Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Summary

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na odwapnienie świeżo pobranych tkanek kostnych i zachowanie wysokiej jakości RNA. Przedstawiono również metodę cięcia próbek niezdemineralizowanych kości z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie (FFPE) w celu uzyskania dobrej jakości wyników, jeśli świeże tkanki nie są dostępne lub nie można ich pobrać.

Abstract

Zrozumienie relacji między komórkami i ich lokalizacji w każdej tkance jest niezbędne do odkrycia procesów biologicznych związanych z normalnym rozwojem i patologią choroby. Transkryptomika przestrzenna to potężna metoda, która umożliwia analizę całego transkryptomu w próbkach tkanek, dostarczając w ten sposób informacji o ekspresji genów komórkowych i kontekście histologicznym, w którym znajdują się komórki. Chociaż metoda ta jest szeroko stosowana w przypadku wielu tkanek miękkich, jej zastosowanie do analiz tkanek twardych, takich jak kości, było wyzwaniem. Głównym wyzwaniem jest niemożność zachowania dobrej jakości RNA i morfologii tkanek podczas przetwarzania próbek tkanek twardych do sekcji. W związku z tym opisano tutaj metodę przetwarzania świeżo pobranych próbek tkanki kostnej w celu efektywnego generowania przestrzennych danych transkryptomicznych. Metoda pozwala na odwapnienie próbek, zapewniając udane skrawki tkanek z zachowanymi szczegółami morfologicznymi przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA. Ponadto podano szczegółowe wytyczne dla próbek, które wcześniej były zatopione w parafinie, bez demineralizacji, takich jak próbki pobrane z banków tkanek. Korzystając z tych wytycznych, przedstawiono wysokiej jakości dane transkryptomiki przestrzennej wygenerowane z próbek tkanek z banku tkanek guza pierwotnego i przerzutów do płuc kostniakomięsaka kostnego.

Introduction

Kość to wyspecjalizowana tkanka łączna składająca się głównie z włókien kolagenu typu 1 i soli nieorganicznych¹. Dzięki temu kość jest niezwykle mocna i sztywna, a jednocześnie lekka i odporna na urazy. Ogromna wytrzymałość kości wynika z jej zawartości minerałów. W rzeczywistości, przy każdym wzroście procentowej zawartości minerałów, sztywność wzrasta pięciokrotnie². W związku z tym badacze napotykają poważne problemy, gdy analizują, za pomocą sekcji histologicznej, biologię próbki kości.

Histologia kości nieodwapnionej jest wykonalna i czasami wymagana, w zależności od rodzaju badania (np. w celu zbadania mikroarchitektury kości); jest to jednak bardzo trudne, zwłaszcza jeśli próbki są duże. W takich przypadkach przetwarzanie tkanek do celów histologicznych wymaga kilku modyfikacji standardowych protokołów i technik³. Ogólnie rzecz biorąc, aby przeprowadzić typowe oceny histologiczne, tkanki kostne są odwapniane zaraz po utrwaleniu, co może trwać od kilku dni do kilku tygodni, w zależności od wielkości tkanki i zastosowanego środka odwapniającego⁴. Odwapnione skrawki są często wykorzystywane do badania szpiku kostnego, diagnozy nowotworów itp. Istnieją trzy główne rodzaje środków odwapniających: mocne kwasy (np. kwas azotowy, kwas solny), słabe kwasy (np. kwas mrówkowy) i czynniki chelatujące (np. kwas etylenodiaminoterakowy lub EDTA)⁵. Silne kwasy mogą bardzo szybko odwapnić kości, ale mogą uszkodzić tkanki; słabe kwasy są bardzo powszechne i nadają się do procedur diagnostycznych; Czynniki chelatujące są zdecydowanie najczęściej stosowane i odpowiednie do zastosowań badawczych, ponieważ w tym przypadku proces demineralizacji jest powolny i łagodny, co pozwala na zachowanie wysokiej jakości morfologii i zachowanie informacji o genach i białkach, co jest wymagane przez wiele procedur (np. hybrydyzacja in situ, barwienie immunologiczne). Jednak gdy konieczne jest zachowanie całego transkryptomu, na przykład w przypadku analiz ekspresji genów, nawet powolna i delikatna demineralizacja może być szkodliwa. W związku z tym potrzebne są lepsze podejścia i metody, gdy analiza morfologiczna tkanek musi być połączona z analizami ekspresji genów w komórkach.

