Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na odwapnienie świeżo pobranych tkanek kostnych i zachowanie wysokiej jakości RNA. Przedstawiono również metodę cięcia próbek niezdemineralizowanych kości z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie (FFPE) w celu uzyskania dobrej jakości wyników, jeśli świeże tkanki nie są dostępne lub nie można ich pobrać.

Streszczenie

Zrozumienie relacji między komórkami i ich lokalizacji w każdej tkance jest niezbędne do odkrycia procesów biologicznych związanych z normalnym rozwojem i patologią choroby. Transkryptomika przestrzenna to potężna metoda, która umożliwia analizę całego transkryptomu w próbkach tkanek, dostarczając w ten sposób informacji o ekspresji genów komórkowych i kontekście histologicznym, w którym znajdują się komórki. Chociaż metoda ta jest szeroko stosowana w przypadku wielu tkanek miękkich, jej zastosowanie do analiz tkanek twardych, takich jak kości, było wyzwaniem. Głównym wyzwaniem jest niemożność zachowania dobrej jakości RNA i morfologii tkanek podczas przetwarzania próbek tkanek twardych do sekcji. W związku z tym opisano tutaj metodę przetwarzania świeżo pobranych próbek tkanki kostnej w celu efektywnego generowania przestrzennych danych transkryptomicznych. Metoda pozwala na odwapnienie próbek, zapewniając udane skrawki tkanek z zachowanymi szczegółami morfologicznymi przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA. Ponadto podano szczegółowe wytyczne dla próbek, które wcześniej były zatopione w parafinie, bez demineralizacji, takich jak próbki pobrane z banków tkanek. Korzystając z tych wytycznych, przedstawiono wysokiej jakości dane transkryptomiki przestrzennej wygenerowane z próbek tkanek z banku tkanek guza pierwotnego i przerzutów do płuc kostniakomięsaka kostnego.

Wprowadzenie

Kość to wyspecjalizowana tkanka łączna składająca się głównie z włókien kolagenu typu 1 i soli nieorganicznych¹. Dzięki temu kość jest niezwykle mocna i sztywna, a jednocześnie lekka i odporna na urazy. Ogromna wytrzymałość kości wynika z jej zawartości minerałów. W rzeczywistości, przy każdym wzroście procentowej zawartości minerałów, sztywność wzrasta pięciokrotnie². W związku z tym badacze napotykają poważne problemy, gdy analizują, za pomocą sekcji histologicznej, biologię próbki kości.

Histologia kości nieodwapnionej jest wykonalna i czasami wymagana, w zależności od rodzaju badania (np. w celu zbadania mikroarchitektury kości); jest to jednak bardzo trudne, zwłaszcza jeśli próbki są duże. W takich przypadkach przetwarzanie tkanek do celów histologicznych wymaga kilku modyfikacji standardowych protokołów i technik³. Ogólnie rzecz biorąc, aby przeprowadzić typowe oceny histologiczne, tkanki kostne są odwapniane zaraz po utrwaleniu, co może trwać od kilku dni do kilku tygodni, w zależności od wielkości tkanki i zastosowanego środka odwapniającego⁴. Odwapnione skrawki są często wykorzystywane do badania szpiku kostnego, diagnozy nowotworów itp. Istnieją trzy główne rodzaje środków odwapniających: mocne kwasy (np. kwas azotowy, kwas solny), słabe kwasy (np. kwas mrówkowy) i czynniki chelatujące (np. kwas etylenodiaminoterakowy lub EDTA)⁵. Silne kwasy mogą bardzo szybko odwapnić kości, ale mogą uszkodzić tkanki; słabe kwasy są bardzo powszechne i nadają się do procedur diagnostycznych; Czynniki chelatujące są zdecydowanie najczęściej stosowane i odpowiednie do zastosowań badawczych, ponieważ w tym przypadku proces demineralizacji jest powolny i łagodny, co pozwala na zachowanie wysokiej jakości morfologii i zachowanie informacji o genach i białkach, co jest wymagane przez wiele procedur (np. hybrydyzacja in situ, barwienie immunologiczne). Jednak gdy konieczne jest zachowanie całego transkryptomu, na przykład w przypadku analiz ekspresji genów, nawet powolna i delikatna demineralizacja może być szkodliwa. W związku z tym potrzebne są lepsze podejścia i metody, gdy analiza morfologiczna tkanek musi być połączona z analizami ekspresji genów w komórkach.

