Artykuł metodologiczny

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66860

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1i3S – Instituto de Investigação e Inovação em Saúde da Universidade do Porto, 2ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 3IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4Programa Doutoral em Biologia Molecular e Celular (MCBiology), Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto, 5Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygiene (LMPH), 6Department of Infectious Diseases in Humans, Immune Response, Sciensano

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Streszczenie

Zakażenia Mycobacterium abscessus (Mab) są trudne do leczenia ze względu na wysoką wewnętrzną oporność na leki, porównywalną do gruźlicy wielolekoopornej. Leczenie jest skrajnie nieskuteczne i opiera się na schemacie wielolekowym, co skutkuje niskim poziomem przestrzegania zaleceń przez pacjentów. W związku z tym wzywa się społeczność naukową do zidentyfikowania nowych i skutecznych leków do leczenia tych zakażeń. Jedną ze strategii stosowanych w tym celu jest zmiana przeznaczenia leków – proces identyfikacji nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących leków na rynku, z pominięciem czasu potrzebnego na ustalenie profili farmakokinetycznych i bezpieczeństwa nowych leków. Ponieważ większość badań nad opracowywaniem leków przeciwko Mab opiera się na tradycyjnych i czasochłonnych metodach, opracowano test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom przy użyciu opracowanego we własnym zakresie szczepu Mab z podwójnym reporterem. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy, a także opracowanych przez nas podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii można szybko zmierzyć za pomocą dwóch różnych odczytów, luminescencji i fluorescencji, bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Skraca to czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest główną zaletą w przypadku badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Opisany protokół został zweryfikowany poprzez badania przesiewowe biblioteki 1280 związków. Uzyskane wyniki zostały potwierdzone w piśmiennictwie, przy skutecznej detekcji związków aktywnych. Tym samym prace te spełniły cel, jakim było dostarczenie terenowi nowego narzędzia, które pomoże w walce z tą niezwykle lekooporną bakterią.

Wprowadzenie

Mycobacterium abscessus (Mab) to patogen oportunistyczny odpowiedzialny za infekcje płuc, szczególnie u osób z mukowiscydozą i innymi schorzeniami płuc. Infekcje wywołane przez Mab są znane z tego, że są wyjątkowo trudne do leczenia ze względu na ogromną wrodzoną oporność na leki, porównywalną do wielolekoopornej gruźlicy1. Dostępne leki są w dużej mierze nieskuteczne z powodu wysokiej nieprzepuszczalności otoczki komórkowej prątków oraz genomu kodującego szereg enzymów dezaktywujących antybiotyki2. W związku z tym leczenie obejmuje kombinację kilku leków i trwa od kilku miesięcy do kilku lat. Ten wymagający schemat wielolekowy w połączeniu z niskim stopniem przestrzegania zaleceń przez pacjentów skutkuje średnią stopą wyleczeń na poziomie od 30% do 50%3. Co więcej, w ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci wzrosła zapadalność na infekcje płuc wywołane przez prątki nietuberkulozowe, w tym te spowodowane przez Mab1,4. W konsekwencji środowisko naukowe dąży do opracowania nowych związków do leczenia infekcji Mab.

Jedną ze strategii realizowanych w tym celu jest repozycjonowanie leków – proces identyfikacji nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących już leków. Pozwala to ominąć największe wyzwanie towarzyszące procesowi odkrywania i opracowywania nowych leków, jakim jest czas5. Ta prosta koncepcja wykorzystuje już ustalone profile farmakokinetyczne i bezpieczeństwa wielu leków, aby obniżyć koszty opracowania i skrócić czas potrzebny na wprowadzenie leku z etapu badań laboratoryjnych do praktyki klinicznej6. W związku z tym stworzono biblioteki łączące od setek do tysięcy takich związków, co pozwala badaczom szybko przetestować możliwość repozycjonowania leków przeciwko interesującemu ich patogenowi.

Większość badań nad opracowaniem leków przeciwko Mab opiera się na tradycyjnym, uznawanym za złoty standard teście oceniającym aktywność związku in vitro przeciwko prątkom — liczeniu jednostek tworzących kolonie7. Mimo swojej dokładności, procedura ta jest niezwykle czasochłonna, co sprawia, że staje się niewykonalna przy próbie przetestowania bibliotek zawierających tysiące związków. W związku z tym w rozwój leków włączono badania wysokoprzepustowe (HTS) — solidne testy wykorzystujące robotykę i urządzenia do dozowania cieczy, które umożliwiają szybkie, równoległe przesiewanie tysięcy związków8. Zazwyczaj wykonuje się to poprzez początkowe przetestowanie pojedynczej stężenia z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych w formacie 96, 384, 1536 lub 3456 dołków, co służy jako punkt wyjścia do identyfikacji trafień i ich późniejszej optymalizacji w dalszych etapach procesu w celu zastosowania klinicznego.

Testy oparte na reporterach zapewniają znaczącą przewagę w zakresie powtarzalności HTS ze względu na ich prostotę i czułość w porównaniu z innymi testami opartymi na barwnikach i absorbancji7,9. Jednakże, według naszej wiedzy, tylko w kilku badaniach zoptymalizowano wysokoprzepustowy przesiew przeciwko Mab9.

Niedawno w naszym laboratorium opracowano szczepy z podwójnym reporterem, zdolne do jednoczesnej emisji luminescencji i fluorescencji10. Mab operon_mScarlet jest jednym z takich szczepów. Wykazuje on autoluminescencję dzięki ekspresji operonu LuxABCDE, który obejmuje bakteryjną lucyferazę (poprzez ekspresję genów luxAB) oraz substrat w postaci długołańcuchowego aldehydu (poprzez ekspresję genów luxCDE). Z kolei odczyt fluorescencyjny uzyskuje się poprzez ekspresję niedawno opracowanego czerwonego białka fluorescencyjnego mScarlet, które przewyższa powszechniej stosowane białka eGFP i mCherry, zapewniając silniejszy sygnał11. Wykorzystanie tego szczepu pozwala nam oceniać żywotność bakterii w kulturze płynnej poprzez pomiar sygnału luminescencyjnego w czytniku mikroplatek, bez konieczności dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych kroków. W zakresie detekcji, fluorescencja wewnętrzna umożliwia wizualizację mikroskopową w komórkach żywych lub utrwalonych bez użycia barwników lub przeciwciał. Posiadanie jednego szczepu z oboma typami odczytu daje badaczom znaczącą przewagę podczas stosowania go w testach HTS – zredukowana zostaje zmienność między analizami o różnych typach odczytu, ponieważ nie ma potrzeby wymiany szczepów w zależności od charakteru badania.

W związku z tym w niniejszej pracy opracowano wysokoprzepustowy test przeciwko Mab przy użyciu wewnętrznie zmodyfikowany szczep z podwójnym reporterem (Rycina 1). Pozwoliło to na szybką ocenę in vitro aktywność 1280 leków przeznaczonych do repositioningu z wykorzystaniem biblioteki komercyjnej (patrz Tabela materiałów). Po pierwsze, aktywność oceniono w teście w kulturze płynnej z wykorzystaniem luminescencji, a po drugwie w makrofagach zainfekowanych Mab, wykorzystując sygnał fluorescencyjny, co lepiej odwzorowuje obserwowany proces infekcji in vivo12.

