Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Podsumowanie

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Streszczenie

Zakażenia Mycobacterium abscessus (Mab) są trudne do leczenia ze względu na wysoką wewnętrzną oporność na leki, porównywalną do gruźlicy wielolekoopornej. Leczenie jest skrajnie nieskuteczne i opiera się na schemacie wielolekowym, co skutkuje niskim poziomem przestrzegania zaleceń przez pacjentów. W związku z tym wzywa się społeczność naukową do zidentyfikowania nowych i skutecznych leków do leczenia tych zakażeń. Jedną ze strategii stosowanych w tym celu jest zmiana przeznaczenia leków – proces identyfikacji nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących leków na rynku, z pominięciem czasu potrzebnego na ustalenie profili farmakokinetycznych i bezpieczeństwa nowych leków. Ponieważ większość badań nad opracowywaniem leków przeciwko Mab opiera się na tradycyjnych i czasochłonnych metodach, opracowano test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom przy użyciu opracowanego we własnym zakresie szczepu Mab z podwójnym reporterem. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy, a także opracowanych przez nas podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii można szybko zmierzyć za pomocą dwóch różnych odczytów, luminescencji i fluorescencji, bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Skraca to czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest główną zaletą w przypadku badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Opisany protokół został zweryfikowany poprzez badania przesiewowe biblioteki 1280 związków. Uzyskane wyniki zostały potwierdzone w piśmiennictwie, przy skutecznej detekcji związków aktywnych. Tym samym prace te spełniły cel, jakim było dostarczenie terenowi nowego narzędzia, które pomoże w walce z tą niezwykle lekooporną bakterią.

Wprowadzenie

Mycobacterium abscessus (Mab) jest oportunistycznym patogenem odpowiedzialnym za infekcje płuc, szczególnie u osób z mukowiscydozą i innymi chorobami płuc. Infekcje wywołane przez Mab są niesławnie trudne do leczenia ze względu na wyjątkową wewnętrzną oporność na leki, porównywalną z gruźlicą wielolekooporną¹. Dostępne leki są w dużej mierze nieskuteczne ze względu na wysoce nieprzepuszczalną otoczkę komórek prątków i genom kodujący kilka enzymów dezaktywujących antybiotyki². W związku z tym leczenie obejmuje połączenie kilku leków, które trwa od miesięcy do lat. Ten wymagający schemat leczenia wielolekowego w połączeniu z niskim poziomem przestrzegania zaleceń przez pacjentów skutkuje średnim wskaźnikiem wyleczeń od 30% do 50%³. Co więcej, częstość występowania infekcji płuc wywołanych przez prątki niegruźlicze wzrosła w ciągu ostatnich kilku dekad, w tym tych wywoływanych przez Mab^1,4. W związku z tym społeczność naukowa prześciga się w opracowywaniu nowych związków do leczenia zakażeń MAB.

Jedną ze strategii realizowanych w tym celu jest zmiana przeznaczenia leków - proces identyfikowania nowych możliwości terapeutycznych dla istniejących leków. W ten sposób omija się największe wyzwanie związane z odkrywaniem i opracowywaniem nowego leku - time⁵. Ta prosta koncepcja wykorzystuje już ustalone profile farmakokinetyczne i bezpieczeństwa kilku leków w celu zmniejszenia kosztów rozwoju i skrócenia czasu potrzebnego na dostarczenie leku z laboratorium do łóżka pacjenta⁶. W ten sposób stworzono biblioteki, które łączą setki do tysięcy takich związków, co pozwala naukowcom szybko przetestować możliwość zmiany przeznaczenia leków przeciwko ich patogenowi, który ich interesuje.

Większość badań nad rozwojem leków przeciwko Mab opiera się na złotym, ale tradycyjnym teście, który ocenia aktywność związku in vitro przeciwko prątkom - liczenie jednostek tworzących kolonie⁷. Pomimo swojej dokładności, procedura ta jest niezwykle czasochłonna, szybko staje się niewykonalna, gdy ktoś chce przetestować biblioteki zawierające tysiące związków. W tym celu do opracowywania leków włączono wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) - solidne testy, które wykorzystują robotykę i urządzenia do obsługi cieczy, umożliwiając szybkie równoległe badanie tysięcy związków⁸. Zazwyczaj odbywa się to poprzez początkowe testowanie pojedynczego stężenia przy użyciu płytek mikromiareczkowych w formatach 96, 384, 1536 lub 3456 dołków, które działają jako punkt wyjścia do identyfikacji trafień i dalszej ich optymalizacji w dół rurociągu do klinicznego zastosowania.

Testy oparte na raportowaniu zapewniają znaczącą przewagę w zakresie wytrzymałości HTS ze względu na ich prostotę i czułość w porównaniu z innymi testami opartymi na barwniku i absorbancji^7,9. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, tylko kilka badań zoptymalizowało wysokoprzepustowe badanie przesiewowe przeciwko Mab⁹.

Ostatnio nasze laboratorium opracowało podwójne szczepy reporterowe zdolne do jednoczesnego emitowania luminescencji i fluorescencji¹⁰. Mab operon_mScarlet jest jednym z tych szczepów. Jest autoluminescencyjny dzięki ekspresji operonu LuxABCDE, który obejmuje lucyferazy bakteryjnej (poprzez ekspresję genów luxAB) i długołańcuchowy substrat aldehydowy (przez ekspresję genów luxCDE). Z drugiej strony, odczyt fluorescencyjny uzyskuje się poprzez ekspresję niedawno opracowanego białka czerwonej fluorescencji, mScarlet, które przewyższa bardziej powszechnie stosowane białka eGFP i mCherry, zapewniając silniejszy sygnał¹¹. Użycie tego szczepu pozwala nam ocenić żywotność bakterii w hodowli płynnej poprzez pomiar sygnału luminescencyjnego w czytniku mikropłytek bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Jeśli chodzi o wykrywanie, fluorescencja wewnętrzna pozwala na wizualizację mikroskopową w żywych lub nieruchomych komórkach bez użycia barwników lub przeciwciał. Posiadanie jednego szczepu z obydwoma odczytami zapewnia badaczom znaczną przewagę podczas stosowania go w testach HTS - zmniejszoną zmienność między testami z różnymi odczytami, ponieważ nie ma potrzeby wymiany szczepów w zależności od charakteru testu.

Tak więc, ta praca opracowała wysokoprzepustowy test przeciwko Mab przy użyciu własnego podwójnego szczepu reporterowego (Rysunek 1). Pozwoliło to na szybką ocenę aktywności in vitro 1280 leków przeznaczonych do zmiany przeznaczenia przy użyciu komercyjnej biblioteki (patrz tabela materiałów). Po pierwsze, działania oceniano w teście hodowli bulionu przy użyciu luminescencji, a po drugie, przy użyciu makrofagów zakażonych Mab, wykorzystujących sygnał fluorescencyjny, lepiej emulując proces infekcji obserwowany in vivo¹².