Dzięki niedawnym ulepszeniom w sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) i transkryptomice przestrzennej, teraz możliwe jest badanie ekspresji genów w próbce tkanki nawet wtedy, gdy do przechowywania próbek tkanek użyto zatapiania parafiny z utrwalaniem w formalinie (FFPE)^6,7,8. Ta możliwość odblokowała dostęp do większej liczby próbek, takich jak te przechowywane w bankach tkanek na całym świecie. Jeśli ma być zastosowany sekwencjon scRNA, integralność RNA jest najważniejszym wymogiem; jednak w przypadku transkryptomiki przestrzennej próbek FFPE do wizualizacji ekspresji genów w kontekście histologicznym każdego wycinka tkanki niezbędne są zarówno wysokiej jakości skrawki tkanki, jak i wysokiej jakości RNA. Chociaż można to łatwo osiągnąć w przypadku tkanek miękkich, tego samego nie można powiedzieć o tkankach twardych, takich jak kości. W rzeczywistości, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nigdy nie przeprowadzono żadnego badania z wykorzystaniem transkryptomiki przestrzennej na próbkach kości FFPE. Wynika to z braku protokołów, które mogłyby skutecznie przetwarzać tkanki kostne FFPE przy jednoczesnym zachowaniu ich zawartości RNA. W tym przypadku najpierw przedstawiono metodę przetwarzania i odwapniania świeżo uzyskanych próbek tkanki kostnej przy jednoczesnym unikaniu degradacji RNA. Następnie, dostrzegając potrzebę analizy transkryptomicznej próbek FFPE pobranych w bankach tkanek na całym świecie, przedstawiono również opracowane wytyczne dotyczące prawidłowego postępowania z próbkami FFPE kości niezdemineralizowanych.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Szkole Medycyny Dentystycznej Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Metoda przygotowania bloków FFPE próbek tkanki kostnej, które wymagają demineralizacji