Schemat procesu przesiewowego leków przeciwko M. abscessus; odczyt luminescencyjny i fluorescencyjny; przesiewanie biblioteki, test walidacyjny.
Rycina 1Graficzne streszczenie ustalonego protokołu. Kluczowym elementem w tym badaniu przesiewowym jest wewnętrzne opracowany szczep prątkowy z podwójnym reporterem, który jest wykorzystywany we wszystkich eksperymentach. W pierwszej kolejności, przy użyciu dozownika odczynników i bakterii planktonicznych, przeprowadza się wstępny screening poprzez testowanie związków w pojedynczym stężeniu. Zidentyfikowane trafienia (hits) są przekazywane do testu walidacyjnego, w którym badane są trzy różne stężenia. Oba eksperymenty są realizowane z odczytem luminescencyjnym. Zwalidowane trafienia są następnie poddawane testowi infekcyjnemu, w którym również testowane są trzy różne stężenia, a makrofagi pochodzące z szpiku kostnego są infekowane przy MOI 1. System obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) rejestruje fluorescencyjny sygnał bakteryjny, a oprogramowanie analityczne służy do oceny ładunku wewnątrzkomórkowego za pomocą formuły Mycoload. Liczba związków zmniejsza się wraz ze wzrostem złożoności testów. Stworzone za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Lokalny Komitet Etyki ds. Zwierząt i3S oraz licencjonowane przez portugalski organ nadzorczy General Directorate for Food and Veterinary (DGAV), zgodnie z dyrektywą Rady Europejskiej (2010/63/EU) oraz prawem portugalskim (DL 113/2013) w zakresie dobrostanu zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach.

1. Ocena czynnika Z'

UWAGA: Aby ocenić wydajność testu HTS, można wyznaczyć kilka parametrów. Najczęściej stosowanym parametrem jest czynnik Z-prime (czynnik Z'). Metryka ta mierzy statystyczną wielkość efektu danego eksperymentu, wskazując, jak dobrze oddzielone są kontrole pozytywne i negatywne. Jeśli czynnik Z' mieści się w zakresie od 0,5 do 1, rozdzielenie obu populacji jest doskonałe i takie warunki można zastosować w teście HTS. Jeśli Z' < 0,5, rozdzielenie jest jedynie marginalne i nie zaleca się przeprowadzania przesiewu13. W związku z tym zaprojektowano eksperyment z wykorzystaniem połowy płytki z bakteriami niepoddanymi działaniu czynnika oraz drugiej połowy z kontrolą pozytywną w celu obliczenia czynnika Z' (Rycina uzupełniająca 1).

  1. Na 2-3 dni przed analizą przygotować prekultury Mab, szczepiąc bakterie w płynnej pożywce wzrostowej (około 1 x 107 CFU/mL) w kolbie Erlenmeyera. Bakterie inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (90 rpm).
    UWAGA: Praca z kulturami Mab wymaga użycia komory z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Monitorować wzrost prekultury Mab, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Po osiągnięciu przez kulturę fazy wzrostu wykładniczego przejść do kroku 1.3.
  3. Z wykorzystaniem prekultury w fazie wykładniczej przygotować zawiesinę bakteryjną o stężeniu około 5 x 105 CFUs/mL (skorelowanym z wartościami gęstości optycznej)14 w płynnej pożywce wzrostowej.
  4. Przygotować roztwór kontroli pozytywnej hamowania wzrostu bakterii w płynnej pożywce wzrostowej. W tej analizie jako kontrola pozytywna zastosowano klarytromycynę (10 mg/mL w DMSO) w stężeniu 4 µg/mL. Klarytromycynę należy przygotować w stężeniu dwukrotnie wyższym niż pożądane stężenie końcowe.
  5. Używając dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować 15 µL płynnej pożywki wzrostowej do kolumn pustych (blank) oraz kolumn nietraktowanych czarnej polipropylenowej płytki 384-dołkowej. Do kolumn pustych dozować dodatkowe 15 µL płynnej pożywki wzrostowej.
    UWAGA: Kolumny puste zapobiegają parowaniu cieczy z wewnętrznych dołków w temperaturze 37 °C.
  6. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę dozować 15 µL roztworu kontroli pozytywnej przygotowanego w kroku 1.4 do kolumn kontroli pozytywnej.
  7. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w dużą kasetę dozować 15 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 1.3 do wszystkich kolumn z wyjątkiem kolumn pustych, rozcieńczając zawartość w stosunku 1:2. Końcowa objętość we wszystkich 384 dołkach wynosi 30 µL.
    UWAGA: Dozownik odczynników do mikropłytek może być wyposażony w kasetę dużą lub małą, różniące się średnicą rurek (odpowiednio 0,5 i 0,22 mm). Zaleca się stosowanie większej kasety, aby zapobiec agregacji bakterii w systemie rurek, mimo że wiąże się to z większą stratą cieczy. Niemniej jednak, w trakcie całej analizy można stosować tę samą kasetę.
  8. Zapieczętować każdą płytkę za pomocą uszczelniacza do płytek umożliwiającego ciągłą wymianę gazową. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez wytrząsania w komorze wilgotnościowej przez 48 h.
  9. Po 48 h zmierzyć luminescencję emitowaną przez bakterie w każdej płytce za pomocą czytnika płytek przy czasie integracji 1 s.
  10. Aby wyznaczyć czynnik Z', należy wykorzystać wartości uzyskane w kroku 1.9 i obliczyć średnią oraz odchylenie standardowe dla kontroli pozytywnej (AVGP i SDP) oraz negatywnej (AVGN i SDN). Następnie zastosować następujący wzór: Wzór na czynnik Z' dla statystycznej jakości analizy; równanie dla wiarygodności screeningu hitów.
    UWAGA: Wartość 3 x SD jest powszechnie stosowanym progiem; można go jednak dostosować do konkretnego screeningu, zwiększając lub zmniejszając mnożnik odchylenia standardowego.

2. Przesiewy biblioteki w poszukiwaniu trafień

UWAGA: Pierwsze badania przesiewowe przeprowadzono w odniesieniu do bakterii hodowanych w kulturze płynnej. Układ został zaprojektowany dla płytek 384-dołkowych z 30 µL objętości końcowej. Każda płytka zawierała dołki kontrolne (sama ciekła pożywka wzrostowa), kontrole negatywne (bakterie niepoddane działaniu związku) oraz kontrolę rozpuszczalnika (bakterie z rozpuszczalnikiem związku – w tym przypadku DMSO); Rycina uzupełniająca 2Związki lub rozpuszczalnik dodano do płytki w dwukrotności pożądanego stężenia końcowego, a następnie dodano bakterie w stosunku 1:1 (rozcieńczając całość dwukrotnie).