Rysunek 1: Graficzne streszczenie ustalonego protokołu. Kluczowym graczem w tym badaniu przesiewowym jest opracowany przez nas podwójny reporterowy szczep prątków, który jest używany we wszystkich eksperymentach. Po pierwsze, przy użyciu dozownika odczynników i bakterii planktonowych, przeprowadza się wstępne badanie przesiewowe, testując związki w jednym stężeniu. Zidentyfikowane trafienia są następnie poddawane testowi walidacyjnemu, w którym badane są trzy różne stężenia. Oba eksperymenty są wykonywane przy użyciu odczytu luminescencyjnego. Zwalidowane trafienia przechodzą do testu infekcji, w którym testowane są również trzy różne stężenia, a makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego są zakażone w MOI 1. System obrazowania o wysokiej zawartości pozyskuje bakteryjny sygnał fluorescencyjny, a oprogramowanie analityczne służy do oceny obciążenia wewnątrzkomórkowego za pomocą formuły Mycoload. Liczba związków zmniejsza się wraz ze wzrostem złożoności testu. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyki Zwierząt i3S i licencjonowane przez Portugalską Dyrekcję Generalną ds. Żywności i Weterynarii (DGAV), zgodnie z Dyrektywą Rady Europejskiej (2010/63/UE) i portugalskim prawem (DL 113/2013) dotyczącym dobrostanu zwierząt podczas eksperymentów.

1. Ocena współczynnika Z'

UWAGA: Aby ocenić wydajność testu HTS, można określić kilka parametrów. Najczęściej używanym parametrem jest współczynnik pierwszy Z (współczynnik Z'). Metryka ta mierzy wielkość efektu statystycznego danego eksperymentu, wskazując, jak dobrze oddzielone są kontrole pozytywne i negatywne. Jeśli współczynnik Z' mieści się w zakresie od 0,5 do 1, separacja między obiema populacjami jest doskonała, a warunki te można wykorzystać w teście HTS. Jeśli Z' < 0,5, separacja jest tylko marginalna i nie zaleca się wykonywania screeningu¹³. W związku z tym zaprojektowano eksperyment z użyciem połowy płytki z nieleczonymi bakteriami i drugiej połowy z kontrolą pozytywną w celu obliczenia współczynnika Z' (rysunek uzupełniający 1).

1. Na 2-3 dni przed badaniem należy przygotować wstępne kultury Mab, zaszczepiając bakterie w płynnym pożywce wzrostowej (około 1 x 10⁷ jtk/ml) w kolbie Erlenmeyera. Pozostawić bakterie do wzrostu w temperaturze 37 °C w inkubatorze z mieszaniem (90 obr./min).
   UWAGA: Podczas pracy z kulturami Mab wymagana jest szafa bezpieczeństwa biologicznego.
2. Śledź wzrost prekultury Mab, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Gdy kultura osiągnie fazę wzrostu wykładniczego, przejdź do kroku 1.3.
3. Korzystając z wykładniczej hodowli wstępnej, przygotuj zawiesinę bakteryjną o wymiarach około 5 x 10⁵ jtk/ml (skorelowaną z wartościami gęstości optycznej)¹⁴ w płynnym podłożu wzrostowym.
4. Przygotować roztwór pozytywnej kontroli zahamowania wzrostu bakterii w płynnej pożywce wzrostowej. W przypadku tego testu kontrolą dodatnią była klarytromycyna (10 mg/ml w DMSO) w stężeniu 4 μg/ml. Klarytromycynę należy przygotować 2x pożądane stężenie końcowe.
5. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować 15 μl płynnej pożywki wzrostowej do ślepej i niepoddanej działaniu substancji kolumn czarnej 384-dołkowej płytki polipropylenowej. W przypadku kolumn ślepej próby należy dozować dodatkowe 15 μl płynnego podłoża wzrostowego.
   UWAGA: Puste kolumny zapobiegają parowaniu studzienek wewnętrznych w temperaturze 37 °C.
6. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować 15 μl roztworu kontroli dodatniej przygotowanego w kroku 1.4 do kolumn kontroli dodatniej.
7. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w dużą kasetę dozować 15 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 1.3 do wszystkich kolumn z wyjątkiem ślepych prób, rozcieńczając wszystko w stosunku 1:2. Ostateczna objętość wszystkich 384 studzienek wynosi 30 μL.
   UWAGA: Dozownik odczynników do mikropłytek może być wyposażony w dużą lub małą kasetę, różniącą się rozmiarem rurki (odpowiednio 0,5 i 0,22 mm). Zaleca się użycie większej kasety, aby zapobiec agregacji bakterii w systemie rurek, nawet jeśli powoduje to większe marnotrawstwo cieczy. Niemniej jednak ta sama kaseta może być używana przez cały test.
8. Uszczelnij każdą płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt, który umożliwia ciągłą wymianę gazową. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez mieszania w wilgotnej komorze przez 48 godzin.
9. Po 48 godzinach odczytaj luminescencję emitowaną przez bakterie na każdej płytce za pomocą czytnika płytek o czasie całkowania 1 s.
10. Aby określić współczynnik Z', należy użyć wartości uzyskanych w kroku 1.9 i obliczyć średnią i odchylenie standardowe kontrolek dodatnich (AVG_P i SD_P) i ujemnych (AVG_N i SD_N). Następnie zastosuj następującą formułę:
    UWAGA: 3 x SD to powszechnie stosowany próg; Można go jednak dostosować, aby lepiej pasował do badania przesiewowego - zwiększając lub zmniejszając współczynnik, przez który należy pomnożyć odchylenie standardowe.

2. Przegląd biblioteki pod kątem trafień

UWAGA: Pierwsze badania przesiewowe przeprowadzono przeciwko bakteriom rosnącym w płynnej kulturze. Zestaw został zaprojektowany dla płytek 384-dołkowych o 30 μl końcowej objętości. Każda płytka zawierała ślepe studzienki (tylko ciekła pożywka wzrostowa), kontrole ujemne (bakterie niepoddane działaniu substancji) i kontrolę rozpuszczalnika (bakterie plus rozpuszczalnik związku - w tym przypadku DMSO; Rysunek uzupełniający 2). Związki lub rozpuszczalnik dodawano do płytki w stężeniu końcowym 2x pożądanym, a bakterie dodawano w stosunku 1:1 (rozcieńczając wszystko do połowy).

1. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.3.
   UWAGA: Podczas pracy z kulturami Mab wymagana jest szafa bezpieczeństwa biologicznego.
2. Przygotuj roztwór rozpuszczalnika w płynnym podłożu wzrostowym. Ilość rozpuszczalnika musi być 2x większa od pożądanego stężenia końcowego.
3. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować 15 μl płynnej pożywki wzrostowej do każdej kolumny czarnych 384-dołkowych płytek polipropylenowych, z wyjątkiem kolumny kontrolnej rozpuszczalnika. W przypadku kolumn zerowych należy dozować dodatkowe 15 μl płynnej pożywki wzrostowej.
4. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę należy dozować 15 μl przygotowanego wcześniej roztworu rozpuszczalnika do kolumny kontrolnej rozpuszczalnika.
5. Za pomocą manipulatora z cieczą przenieść 200 nl związków z podstawowych płytek 96-dołkowych (1 mM w DMSO) na płytki 384-dołkowe, z wyjątkiem ślepych prób, kontroli rozpuszczalnika i kolumn niepoddanych obróbce. Związki te mają obecnie stężenie 13,3 μM.
6. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek wyposażonego w dużą kasetę, dozować 15 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 2.1 do wszystkich kolumn z wyjątkiem ślepych prób, rozcieńczając wszystko w stosunku 1:2. Ostateczna objętość wszystkich 384 dołków wynosi 30 μL, a każdy związek ma 6,66 μM.
7. Uszczelnij każdą płytę za pomocą uszczelniacza do płyt, który umożliwia ciągłą wymianę gazową.
   UWAGA: Test można wykonać za pomocą zwykłych pokrywek; Istnieje jednak większe prawdopodobieństwo wystąpienia silniejszych efektów krawędziowych.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez mieszania w wilgotnej komorze przez 48 godzin.
9. Po 48 godzinach odczytaj luminescencję emitowaną przez bakterie na każdej płytce za pomocą czytnika płytek o czasie całkowania 1 s.

3. Analiza danych z badań przesiewowych trafień

UWAGA: Aby zidentyfikować trafienia z uzyskanymi danymi luminescencji, wartości muszą być znormalizowane do rozpuszczalnika, w którym związki są rozpuszczone, a jeśli wystąpi, do efektu krawędzi zweryfikowanego na płytkach 384 mikromiareczkowych.

1. W celu normalizacji rozpuszczalnika danych uzyskanych w kroku 2.9 należy podzielić względne jednostki światła (RLU) każdej studzienki przez średnią RLU studzienek kontrolnych rozpuszczalnika (na odpowiedniej tabliczce). W tym teście zweryfikowano silny efekt krawędzi w kierunku środka płytek przesiewowych; W związku z tym zdecydowano się znormalizować wszystkie dane dla niego. Aby to osiągnąć, proces został przeprowadzony w dwóch etapach, jak opisano poniżej.
   1. Utwórz maskę efektu krawędzi, dzieląc wartości uzyskane w kroku 3.1 dla odpowiednich pozycji, z wyłączeniem trafień, na wszystkich blachach (płyta 1 - P1, płyta 2 - P2, płyta 3 - P3, płyta 4 - P4). Na przykład dla pozycji A1 i A2 Mask_A1 = Średnia (P1_A1; P2_A1; P3_A1; P4_A1); Mask_A2 = Średnia (P1_A2; P2_A2; P4_A2) [P3_A2 został wykluczony, ponieważ był hitem].
   2. Podziel wartości uzyskane w kroku 3.1. przez maskę efektu krawędzi uzyskaną w kroku 3.1.1. Na przykład . Następnie oblicz AVG i SD każdej płyty, aby ustalić próg (AVG ± 3SD) dla każdej płyty. Każdy związek chemiczny przekraczający ten próg uznaje się za trafienie i przechodzi on do testu walidacji trafienia.

4. Test walidacji trafień

UWAGA: Po zidentyfikowaniu trafień, muszą one zostać zweryfikowane przy użyciu różnych stężeń. Test walidacyjny wykorzystuje podobną konfigurację z tymi samymi kontrolami, ale każde trafienie zostanie poddane seryjnym rozcieńczeniom 1:2. Do tego testu zastosowano trzy stężenia - 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM. Kontrole rozpuszczalnikowe będą zawierały taki sam % rozpuszczalnika, jak każdy dobrze złożony (rysunek uzupełniający 3).

1. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.3.
   UWAGA: Podczas pracy z kulturami Mab wymagana jest szafa bezpieczeństwa biologicznego.
2. Za pomocą dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozuj 15 μl płynnej pożywki wzrostowej do każdej kolumny czarnej 384-dołkowej płytki polipropylenowej. W przypadku studzienek ślepych należy dozować dodatkowe 15 μl płynnego podłoża wzrostowego do pierwszej i ostatniej kolumny.
3. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek dozować dodatkowe 15 μl płynnej pożywki wzrostowej do kolumn zawierających najwyższą [μM] zawartość każdego związku.
4. Z podstawowych płytek 96-dołkowych ręcznie odpipetować 0,8 μl każdego uderzenia (1 mM w DMSO) do odpowiednich dołków z kroku 4.3, w dwóch egzemplarzach. Związki te mają obecnie stężenie 26,6 μM.
5. Ręcznie odpipetować 0,8 μl rozpuszczalnika do studzienek kontrolnych w dwóch egzemplarzach (tak samo jak w kroku 4.4).
6. Za pomocą mikropipety wielokanałowej wykonaj dwa seryjne rozcieńczenia 1:2 dla każdego związku i próbki rozpuszczalnika. Odrzucić ponad 15 μl po ostatnim seryjnym rozcieńczeniu. Wszystkie studzienki mają teraz 15 μL, a stężenia związków wynoszą 26,6 μM, 13,3 μM i 6,66 μM.
7. Używając dozownika odczynnika do mikropłytek z dużą kasetą, dozować 15 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w 4.1 do wszystkich kolumn (z wyjątkiem studzienek ślepych), rozcieńczając związki w stosunku 1:2. Wszystkie studzienki mają końcową objętość 30 μL, a każdy związek ma 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM.
8. Uszczelnij płytę za pomocą uszczelniacza do płyt, który umożliwia ciągłą wymianę gazową. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez mieszania w wilgotnej komorze przez 48 godzin.
9. Po 48 godzinach odczytaj luminescencję emitowaną przez bakterie na każdej płytce z czasem integracji 1 s za pomocą czytnika płytek.

5. Test infekcji

UWAGA: Mab jest wewnątrzkomórkowym patogenem fakultatywnym, więc aktywność przeciwdrobnoustrojowa hitów i toksyczność gospodarza muszą być określone w testach infekcji. W tym celu makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMM) zostały zakażone Mab i potraktowane trafieniami zwalidowanymi w kroku 4 w różnych stężeniach. Każdy test obejmował ślepą próbę (tylko woda), kontrole ujemne (zakażone makrofagi niepoddane działaniu substancji), kontrole pozytywne (zakażone makrofagi potraktowane skutecznym antybiotykiem), kontrole rozpuszczalnikowe (w tym przypadku DMSO) oraz związki do badania w trzech stężeniach - 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM (rysunek uzupełniający 4).