1. Przygotowanie odczynników i materiałów
   1. Przygotować EDTA 20% pH 8,0. Na 1 l rozpuść 200 g EDTA w 800 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 8,0 za pomocą wodorotlenku sodu 10 N i na koniec zwiększ objętość do 1 l za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego EDTA 20% pH 8,0. Wodorotlenek sodu (NaOH) 10 N otrzymuje się przez rozpuszczenie 400 g NaOH w 1 l ultraczystej wody.
   2. Przygotować paraformaldehyd (PFA) 4% w dygestorium z wykorzystaniem 1x PBS bez wapnia i magnezu.
      UWAGA: Wyznacz obszar w dygestorii do pracy ze stężonymi roztworami paraformaldehydu lub stałymi roztworami paraformaldehydu i oznacz go jako taki. Aby uniknąć narażenia, należy przechowywać pojemniki tak szczelnie, jak to możliwe. Stosować w najmniejszych ilościach praktycznych potrzebnych do przeprowadzanego eksperymentu. Jeśli ważenie proszku paraformaldehydowego i waga nie może być używana w dygestorium, najpierw weź pojemnik, a następnie dodaj proszek PFA do kaptura i przykryj przed powrotem do wagi w celu zważenia proszku. Zawsze używaj świeżo przygotowanego 4% PFA.
   3. Do każdej próbki należy użyć odpowiedniego pojemnika.
      UWAGA: Na przykład w przypadku 1 mg tkanki kostnej należy użyć pojemnika, który pozwala na kontakt co najmniej 1 ml dowolnego roztworu z kością.
   4. Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny potrzebny do sekcji.
   5. Oczyść wszystkie obszary roztworem odkażającym, aby usunąć RNazy.
   6. Zbierz pozostałe materiały eksperymentalne, w tym pojemniki na lód, spray 70% etanolu i uzyskaj dostęp do wytrząsarki orbitalnej.
2. Izolacja próbek tkanki kostnej od myszy
   1. Poddaj mysz eutanazji przez ekspozycję na CO₂, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i połóż ją na plecach. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem.
   2. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych otwórz skórę i odsłoń mięsień nogi. Przetnij mięsień wzdłuż nogi, aby uzyskać wyraźny widok na położenie kości, i delikatnie rozdziel kość, aby usunąć ją bez uszkodzenia.
      UWAGA: Nie jest konieczne całkowite usunięcie całego mięśnia przyczepionego do kości. Staraj się być tak szybki, jak to możliwe, aby ograniczyć degradację RNA.
   3. Natychmiast umieść próbkę kości w probówce zawierającej 4% PFA i umieść probówkę na lodzie.
   4. Powtórz procedurę, aby pobrać inne próbki kości zgodnie z potrzebami.
   5. Próbki z 4% PFA umieścić w mieszadle na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, aby umożliwić prawidłowe utrwalenie.
3. Odwapnienie próbek tkanki kostnej
   1. Odzyskaj tkankę kostną z wytrząsarki oczodołowej po utrwaleniu.
   2. Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min, aby usunąć resztki PFA.
   3. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych usuń wszelkie pozostałe mięśnie nadal przyczepione do kości.
   4. Umyj tkankę kostną jeszcze raz za pomocą 1x PBS przez 3 min.
   5. Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku o 20% EDTA pH 8,0. Następnie umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Wyrzuć roztwór, dodaj świeże 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieść go na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Powtórz krok 1.3.6 10 razy.
   8. Wyrzucić roztwór, dodać świeży 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieścić go w temperaturze 4 °C w chłodnym pomieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na noc.
4. Odwodnienie próbek tkanki kostnej
   1. Pobrać próbkę tkanki kostnej z pojemnika.
   2. Sprawdź tkankę i sprawdź skuteczność odwapnienia, delikatnie obracając i skręcając kość. Alternatywnie można wykonać zdjęcie rentgenowskie kości za pomocą aparatu rentgenowskiego.
      UWAGA: Jeśli próbka łatwo się wygina, osiągnięto dobry stopień odwapnienia. Jeśli nie, należy zwiększyć parametry odwapnienia (czas, szybkość mieszania, objętość użytego 20% EDTA pH 8,0 itp.).
   3. Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty, aby usunąć pozostałości EDTA.
   4. Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku i rozpocznij odwodnienie 70% etanolem. Inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   5. Odrzucić 70% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 90% roztworze etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   6. Odrzucić 90% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   7. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   8. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.
   9. Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 30 minut przy 140 obr./min.
   10. Wyrzuć 100% etanol, umieść próbkę w nowym 100% etanolu i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min.
       UWAGA: Odwodnienie można również przeprowadzić za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego odwadniania. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas odwodnienia musi być określony doświadczalnie.
5. Oczyszczanie próbek tkanki kostnej
   1. Umieść próbkę tkanki kostnej w nowym pojemniku i rozpocznij proces oczyszczania za pomocą ksylenu. Inkubować przez 20 minut przy 140 obr./min.
   2. Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez dodatkowe 20 minut przy 140 obr./min.
   3. Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min.
      UWAGA: Czyszczenie można również wykonać za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego czyszczenia. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas musi być określony doświadczalnie.
6. Naciekanie i osadzanie próbek tkanki kostnej
   1. Po oczyszczeniu pobrać próbkę tkanki kostnej z wytrząsarki orbitalnej/automatycznego procesora.
   2. Umieść próbkę tkanki kostnej w kasecie do zatapiania i rozpocznij infiltrację woskiem (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
   3. Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
   4. Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 60 °C.
   5. Ostrożnie umieść próbkę tkanki kostnej w formie o pożądanej orientacji.
   6. Poczekaj, aż blok próbki zestali się na zimnej powierzchni.
   7. Otrzymany FFPE przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do rozpoczęcia krojenia.
      UWAGA: Blok FFPE może być przechowywany przez wiele lat przed przeprowadzeniem cięcia.

2. Wytyczne dotyczące sekcji niezdemineralizowanych próbek FFPE

UWAGA: Poniższe wskazówki dostarczają cennych wskazówek i instrukcji przydatnych do znacznego poprawy jakości odcinków tkanek przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA, szczególnie w przypadku małych nieodwapnionych próbek kości. Wytyczne te mogą być również stosowane do odwapnionych próbek kości, jeśli są dostępne. W przypadku większych próbek tkanki kostnej należy przeprowadzić demineralizację w celu uzyskania lepszej jakości skrawków; W takich przypadkach należy postępować zgodnie z metodą opisaną powyżej, a parametry (czas, objętości roztworów itp.) powinny być odpowiednio dostosowane. Poniższe wytyczne są odpowiednie zarówno wtedy, gdy tkanki kostne FFPE zostały już przetworzone (np. blok FFPE pobrany z banków tkanek lub innych laboratoriów), jak i gdy pobrane skrawki zostaną wykorzystane do wykonania dowolnego rodzaju analizy, która wymaga dobrej jakości RNA, wysokiej jakości skrawków tkanek lub obu.