  1. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach 1.1 do 1.3.
    OSTROŻNIE: Praca z kulturami Mab wymaga użycia komory z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Przygotować roztwór rozpuszczalnika w płynnej pożywce wzrostowej. Ilość rozpuszczalnika musi być dwukrotnością (2x) pożądanej stężenia końcowego.
  3. Używając dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować 15 µL płynnej pożywki wzrostowej do każdej kolumny czarnych polipropylenowych płytek 384-dołkowych, z wyjątkiem kolumny kontroli rozpuszczalnika. Do kolumn pustych (blank) dozować dodatkowe 15 µL płynnej pożywki wzrostowej.
  4. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę dozować 15 µL wcześniej przygotowanego roztworu rozpuszczalnika do kolumny kontroli rozpuszczalnika.
  5. Używając automatycznego dozownika cieczy, przenieść 200 nL związków z zapasowych płytek 96-dołkowych (1 mM w DMSO) na płytki 384-dołkowe, z wyjątkiem kolumn pustych, kontroli rozpuszczalnika oraz kolumn nieleczonych. Stężenie związków wynosi teraz 13.3 µM.
  6. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w dużą kasetę dozować 15 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 2.1 do wszystkich kolumn z wyjątkiem pustych, rozcieńczając wszystko w stosunku 1:2. Objętość końcowa we wszystkich 384 dołkach wynosi 30 µL, a stężenie każdego związku wynosi 6.66 µM.
  7. Uszczelnić każdą płytkę za pomocą uszczelniacza do płytek umożliwiającego ciągłą wymianę gazową.
    UWAGA: Analizę można przeprowadzić przy użyciu zwykłych przykrywek, istnieje jednak większe prawdopodobieństwo wystąpienia silniejszych efektów brzegowych.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez wytrząsania, wewnątrz komory nawilżonej, przez 48 h.
  9. Po 48 h odczytać luminescencję emitowaną przez bakterie na każdej płytce za pomocą czytnika płytek z czasem integracji 1 s.

3. Analiza danych z przesiewania hitów

UWAGA: Aby zidentyfikować trafienia na podstawie uzyskanych danych luminescencyjnych, wartości muszą zostać znormalizowane względem rozpuszczalnika, w którym rozpuszczono związki, a w razie wystąpienia – względem efektu brzegowego zweryfikowanego na płytkach mikrotitracyjnych 384.

  1. Aby dokonać normalizacji rozpuszczalnika dla danych uzyskanych w kroku 2.9, należy podzielić względne jednostki światła (RLU) z każdego dołka przez średnią wartość RLU dołków kontrolnych z rozpuszczalnikiem (na odpowiadającej im płytce). W tym badaniu potwierdzono występowanie silnego efektu brzegowego w kierunku środka płytek przesiewowych; zdecydowano zatem o normalizacji wszystkich danych pod tym kątem. Aby to osiągnąć, proces przeprowadzono w dwóch etapach, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Należy stworzyć maskę efektu brzegowego, dzieląc wartości uzyskane w kroku 3.1 dla odpowiadających sobie pozycji we wszystkich płytkach (płytka 1 – P1, płytka 2 – P2, płytka 3 – P3, płytka 4 – P4), z wyłączeniem trafień (hitów). Na przykład dla pozycji A1 i A2: Mask_A1 = Average (P1_A1; P2_A1; P3_A1; P4_A1); Mask_A2 = Average (P1_A2; P2_A2; P4_A2) [P3_A2 zostało wyłączone, ponieważ było trafieniem].
    2. Wartości uzyskane w kroku 3.1 należy podzielić przez odpowiadającą im maskę efektu brzegowego uzyskaną w kroku 3.1.1. Na przykład: Równanie normalizacji P1_A1=P1_A1/Mask_A1; formuła parametryzacji procesu.. Następnie należy obliczyć średnią (AVG) i odchylenie standardowe (SD) dla każdej płytki, aby ustanowić próg (AVG ± 3SD) dla każdej płytki. Każdy związek znajdujący się poza tym progiem uznaje się za trafienie, które przechodzi do etapu weryfikacji trafień.

4. Test walidacji trafień

UWAGA: Po zidentyfikowaniu hitów należy je zwalidować, stosując różne stężenia. Analiza walidacyjna wykorzystuje podobny układ z tymi samymi kontrolami, jednak każdy hit zostaje poddany seryjnym rozcieńczeniom 1:2. W tej analizie zastosowano trzy stężenia: 13.3 µM, 6.66 µM oraz 3.3 µM. Kontrole rozpuszczalnika będą zawierać taki sam % rozpuszczalnika, jak każda studnia z związkiem (Supplementary Figure 3).

  1. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach 1.1 do 1.3.
    OSTRZEŻENIE: Do pracy z kulturami Mab wymagana jest komora z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Używając dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, nanieść 15 µL płynnej pożywki wzrostowej do każdej kolumny czarnej płytki 384-dołkowej z polipropylenu. W przypadku dołków pustych (blank) nanieść dodatkowe 15 µL płynnej pożywki wzrostowej do pierwszej i ostatniej kolumny.
  3. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek nanieść dodatkowe 15 µL płynnej pożywki wzrostowej do kolumn zawierających najwyższe stężenie [µM] każdego związku.
  4. Z zapasowych płytek 96-dołkowych ręcznie pipetować 0,8 µL każdego wyselekcjonowanego związku (1 mM w DMSO) do odpowiednich dołków z kroku 4.3, w duplikacie. Związki mają teraz stężenie 26,6 µM.
  5. Ręcznie pipetować 0,8 µL rozpuszczalnika do dołków kontrolnych w duplikacie (podobnie jak w kroku 4.4).
  6. Używając wielokanałowej mikropipety, przeprowadzić dwa rozcieńczenia seryjne 1:2 dla każdego związku oraz kontroli rozpuszczalnika. Odrzucić nadmiarowe 15 µL po ostatnim rozcieńczeniu seryjnym. Wszystkie dołki zawierają teraz 15 µL, a stężenia związków wynoszą 26,6 µM, 13,3 µM i 6,66 µM.
  7. Używając dozownika odczynników do mikropłytek z dużą kasetą, nanieść 15 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w punkcie 4.1 do wszystkich kolumn (z wyjątkiem dołków pustych), rozcieńczając związki 1:2. Wszystkie dołki mają objętość końcową 30 µL, a każdy związek znajduje się w stężeniu 13,3 µM, 6,66 µM i 3,3 µM.
  8. Uszczelnić płytkę za pomocą uszczelniacza umożliwiającego ciągłą wymianę gazową. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez wytrząsania, w komorze wilgotnościowej przez 48 h.
  9. Po 48 h odczytać luminescencję emitowaną przez bakterie w każdej płytce przy czasie całkowania 1 s za pomocą czytnika płytek.

5. Test infekcji

UWAGA: Mab jest wewnątrzkomórkowym patogenem fakultatywnym, dlatego aktywność przeciwdrobnoustrojową oraz toksyczność dla gospodarza wyselekcjonowanych związków (hits) należy określić w testach infekcyjnych. W tym celu makrofagi pochodzące z szpiku kostnego (BMM) zainfekowano Mab, a następnie poddano działaniu związków zwalidowanych w kroku 4 w różnych stężeniach. Każdy test obejmował próbę ślepą (tylko woda), kontrole negatywne (zainfekowane makrofagi nieleczone), kontrole pozytywne (zainfekowane makrofagi poddane działaniu skutecznego antybiotyku), kontrole rozpuszczalnika (w tym przypadku DMSO) oraz testowane związki w trzech stężeniach: 13.3 µM, 6.66 µM i 3.3 µM (Supplementary Figure 4).