1. Wyprowadź makrofagi z mysiego szpiku kostnego dorosłych myszy typu dzikiego (BALB/c lub C57BL/6), jak opisano wcześniej¹⁵. Umieść komórki na 96-dołkowej, czarnej, optycznie przezroczystej płytce z płaskim dnem o wymiarach 2 x 10⁵ komórek/ml, 200 μl na studzienkę. Po 10 dniach różnicowania w temperaturze 37 °C, 7% CO₂¹⁵, komórki są gotowe do zakażenia i kontynuowania leczenia.
   UWAGA: Protokół uzyskiwania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego jest dobrze znany¹⁵; jednak ten protokół przesiewowy można dostosować do innych komórek, takich jak RAW 264.7, THP-1 i makrofagi pochodzące z PBMC.
2. Przygotować zawiesinę bakteryjną zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.3, dostosowując zawiesinę bakteryjną w pożywce do hodowli komórkowych dla zakażenia o wielokrotności infekcji (MOI) 1,
   UWAGA: Podczas pracy z kulturami Mab wymagana jest szafa bezpieczeństwa biologicznego.
3. Ostrożnie odessać uzupełnioną pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek za pomocą pompy próżniowej podłączonej do szklanej pipety. Ten krok należy wykonywać powoli i łatwo, aby zapobiec oderwaniu się komórek.
4. Ręcznie odpipetować 75 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 5.2 do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 7% CO₂ przez 4 godziny w inkubatorze komórkowym.
5. Przygotuj związki do leczenia komórkowego. Korzystając z dozownika odczynników do mikropłytek wyposażonego w małą kasetę, dozować do polipropylenu, okrągłego dna, 96-dołkowych płytek, 110 μl uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych do kolumn, w których będą znajdować się związki lub kontrola rozpuszczalnika (rysunek uzupełniający 4).
6. Za pomocą dozownika odczynnika do mikropłytek dozować dodatkowe 104 μl uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych do kolumn, w których będzie najwyższe stężenie związku lub rozpuszczalnika.
7. Ręcznie odpipetować 5,9 μl związków (1 mM w DMSO) lub rozpuszczalniku do wyznaczonych dołków (kolumny w kroku 5.6). Związki te mają obecnie stężenie 26,6 μM.
8. Za pomocą mikropipety wielokanałowej wykonaj dwa seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:2 dla każdego związku i rozpuszczalnika. Odrzucić ponad 110 μl po ostatnim seryjnym rozcieńczeniu. Wszystkie studzienki mają teraz 110 μL, a związki mają stężenie 26,6 μM, 13,3 μM i 6,66 μM.
9. Używając dozownika odczynnika do mikropłytek, dozować 110 μl uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych do wszystkich kolumn (z wyjątkiem studzienek ślepych). Wszystkie studzienki mają teraz 220 μl, a związki mają stężenie 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM.
10. Przygotować roztwór klarytromycyny (kontrola pozytywna) w stężeniu 2 μg/ml w pożywce z dodatkiem hodowli komórkowych.
11. Po 4 godzinach od kroku 5.4 za pomocą myjki do płytek przemyć 3x 200 μl roztworu do przemywania infekcji zainfekowaną płytkę 96-dołkową. Utrzymuj prędkości aspiracji i dozowania na jak najniższym, aby zapobiec odłączeniu komórek.
12. Po końcowej aspiracji przenieść 200 μl związków przygotowanych w krokach 5.5-5.9 na 96-dołkową płytkę zawierającą zakażone makrofagi.
13. Przenieść 200 μl uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych do studzienek niepoddanych działaniu środka. Przenieść 200 μl roztworu klarytromycyny przygotowanego w kroku 5.10 do odpowiednich studzienek.
14. Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, z 7% CO_{2 ,} przez 48 godzin.
15. Po 48 godzinach umyć zainfekowaną płytkę 96-dołkową za pomocą myjki do płytek z roztworem płuczącym związku (3x po 200 μl na studzienkę).
16. Za pomocą mikropipety wielokanałowej dozować 200 μl roztworu utrwalającego do wszystkich studzienek i pozostawić na 10 minut.
17. Po utrwaleniu, za pomocą myjki do płytek, przemyć komórki roztworem myjącym związków (3x po 200 μl na studzienkę).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Komórki mogą być przechowywane w roztworze płuczącym związki w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub tygodni, jeśli zapobiega się zanieczyszczeniu i wysuszeniu komórek. Roztwór myjący związków musi zostać zasysany przed etapem 5.18.
18. Za pomocą mikropipety wielokanałowej dozować 200 μl roztworu przepuszczalnego do wszystkich studzienek i pozostawić go na 15 minut. Za pomocą myjki do płytek odessać roztwór przepuszczalny.
19. Za pomocą mikropipety wielokanałowej ręcznie dozować 100 μl roztworu barwiącego i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
20. Za pomocą myjki do talerzy umyj płytki roztworem do mycia związków (3x po 200 μl na studzienkę). Na koniec pozostaw poplamione komórki w roztworze myjącym związków.
21. Przesiewaj płytki w systemie obrazowania o wysokiej zawartości z następującymi ustawieniami:
    Obiektyw: 20x Air/0,4NA (jedno zagłębienie na 96-mikropłytkowej płytce, 57 pól widzenia (FOV)
    Tryb: Ogniskowy
    Laser 405 nm dla DAPI (jąder)
    Laser 561 nm dla mScarlet (bakterii)
    Laser 640 nm do maski HCS Cell Deep Red (cytoplazma)
    Brak z-stack
    UWAGA: Komórki można obrazować za pomocą systemu obrazowania szerokokątnego, co zmniejsza rozdzielczość.
22. Skonfiguruj robota do obsługi sprzętu do akwizycji obrazu w nocy. To ramię robota wymienia płytki w systemie obrazowania o wysokiej zawartości bez interwencji człowieka.
    UWAGA: Nie jest to obowiązkowe; Płyty można wymieniać ręcznie.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania do analizy, które jest takie samo jak system obrazowania o wysokiej zawartości używany do pozyskiwania obrazów. Potok analizy musi zostać utworzony przy użyciu przykładowych obrazów (rysunek uzupełniający 5). Następnie zostanie on zastosowany do całego odwiertu (57 FOV) i zestawu danych (wszystkie płyty). Oprogramowanie analityczne postępuje zgodnie z logiczną sekwencją kroków, zaczynając od segmentacji różnych obszarów zainteresowania (jądra, cytoplazma, komórki i bakterie), odnosząc je (np. bakterie w komórkach), a następnie wyodrębniając właściwości morfologiczne i intensywności (np. obszar, intensywność). Poniżej opisano podstawowe etapy analizy obrazu. Pełny zastosowany protokół można znaleźć na rysunku uzupełniającym 5.