Dzięki niedawnym ulepszeniom w sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) i transkryptomice przestrzennej, teraz możliwe jest badanie ekspresji genów w próbce tkanki nawet wtedy, gdy do przechowywania próbek tkanek użyto zatapiania parafiny z utrwalaniem w formalinie (FFPE)^6,7,8. Ta możliwość odblokowała dostęp do większej liczby próbek, takich jak te przechowywane w bankach tkanek na całym świecie. Jeśli ma być zastosowany sekwencjon scRNA, integralność RNA jest najważniejszym wymogiem; jednak w przypadku transkryptomiki przestrzennej próbek FFPE do wizualizacji ekspresji genów w kontekście histologicznym każdego wycinka tkanki niezbędne są zarówno wysokiej jakości skrawki tkanki, jak i wysokiej jakości RNA. Chociaż można to łatwo osiągnąć w przypadku tkanek miękkich, tego samego nie można powiedzieć o tkankach twardych, takich jak kości. W rzeczywistości, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nigdy nie przeprowadzono żadnego badania z wykorzystaniem transkryptomiki przestrzennej na próbkach kości FFPE. Wynika to z braku protokołów, które mogłyby skutecznie przetwarzać tkanki kostne FFPE przy jednoczesnym zachowaniu ich zawartości RNA. W tym przypadku najpierw przedstawiono metodę przetwarzania i odwapniania świeżo uzyskanych próbek tkanki kostnej przy jednoczesnym unikaniu degradacji RNA. Następnie, dostrzegając potrzebę analizy transkryptomicznej próbek FFPE pobranych w bankach tkanek na całym świecie, przedstawiono również opracowane wytyczne dotyczące prawidłowego postępowania z próbkami FFPE kości niezdemineralizowanych.

Protocol

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Szkole Medycyny Dentystycznej Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Metoda przygotowania bloków FFPE próbek tkanki kostnej, które wymagają demineralizacji