  1. Wyizolować makrofagi z szpiku kostnego dorosłych myszy szczepów dzikich (BALB/c lub C57BL/6), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą15. Wysiewamy komórki na czarną, optycznie przezroczystą płytkę 96-dołkową z płaskim dnem w zagęszczeniu 2 x 105 komórek/ml, 200 µL na studzienkę. Po 10 dniach różnicowania w 37 °C, 7% CO2215komórki są gotowe do zakażenia i rozpoczęcia procedury traktowania.
    UWAGA: Protokół pozyskiwania makrofagów pochodzących z szpiku kostnego jest dobrze udokumentowany15; jednakże niniejszy protokół przesiewowy można dostosować do innych komórek, takich jak RAW 264.7, THP-1 oraz makrofagi pochodzące z PBMC.
  2. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach 1.1–1.3, dostosowując zawiesinę bakteryjną w pożywce do hodowli komórkowej tak, aby wielokrotność infekcji (MOI) wynosiła 1.
    OSTRZEŻENIE: Podczas pracy z kulturami Mab wymagana jest komora z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Należy ostrożnie odessać uzupełnioną pożywkę hodowlaną z dołków za pomocą pompy próżniowej z podłączoną pipetą szklaną. Krok ten musi być wykonywany powoli i z wyczuciem, aby zapobiec odrywaniu się komórek.
  4. Pipetować ręcznie 75 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 5.2 do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 7% CO2 przez 4 h w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  5. Przygotuj związki do traktowania komórek. Używając dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, napełnij polipropylowe płytki 96-dołkowe o dnie okrągłym, 110 µL suplementowanego pożywki do hodowli komórkowej do kolumn, w których znajdować się będą związki lub kontrola rozpuszczalnika (Rycina uzupełniająca 4).
  6. Przy użyciu dyspensera odczynników do mikropłytek nanieś dodatkowe 104 µL dopełnienia pożywki hodowlanej z dodatkami w kolumnach, w których znajdzie się najwyższe stężenie związku lub rozpuszczalnika.
  7. Pipetować ręcznie 5.9 µL związków (1 mM w DMSO) lub rozpuszczalnika do wyznaczonych studni (kolumny w kroku 5.6). Związki znajdują się obecnie w stężeniu 26.6 µM.
  8. Za pomocą wielokanałowej mikropipety należy przeprowadzić dwa rozcieńczenia seryjne w stosunku 1:2 dla każdego związku i rozpuszczalnika. Nadmiar cieczy należy odrzucić. 110 µL po ostatnim rozcieńczeniu seryjnym. Wszystkie studzienki zawierają obecnie 110 µLa związki znajdują się w stężeniu 26.6 µM, 13.3 µM, i 6.66 µM.
  9. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek dozować 110 µL dopełnionej pożywki hodowlanej do wszystkich kolumn (z wyjątkiem studzienek pustych). Wszystkie studzienki zawierają teraz 220 µLa związki znajdują się w stężeniu 13.3 µM, 6.66 µMoraz 3.3 µM.
  10. Przygotować roztwór klarytromycyny (kontroli pozytywnej) o stężeniu 2 µg/mL w suplementowanej pożywce do hodowli komórkowej.
  11. Po 4 godzinach od etapu 5.4, używając myjki do płytek, przemyć 3 razy za pomocą 200 µL roztworem do przemywania zakażonej płytki 96-dołkowej. Należy zachować jak najniższe prędkości aspiracji i dozowania, aby zapobiec odrywaniu się komórek.
  12. Po końcowej aspiracji przenieść 200 µL związków przygotowanych w krokach 5.5–5.9 do płytki 96-dołkowej zawierającej zainfekowane makrofagi.
  13. Transfer 200 µL do studzienek niepoddanych działaniu czynnika. Przenieś 200 µL roztworu klarytromycyny przygotowanego w kroku 5.10 do odpowiednich dołków.
  14. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °Cz dodatkiem 7% CO22przez 48 h.
  15. Po 48 h należy wypłukać zakażoną płytkę 96-dołkową za pomocą myjki do płytek, używając roztworu płuczącego dołączonego do zestawu (3x za pomocą 200 µL na dołek).
  16. Za pomocą wielokanałowej mikropipety nanieść 200 µL do wszystkich dołków i pozostawić na 10 minut.
  17. Po utrwaleniu, używając myjki do płytek, przemyj komórki roztworem do mycia związków (3x za pomocą 200 µL na dołek).
    UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Komórki można przechowywać w roztworze do przemywania związków w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub tygodni, pod warunkiem uniknięcia kontaminacji oraz przesuszenia komórek. Roztwór do płukania związków musi zostać odessany przed krokiem 5.18.
  18. Używając wielokanałowej mikropipety, nanieś 200 µL do wszystkich dołków roztwór permeabilizujący i pozostawić go na 15 min. Za pomocą myjki do płytek odessać roztwór permeabilizujący.
  19. Przy użyciu wielokanałowej mikropipety nanieść ręcznie 100 µL roztworu barwiącego i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  20. Przy użyciu myjni do płytek należy przemyć płytki roztworem piorącym dla związków (3x za pomocą 200 µL na studzienkę). Na koniec pozostaw zabarwione komórki w roztworze płuczącym związki.
  21. Przeskanuj płytki w systemie obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) z następującymi ustawieniami:
    Obiektyw: 20x Air/0,4NA (jedna studnia płytki 96-dołkowej, 57 pól widzenia (FOV))
    Tryb: konfokalny
    Laser 405 nm dla DAPI (jądra komórkowe)
    Laser 561 nm dla mScarlet (bakterie)
    Laser 640 nm dla HCS Cell Mask Deep Red (cytoplazma)
    Brak stosu Z
    UWAGA: Komórki można obrazować za pomocą systemu obrazowania szerokopolowego, co jednak obniża rozdzielczość.
  22. Skonfiguruj robota do obsługi sprzętu w celu nocnego pozyskiwania obrazów. To ramię robotyczne wymienia płytki w systemie obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) bez ingerencji człowieka.
    UWAGA: Nie jest to obowiązkowe; płytki mogą być wymieniane ręcznie.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazów jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania analitycznego, które jest zintegrowane z systemem obrazowania wysokotreściowego wykorzystanym do pozyskania obrazów. Należy stworzyć potok analityczny, korzystając z obrazów próbnych (Rycina uzupełniająca 5). Następnie zostanie ona zastosowana do całego dołka (57 pól widzenia – FOV) i zbioru danych (wszystkie płytki). Oprogramowanie analityczne postępuje zgodnie z logiczną sekwencją kroków, zaczynając od segmentacji różnych obszarów zainteresowania (jąder komórkowych, cytoplazmy, komórek i bakterii), zestawiania ich ze sobą (np. bakterie wewnątrz komórek), a następnie wyodrębniania właściwości morfologicznych i intensywności (np. pola powierzchni, intensywności). Kluczowe etapy analizy obrazu opisano poniżej. Pełny zastosowany protokół znajduje się w Rycina uzupełniająca 5.

