczone antybiotykami (cefoksytyna w wodzie pitnej) przez 2 dni w celu usunięcia komensalnych społeczności drobnoustrojów przed rozpoczęciem sesji treningowej MDA. Słodzony roztwór mleka skondensowanego/wody podawano raz na dobę kolejno przez 3 dni przed podaniem leku. Myszy były na krótko krępowane przez delikatny kark podczas podawania leczenia MDA. W dniu 4 myszy traktowano raz PBS (kontrola ujemna, n = 4) lub beztlenową kulturę C. scindens (bakterie desA+, n = 4), która została wcześniej zawieszona w słodzonym roztworze skondensowanego mleka / wody. Wszystkie myszy na ogół przyjmowały leczenie w ciągu kilku sekund i wypijały całą dawkę (100 μl). Aby zweryfikować dostarczanie i obecność bakterii beztlenowych, porównaliśmy próbki kału pobrane po leczeniu antybiotykami z próbkami kału pobranymi 24 godziny po leczeniu PBS lub C. scindens (Rysunek 1). DNA kału wyizolowano, określono ilościowo i znormalizowano do 10 ng / μl w celu przeprowadzenia qPCR przy użyciu starterów specyficznych dla genu C. scindens ATCC 35704 desA (Tabela 1). Zaobserwowaliśmy, że myszy leczone antybiotykami miały minimalne lub żadne bakterie desA +. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowaliśmy znacznie większą ilość bakterii desA + u myszy leczonych C. scindens, która znacznie różniła się od tych w grupie kontrolnej PBS (p = 0,0286, Figura 1).

Dostarczenie eksperymentalnego związku (S-equol) przy użyciu metody MDA. Myszy NSG (n = 15) i FVB/NJ (n = 18) przeszły trening z użyciem słodzonego roztworu mleka skondensowanego / wody dwa dni przed podaniem leczenia. Myszy NSG poddano antybiotykoterapii (cefoksytyna w wodzie pitnej) w celu wyeliminowania bakterii jelitowych wytwarzających equol, a tym samym endogennej produkcji equolu. Myszy FVB/NJ karmiono dietą bezsojową w celu wyeliminowania endogennej produkcji equolu. Wszystkie myszy zostały na krótko skrępowane delikatnym karkiem w celu podania zabiegów. Grupa kontrolna otrzymała słodzony roztwór mleka skondensowanego / wody w połączeniu z olejem kukurydzianym, grupa DMSO (kontrola nośnika dla S-equol) otrzymała słodzony roztwór mleka skondensowanego / wody i DMSO w oleju kukurydzianym, a grupa equol otrzymała słodzony roztwór mleka skondensowanego / wody i equol w oleju kukurydzianym. Myszy leczono techniką MDA przez pięć dni w tygodniu przez łącznie 43 dni. Myszy na ogół przyjmowały leki w ciągu kilku sekund i wypijały całą dawkę (100 μl). Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie myszy spożywały co najmniej połowę dawki w danym dniu (częściowa dawka w określonym dniu, ale pełna dawka dzień wcześniej lub następnego dnia). Żadna z myszy nie odmówiła całkowicie leczenia w trakcie trwania badania. Zaobserwowaliśmy, że po ułożeniu myszy na plecach skróciło czas konsumpcji leku i upewniło się, że zwierzę przyjęło całą dawkę.

Krążące poziomy equolu świadczą o skutecznym dostarczaniu leków MDA. Próbki krwi pobrano od myszy NSG po eutanazji pod koniec badania, aby potwierdzić, że dostarczanie eklolu przez MDA doprowadziło do krążących poziomów equolu u badanych zwierząt. Nie odzyskaliśmy wystarczającej ilości krwi od jednej z myszy leczonych equol, aby wykonać test LC / MS / MS. Stężenia equol w surowicy mierzono metodą LC/MS/MS w Analytical Pharmacology Shared Resource w Johns Hopkins University School of Medicine. Zaobserwowaliśmy brak krążącego equolu w grupach kontrolnych i DMSO (nośnik equol), podczas gdy myszy leczone equol miały wykrywalny krążący equol (Figura 2). Co ważne, spodziewamy się pewnych różnic w krążących poziomach equolu u myszy leczonych equolem ze względu na różne daty i godziny składania ofiar ze zwierząt w tym eksperymencie.