1. Przygotowanie sprzętu
   1. Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.
   2. Przygotować łaźnię wodną z podwójnie destylowaną wodą i ustawić temperaturę na 42 °C.
   3. Weź ostrze mikrotomu, spryskaj je 70% etanolem, aby usunąć pozostałości oleju, a następnie spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.
   4. Przymocuj ostrze do mikrotomu. Upewnij się, że kąt przyłożenia jest ustawiony na 10°.
      UWAGA: Do cięcia należy zawsze używać nowych ostrzy.
   5. Przygotuj dwa wiadra lodu.
   6. Weź pęsetę, szczoteczki i sondy, spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy i umieść je w jednym z dwóch wiader na lód.
   7. Przygotuj kąpiel lodową, dodając podwójnie destylowaną wodę do drugiego wiadra z lodem.
      UWAGA: blok FFPE nie powinien unosić się w dodanej wodzie; Dlatego ilość dodanej wody do wiadra z lodem musi być wystarczająca, aby próbka mogła być mokra bez unoszenia się na wodzie.
2. Cięcia
   1. Wyjąć blok FFPE z magazynu w temperaturze 4 °C i umieścić go w mikrotomie. Ustaw polecenie na Przytnij lub na 14 μm grubości przewijania i rozpocznij przycinanie próbki, aż tkanka zostanie odsłonięta.
      UWAGA: Jeśli blok FFPE został już przycięty, a tkanka jest już odsłonięta, pomiń krok 2.2.1. Sprawdź, czy blok jest bez i pęknięć. Jeśli tak, przejdź bezpośrednio do kroku 2.2.2. Jeśli nie, wytnij kilka odcinków, aby spłaszczyć powierzchnię i uniknąć i pęknięć, a następnie przejdź do kroku 2.2.2.
   2. Umieść blok FFPE na łaźni lodowej w celu uwodnienia próbki. Czas nawodnienia należy określić doświadczalnie.
      1. Zacznij od 2 minut i wydłuż czas, jeśli nawodnienie nie wystarcza. Nie przekraczać 10 minut. Nawilżenie rozszerzy tkankę i zmniejszy powstawanie "żaluzji weneckich" i linii. Dłuższy czas hydratacji może spowodować pęknięcia bloku parafinowego i ewentualnie oderwanie tkanki.
      2. Jeśli 10 minut jest niewystarczające do uwodnienia próbki, należy wykonać cykle hydratacji nie dłuższe niż 10 minut i spróbować ponownie podzielić na sekcje.
      3. Jeśli powierzchnia bloku nie jest gładka i czysta z powodu pęknięć lub nacięć, należy rozważyć ponowne osadzenie próbki. Proces ponownego osadzania nie będzie miał wpływu na jakość RNA.
   3. Umieść próbkę w zacisku próbki mikrotomu, wyrównaj ją z ostrzem i rozpocznij cięcie. Ustaw grubość zwoju na 5 μm.
   4. Zebrać skrawek i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C za pomocą zimnej pęsety i szczotek.
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli ma być wykonywana izolacja RNA skrawków tkanki, należy zebrać skrawki w probówce wirówkowej i postępować zgodnie ze specyfikacjami produkcyjnymi dotyczącymi przygotowania RNA (patrz Tabela materiałów).
   5. Wykonaj inkubację sekcji w łaźni wodnej, aby rozciągnąć tkankę i wyeliminować wszelkie resztki zmarszczek i fałdów.
      UWAGA: Czas pływania w łaźni wodnej dla każdej sekcji musi być określony doświadczalnie. Rozważ pozostawienie skrawków kości na dodatkową minutę, jeśli wystąpią problemy z odwarstwieniem tkanek. Nie pozostawiaj sekcji unoszącej się zbyt długo, ponieważ długi czas pływania może uszkodzić tkankę.
   6. Umieścić wycinek na szkiełku podstawowym i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 42 °C.
   7. Umieść szkiełko szkiełkowe w eksykatorze lub piekarniku na noc w temperaturze pokojowej w celu prawidłowego wysuszenia.
   8. Przechowuj szkiełko podstawowe z dołączoną sekcją w temperaturze RT w pudełku na slajdy.
      UWAGA: Slajdy mogą być przechowywane przez wiele lat w RT. W przypadku, gdy ma być wykonywana transkryptomika przestrzenna, zamiast szkiełka należy umieścić wycinek na szkiełku do przestrzennej ekspresji genów dostarczonym przez producenta i postępować zgodnie z przedstawionymi zaleceniami (patrz Tabela Materiałów).