  1. Wysegmentuj jądra komórkowe za pomocą sygnału DAPI, cytoplazmę za pomocą sygnału DeepRed oraz bakterie za pomocą sygnału mScarlet.
  2. Powiąż segmentację jąder i cytoplazmy w celu utworzenia maski komórek.
  3. Usuń wszystkie obiekty znajdujące się na krawędziach. Uwzględnione zostaną tylko komórki, które w całości znajdują się w polu widzenia (komórki pełne).
  4. Zdefiniuj populację wyjściową „Bakterie w pełnych komórkach”, powiążąc pełne komórki z bakteriami.
  5. Zdefiniuj pełne komórki zainfekowane jako posiadające więcej niż jeden obszar bakteryjny, a pełne komórki niezinfekowane jako posiadające mniej niż jeden obszar bakteryjny.
  6. Po wysegmentowaniu wszystkich obszarów zainteresowania i utworzeniu populacji, oblicz i wyodrębnij ich właściwości. Dla każdej studni wyodrębniane są następujące właściwości:
    1. Dla Pełnych komórek/ Zainfekowanych pełnych komórek/ Niezinfekowanych pełnych komórek wyodrębnij:
      Liczba komórek (Suma na studnię)
      Powierzchnia [µm2] (Średnia + Odchylenie standardowe na studnię)
      Stosunek szerokości do długości komórki (Średnia + Odchylenie standardowe na studnię)
    2. Dla bakterii w pełnych komórkach wyodrębnij:
      Liczba zidentyfikowanych obszarów bakteryjnych (Suma na studnię)
      Intensywność (Suma średnich intensywności każdego obszaru na studnię)
      Powierzchnia obszaru (Suma na studnię)
  7. Po wyeksportowaniu danych i ich opracowaniu w arkuszu kalkulacyjnym, określ ładunek wewnątrzkomórkowy (Mycoload) zgodnie z następującym wzorem:
    Wzór obliczeniowy Mycoload, pokazujący intensywność bakterii, powierzchnię i obszary podzielone przez liczbę komórek.

Wyniki

Ocena czynnika Z'
Rysunek 2 przedstawia dane z jednego z dwóch przeprowadzonych eksperymentów w celu obliczenia czynnika Z'. Jako kontrolę pozytywną zastosowano klarytromycynę w stężeniu 4 µg/mL. W obu eksperymentach uzyskano wartości czynnika Z' wynoszące odpowiednio 0,64 i 0,62, co oznacza, że warunki oraz odczyt zastosowane w tym teście mogą zostać wykorzystane w kolejnym badaniu przesiewowym (Z' > 0,5). Niemniej jednak, czynnik Z' obliczano dla wszystkich pozostałych eksperymentów (testu infekcyjnego), aby kontrolować poprawność przebiegu każdego z nich.

W ramach dowodu koncepcji zaprojektowanego testu HTS przebadano bibliotekę związków przeznaczonych do repositioningu leków. Składa się ona z 1280 różnorodnych małych cząsteczek, z których 95% to leki zatwierdzone zarówno przez FDA, jak i EMA. Cząsteczki te oferują wysoką różnorodność chemiczną i farmakologiczną.

Wykres porównawczy względnych jednostek światła (RLU) dla próbek traktowanych i nietraktowanych.
Rysunek 2: Wyniki oceny współczynnika Z'. Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z klarytromycyną w stężeniu 4 µg/mL oraz bez niej, przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia indywidualne wartości luminescencji traktowanych i nietraktowanych żywych prątków w jednym niezależnym doświadczeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przesiewanie biblioteki w celu znalezienia trafień
Wszystkie związki przetestowano w stężeniu 6,66 µM przeciwko Mab. Ze względu na wielkość biblioteki, związki podzielono na cztery różne płytki mikrotytracyjne z 384 dołkami (Rysunek 3A-D). Wyniki znormalizowano pod kątem rozpuszczalnika oraz zweryfikowanego efektu brzeżnego.

W tym teście przesiewowym zidentyfikowano trzydzieści trzy związki aktywnie oddziałujące na badany układ, z których trzydzieści znacząco zmniejszyło emisję luminescencji, redukując żywotność prątków (Rysunek 3). Co ciekawe, trzy związki doprowadziły do wyższej emisji luminescencji, co może być związane ze zwiększonym metabolizmem lub proliferacją bakterii (Rysunek 3). Wszystkich 33 zidentyfikowanych związków, w tym trzy związki zwiększające luminescencję, poddano testowi walidacyjnemu, aby sprawdzić, czy taki profil zostanie zachowany.

Analiza równowagi statycznej; wykres RLU; rozkład danych; średnia ±3SD; odchylenie statystyczne.
Rysunek 3: Wyniki przesiewania biblioteki. (A-D) Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z 1280 związkami w stężeniu 6,66 µM przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykresy przedstawiają RLU z jednego niezależnego eksperymentu, wyrażone w jednostkach arbitralnych po normalizacji względem rozpuszczalnika i efektu brzegowego. Dla każdej płytki obliczono AVG RLU oraz odpowiadające mu SD, aby wyznaczyć próg (na szaro; AVG ± 3SD). Okrągłe symbole reprezentują testowany związek. Na niebiesko zaznaczono związki znajdujące się poza tym progiem, które uznano za trafienia (hits). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test walidacji trafności
Stężenia zastosowane w tym teście wynosiły 13,3 µM, 6,66 µM oraz 3,3 µM. Każdy związek badano w dwóch powtórzeniach w celu zwiększenia wiarygodności wyników.

Co istotne, związki 30, 31 i 32, z którymi wcześniej wiązano wyższe wartości RLU (Rysunek 3A,C), zachowały ten profil, przy czym w studzienkach traktowanych związkiem 32 uzyskano ponad 200% przeżywalności prątków (Rysunek 4).

Związki 20 i 33 uznano za nieaktywne, ponieważ przeżywalność prątków wyniosła blisko 100% we wszystkich badanych stężeniach (Rysunek 4).

Związki 9 i 21 wykazały podobną nieaktywność przy dwóch najniższych stężeniach; jednak w przeciwieństwie do związku 20, pozostały one aktywne przy najwyższym stężeniu 13,3 µM, przy czym związek 21 wykazał wyższą aktywność (Rysunek 4).

Związek 3 wykazuje również brak aktywności przy najniższym stężeniu oraz utratę aktywności przy 6,66 µM, choć w mniejszym stopniu niż związek 21 (Rycina 4). Tylko przy najniższym stężeniu związki 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 i 28 wykazały niższy potencjał terapeutyczny. Niemniej jednak związki 2, 10 i 28 nadal prowadzą do przeżywalności prątków na poziomie <50%.

W skali globalnej pozostałe czternaście związków wykazało aktywność we wszystkich badanych stężeniach.

Wykres żywotności prątków porównujący efekty związków; wyniki testu przeciwmikrobianego, wpływ stężenia.
Rycina 4: Wyniki testu walidacji trafień. Mab w stężeniu 2,5 x 105 CFUs/mL inkubowano z każdym wcześniej zidentyfikowanym trafieniem w stężeniach 13,3 µM, 6,66 µM i 3,3 µM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia procenty żywotnych prątków po traktowaniu w stosunku do prątków nietraktowanych w jednym niezależnym eksperymencie, przy czym każdy związek testowano w dubletach. Symbole okrągłe reprezentują dublety dla każdego związku. Słupki reprezentują średnią z tych dubletów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Test infekcji
Z trzydziestu trzech przetestowanych związków wybrano dwadzieścia osiem do testu infekcji (Rycina 4). Związki 7, 8, 9, 20 i 33 nie zostały wybrane do tego badania. Związki 9, 20 i 33 pominięto ze względu na brak aktywności podczas walidacji (Rycina 4), natomiast dwa pierwsze pominięto z przyczyn technicznych. Niemniej jednak związki te zidentyfikowano jako ryfampicynę i linezolid, antybiotyki stosowane już w leczeniu infekcji Mab12. Wszystkie związki przetestowane w teście infekcji zostały zidentyfikowane i wymienione w Tabeli 1. Aktywność przeciwdrobnoustrojową związków wobec makrofagów zainfekowanych Mab oceniano, wykorzystując wewnętrzną fluorescencję bakterii jako odczyt.