1. Przygotowanie odczynników i materiałów
   1. Przygotować EDTA 20% pH 8,0. Na 1 l rozpuść 200 g EDTA w 800 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 8,0 za pomocą wodorotlenku sodu 10 N i na koniec zwiększ objętość do 1 l za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego EDTA 20% pH 8,0. Wodorotlenek sodu (NaOH) 10 N otrzymuje się przez rozpuszczenie 400 g NaOH w 1 l ultraczystej wody.
   2. Przygotować paraformaldehyd (PFA) 4% w dygestorium z wykorzystaniem 1x PBS bez wapnia i magnezu.
      UWAGA: Wyznacz obszar w dygestorii do pracy ze stężonymi roztworami paraformaldehydu lub stałymi roztworami paraformaldehydu i oznacz go jako taki. Aby uniknąć narażenia, należy przechowywać pojemniki tak szczelnie, jak to możliwe. Stosować w najmniejszych ilościach praktycznych potrzebnych do przeprowadzanego eksperymentu. Jeśli ważenie proszku paraformaldehydowego i waga nie może być używana w dygestorium, najpierw weź pojemnik, a następnie dodaj proszek PFA do kaptura i przykryj przed powrotem do wagi w celu zważenia proszku. Zawsze używaj świeżo przygotowanego 4% PFA.
   3. Do każdej próbki należy użyć odpowiedniego pojemnika.
      UWAGA: Na przykład w przypadku 1 mg tkanki kostnej należy użyć pojemnika, który pozwala na kontakt co najmniej 1 ml dowolnego roztworu z kością.
   4. Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny potrzebny do sekcji.
   5. Oczyść wszystkie obszary roztworem odkażającym, aby usunąć RNazy.
   6. Zbierz pozostałe materiały eksperymentalne, w tym pojemniki na lód, spray 70% etanolu i uzyskaj dostęp do wytrząsarki orbitalnej.
2. Izolacja próbek tkanki kostnej od myszy
   1. Poddaj mysz eutanazji przez ekspozycję na CO₂, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i połóż ją na plecach. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem.
   2. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych otwórz skórę i odsłoń mięsień nogi. Przetnij mięsień wzdłuż nogi, aby uzyskać wyraźny widok na położenie kości, i delikatnie rozdziel kość, aby usunąć ją bez uszkodzenia.
      UWAGA: Nie jest konieczne całkowite usunięcie całego mięśnia przyczepionego do kości. Staraj się być tak szybki, jak to możliwe, aby ograniczyć degradację RNA.
   3. Natychmiast umieść próbkę kości w probówce zawierającej 4% PFA i umieść probówkę na lodzie.
   4. Powtórz procedurę, aby pobrać inne próbki kości zgodnie z potrzebami.
   5. Próbki z 4% PFA umieścić w mieszadle na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, aby umożliwić prawidłowe utrwalenie.
3. Odwapnienie próbek tkanki kostnej
   1. Odzyskaj tkankę kostną z wytrząsarki oczodołowej po utrwaleniu.
   2. Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min, aby usunąć resztki PFA.
   3. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych usuń wszelkie pozostałe mięśnie nadal przyczepione do kości.
   4. Umyj tkankę kostną jeszcze raz za pomocą 1x PBS przez 3 min.
   5. Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku o 20% EDTA pH 8,0. Następnie umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Wyrzuć roztwór, dodaj świeże 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieść go na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Powtórz krok 1.3.6 10 razy.
   8. Wyrzucić roztwór, dodać świeży 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieścić go w temperaturze 4 °C w chłodnym pomieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na noc.
4. Odwodnienie próbek tkanki kostnej
   1. Pobrać próbkę tkanki kostnej z pojemnika.
   2. Sprawdź tkankę i sprawdź skuteczność odwapnienia, delikatnie obracając i skręcając kość. Alternatywnie można wykonać zdjęcie rentgenowskie kości za pomocą aparatu rentgenowskiego.
      UWAGA: Jeśli próbka łatwo się wygina, osiągnięto dobry stopień odwapnienia. Jeśli nie, należy zwiększyć parametry odwapnienia (czas, szybkość mieszania, objętość użytego 20% EDTA pH 8,0 itp.).
   3. Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty, aby usunąć pozostałości EDTA.
   4. Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku i rozpocznij odwodnienie 70% etanolem. Inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   5. Odrzucić 70% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 90% roztworze etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   6. Odrzucić 90% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   7. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   8. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   9. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 30 minut przy 140 obr./min.
   10. Wyrzuć 100% etanol, umieść próbkę w nowym 100% etanolu i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min.
       UWAGA: Odwodnienie można również przeprowadzić za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego odwadniania. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas odwodnienia musi być określony doświadczalnie.
5. Oczyszczanie próbek tkanki kostnej
   1. Umieść próbkę tkanki kostnej w nowym pojemniku i rozpocznij proces oczyszczania za pomocą ksylenu. Inkubować przez 20 minut przy 140 obr./min.
   2. Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez dodatkowe 20 minut przy 140 obr./min.
   3. Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min.
      UWAGA: Czyszczenie można również wykonać za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego czyszczenia. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas musi być określony doświadczalnie.
6. Naciekanie i osadzanie próbek tkanki kostnej
   1. Po oczyszczeniu pobrać próbkę tkanki kostnej z wytrząsarki orbitalnej/automatycznego procesora.
   2. Umieść próbkę tkanki kostnej w kasecie do zatapiania i rozpocznij infiltrację woskiem (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
   3. Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
   4. Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 60 °C.
   5. Ostrożnie umieść próbkę tkanki kostnej w formie o pożądanej orientacji.
   6. Poczekaj, aż blok próbki zestali się na zimnej powierzchni.
   7. Otrzymany FFPE przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do rozpoczęcia krojenia.
      UWAGA: Blok FFPE może być przechowywany przez wiele lat przed przeprowadzeniem cięcia.