Społeczności mikroorganizmów jelitowych pozostają niezmienione po leczeniu MDA. Wpływ roztworu mleka MDA (z equolem i bez) na mikrobiotę jelitową oceniano przy użyciu myszy FVB/NJ. Określiliśmy ilościowo skład mikrobiologiczny próbek pobranych na początku badania (bez leczenia/bez MDA) oraz próbek pobranych 7 dni po rozpoczęciu leczenia (9 dni po rozpoczęciu MDA, w tym dni treningowe). Nie zaobserwowaliśmy żadnych istotnych zmian w całkowitym obciążeniu bakteryjnym ani ogólnym składzie mikrobioty jelitowej (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.), jak oceniono za pomocą specyficznej dla gatunku analizy qPCR (Rysunek 3), jak opisano wcześniej21,22. Jedna klatka wykazała istotną różnicę w Lactobacillus między wartością wyjściową a po leczeniu MDA; jednak odkrycie to zaobserwowano w kontroli pojazdu DMSO i nie było spójne we wszystkich klatkach.

figure-results-1
Rysunek 1: MDA dostarcza bakterie beztlenowe do jelit myszy, które można określić ilościowo za pomocą qPCR w kale. Myszy C57BL/6J były leczone antybiotykami przez dwa kolejne dni w wodzie pitnej. Myszy były następnie leczone bakterią beztlenową C. scindens przy użyciu metody MDA. Obciążenie bakteriami C. scindens (desA+) w kale mierzono metodą qPCR dla genu desA zarówno po antybiotykoterapii, jak i 24 godziny po leczeniu MDA (PBS lub C. scindens). (A) Kwantyfikacja genu desA specyficzna dla C. scindens jest pokazana między myszami leczonymi PBS i C. scindens po leczeniu antybiotykami i 24 godziny po leczeniu MDA. (B) Te same dane pokazane dla 24 godzin po MDA w (A) są pokazane jako wykres kolumnowy. Istotność statystyczną określono za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. (*) p = 0,0286, słupki błędów = SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza krążących poziomów equolu u myszy NSG leczonych equol techniką MDA. Poziomy equol w surowicy oznaczano ilościowo za pomocą LC / MS / MS u myszy kontrolnych (n = 5), DMSO (nośnik, n = 5) i equol (n = 4). Od jednej z myszy leczonych equol nie pobrano wystarczającej ilości krwi, aby wykonać LC/MS/MS. Zabiegi te były realizowane metodą MDA. Equol w surowicy był wykrywalny tylko w grupie leczonej equolem. Granica oznaczalności < 5 ng/ml. Istotność statystyczną określono za pomocą nieparametrycznej jednoczynnikowej ANOVA z wielokrotnymi porównaniami (poprawka Dunna). (**) p = 0,0053, słupki błędów = SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Podstawowe bakterie jelitowe i całkowite poziomy obciążenia bakteryjnego pozostają niezmienione u myszy FVB/NJ po leczeniu MDA. Nie zaobserwowano istotnych zmian w wartościach qPCR Cq dla docelowych zbiorowisk drobnoustrojów przed i po podaniu metody MDA. Lactobacillus wykazał istotną różnicę (*, p = 0,0321) tylko w klatce 3 między wartością wyjściową a leczeniem MDA. Odkrycie to nie było spójne wśród klatek. Numery koszyków są oznaczone jako C1-C4. Istotność statystyczną określono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z wielokrotnymi porównaniami (poprawka Tukeya). Słupki błędów = SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa podkładuSekwencje podkładoweWarunki PCR
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93°C 3 min, 34 cykle (95 °C 30 s, 54 °C 30 s)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tabela 1: Startery i warunki qPCR dla bakterii desA+ (C. scindens).

Nazwa podkładuSekwencje podkładoweWarunki PCR
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 min
36 cykli
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 cykli
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95 °C, 3 min
36 cykli
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 min
44 cykle
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 cykli
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

Tabela 2: Startery i warunki qPCR używane do pomiaru wpływu MDA na mikrobiotę jelitową.

Dyskusja

OG może być znaczącym źródłem stresu u zwierząt badawczych, które może tworzyć zmienną zakłócającą, jak wcześniej oceniano w wielu badaniach 7,9,11,12,13,14,15,23. Ze względu na inwazyjność OG zastosowano alternatywne techniki w celu zminimalizowania wyzwań związanych z OG 9,10,12,13,14,15. Podawanie leków pod kontrolą mikropipety (MDA) to nowatorska technika, która pozwala na dostarczanie leku w mniej inwazyjny sposób przy użyciu pipety jednokanałowej i mieszanki leku będącego przedmiotem zainteresowania ze słodzonym roztworem mleka skondensowanego7. Kluczowym krokiem dla tej techniki jest sesja treningowa (minimum 2 dni), która pozwala zwierzęciu lepiej zapoznać się z końcówką pipety i smakiem słodzonego mleka skondensowanego, a także ogólnie skraca czas obsługi i stres. Ta sesja treningowa pozwala również myszom na łatwe spożywanie leków zawartych w słodzonym roztworze mleka skondensowanego znacznie szybciej niż inne techniki i z precyzyjną dawką.