ZwiązekNazwaZwiązekNazwa
1Sulfatiazol18Cefuroksym
2Cyprofloksacyna19Rifaksymina
3Cefotaksym21Cefdinir
4Daunorubicyna22Klarytromycyna
5Doksorubicyna 23Besifloksacyna
6Tiostrepton24Lewofloksacyna
10Amikacyna25Rifabutyna
11Moksalaktam26Gatyfloksacyna
12Sulfametizol27Epirubycyna
13Sulfamonometoksyna28Pamobian pirwinium
14Cefoksytyna29Moksifloksacyna
15Nowobioicyna30Troleandomycyna
16Cefmetazol31Linkomycyna
17Roksytromycyna32Spiramycyna

Tabela 1: Lista związków przetestowanych w badaniu infekcyjnym.Związki zwalidowane w kroku 4 zostały przetestowane w badaniu infekcyjnym (krok 5).

Pierwszym ocenianym parametrem była toksyczność związków wobec makrofagów zainfekowanych Mab. Próg ustalony w celu uznania związku za toksyczny lub nietoksyczny wynosił 85% żywych makrofagów (Rysunek 5). Z dwudziestu ośmiu badanych związków, związki 4, 5, 6, 27 i 28 uznano za toksyczne (Rysunek 5). W związku z tym pięć tych związków wykluczono z dalszej oceny aktywności wewnątrzmakrofagicznej.

Wykres żywotności komórek; traktowanie związkami w stężeniach 13,3, 6,66, 3,3 μM; analiza danych na wykresie słupkowym.
Rycina 5: Toksyczność hitów wobec makrofagów zainfekowanych Mab. Makrofagi BMM myszy BALB/c zainfekowano Mab (MOI=1) i inkubowano z każdym z wcześniej zidentyfikowanych hitów w stężeniach 13,3 µM, 6,66 µM i 3,3 µM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Komórki obrazowano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do wysokoprzepustowych analiz (high-content screening), wykorzystując liczbę jąder komórkowych (barwionych DAPI) do pomiaru żywotności komórek. Wykres przedstawia procenty żywych zainfekowanych makrofagów poddanych działaniu związków w stosunku do żywych, niezainfekowanych makrofagów z dwóch niezależnych eksperymentów. Symbole okrągłe reprezentują żywotność komórek dla każdego testu. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby ocenić aktywność wewnątrzmakrofagową pozostałych dwudziestu trzech związków przeciwko wewnątrzkomórkowym Mab (Ryc. 6), wykorzystano wzór Mycoload (wyjaśniony wcześniej w kroku 6) w celu uzyskania procentowej przeżywalności prątków znormowanej względem zakażonych makrofagów niepoddanych działaniu leków. Większość związków utraciła potencjał terapeutyczny przeciwko zinternalizowanym prątkom (Ryc. 6) w porównaniu z testem walidacji trafień (Ryc. 4), ponieważ liczba trafień zmniejszyła się z dwudziestu pięciu do sześciu przy najwyższym testowanym stężeniu. Co uderzające, wszystkie trzy związki, które zwiększały przeżywalność planktonicznych Mab w porównaniu z bakteriami niepoddanymi działaniu leków (30, 31 i 32; Ryc. 3 oraz Ryc. 4), wykazały aktywność przeciwprątkową wobec wewnątrzkomórkowych Mab, przy czym związki 30 i 32 wykazały istotną różnicę statystyczną w porównaniu z DMSO, nawet przy 3,3 µM w przypadku związku 32 (Ryc. 6). Prątki traktowane związkami 11 i 23 wykazały przeżywalność <50% przy 13,3 µM; nie było to jednak istotnie różne od kontroli DMSO (Ryc. 6). Związki 21, 26 i 29 były wystarczająco silne przy 13,3 µM, aby wykazać istotną różnicę statystyczną, przy czym związek 29 był najbardziej aktywny (Ryc. 6). Na koniec, związki 17, 22 i 25 były niezwykle silne we wszystkich testowanych stężeniach przeciwko zinternalizowanym prątkom. Zidentyfikowano je odpowiednio jako roksytromycynę, klarytromycynę i ryfabutynę (Tabela 1). Z trzech związków klarytromycyna była najsilniej działająca przeciwko Mab, a przeżywalność prątków nigdy nie przekroczyła 10%, przy wartości p <0,0001 we wszystkich testowanych stężeniach w porównaniu z DMSO (Ryc. 6).

Wykres słupkowy porównujący stężenia związków i procentowy ładunek mikobakteryjny (mycoload), zaznaczono istotność statystyczną.
Rysunek 6: Aktywność wewnątrzmakrofagiczna hitów przeciwko makrofagom zainfekowanym Mab. BMM myszy BALB/c zostały zainfekowane Mab (MOI=1) i inkubowane z każdym z wcześniej zidentyfikowanych hitów w stężeniach 13,3, 6,66 oraz 3,3 µM (odpowiednio 1,3, 0,7 i 0,3% DMSO) przez 48 h w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Komórki obrazowano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do przesiewania wysokotreściowego (HCS), a sygnał fluorescencyjny wykorzystano do obliczenia Mycoload (patrz krok 6). Wykres przedstawia procentowy ładunek mikobakteryjny (Mycoload) w zainfekowanych makrofagach poddanych działaniu związków w stosunku do nieleczonych makrofagów zainfekowanych w dwóch niezależnych eksperymentach. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem porównań wielokrotnych Dunnetta; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ****, p < 0,0001 w porównaniu do DMSO (kontroli rozpuszczalnika). Gwiazdki odpowiadają kodowi kolorystycznemu dla każdego stężenia zgodnie z legendą wykresu. Symbole okrągłe reprezentują Mycoload dla każdego pomiaru. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Przykład układu płytki 384-dołkowej użytej do oceny czynnika Z'. Biały – dołki pustych prób (tylko płynna pożywka wzrostowa); żółty – kontrola pozytywna (bakterie traktowane antybiotykiem); czerwony – kontrola negatywna (bakterie nietraktowane). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Przykład układu płytki 384-dołkowej stosowanej podczas przesiewania biblioteki. Biały – dołki puste (tylko płynna pożywka wzrostowa); zielony – kontrola rozpuszczalnika; czerwony – kontrola negatywna (bakterie niepoddane działaniu związku); niebieski – związki do przesiewania. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Przykład układu płytki 384-dołkowej stosowanej do walidacji trafień. Biały – dołki puste (tylko ciekła pożywka wzrostowa); zielony – kontrola rozpuszczalnika (w duplikacie); czerwony – kontrola negatywna (bakterie niepoddane działaniu związku); niebieski – związki do przesiewania (w duplikacie). Bladsze kolory reprezentują rozcieńczenia seryjne 1:2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Przykład układu płytki 96-dołkowej stosowanej w teście infekcji. Kolor biały – dołki puste (woda w celu zapobiegania parowaniu); czerwony – kontrola negatywna (makrofagi nieleczone); żółty – kontrola pozytywna (makrofagi leczone antybiotykiem); zielony – kontrola rozpuszczalnika; niebieski – testowane związki. Bladsze kolory oznaczają rozcieńczenia seryjne 1:2. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Protokół analizy obrazów. W niniejszej pracy zastosowano szczegółowy protokół analizy obrazów, który może zostać dostosowany do oprogramowania otwartoźródłowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje proces badań przesiewowych leków przeciwko Mab przy użyciu szczepów opracowanych we własnym zakresie 10. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy oraz podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii jest szybko oceniana za pomocą luminescencji lub fluorescencji bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Takie podejście skraca czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest istotną zaletą przy rozważaniu celu testów HTS.