2. Wytyczne dotyczące sekcji niezdemineralizowanych próbek FFPE

UWAGA: Poniższe wskazówki dostarczają cennych wskazówek i instrukcji przydatnych do znacznego poprawy jakości odcinków tkanek przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA, szczególnie w przypadku małych nieodwapnionych próbek kości. Wytyczne te mogą być również stosowane do odwapnionych próbek kości, jeśli są dostępne. W przypadku większych próbek tkanki kostnej należy przeprowadzić demineralizację w celu uzyskania lepszej jakości skrawków; W takich przypadkach należy postępować zgodnie z metodą opisaną powyżej, a parametry (czas, objętości roztworów itp.) powinny być odpowiednio dostosowane. Poniższe wytyczne są odpowiednie zarówno wtedy, gdy tkanki kostne FFPE zostały już przetworzone (np. blok FFPE pobrany z banków tkanek lub innych laboratoriów), jak i gdy pobrane skrawki zostaną wykorzystane do wykonania dowolnego rodzaju analizy, która wymaga dobrej jakości RNA, wysokiej jakości skrawków tkanek lub obu.

1. Przygotowanie sprzętu
   1. Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.
   2. Przygotować łaźnię wodną z podwójnie destylowaną wodą i ustawić temperaturę na 42 °C.
   3. Weź ostrze mikrotomu, spryskaj je 70% etanolem, aby usunąć pozostałości oleju, a następnie spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.
   4. Przymocuj ostrze do mikrotomu. Upewnij się, że kąt przyłożenia jest ustawiony na 10°.
      UWAGA: Do cięcia należy zawsze używać nowych ostrzy.
   5. Przygotuj dwa wiadra lodu.
   6. Weź pęsetę, szczoteczki i sondy, spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy i umieść je w jednym z dwóch wiader na lód.
   7. Przygotuj kąpiel lodową, dodając podwójnie destylowaną wodę do drugiego wiadra z lodem.
      UWAGA: blok FFPE nie powinien unosić się w dodanej wodzie; Dlatego ilość dodanej wody do wiadra z lodem musi być wystarczająca, aby próbka mogła być mokra bez unoszenia się na wodzie.
2. Cięcia
   1. Wyjąć blok FFPE z magazynu w temperaturze 4 °C i umieścić go w mikrotomie. Ustaw polecenie na Przytnij lub na 14 μm grubości przewijania i rozpocznij przycinanie próbki, aż tkanka zostanie odsłonięta.
      UWAGA: Jeśli blok FFPE został już przycięty, a tkanka jest już odsłonięta, pomiń krok 2.2.1. Sprawdź, czy blok jest bez i pęknięć. Jeśli tak, przejdź bezpośrednio do kroku 2.2.2. Jeśli nie, wytnij kilka odcinków, aby spłaszczyć powierzchnię i uniknąć i pęknięć, a następnie przejdź do kroku 2.2.2.
   2. Umieść blok FFPE na łaźni lodowej w celu uwodnienia próbki. Czas nawodnienia należy określić doświadczalnie.
      1. Zacznij od 2 minut i wydłuż czas, jeśli nawodnienie nie wystarcza. Nie przekraczać 10 minut. Nawilżenie rozszerzy tkankę i zmniejszy powstawanie "żaluzji weneckich" i linii. Dłuższy czas hydratacji może spowodować pęknięcia bloku parafinowego i ewentualnie oderwanie tkanki.
      2. Jeśli 10 minut jest niewystarczające do uwodnienia próbki, należy wykonać cykle hydratacji nie dłuższe niż 10 minut i spróbować ponownie podzielić na sekcje.
      3. Jeśli powierzchnia bloku nie jest gładka i czysta z powodu pęknięć lub nacięć, należy rozważyć ponowne osadzenie próbki. Proces ponownego osadzania nie będzie miał wpływu na jakość RNA.
   3. Umieść próbkę w zacisku próbki mikrotomu, wyrównaj ją z ostrzem i rozpocznij cięcie. Ustaw grubość zwoju na 5 μm.
   4. Zebrać skrawek i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C za pomocą zimnej pęsety i szczotek.
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli ma być wykonywana izolacja RNA skrawków tkanki, należy zebrać skrawki w probówce wirówkowej i postępować zgodnie ze specyfikacjami produkcyjnymi dotyczącymi przygotowania RNA (patrz Tabela materiałów).
   5. Wykonaj inkubację sekcji w łaźni wodnej, aby rozciągnąć tkankę i wyeliminować wszelkie resztki zmarszczek i fałdów.
      UWAGA: Czas pływania w łaźni wodnej dla każdej sekcji musi być określony doświadczalnie. Rozważ pozostawienie skrawków kości na dodatkową minutę, jeśli wystąpią problemy z odwarstwieniem tkanek. Nie pozostawiaj sekcji unoszącej się zbyt długo, ponieważ długi czas pływania może uszkodzić tkankę.
   6. Umieścić wycinek na szkiełku podstawowym i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 42 °C.
   7. Umieść szkiełko szkiełkowe w eksykatorze lub piekarniku na noc w temperaturze pokojowej w celu prawidłowego wysuszenia.
   8. Przechowuj szkiełko podstawowe z dołączoną sekcją w temperaturze RT w pudełku na slajdy.
      UWAGA: Slajdy mogą być przechowywane przez wiele lat w RT. W przypadku, gdy ma być wykonywana transkryptomika przestrzenna, zamiast szkiełka należy umieścić wycinek na szkiełku do przestrzennej ekspresji genów dostarczonym przez producenta i postępować zgodnie z przedstawionymi zaleceniami (patrz Tabela Materiałów).

