Artykuł metodologiczny

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66863

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Radiology, University of Washington, 3Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Streszczenie

Obwodowe komórki jednojądrzaste (PBMC) wykazują silne zmiany w zdolności oddechowej mitochondriów w odpowiedzi na zdrowie i chorobę. Chociaż zmiany te nie zawsze odzwierciedlają to, co dzieje się w innych tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe, komórki te są dostępnym i cennym źródłem żywotnych mitochondriów od ludzi. PBMC są narażone na sygnały ogólnoustrojowe, które wpływają na ich stan bioenergetyczny. Tak więc rozszerzenie naszych narzędzi do badania metabolizmu mitochondrialnego w tej populacji wyjaśni mechanizmy związane z postępem choroby. Testy funkcjonalne mitochondriów są często ograniczone do wykorzystania danych wyjściowych oddechowych zgodnie z maksymalnymi stężeniami substratu, inhibitora i rozprzęgacza w celu określenia pełnego zakresu wydolności oddechowej, która może być nieosiągalna in vivo. Konwersja difosforanu adenozyny (ADP) do trifosforanu adenozyny (ATP) przez syntazę ATP powoduje zmniejszenie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i wzrost zużycia tlenu. Aby zapewnić bardziej zintegrowaną analizę dynamiki mitochondriów, w artykule opisano zastosowanie fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru jednoczesnej reakcji zużycia tlenu i potencjału błony mitochondrialnej (mMP) na fizjologicznie istotne stężenia ADP. Technika ta wykorzystuje metylester tetrametylorodaminy (TMRM) do pomiaru polaryzacji mMP w odpowiedzi na miareczkowanie ADP po maksymalnej hiperpolaryzacji z substratami kompleksu I i II. Technika ta może być wykorzystana do ilościowego określenia, w jaki sposób zmiany stanu zdrowia, takie jak starzenie się i choroby metaboliczne, wpływają na wrażliwość odpowiedzi mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w PBMC, limfocytach T i monocytach od ludzi.

Wprowadzenie

Zdolność komórki do funkcjonowania i przetrwania w okresie stresu fizjologicznego jest w dużej mierze zależna od jej zdolności do zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego na przywrócenie homeostazy1,2. Zapotrzebowanie na energię wzrasta w odpowiedzi na różne bodźce. Na przykład zwiększony skurcz mięśni podczas ćwiczeń zwiększa wykorzystanie ATP i glukozy przez mięśnie szkieletowe, a wzrost syntezy białek po infekcji zwiększa wykorzystanie ATP przez komórki odpornościowe do produkcji i proliferacji cytokin3,4,5,6. Gwałtowny wzrost zapotrzebowania na energię uruchamia szereg procesów bioenergetycznych w celu przywrócenia stosunku ATP/ADP. W miarę zużywania ATP, poziom ADP wzrasta i stymuluje syntazę ATP F1F0 (kompleks V), która wymaga siły protonowej, aby napędzać jej mechaniczną rotację i katalityczną konwersję ADP do ATP w mitochondrium7. Siła protonowa to gradient elektrochemiczny powstały w wyniku pompowania protonów podczas przenoszenia elektronów z substratów do tlenu przez system transportu elektronów (ETS) w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Wynikająca z tego różnica w stężeniu protonów (delta pH) i potencjale elektrycznym (potencjał błonowy) tworzy siłę protonową, która napędza syntezę ATP i zużycie tlenu w odpowiedzi na zapotrzebowanie na energię, zmniejszając stosunek ATP/ADP lub podnosząc poziom ADP. Powinowactwo mitochondriów do ADP można określić przez obliczenie Km lub EC50 oddychania stymulowanego ADP izolowanych mitochondriów lub komórek przepuszczalnych8,9. Metoda ta wykazała, że przepuszczalne włókna mięśniowe starszych ludzi wymagają większego stężenia ADP, aby stymulować 50% ich maksymalnej zdolności fosforylacji oksydacyjnej niż u młodszych osobników9. Podobnie, starzejące się mięśnie szkieletowe myszy wymagają więcej ADP, aby obniżyć produkcję mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS)10,11. Dodatkowo, wrażliwość ADP jest zmniejszona w przepuszczalnych włóknach mięśniowych myszy z otyłością wywołaną dietą w porównaniu z grupą kontrolną i jest zwiększona w obecności insuliny i po spożyciu azotanów12,13. Tak więc zdolność mitochondriów do reagowania na zapotrzebowanie na energię różni się w różnych warunkach fizjologicznych, ale nie było to wcześniej badane w kontekście komórek odpornościowych.