Podczas badań przesiewowych tysięcy związków musi być łatwo zidentyfikowany skuteczny lek. W tym celu współczynnik Z' jest często używany do pomiaru statystycznej wielkości efektu, wnioskując o wydajności testu. Jeśli współczynnik Z' > 0,5, badane warunki są optymalne do rozróżnienia między populacjami leczonymi i nieleczonymi13. W testowanych warunkach uzyskano czynniki Z > 0,6 (ryc. 2), statystycznie udowadniając, że można je zastosować w kampanii przesiewowej. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skuteczności badań przesiewowych.

W związku z tym opracowano protokół HTS w celu wykrycia aktywności przeciwdrobnoustrojowej tysięcy związków przeciwko planktonicznemu wzrostowi Mab. Ponieważ Mab jest wewnątrzkomórkowym patogenem fakultatywnym, opracowany protokół monitoruje również wewnątrzkomórkową aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko temu samemu szczepowi bakteryjnemu - co jest kluczową zaletą. Ponadto można również ocenić toksyczność dla komórek gospodarza. W związku z tym opisano wieloetapowe podejście do badań przesiewowych leków przeciwko Mab, wykorzystujące różne konfiguracje eksperymentalne do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej wraz z cytotoksycznością, zwiększając szanse na sukces. Jako dowód słuszności koncepcji, przebadano bibliotekę chemiczną zawierającą 1280 związków.

Zidentyfikowano łącznie trzydzieści trzy trafienia (ryc. 3). Spośród nich trzy istotnie zwiększyły żywotność prątków w kulturach płynnych (związki 30, 31 i 32; Rysunek 3 i Rysunek 4). Należy zauważyć, że związki te mogą zakłócać emisję luminescencji bez wpływu na żywotność bakterii. W testach przeciwko zinternalizowanym prątkom, związki te wykazały aktywność przeciwdrobnoustrojową (ryc. 6), wykazując wyższą skuteczność przeciwko Mab po internalizacji komórek gospodarza. Związki te zidentyfikowano jako troleandomycynę (30), spiramycynę (32) i linkomycynę (31; Tabela 1). Dwa pierwsze to makrolidy, klasa antybiotyków stosowanych w leczeniu zakażeń prątkami16, a drugi to linkozamid, antybiotyk o mechanizmie działania podobnym do makrolidów17. Doniesiono, że Mab jest szczególnie oporny na inny linkozamid, klindamycynę, zarówno w kulturach płynnych, jak i stałych18. Niemniej jednak właściwości immunomodulujące i przeciwzapalne zostały związane z makrolidami19,20 i linkozamidami21, co może wyjaśniać zwiększoną aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko zinternalizowanym prątkom (ryc. 6).

Z pozostałych trzydziestu trafień, jedenaście zmniejsza o >90% żywotność prątków we wszystkich stężeniach (ryc. 4). Biorąc pod uwagę, że typowy test HTS ma oczekiwany współczynnik trafień ~1%22, opracowany protokół jest zgodny z tym, co zwykle obserwujemy. Niemniej jednak kilka innych związków było nadal aktywnych, a dwadzieścia osiem z nich przeszło do testu infekcji.

Spośród zidentyfikowanych związków, pięć związków uznano za toksyczne (ryc. 5) - daunorubicyna (4), doksorubicyna (5), epirubicyna (27), tiostrepton (6) i amorian pyrwinu (28; Tabela 1). Pierwsze trzy to środki przeciwnowotworowe 23,24,25, więc nic dziwnego, że są toksyczne dla komórek ssaków użytych w tym teście. Ambonian pyrwinu był stosowany przez wiele lat jako skuteczny środek przeciwrobaczy; Jednak od 2004 r. wiąże się ją również z działaniami przeciwnowotworowymi26. Wreszcie, tiostrepton jest oligopeptydem często stosowanym w medycynie weterynaryjnej, nigdy nie zatwierdzonym do stosowania u ludzi27. Aktywność tego leku przeciwko komórkom raka piersi odnotowano28. Aktywność wewnątrzmakrofagiczną tiostreptonu nie oceniano ze względu na jego toksyczność na makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (ryc. 5). Wykazano jednak, że tiostrepton jest skuteczny przy 5 μM na komórkach THP-1 zakażonych Mab29. Zgłoszone wyniki przeciwko bakteriom planktonicznym29 są podobne do tych uzyskanych w tym badaniu przesiewowym, przy czym tiostrepton jest niezwykle silny (ryc. 4).

Większość związków badanych pod kątem aktywności wewnątrzmakrofagicznej nie wykazywała potencjału terapeutycznego (ryc. 6). Wzrost wewnątrzkomórkowy bakterii znacznie różni się od kultur planktonowych. W tym ostatnim przypadku zawsze możliwy jest bezpośredni kontakt bakterii z lekami. W pierwszym przypadku, ze względu na internalizację przez komórki gospodarza, kilka błon gospodarza działa jak fizyczne bariery, które leki muszą transponować, aby dotrzeć do celu, co może pomóc wyjaśnić zmniejszoną aktywność przeciwdrobnoustrojową większości trafień. Przy najwyższym stężeniu, 13,3 μM, trzy związki wykazywały wystarczającą siłę, aby statystycznie różnić się od kontroli DMSO (ryc. 6) - cefdinir (21), gatifloksacyna (26) i moksyfloksacyna (29; Tabela 1). Podczas gdy moksyfloksacyna jest już stosowana jako lek przeciwgruźliczy drugiego rzutu16, cefdinir jest powszechnie stosowany w leczeniu kilku infekcji bakteryjnych dróg oddechowych, takich jak zapalenie płuc30. Jednak jego aktywność przeciwko M. tuberculosis31 i Mab została opisana, wykazując silne działanie synergistyczne z karbapenemym przeciwko temu ostatniemu32. Gatifloksacyna jest fluorochinolonem, a jej aktywność została zgłoszona przeciwko kilku prątkom w ciągu ostatnich 33,34. Trzy najbardziej aktywne związki w tym teście (ryc. 6) to roksytromycyna (17), klarytromycyna (22) i ryfabutyna (25; Tabela 1), które są niezwykle silne we wszystkich stężeniach. Pierwsze dwie to makrolidy, podczas gdy ryfabutyna jest ryfamycyną, przy czym obie klasy służą jako podstawa leczenia wielu zakażeń prątkami16.