Results

Metoda przedstawiona tutaj opisuje, jak przetwarzać świeżo wyizolowane kości w celu uzyskania zdemineralizowanych próbek FFPE, które można łatwo podzielić za pomocą mikrotomu, zachowując integralność RNA (Rysunek 1). Metoda ta została z powodzeniem zastosowana na mysich kościach udowych, ale może być stosowana w przypadku innych próbek tkanki kostnej o podobnych rozmiarach lub może być dostosowana do większych próbek kości (np. próbek ludzkich) poprzez zwiększenie wszystkich parametrów (czas, objętości roztworów itp.).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Schemat ideowy metody otrzymywania bloków FFPE odwapnionych tkanek kostnych z zachowaną integralnością RNA (punkty 1 i 2). Schemat ideowy wytycznych do sekcji bloki FFPE (punkt 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby potwierdzić poprawność czasu odwapnienia, porównano przebieg czasowy, w którym porównano nieodwapnione kości udowe, kości udowe odwapnione przez 3 godziny (dla których EDTA było zmieniane co 30 minut w sumie 6 razy) i kości udowe odkamienione przez 24 godziny (dla których EDTA było zmieniane co 30 minut w sumie 10 razy, a następnie pozostawiane w EDTA na noc) (Rysunek 2). Otrzymane bloki FFPE poddano następnie sekcjom zgodnie z powyższymi wytycznymi, a także zweryfikowano jakość histologiczną i integralność RNA otrzymanych skrawków. W tym celu oceniono integralność strukturalną i morfologię skrawków tkanek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie przeprowadzono kontrolę mikroskopową (Rysunek 2A, C, E), natomiast jakość RNA oceniono poprzez ocenę wartości rozkładu fragmentów RNA o wielkości większej niż 200 nukleotydów (200 nt) (znanych jako wynik DV200) ⁴ (Rysunek 2B, D,F). Zdjęcia H&E wykazały, że nieodwapnione i 3-godzinne odwapnione odcinki kości udowej wykazywały kilka złamań, i uszkodzeń (Rysunek 2A,C,), podczas gdy odcinki kości udowych odwapnione przez 24 godziny wykazywały dobrą jakość histologiczną (Rysunek 2E). Wszystkie próbki uzyskały wyniki DV200 wyższe niż 50%, co jest uważane za minimalną wartość do przeprowadzenia scRNA-seq lub przestrzennych analiz transkryptomicznych⁴. Dłuższe czasy inkubacji z dziennymi zmianami EDTA, w temperaturze 4 °C, z łagodniejszym mieszaniem w mniejszych pojemnikach, zostały również przetestowane i nie są zalecane, ponieważ w tych warunkach integralność RNA próbek dramatycznie spada (Rysunek 2H). W związku z tym czas inkubacji został skrócony do 24 godzin, a częstotliwość, mieszanie i objętość odwapnienia zostały zwiększone, aby zwiększyć odwapnienie.