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMCs) są powszechnie używane do badania bioenergetyki komórkowej u ludzi14,15,16,17,18,19,20. Wynika to w dużej mierze z tego, że komórki są łatwo dostępne z nieskrzepłych próbek krwi w badaniach klinicznych, wrażliwości komórek na zaburzenia metaboliczne oraz metod opracowanych przez różne grupy do badania metabolizmu mitochondriów za pomocą inhibitorów i rozprzęgaczy w celu określenia maksymalnej i minimalnej zdolności oddychania mitochondrialnego21,22. Metody te doprowadziły do docenienia roli bioenergetyki w starzeniu się, chorobach metabolicznych i funkcjonowaniu układu odpornościowego14,20,23,24. Mitochondrialna wydolność oddechowa jest często zmniejszona w mięśniach szkieletowych i PBMC w warunkach niewydolności serca18,25. Bioenergetyka PBMC jest również skorelowana z kardiometabolicznymi czynnikami ryzyka u zdrowych osób dorosłych17 i reaguje na leczenie, takie jak rybozyd nikotynamidu18. PBMC obejmują neutrofile, limfocyty (limfocyty B i limfocyty T), monocyty, komórki NK i komórki dendrytyczne, które przyczyniają się do pojemności mitochondriów PBMC26,27,28. Ponadto bioenergetyka komórkowa odgrywa kluczową rolę w aktywacji, proliferacji i odnowie komórek odpornościowych23. Jednak ograniczeniem tych metod jest to, że komórki nie funkcjonują w fizjologicznym zakresie substratów. W związku z tym potrzebne są dodatkowe metody badania funkcji mitochondriów w stężeniach substratów, które są bardziej istotne dla tego, czego komórki doświadczają in vivo.

Potencjał błony mitochondrialnej (mMP) jest głównym składnikiem siły protonmotywnej i jest niezbędny dla różnych procesów mitochondrialnych poza produkcją ATP, takich jak regulacja przepływu oddechowego, produkcja reaktywnych form tlenu, import białek i jonów, autofagia i apoptoza. mMP może być oceniany za pomocą sond elektrochemicznych lub barwników fluorescencyjnych wrażliwych na zmiany polaryzacji błony, takich jak JC-1, Rhod123, DiOC6, tetrametylo rodamina (TMRE) lub ester metylowy (TMRM) i safranina. Dwa ostatnie to lipofilowe barwniki kationowe, które są z powodzeniem stosowane we fluorespirometrii homogenów tkanek o wysokiej rozdzielczości, izolowanych mitochondriów i tkanek przepuszczalnych11,29,30,31,32,33. W tej technice TMRM jest stosowany w trybie wygaszania, w którym komórki są wystawione na działanie wysokiego stężenia TMRM, które gromadzi się w macierzy mitochondrialnej po polaryzacji (wysoka siła mMP i protonmotive), co powoduje wygaszenie cytozolowej fluorescencji TMRM. Kiedy mitochondria ulegają depolaryzacji w odpowiedzi na ADP lub rozprzęgacze, barwnik jest uwalniany z matrycy, zwiększając sygnał fluorescencyjny TMRM34,35. Celem tej metody jest jednoczesny pomiar zmian w oddychaniu mitochondrialnym i mMP w odpowiedzi na miareczkowanie ADP w PBMC pochodzenia ludzkiego, krążących monocytach i limfocytach T, a także może być stosowana do mysich limfocytów T śledziony.

Protokół

Pobranie próbek krwi na potrzeby opracowania danych i metod przedstawionych w niniejszej pracy zostało zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną (Internal Review Board) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Reprezentatywne wyniki obejmują również dane uzyskane od samców myszy C57BL/6J (w wieku 5–7 miesięcy) zakupionych w Jackson Laboratories. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Biuro Dobrostanu Zwierząt (Office of Animal Welfare) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Przegląd protokołu przedstawiono na rysunku Rysunek 1Przygotowanie odczynników do niniejszego protokołu znajduje się w Plik uzupełniający 1.