1. Segmentuj jądra za pomocą sygnału DAPI, cytoplazmę za pomocą sygnału DeepRed, a bakterie za pomocą sygnału mScarlet.
2. Powiąż jądra i segmentację cytoplazmy, aby stworzyć maskę dla komórek.
3. Usuń wszystkie obiekty obramowania. Pod uwagę będą brane tylko komórki, które wydają się być pełne w polu widzenia (całe komórki).
4. Zdefiniuj populację wyjściową bakterii w całych komórkach, odnosząc całe komórki i bakterie.
5. Zdefiniuj zainfekowane całe komórki jako posiadające więcej niż jeden region bakteryjny, a niezakażone całe komórki jako mające mniej niż jeden region bakteryjny.
6. Po podziale wszystkich obszarów zainteresowania na segmenty i utworzeniu populacji należy obliczyć i wyodrębnić ich właściwości. Dla każdego dołka wyodrębniane są następujące właściwości.
   1. Dla całych komórek/ Zakażone całe komórki/ Niezakażone całe komórki, ekstrakt
      Liczba komórek (suma na studzienkę)
      Powierzchnia [μm²] (średnia + odchylenie standardowe na studzienkę)
      Stosunek szerokości do długości komórki (średnia + odchylenie standardowe na studzienkę)
   2. W przypadku bakterii w całych komórkach ekstrakt
      Liczba zidentyfikowanych regionów bakteryjnych (suma na studzienkę)
      Intensywność (suma średniej intensywności na odwiert każdego regionu)
      Powierzchnia regionu (suma na odwiert)
7. Po wyeksportowaniu danych i uporządkowaniu ich w arkuszu kalkulacyjnym określ ilościowo obciążenie wewnątrzkomórkowe (Mycoload) zgodnie z następującym wzorem:
   

Wyniki

Z' ocena współczynnika
Rysunek 2 przedstawia dane z jednego z dwóch eksperymentów przeprowadzonych w celu obliczenia współczynnika Z'. Kontrolą dodatnią była klarytromycyna w stężeniu 4 μg/ml. W obu eksperymentach uzyskano współczynniki Z' wynoszące 0,64 i 0,62, co oznacza, że warunki i odczyt użyte w tym teście można zastosować do następnego testu przesiewowego (Z' > 0,5). Niemniej jednak współczynnik Z' został obliczony dla wszystkich pozostałych eksperymentów (test infekcji), aby kontrolować wydajność każdego eksperymentu.

Jako dowód koncepcji zaprojektowanego testu HTS, przetestowano bibliotekę związków przeznaczonych do zmiany przeznaczenia leków. Składa się z 1280 różnorodnych i małych cząsteczek, z których 95% to leki zatwierdzone przez FDA i EMA. Cząsteczki te oferują dużą różnorodność chemiczną i farmakologiczną.

Rysunek 2: Wyniki oceny współczynnika Z. Mab w dawce 2,5 x 10⁵ jtk/ml inkubowano z klarytromycyną i bez klarytromycyny w stężeniu 4 μg/ml przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia indywidualne wartości luminescencji leczonych i nieleczonych żywych prątków w jednym niezależnym eksperymencie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przegląd biblioteki pod kątem trafień
Wszystkie związki testowano w temperaturze 6,66 μM w stosunku do Mab. Ze względu na wielkość biblioteki, związki podzielono na cztery różne płytki mikromiareczkowe 384-dołkowe (Rysunek 3A-D). Wyniki zostały znormalizowane zarówno dla rozpuszczalnika, jak i zweryfikowanego efektu krawędzi.

W tym teście przesiewowym zidentyfikowano trzydzieści trzy trafienia, z których trzydzieści znacznie zmniejszyło emisję luminescencji, zmniejszając żywotność prątków (Rysunek 3). Co ciekawe, trzy związki prowadziły do wyższej emisji luminescencji, prawdopodobnie związanej ze zwiększonym metabolizmem lub proliferacją bakterii (Rysunek 3). Wszystkie 33 trafienia zostały poddane testowi walidacyjnemu, w tym trzy związki zwiększające luminescencję, w celu sprawdzenia, czy ten profil zostanie zachowany.

Rysunek 3: Wyniki badań przesiewowych biblioteki. (A-D) Mab przy 2,5 x 10⁵ CFUs/ml inkubowano z 1280 związkami w 6,66 μM przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykresy pokazują RLU z jednego niezależnego eksperymentu, przedstawione jako dowolne jednostki po normalizacji rozpuszczalnika i efektu krawędziowego. AVG RLU i odpowiadający mu SD zostały obliczone dla każdej płyty w celu określenia progu (w kolorze szarym; AVG ± 3SD). Okrągłe symbole reprezentują badany związek. Kolor niebieski oznacza, że każdy związek znajdujący się poza tym progiem jest uznawany za trafienie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Test walidacji trafień
Stężenia użyte w tym teście wynosiły 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM. Każdy związek został przetestowany w dwóch egzemplarzach w celu zwiększenia odporności.

Co ważne, związki 30, 31 i 32, wcześniej kojarzone z wyższym RLU (Rysunek 3A,C), zachowały ten profil, z ponad 200% żywotnością prątków osiągniętą w studzienkach traktowanych związkiem 32 (Rysunek 4).

Związki 20 i 33 zostały uznane za nieaktywne, ponieważ żywotność prątków jest bliska 100% we wszystkich badanych stężeniach (Rysunek 4).

Związki 9 i 21 wykazywały podobną nieaktywność przy dwóch najniższych stężeniach; jednakże, w przeciwieństwie do 20, pozostają aktywne przy najwyższym, 13,3 μM, przy czym związek 21 wykazuje wyższą moc (Rysunek 4).

Związek 3 również wykazuje brak aktywności przy najniższym stężeniu i spadek aktywności na poziomie 6,66 μM, choć mniejszy niż związek 21 (Rysunek 4). Jedynie w najniższym stężeniu związki 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 i 28 wykazywały mniejszy potencjał terapeutyczny. Jednak 2, 10 i 28 nadal prowadzą do <50% żywotności prątków.

Globalnie, pozostałe czternaście związków było aktywnych we wszystkich testowanych stężeniach.