Rysunek 2. Skrawki i kontrola jakości integralności RNA (QC) 8-tygodniowych kości udowych myszy po odwapnieniu. Kości udowe od 8-tygodniowych myszy zostały świeżo wypreparowane, utrwalone i odkamienione za pomocą 20% EDTA pH 8,0. w różnych punktach czasowych, zatopione w parafinie przy użyciu opisanej metody i podzielone zgodnie z podanymi wytycznymi. Histologiczną kontrolę jakości otrzymanych skrawków przeprowadzono następnie za pomocą barwienia H&E, natomiast integralność RNA oceniano poprzez ocenę wartości rozkładu fragmentów RNA przy wielkości większej niż 200 nukleotydów (200 nt) (DV200). (A) Barwienie H&E pokazujące 8-tygodniowe odcinki kości udowej myszy bez odwapnienia. Prawy obraz pokazuje większe powiększenie obszaru ramki. (B) Kontrola jakości RNA 8-tygodniowych odcinków kości udowej myszy bez odwapnienia. (C) Barwienie H&E pokazujące 8-tygodniowe wycinki kości udowej myszy po 3 godzinach odwapnienia. Prawy obraz pokazuje większe powiększenie obszaru ramki. (D) Kontrola jakości RNA 8-tygodniowych wycinków kości udowej myszy po 3 godzinach odwapnienia. (E) Barwienie H&E pokazujące 8-tygodniowe wycinki kości udowej myszy po 24 godzinach odwapnienia. Prawy obraz pokazuje większe powiększenie obszaru ramki. (F) Kontrola jakości RNA 8-tygodniowych wycinków kości udowej myszy po 24 godzinach odwapnienia. (G) Barwienie H&E pokazujące 8-tygodniowe wycinki kości udowej myszy po 72 godzinach odwapnienia. Prawy obraz pokazuje większe powiększenie obszaru ramki. (H) Kontrola jakości RNA 8-tygodniowych wycinków kości udowej myszy po 72 godzinach odwapnienia. Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; DV200 (%) = % wartości rozkładu fragmentu > 200 nt; NT = nukleotydy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby przetestować skuteczność zgłoszonych wytycznych do obsługi niezdemineralizowanych próbek FFPE, zebrano bloki FFPE niezdemineralizowanego ludzkiego pierwotnego kostniakomięsaka i przerzutów do kostniakomięsaka płuc uzyskanych z naszego Rejestru Nowotworów Onkologii Mięśniowo-Szkieletowej i Banku Tkanek (MOTOR) oraz przeprowadzono przestrzenną analizę transkryptomiczną (Rysunek 3). Przed przystąpieniem do przestrzennej analizy transkryptomicznej bloki FFPE zostały ponownie zatopione w parafinie, aby uzyskać gładką powierzchnię wyjściową. Następnie oceniono RNA i jakość histologiczną skrawków (dane nie pokazane). Etapy nawodnienia były decydujące, ponieważ pierwotne próbki kostniakomięsaka nie mogły być sekcjonowane bez odpowiedniego nawodnienia. Natomiast przerzuty do płuc nie wymagały żadnych etapów nawodnienia. Po przecięciu tkanki umieszczono na przestrzennym szkiełku transkryptomicznym ( Ryc. 3A), wybarwiono H&E ( Ryc. 3D), a przestrzenną analizę transkryptomiczną przeprowadzono zgodnie ze specyfikacją producenta (patrz Tabela Materiałów). Uzyskane biblioteki cDNA zsekwencjonowano, a przetworzone dane zwizualizowano za pomocą Space Ranger w celu kontroli jakości⁵ (Rysunek 3B). Wyniki Space Ranger wykazały bardzo wysokie wyniki (prawie 100%) dla ważnych kodów kreskowych, ważnych unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), zasad Q30 i mediany wykrytych genów na plamkę (między 1700 a 5000), wykazując solidność i solidność uzyskanych danych (Rysunek 3B). Za pomocą bezstronnej analizy skupień opartej na wykresach zidentyfikowano 12 głównych klastrów, w tym klastry komórek osteogennych, immunologicznych, nabłonkowych i śródbłonka, a także adipocytów (Rysunek 3E). Warto zauważyć, że granice klastrów pokrywały się z krawędziami regionów histologicznych zidentyfikowanych przez patologa (Ryc. 3D). Dodatkowe sekcje tych samych próbek zostały również wybarwione trichromem Goldnera w celu wizualizacji zmineralizowanych obszarów (Rysunek 3C).