Wyniki

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu opisuje sposób przetwarzania świeżo wyizolowanych kości w celu uzyskania odwapnionych próbek FFPE, które można łatwo kroić za pomocą mikrotomu przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA (Rysunek 1). Metoda ta została z sukcesem zastosowana w przypadku kości udowych myszy, lecz może być stosowana również dla innych próbek tkanki kostnej o podobnych wymiarach lub dostosowana do większych preparatów kostnych (np. próbek ludzkich) poprzez zwiększ...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę przygotowania bloków FFPE odwapnionych kości i zachowania integralności RNA do sekwencjonowania (tj. sekwencjonowania nowej generacji (NGS)) lub do innych technik związanych z RNA (tj. hybrydyzacja in situ , ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) itp.).

Metoda wykorzystuje EDTA do odwapniania próbek tkanki kostnej; inkubacja EDTA pozwala na powolną, ale drobną demineralizację próbek, zachowując w ten spo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowana wytrząsarka orbitalna	VWR	76683-470	Służy do utrzymywania tkanek w stanie mieszania podczas inkubacji, zgodnie z instrukcjami metody.
Szczotki do włosów wielbłądzich	Ted Pella	11859	Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Służy do wykonywania transkryptomiki przestrzennej.
Etanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Służy do wykonywania odwodnienia tkanek zgodnie z instrukcjami metody.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Służy do przygotowania EDTA 20% pH 8,0.
Kleszcze ogólnego przeznaczenia Fisherbrand Curved Medium Point	Fisher Scientific	16-100-110	Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.
Sonda precyzyjna Fisherbrand	Fisher Scientific	12-000-153	Służy do obsługi odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Marka rybacka  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Służy do mocowania zwojów podzielonych na sekcje, zgodnie z wytycznymi.
Wysokoprofilowe diamentowe ostrza mikrotomu	CL Sturkey	D554DD	Służy do cięcia bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Sekwencer Novaseq 150PE	Novogene	N/A	.
Paraformaldehyd (PFA) 32% roztwór wodny	Mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences	15714-S	Rozcieńczyć do końcowego stężenia 4% za pomocą 1x PBS  w celu utrwalenia tkanki.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Produkt gotowy. Stosować do rozcieńczania PFA i przeprowadzania płukania zgodnie z instrukcją metody.
Premiere Pływająca kąpiel z tkankami	Fisher Scientific A84600061		Służy do usuwania zmarszczek z odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.
RNase AWAY Odkażacz powierzchni	Thermo Fisher Scientific	7002	Służy do czyszczenia wszystkich powierzchni zgodnie z instrukcją metody.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Służy do izolowania RNA z odcinków FFPE po ich wygenerowaniu, jak podano w wytycznych.
Półautomatyczny mikrotom obrotowy	Leica Biosystems	RM2245	Służy do sekcji bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Wodorotlenek sodu	Millipore Sigma	S8045-500	Przygotować roztwór 10 N, powoli rozpuszczając 400 g w 1 litrze wody Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Służy do przetwarzania danych wyjściowych sekwencjonowania.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Służy do wykonywania inflacji i osadzania tkanek, zgodnie z instrukcjami metody.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Zestaw sondy transkryptomu dla człowieka Visium Mały	10X Genomics	PN-1000363	Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Zestaw szkiełek do przestrzennej ekspresji genów Visium 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Służy do umieszczania sekcji podczas wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Służy do oczyszczania tkanek zgodnie z instrukcjami metody.