Rysunek 4: Wyniki testu walidacyjnego trafień. Mab przy 2,5 x 10⁵ CFUs/ml inkubowano przy każdym wcześniej zidentyfikowanym trafieniu w temperaturze 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji zmierzono luminescencję w celu oceny żywotności prątków. Wykres przedstawia procentowy odsetek leczonych żywotnych prątków w stosunku do prątków nieleczonych w jednym niezależnym eksperymencie, przy czym każdy związek testowany jest w dwóch egzemplarzach. Okrągłe symbole reprezentują duplikaty dla każdego związku. Słupki reprezentują średnią tych duplikatów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Test infekcji
Spośród trzydziestu trzech badanych związków, dwadzieścia osiem wybrano do testu infekcji (Ryc. 4). Związki 7, 8, 9, 20 i 33 nie zostały wybrane do tego testu. Podczas gdy 9, 20 i 33 zostały pominięte z powodu ich braku aktywności podczas walidacji (Rysunek 4), pierwsze dwie zostały pominięte z przyczyn technicznych. Niemniej jednak związki te zostały zidentyfikowane jako ryfampicyna i linezolid, antybiotyki już stosowane w leczeniu zakażeń Mab¹². Wszystkie związki badane w teście infekcji zostały zidentyfikowane i są wymienione w tabeli 1. Aktywność przeciwdrobnoustrojową związków przeciwko makrofagom zakażonym Mab oceniono przy użyciu wewnętrznej fluorescencji bakterii jako odczytu.

związek	nazwa	związek	nazwa
1	Sulfatiazol	Rozdział 18	Cefuroksym
cyfra arabska	cyprofloksacyna	Rozdział 19	Rifaksymina
3	Cefotaksym	21	Cefdinir
4	Daunorubicyna	22 Rozdział 22	Klarytromycyna
5	Doksorubicyny	23	Bezyfloksacyna
6	Tiostrepton (Tiostrepton)	24	Lewofloksacyna
10	Amikacyna	25	Ryfabutyna
11	Moksalaktam	26	Gatifloksacyna
12	Sulfametyol	27 Rozdział 27	Epirubicyna
13	Sulfamonometoksyna	28	Ambonian pyrwinu
14	Cefoksytyna	29	Moksyfloksacyna
15	Nowobiocyna	Rozdział 30	Troleandomycyna
16	Cefmetazol	Rozdział 31	Linkomycyny
17	Roksytromycyna	Rozdział 32	Spiramycyna

Tabela 1: Lista związków testowanych w teście infekcji. Związki zwalidowane w kroku 4 zostały przetestowane w teście infekcji (krok 5).

Pierwszym ocenianym parametrem była toksyczność związków w stosunku do makrofagów zakażonych Mab. Próg ustalony dla uznania związku za toksyczny lub nietoksyczny wynosił 85% żywotnych makrofagów (Rysunek 5). Spośród dwudziestu ośmiu badanych związków, 4, 5, 6, 27 i 28 uznano za toksyczne. (Rysunek 5). W związku z tym te pięć związków zostało wykluczonych z następującej oceny aktywności wewnątrzmakrofagicznej.

Rysunek 5: Toksyczność hitów dla makrofagów zakażonych Mab. Myszy BALB/c BMM zostały zakażone Mab (MOI=1) i inkubowane z każdym wcześniej zidentyfikowanym trafieniem przy 13,3 μM, 6,66 μM i 3,3 μM (odpowiednio 1,3%, 0,7% i 0,3% DMSO) przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 7% CO₂. Komórki zobrazowano w przesiewowym mikroskopie fluorescencyjnym o wysokiej zawartości, wykorzystując liczbę jąder (barwionych DAPI) do pomiaru żywotności komórek. Wykres przedstawia odsetek żywotnych zakażonych makrofagów poddanych działaniu substancji w stosunku do żywotnych nieleczonych zakażonych makrofagów z dwóch niezależnych eksperymentów. Okrągłe symbole reprezentują żywotność komórki dla każdego testu. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby wywnioskować wewnątrzmakrofagiczną aktywność pozostałych dwudziestu trzech związków przeciwko wewnątrzkomórkowemu Mab (Rysunek 6), użyto wzoru Mycoload (wcześniej wyjaśnionego w kroku 6), aby uzyskać procent żywotności prątków znormalizowany do nieleczonych zakażonych makrofagów. Większość związków utraciła swój potencjał terapeutyczny przeciwko zinternalizowanym prątkom (Rysunek 6) w porównaniu z testem walidacji trafień (Rysunek 4), ponieważ liczba trafień zmniejszyła się z dwudziestu pięciu do sześciu przy najwyższym badanym stężeniu. Co uderzające, wszystkie trzy związki, które zwiększały żywotność planktonowego Mab w porównaniu z nieleczonymi bakteriami (30, 31 i 32; Rysunek 3 i Rysunek 4) wykazywały aktywność przeciwprątkową przeciwko wewnątrzkomórkowemu Mab, przy czym związki 30 i 32 wykazywały istotną różnicę statystyczną w porównaniu z DMSO, nawet przy 3,3 μM w przypadku związku 32 (Rysunek 6). Prątki traktowane związkami 11 i 23 wykazywały żywotność <50% przy 13,3 μM; jednak nie różniło się to znacząco od kontroli DMSO (Rysunek 6). Związki 21, 26 i 29 były wystarczająco silne przy 13,3 μM, aby uzasadnić znaczącą różnicę statystyczną, przy czym 29 było najbardziej aktywne (Ryc. 6). Wreszcie, związki 17, 22 i 25 były niezwykle silne we wszystkich testowanych stężeniach przeciwko zinternalizowanym prątkom. Zostały one zidentyfikowane odpowiednio jako roksytromycyna, klarytromycyna i ryfabutyna (Tabela 1). Spośród tych trzech związków, klarytromycyna była najbardziej aktywna przeciwko Mab, a żywotność prątków nigdy nie przekraczała 10%, prezentując wartość p <0,0001 we wszystkich badanych stężeniach w porównaniu z DMSO (Figura 6).