Nasze badania ściśle śledziły przygotowanie i dostarczanie słodzonego roztworu mleka skondensowanego / wody przedstawionego w Scarborough i wsp.7. Przez cały czas trwania badania myszy nie były pozbawione wody ani pożywienia przed podaniem dawki. Trzymano je w odpowiednich klatkach, a czas leczenia wynosił mniej niż 1 minutę. Jedną z kluczowych różnic w naszych badaniach było to, że prawdopodobnie ze względu na potencjalne upośledzenie wzroku u szczepów myszy albinosów, których używaliśmy, oraz możliwość lekkiej awersji do smaku przy leczeniu farmakologicznym, wszystkie myszy wymagały krótkiego ograniczenia poprzez delikatne chrupanie w ramach protokołu szkolenia i leczenia. Ta modyfikacja leczenia MDA jest zalecana przez Vanhecke i wsp.16. Delikatny kark, wraz z ułożeniem myszy na grzbietach, zachęcił myszy do chętnego spożywania roztworu mleka. Dochodzimy do wniosku, że potrzeba delikatnego karczowania w ramach etapów szkolenia i leczenia jest opcjonalna i będzie zależała od badania. Podawanie leków (skorygowanych o masę ciała zwierzęcia, jeśli dotyczy) podawano w standaryzowanej objętości, a myszy nie wykazywały zmian w zachowaniu. Inne niewielkie modyfikacje w stosunku do początkowego badania7 obejmowały zmniejszenie liczby sesji treningowych i objętości podawanych podczas każdej sesji. Niektóre z ograniczeń, które napotkaliśmy w tym badaniu, obejmują oporność niektórych myszy na wypicie całej dawki (100 μl) roztworu mleka w pierwszym dniu treningu i w określonych momentach badania. Udało się to przezwyciężyć poprzez ułożenie myszy na plecach podczas krępowania. W badaniu tym nie oceniano interakcji leku ze słodzonym roztworem mleka skondensowanego, różnic w spożyciu między płciami myszy (chociaż wcześniej wykazano, że MDA jest skuteczne również u samic myszy 7,17) ani podwyższenia markerów stresu, takich jak poziom kortykosteronu 7,11,14, związanego z OG.

W tym badaniu skupiliśmy się na zdolności techniki MDA do dostarczania precyzyjnej dawki eksperymentalnego leczenia, a następnie oceniliśmy poziomy kału i / lub krążenia badanych terapii u badanych zwierząt. Oceniliśmy również, czy leczenie MDA zmienia mikrobiotę jelitową i zaobserwowaliśmy minimalne lub żadne zmiany w podstawowej mikrobiocie kałowej lub całkowitym obciążeniu bakteryjnym kałem badanych zwierząt. Nie zaobserwowaliśmy również żadnych urazów u zwierząt spowodowanych leczeniem MDA. Podsumowując, MDA może służyć jako alternatywna metoda krótko- i długoterminowego leczenia w modelach gryzoni. Ogólnie rzecz biorąc, MDA ma pozytywny wpływ na dobrostan zwierząt poprzez zmniejszenie ryzyka urazów związanych z OG. MDA pokonuje niektóre ograniczenia innych technik i proponujemy, aby mogło być szeroko stosowane w badaniach translacyjnych w wielu różnych modelach gryzoni24.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie badawcze ze strony Departamentu Obrony Nagroda Programu Badań nad Rakiem Prostaty W81XWH-20-1-0274 oraz Nagroda Fundacji Raka Prostaty 16CHAL13. Chcielibyśmy podziękować i wyrazić uznanie dla dr Michelle Rudek, dr Noushin Rastkari, dr Nicole Anders i Linping Xu z Analytical Pharmacology Shared Resource w Johns Hopkins za pomoc w equol LC/MS/MS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200 i mikro; L końcówki do pipetMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 detektor spektrometrycznySciexN/A
Akkermansia muciniphila szczep muc genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Octan amonuSigma– Myszy Aldrich5.43834
C57BL/6JSzczep Jackson Laboratories# 000664
C. scindens szczep 35704Kolekcja kultur typu amerykańskiego35704
Agent cefoxityny NDC25021-109-10
Olej kukurydzianyMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
Fisher ScientificAC611050040
Kwas mrówkowySigma– Aldrich5.33002
Myszy FVB/NJSzczep Jackson Laboratories# 001800
GlycerolSigma– AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
Woda klasy LC-MSFisher Scientific14-650-357
MetanolFisher Scientific02-003-340
Rurka separatora surowicy MicrotainerBecton Dickinson02-675-185
Woda klasy biologii molekularnejCorning46-000-CI
Myszy NSGJackson LaboratoriesSzczep # 005557
PBSCorning21-031-CV
Zestaw Qubit DNA HSInvitrogenQ32851
Racemic  equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Wzmocniony agar ClostridiumAnaerobe SystemsAS-6061
Wzmocniony bulion ClostridiumSystemy beztlenoweAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
Wzorzec referencyjny S-equol dla LC-MSCayman Chemical10010173
Pojedynczy pipeta kanałowaRainin17008652
Streptococcus salivarius genomic DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Słodzone mleko skondensowaneCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3 VSL#3B07WX1LVHL
β-glukuronidaza z Helix pomatiaSigma– AldrichG7017
etanol powiedział:

Bibliografia

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podawanie lek w za pomoc mikropipetydostarczanie lek w myszomtechnika ma oinwazyjnamikrobiom jelitowymodele raka prostatymetody redukcji stresumetody podawania lek ws odzone mleko jako no nik

Powiązane artykuły