To badanie przesiewowe opiera się na specjalnym i drogim sprzęcie do obsługi cieczy w celu zmniejszenia zmienności między testami. Pomimo tego, że jest niezwykle powtarzalny, płyn nie posiada bezdotykowego transferu związków, takiego jak akustyczny. W ten sposób niektóre przylegające związki mogą pozostać przyczepione do metalowych kołków między transferami, przenosząc się do kolejnych studzienek, co skutkuje fałszywie dodatnimi wynikami podczas fazy przesiewowej - tak właśnie stało się w przypadku związku 33. Właśnie dlatego walidacja badań przesiewowych ma tak kluczowe znaczenie dla ich powodzenia, zapewniając, że żadne wyniki fałszywie dodatnie nie przejdą do kolejnych etapów badań przesiewowych leków. Test infekcji wykorzystuje system obrazowania o wysokiej zawartości z trybem konfokalnym, aby uzyskać najlepszą możliwą definicję regionów bakteryjnych. Niemniej jednak nadal można go używać bez trybu konfokalnego, choć przy utracie definicji i prawdopodobnie utrudnia identyfikację regionów bakteryjnych. Protokół ten wykorzystuje proste i przyjazne dla użytkownika oprogramowanie analityczne zintegrowane z systemem obrazowania; jednak oprogramowanie typu open source może być używane zgodnie z protokołem (rysunek uzupełniający 5). Ostatecznie, pomimo tego, że nie zmienia się przeznaczenia leków w leczeniu zakażeń MAB, wyniki te są niezwykle ważne, ponieważ potwierdzają ustalony protokół, który można rozszerzyć na większe biblioteki. Co ważne, uważamy, że protokół ten można dostosować do dowolnych bakterii, pod warunkiem, że dostępne są odczyty fluorescencyjne lub luminescencyjne. W ten sposób prace te wnoszą znaczący wkład w dziedzinę odkrywania leków, dostarczając niezbędnych narzędzi do walki z jednym z największych problemów zdrowia publicznego – bakteriami opornymi na antybiotyki – a w szczególności z prawie nieuleczalnym patogenem – Mycobacterium abscessus.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana z portugalskich funduszy narodowych za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P, w ramach projektu PTDC/BIA-MIC/3458/2020 (DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020) oraz stypendiów doktoranckich 2021.07335.BD dla GSO i UI/BD/150830/2021 dla CMB; FWO - Fundacja Badawcza Flandria, grant nr 1S68720N; Inicjatywa w zakresie leków innowacyjnych 2 Call 16 (IMI2-Call 16) wniosek RespiriTB pod numerem umowy 853903. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony i3S Scientific Platform BioSciences Screening, członka krajowych infrastruktur PT-OPENSCREEN (NORTE-01-0145-FEDER-085468) i PPBI - Portugalskiej Platformy Bioobrazowania (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaBio Optica05-01005Qroztwór utrwalający
384-dołkowa okrągłodenna mikropłytka polipropylenowa niepoddana obróbceCorning3658Można użyć białych mikropłytek; można użyć polistyrenu
50 TS MyjkaBioTek
Membrana uszczelniająca Breathe-EasySigma-AldrichZ380059-1PAK
:: explorerRevvityequipment handling robot
ClarithromycinSigma-AldrichA3487-100MGRozpuszczony w DMSO do pożądanego stężenia
DMSOFisher ScientificD/4121/PB15Rozcieńczyć w płynnym podłożu wzrostowym do pożądanego stężenia
Harmony 5.1Oprogramowanie do analizyRevvity
Heracell VIOS 160i CO2 Inkubator, 165 LThermo Scientificinkubator komórkowy
JANUS z 4 ramieniem końcówkowym i ramieniem MDT Ładowarkado cieczyRevvity
KB 8182Inkubator Termaksz mieszadłem
Libra S4+Biochrom
Multidrop  Dozownik odczynników CombiSystem
Opera Phenix PlusRevvity
PhenoPlateRevvity6055302Niezbędny do mikroskopów o wysokiej zawartości
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS) 1xmyjącyNA NA
Biblioteki chemiczne Prestwick Komercyjna biblioteka chemiczna przeznaczona do zmiany przeznaczenia leków
Inkubator wstrząsający 3031GFL
VICTOR NivoRevvity
Pożywka do hodowli komórkowych: W razie potrzeby dodać 10% suplementu
DMEMGibco10938-025
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiowestS1810
Roztwór buforowy HEPES (1 M)Gibco15630-056
LCCMNANA Kondycjonowane podłoże z linii komórkowej L929, które uwalnia czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF); suplement pożywki do hodowli komórkowych
L-glutamina (200 mM)Thermo Scientific25030024
Pirogronian sodu 100 mM (100X)Gibco11360-039
Infection roztwór do mycia
WodaDostępnych jest wielu dostawców
Hank's Balanced Salt Solution 10xGibco14060-040Rozcieńczyć do 1x z wodą apirogenną
Roztwór przepuszczalnyPBS z 0,1% Triton X100
PBS 1xNANA
Triton X100Sigma-AldrichT8787Inni dostępni dostawcy
Roztwór barwiącyPBS z DAPI (500 ng/mL) i HCS Far Red (10 ng/mL)
DAPISigma-AldrichD9564
HCS Far Red InvitrogenH32721
PBS 1xNANADostępnych jest wielu dostawców
Płynna pożywka wzrostowaW razie potrzeby dodaj 10% suplementu
Middlebrook 7H9 BrothBD Difco271310
Tween80Sigma-AldrichP47800,05% stężenia końcowego. Inni dostępni dostawcy
< silny> płynny suplement pożywki: < / strong>
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP9702-100
D-glukoza bezwodnaFisher ScientificG/0450/60
obrazowania Thermo Scientific roztwór apirogenna

Bibliografia

  1. Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen. Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).
  2. Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance. Front Microbiol. 9, 2179(2018).
  3. Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease. Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).
  4. Cristancho-Rojas, C., et al. Epidemiology of Mycobacterium abscessus. Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).
  5. Hua, Y., et al. Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases. Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).
  6. Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. Annual reports in medicinal chemistry. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).
  7. Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria. Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).
  8. Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. High throughput screening. Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).
  9. Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus. Front Microbiol. 8, 2204(2017).
  10. Bento Clara, M., et al. Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet. Microbiol Spectr. , e0036224(2024).
  11. Kolbe, K., et al. Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs. Front Microbiol. 11, 591866(2020).
  12. Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen. Microorganisms. 11 (1), 90(2022).
  13. Bray, M. A., Carpenter, A. Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. CLSI document M07-A10. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).
  15. Silva, T., et al. Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium. mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).
  16. Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria. Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).
  17. Spizek, J., Rezanka, T. Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications. Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).
  18. Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).
  19. Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages. Molecules. 27 (10), 3202(2022).
  20. Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms. Front Immunol. 9, 302(2018).
  21. Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology. Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).
  22. Volochnyuk, D. M., et al. Evolution of commercially available compounds for hts. Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).
  23. Sritharan, S., Sivalingam, N. A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin. Life Sci. 278, 119527(2021).
  24. Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review. Cureus. 14 (12), e33165(2022).
  25. Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review. Breast. 21 (2), 142-149 (2012).
  26. Schultz, C. W., Nevler, A. Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug. Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).
  27. Bailly, C. The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications. Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).
  28. Kwok, J. M., et al. Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression. Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).
  29. Kim, T. H., et al. Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection. Molecules. 24 (24), 4511(2019).
  30. Perry, C. M., Scott, L. J. Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections. Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).
  31. Ramon-Garcia, S., et al. Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy. Sci Rep. 6, 34293(2016).
  32. Kumar, P., et al. Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins. Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).
  33. Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).
  34. Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewy wysokoprzepustoweMycobacterium abscessusrepurposing lekówszczep z podwójnym reporteremzautomatyzowana mikroskopiarobotyka do obsługi cieczytest żywotności bakteriiwewnątrzkomórkowe prątkiobrazowanie konfokalnemodel infekcji makrofagów
Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.