Rysunek 6: Wewnątrzmakrofagiczne działania hitów przeciwko makrofagom zakażonym Mab. Myszy BALB/c BMM zostały zakażone Mab (MOI = 1) i inkubowane z każdym wcześniej zidentyfikowanym trafieniem przy 13,3, 6,66 i 3,3 μM (odpowiednio 1,3, 0,7 i 0,3% DMSO) przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 7% CO₂. Komórki zobrazowano w przesiewowym mikroskopie fluorescencyjnym o wysokiej zawartości, a sygnał fluorescencyjny wykorzystano do obliczenia obciążenia Mycoload (patrz krok 6). Wykres przedstawia procenty obciążenia Mycoload znalezionego w leczonych zakażonych makrofagach w stosunku do nieleczonych zakażonych makrofagów w dwóch niezależnych eksperymentach. Statystyki przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunneta; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 w porównaniu do DMSO (kontrola rozpuszczalnika). Gwiazdki mają ten sam kod kolorystyczny dla każdego stężenia, co legenda wykresu. Okrągłe symbole reprezentują obciążenie Mycoload dla każdego testu. Słupki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Przykład układu płytki 384-dołkowej użytej w ocenie współczynnika Z'. Biały - puste studzienki (tylko płynne podłoże wzrostowe); żółty - kontrola pozytywna (bakterie leczone antybiotykiem); czerwony - kontrola negatywna (nieleczone bakterie). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Przykład układu płytek 384-dołkowych użytego w przeglądzie biblioteki. Biały - puste studzienki (tylko płynne podłoże wzrostowe); zielony - kontrola rozpuszczalnika; czerwony - kontrola negatywna (nieleczone bakterie); niebieski - związki do przesiewania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Przykład układu płytki 384-dołkowej używanej do walidacji trafień. Biały - puste studzienki (tylko płynne podłoże wzrostowe); zielony - kontrola rozpuszczalnika (w duplikatach); czerwony - kontrola negatywna (nieleczone bakterie); niebieski - związki do przesiewania (w dwóch egzemplarzach). Wyblakłe kolory reprezentują seryjne rozcieńczenia 1:2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Przykład układu płytki 96-dołkowej użytej do testu infekcji. Biały - puste studnie (woda zapobiegająca parowaniu); czerwony - kontrola negatywna (makrofagi niepoddane działaniu substancji); żółty - kontrola pozytywna (makrofagi leczone antybiotykiem); zielony - kontrola rozpuszczalnika; niebieski - związki do badania. Wyblakłe kolory reprezentują seryjne rozcieńczenia 1:2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Protokół analizy obrazu. W pracy tej wykorzystywany jest szczegółowy protokół analizy obrazu, który można dostosować do oprogramowania open-source. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje proces badań przesiewowych leków przeciwko Mab przy użyciu szczepów opracowanych we własnym zakresie ¹⁰. Korzystając z robotyki zajmującej się obsługą cieczy, zautomatyzowanej mikroskopii i analizy oraz podwójnych szczepów reporterowych, żywotność bakterii jest szybko oceniana za pomocą luminescencji lub fluorescencji bez dodawania odczynników lub wykonywania dodatkowych czynności. Takie podejście skraca czas i zmniejsza zmienność między testami, co jest istotną zaletą przy rozważaniu celu testów HTS.

Podczas badań przesiewowych tysięcy związków musi być łatwo zidentyfikowany skuteczny lek. W tym celu współczynnik Z' jest często używany do pomiaru statystycznej wielkości efektu, wnioskując o wydajności testu. Jeśli współczynnik Z' > 0,5, badane warunki są optymalne do rozróżnienia między populacjami leczonymi i nieleczonymi¹³. W testowanych warunkach uzyskano czynniki Z > 0,6 (ryc. 2), statystycznie udowadniając, że można je zastosować w kampanii przesiewowej. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skuteczności badań przesiewowych.

W związku z tym opracowano protokół HTS w celu wykrycia aktywności przeciwdrobnoustrojowej tysięcy związków przeciwko planktonicznemu wzrostowi Mab. Ponieważ Mab jest wewnątrzkomórkowym patogenem fakultatywnym, opracowany protokół monitoruje również wewnątrzkomórkową aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko temu samemu szczepowi bakteryjnemu - co jest kluczową zaletą. Ponadto można również ocenić toksyczność dla komórek gospodarza. W związku z tym opisano wieloetapowe podejście do badań przesiewowych leków przeciwko Mab, wykorzystujące różne konfiguracje eksperymentalne do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej wraz z cytotoksycznością, zwiększając szanse na sukces. Jako dowód słuszności koncepcji, przebadano bibliotekę chemiczną zawierającą 1280 związków.

Zidentyfikowano łącznie trzydzieści trzy trafienia (ryc. 3). Spośród nich trzy istotnie zwiększyły żywotność prątków w kulturach płynnych (związki 30, 31 i 32; Rysunek 3 i Rysunek 4). Należy zauważyć, że związki te mogą zakłócać emisję luminescencji bez wpływu na żywotność bakterii. W testach przeciwko zinternalizowanym prątkom, związki te wykazały aktywność przeciwdrobnoustrojową (ryc. 6), wykazując wyższą skuteczność przeciwko Mab po internalizacji komórek gospodarza. Związki te zidentyfikowano jako troleandomycynę (30), spiramycynę (32) i linkomycynę (31; Tabela 1). Dwa pierwsze to makrolidy, klasa antybiotyków stosowanych w leczeniu zakażeń prątkami¹⁶, a drugi to linkozamid, antybiotyk o mechanizmie działania podobnym do makrolidów¹⁷. Doniesiono, że Mab jest szczególnie oporny na inny linkozamid, klindamycynę, zarówno w kulturach płynnych, jak i stałych¹⁸. Niemniej jednak właściwości immunomodulujące i przeciwzapalne zostały związane z makrolidami^19,20 i linkozamidami²¹, co może wyjaśniać zwiększoną aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko zinternalizowanym prątkom (ryc. 6).

Z pozostałych trzydziestu trafień, jedenaście zmniejsza o >90% żywotność prątków we wszystkich stężeniach (ryc. 4). Biorąc pod uwagę, że typowy test HTS ma oczekiwany współczynnik trafień ~1%²², opracowany protokół jest zgodny z tym, co zwykle obserwujemy. Niemniej jednak kilka innych związków było nadal aktywnych, a dwadzieścia osiem z nich przeszło do testu infekcji.

Spośród zidentyfikowanych związków, pięć związków uznano za toksyczne (ryc. 5) - daunorubicyna (4), doksorubicyna (5), epirubicyna (27), tiostrepton (6) i amorian pyrwinu (28; Tabela 1). Pierwsze trzy to środki przeciwnowotworowe 23,24,25, więc nic dziwnego, że są toksyczne dla komórek ssaków użytych w tym teście. Ambonian pyrwinu był stosowany przez wiele lat jako skuteczny środek przeciwrobaczy; Jednak od 2004 r. wiąże się ją również z działaniami przeciwnowotworowymi²⁶. Wreszcie, tiostrepton jest oligopeptydem często stosowanym w medycynie weterynaryjnej, nigdy nie zatwierdzonym do stosowania u ludzi²⁷. Aktywność tego leku przeciwko komórkom raka piersi odnotowano²⁸. Aktywność wewnątrzmakrofagiczną tiostreptonu nie oceniano ze względu na jego toksyczność na makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (ryc. 5). Wykazano jednak, że tiostrepton jest skuteczny przy 5 μM na komórkach THP-1 zakażonych Mab²⁹. Zgłoszone wyniki przeciwko bakteriom planktonicznym²⁹ są podobne do tych uzyskanych w tym badaniu przesiewowym, przy czym tiostrepton jest niezwykle silny (ryc. 4).