Rysunek 3. Przestrzenna analiza transkryptomiczna dwóch par nieodwapnionego pierwotnego kostniakomięsaka (OS) i przerzutów do płuc. Bloki FFPE dwóch pasujących par niezdemineralizowanego ludzkiego kostniakomięsaka pierwotnego i przerzutów do płuc zostały pobrane z naszego banku tkanek MOTORYCZNYCH. Próbki podzielono na sekcje zgodnie ze zgłoszonymi wytycznymi i umieszczono na szkiełku Visium Spatial Gene Expression dla próbek FFPE w celu przeprowadzenia przestrzennej analizy transkryptomicznej. (A) Szkiełko do przestrzennej ekspresji genów Visium dla próbek FFPE z dołączonymi sekcjami. (B) Dane wyjściowe Space Ranger przedstawiające wspólne parametry używane do oceny jakości uzyskanych danych dla wszystkich próbek. (C) Barwienie trichromowe Goldnera pokazujące lokalizację zmineralizowanych tkanek kostnych i osteoidu. (D) Plama H&E z adnotacją patologa. (E) Analiza skupień pokazująca lokalizację populacji komórek znajdujących się w tkance. Skróty: FFPE = utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; MOCe = złośliwe komórki osteogenne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę przygotowania bloków FFPE odwapnionych kości i zachowania integralności RNA do sekwencjonowania (tj. sekwencjonowania nowej generacji (NGS)) lub do innych technik związanych z RNA (tj. hybrydyzacja in situ , ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) itp.).

Metoda wykorzystuje EDTA do odwapniania próbek tkanki kostnej; inkubacja EDTA pozwala na powolną, ale drobną demineralizację próbek, zachowując w ten sposób cechy histologiczne tkanki w najlepszym wydaniu. Zwykle odwapnienie kości przeprowadza się przy użyciu 10% EDTA pH 7,0 przez co najmniej 2 tygodnie poprzez odświeżanie roztworu co drugi dzień⁴. Długie czasy odwapnienia znacząco przyczyniają się jednak do degradacji RNA ^6,7,8. Aby przezwyciężyć ten problem, stężenie EDTA zwiększono do 20%, pH podniesiono do 8,0, a częstotliwość wymiany roztworu zwiększono do co 30 minut. Warunki te, w połączeniu z dużą ilością roztworu, na działanie którego narażona jest tkanka, energicznym mieszaniem i wysokim stosunkiem objętości pojemnika do tkanki, maksymalizowały odwapnienie i skracały czas leczenia, umożliwiając delikatną, ale szybką demineralizację. Warto wspomnieć, że gdy próbki tkanki kostnej mają być wykorzystane do sekwencjonowania transkryptomu, ich całkowite odwapnienie może nie być konieczne. W takim przypadku należy znaleźć optymalną proporcję między wystarczającą demineralizacją a dobrym zachowaniem RNA. Inną ważną rzeczą, o której należy wspomnieć, jest to, że bez względu na to, jak próbki są traktowane, jeśli zostały utrwalone, ich RNA zostanie pofragmentowane. Opisana tutaj metoda pozwala na zatrzymanie fragmentów RNA o wielkości większej niż 200 nukleotydów (%DV200) (Figura 2F), co wskazuje na wysoką jakość RNA ^9,11.

Ta metoda ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ myszy były jedynym źródłem próbek tkanki kostnej, metoda została zwalidowana tylko na kościach mysich, które są stosunkowo małe. Co więcej, nie wiadomo, czy metoda ta może być stosowana u myszy starszych lub młodszych niż 8 tygodni, ponieważ była testowana tylko na 8-tygodniowych myszach. Wybraliśmy 8-tygodniowe myszy, ponieważ są dojrzałe kostnie. Ponieważ starzenie się modyfikuje zawartość minerałów w kościach, może być konieczne wprowadzenie zmian w tym podejściu.