Większość związków badanych pod kątem aktywności wewnątrzmakrofagicznej nie wykazywała potencjału terapeutycznego (ryc. 6). Wzrost wewnątrzkomórkowy bakterii znacznie różni się od kultur planktonowych. W tym ostatnim przypadku zawsze możliwy jest bezpośredni kontakt bakterii z lekami. W pierwszym przypadku, ze względu na internalizację przez komórki gospodarza, kilka błon gospodarza działa jak fizyczne bariery, które leki muszą transponować, aby dotrzeć do celu, co może pomóc wyjaśnić zmniejszoną aktywność przeciwdrobnoustrojową większości trafień. Przy najwyższym stężeniu, 13,3 μM, trzy związki wykazywały wystarczającą siłę, aby statystycznie różnić się od kontroli DMSO (ryc. 6) - cefdinir (21), gatifloksacyna (26) i moksyfloksacyna (29; Tabela 1). Podczas gdy moksyfloksacyna jest już stosowana jako lek przeciwgruźliczy drugiego rzutu¹⁶, cefdinir jest powszechnie stosowany w leczeniu kilku infekcji bakteryjnych dróg oddechowych, takich jak zapalenie płuc³⁰. Jednak jego aktywność przeciwko M. tuberculosis³¹ i Mab została opisana, wykazując silne działanie synergistyczne z karbapenemym przeciwko temu ostatniemu³². Gatifloksacyna jest fluorochinolonem, a jej aktywność została zgłoszona przeciwko kilku prątkom w ciągu ostatnich ^33,34. Trzy najbardziej aktywne związki w tym teście (ryc. 6) to roksytromycyna (17), klarytromycyna (22) i ryfabutyna (25; Tabela 1), które są niezwykle silne we wszystkich stężeniach. Pierwsze dwie to makrolidy, podczas gdy ryfabutyna jest ryfamycyną, przy czym obie klasy służą jako podstawa leczenia wielu zakażeń prątkami¹⁶.

To badanie przesiewowe opiera się na specjalnym i drogim sprzęcie do obsługi cieczy w celu zmniejszenia zmienności między testami. Pomimo tego, że jest niezwykle powtarzalny, płyn nie posiada bezdotykowego transferu związków, takiego jak akustyczny. W ten sposób niektóre przylegające związki mogą pozostać przyczepione do metalowych kołków między transferami, przenosząc się do kolejnych studzienek, co skutkuje fałszywie dodatnimi wynikami podczas fazy przesiewowej - tak właśnie stało się w przypadku związku 33. Właśnie dlatego walidacja badań przesiewowych ma tak kluczowe znaczenie dla ich powodzenia, zapewniając, że żadne wyniki fałszywie dodatnie nie przejdą do kolejnych etapów badań przesiewowych leków. Test infekcji wykorzystuje system obrazowania o wysokiej zawartości z trybem konfokalnym, aby uzyskać najlepszą możliwą definicję regionów bakteryjnych. Niemniej jednak nadal można go używać bez trybu konfokalnego, choć przy utracie definicji i prawdopodobnie utrudnia identyfikację regionów bakteryjnych. Protokół ten wykorzystuje proste i przyjazne dla użytkownika oprogramowanie analityczne zintegrowane z systemem obrazowania; jednak oprogramowanie typu open source może być używane zgodnie z protokołem (rysunek uzupełniający 5). Ostatecznie, pomimo tego, że nie zmienia się przeznaczenia leków w leczeniu zakażeń MAB, wyniki te są niezwykle ważne, ponieważ potwierdzają ustalony protokół, który można rozszerzyć na większe biblioteki. Co ważne, uważamy, że protokół ten można dostosować do dowolnych bakterii, pod warunkiem, że dostępne są odczyty fluorescencyjne lub luminescencyjne. W ten sposób prace te wnoszą znaczący wkład w dziedzinę odkrywania leków, dostarczając niezbędnych narzędzi do walki z jednym z największych problemów zdrowia publicznego – bakteriami opornymi na antybiotyki – a w szczególności z prawie nieuleczalnym patogenem – Mycobacterium abscessus.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% neutralna buforowana formalina	Bio Optica	05-01005Q	roztwór utrwalający
384-dołkowa okrągłodenna mikropłytka polipropylenowa niepoddana obróbce	Corning	3658	Można użyć białych mikropłytek; można użyć polistyrenu
50 TS Myjka	BioTek
Membrana uszczelniająca Breathe-Easy	Sigma-Aldrich	Z380059-1PAK
:: explorer	Revvity		equipment handling robot
Clarithromycin	Sigma-Aldrich	A3487-100MG	Rozpuszczony w DMSO do pożądanego stężenia
DMSO	Fisher Scientific	D/4121/PB15	Rozcieńczyć w płynnym podłożu wzrostowym do pożądanego stężenia
Harmony 5.1	Oprogramowanie do analizy	Revvity
Heracell VIOS 160i CO2 Inkubator, 165 L	Thermo Scientific		inkubator komórkowy
JANUS z 4 ramieniem końcówkowym i ramieniem MDT Ładowarka	do cieczy	Revvity
KB 8182	Inkubator Termaks		z mieszadłem
Libra S4+	Biochrom
Multidrop  Dozownik odczynników Combi	System
Opera Phenix Plus	Revvity
PhenoPlate	Revvity	6055302	Niezbędny do mikroskopów o wysokiej zawartości
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS) 1x	myjący	NA NA
Biblioteki chemiczne Prestwick			Komercyjna biblioteka chemiczna przeznaczona do zmiany przeznaczenia leków
Inkubator wstrząsający 3031	GFL
VICTOR Nivo	Revvity
Pożywka do hodowli komórkowych:			W razie potrzeby dodać 10% suplementu
DMEM	Gibco	10938-025
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biowest	S1810
Roztwór buforowy HEPES (1 M)	Gibco	15630-056
LCCM	NA		NA Kondycjonowane podłoże z linii komórkowej L929, które uwalnia czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF); suplement pożywki do hodowli komórkowych
L-glutamina (200 mM)	Thermo Scientific	25030024
Pirogronian sodu 100 mM (100X)	Gibco	11360-039
Infection roztwór do mycia
Woda			Dostępnych jest wielu dostawców
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Gibco	14060-040	Rozcieńczyć do 1x z wodą apirogenną
Roztwór przepuszczalny			PBS z 0,1% Triton X100
PBS 1x	NA	NA
Triton X100	Sigma-Aldrich	T8787	Inni dostępni dostawcy
Roztwór barwiący			PBS z DAPI (500 ng/mL) i HCS Far Red (10 ng/mL)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
HCS Far Red	Invitrogen	H32721
PBS 1x	NA	NA	Dostępnych jest wielu dostawców
Płynna pożywka wzrostowa			W razie potrzeby dodaj 10% suplementu
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310
Tween80	Sigma-Aldrich	P4780	0,05% stężenia końcowego. Inni dostępni dostawcy
< silny> płynny suplement pożywki: < / strong>
Albumina surowicy bydlęcej	Fisher Scientific	BP9702-100
D-glukoza bezwodna	Fisher Scientific	G/0450/60