Ponadto podano wytyczne, które mają pomóc poprawić jakość skrawków tkanek, gdy wykorzystywane są próbki FFPE małych nieodwapnionych próbek kości, na przykład gdy są one pobierane bezpośrednio z banków tkanek. W takich sytuacjach nic nie można zrobić, jeśli RNA zostanie zdegradowane, ale można poprawić jakość sekcji. Z drugiej strony, w przypadku próbek o dobrej zawartości RNA, takich jak te pokazane tutaj, przestrzenna analiza transkryptomiczna jest możliwa, jeśli przestrzegane są dostarczone wytyczne. Warto zauważyć, że w próbkach pierwotnego kostniakomięsaka struktura kości może zostać zmieniona przez obecność masy guza, co sprawia, że rzeczywiste próbki są słabsze i kruche, co może ułatwić cięcie. W związku z tym wykorzystano barwienie trichromowe Goldnera, aby ocenić, czy tak jest, ponieważ obszary zmineralizowane i niezmineralizowane można zidentyfikować za pomocą tej techniki barwienia (ryc. 3C).

Podsumowując, przedstawiona metoda stanowi łatwą do zastosowania metodę odwapniania próbek tkanki kostnej i uzyskiwania skrawków FFPE, które mogą być skutecznie stosowane do NGS lub innych technik wymagających integralności RNA. Ponadto podano wytyczne dotyczące cięcia próbek, które mogły nie zostać zdemineralizowane przed zatopieniem parafiny, takich jak próbki uzyskane z banków tkanek. Biorąc pod uwagę szybki rozwój przestrzennych analiz transkryptomicznych, proponowana metoda i wytyczne mogą być bardzo pomocne w badaniach nad kośćmi w ogóle, a także w badaniach nad rakiem kości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zaawansowana wytrząsarka orbitalna	VWR	76683-470	Służy do utrzymywania tkanek w stanie mieszania podczas inkubacji, zgodnie z instrukcjami metody.
Szczotki do włosów wielbłądzich	Ted Pella	11859	Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Służy do wykonywania transkryptomiki przestrzennej.
Etanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Służy do wykonywania odwodnienia tkanek zgodnie z instrukcjami metody.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Służy do przygotowania EDTA 20% pH 8,0.
Kleszcze ogólnego przeznaczenia Fisherbrand Curved Medium Point	Fisher Scientific	16-100-110	Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.
Sonda precyzyjna Fisherbrand	Fisher Scientific	12-000-153	Służy do obsługi odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Marka rybacka  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Służy do mocowania zwojów podzielonych na sekcje, zgodnie z wytycznymi.
Wysokoprofilowe diamentowe ostrza mikrotomu	CL Sturkey	D554DD	Służy do cięcia bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Sekwencer Novaseq 150PE	Novogene	N/A	.
Paraformaldehyd (PFA) 32% roztwór wodny	Mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences	15714-S	Rozcieńczyć do końcowego stężenia 4% za pomocą 1x PBS  w celu utrwalenia tkanki.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Produkt gotowy. Stosować do rozcieńczania PFA i przeprowadzania płukania zgodnie z instrukcją metody.
Premiere Pływająca kąpiel z tkankami	Fisher Scientific A84600061		Służy do usuwania zmarszczek z odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.
RNase AWAY Odkażacz powierzchni	Thermo Fisher Scientific	7002	Służy do czyszczenia wszystkich powierzchni zgodnie z instrukcją metody.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Służy do izolowania RNA z odcinków FFPE po ich wygenerowaniu, jak podano w wytycznych.
Półautomatyczny mikrotom obrotowy	Leica Biosystems	RM2245	Służy do sekcji bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Wodorotlenek sodu	Millipore Sigma	S8045-500	Przygotować roztwór 10 N, powoli rozpuszczając 400 g w 1 litrze wody Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Służy do przetwarzania danych wyjściowych sekwencjonowania.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Służy do wykonywania inflacji i osadzania tkanek, zgodnie z instrukcjami metody.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Zestaw sondy transkryptomu dla człowieka Visium Mały	10X Genomics	PN-1000363	Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Zestaw szkiełek do przestrzennej ekspresji genów Visium 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Służy do umieszczania sekcji podczas wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Służy do oczyszczania tkanek zgodnie z instrukcjami metody.