Separacja komórek krwi, wysokorozdzielcza fluororespirometria, kalibracja TMRM, protokół SUIT, analiza.
Rycina 1: Przegląd protokołu. Schemat postępowania z wykorzystaniem wysokorozdzielczej fluororespirometrii w celu oceny zmian potencjału błony mitochondrialnej w izolowanych monocytach (CD14+) i limfocytach T (CD3+) z próbek świeżej krwi ludzkiej. Skróty: TMRM, ester metylowy tetrametylorodaminy; SUIT, miareczkowanie substratami, odsprzęgaczem i inhibitorem; ADP, adenozynodifosforan; Dig, digitonina; Mal, jabłczan; Pyr, pirogronian; Glut, glutaminian; D1-10, 10 następujących po sobie miareczkowań ADP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Oddzielenie warstwy leukocytowej (buffy coat) od krwi pełnej

UWAGA: Metoda izolacji komórek została zmodyfikowana na podstawie pracy Kramer i wsp.27.

  1. Pozostawć medium RPMI, gradient gęstości oraz wirówkę do osiągnięcia temperatury pokojowej. Przed rozpoczęciem pracy wysterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza oraz materiały.
  2. Pobrać krew żylną do trzech probówek 10 mL z K2EDTA. Odwrócić probówki co najmniej 3 razy.
  3. Wirować probówki przy 500 x g przez 10 min (22 °C, przyspieszenie [acc] 9, hamowanie [dec] 2).
  4. Odebrać 1 mL osocza z każdej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.
  5. Przenieść osocze oraz połowę warstwy erytrocytów z każdej probówki do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać medium RPMI do oznacznika 40 mL. Odwrócić probówkę co najmniej 3 razy.
  6. Powoli nalać 10 mL roztworu osocza do czterech probówek stożkowych 15 mL zawierających 3 mL gradientu gęstości.
  7. Wirować przy 700 x g przez 30 min (22 °C, 5 acc, 2 dec).
  8. zebrać całe osocze oraz warstwę leukocytarną (buffy coat) zawierającą mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs), uważając, aby nie naruszyć warstwy erytrocytów.
  9. Wirować przy 500 x g przez 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec) i odessać nadsącz.
  10. Przemyć osad PBMC 1-2 razy, resuspensując go w 10 mL medium RPMI i wirując przy 500 x g przez 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec).

2. Separacja magnetyczna komórek CD14+ i CD3+

  1. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora magnetycznego komórek (patrz Tabela materiałów). Przemyj kolumnę 3 mL RP-5.
  2. Resuspenduj osad PBMC w 80 µL RP-5 i 20 µL mikrokulek anty-CD14 (patrz Tabela materiałów). Inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  3. Resuspenduj komórki w 1 mL RP-5 i nałóż zawiesinę na kolumnę. Zbierz nieoznaczone komórki, które przepłynęły przez kolumnę, do probówki stożkowej 15 mL oznaczonej jako „Flow-through 1”. Odczekaj, aż cała zawiesina komórek przepłynie przez kolumnę, a następnie kontynuuj płukanie 3 mL RP-5 (3x), zbierając cały przesącz.
  4. Ostrożnie wyjmij kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej probówce stożkowej 15 mL. Dodaj 5 mL RP-5 i natychmiast użyj tłoka, aby wypłukać zawartość kolumny do probówki zbiorczej oznaczonej jako „CD14+”.
  5. Odwiruj „Flow-through 1” przy 500 x g przez 10 min (22 °C, przyspieszenie 5, hamowanie 5) i odessij supernatant.
  6. Używając komórek z Flow-through 1, powtórz kroki 2.2-2.5, stosując mikrokulki anty-CD3 (patrz Tabela materiałów), aby wyizolować limfocyty T.
  7. Odwiruj probówki zawierające limfocyty T (CD3+) i monocyty (CD14+) przy 300 x g przez 5 min. Odessij supernatant i resuspenduj osad w 1 mL RP-5.
  8. Wyznacz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Komórki można policzyć, dodając 10 µL rozcieńczenia komórek 1:10 lub 1:20 do hemocytometru. W celu policzenia komórek za pomocą hemocytometru można odnieść się do wcześniej opublikowanych protokołów36.
  9. Pipetuj 2,5 miliona monocytów lub 5 milionów limfocytów T do nowej probówki do wirowania. Wiruj przez 30 s przy 2000 x g, odessij supernatant i resuspenduj komórki w MiR05 do całkowitej objętości 20 µL i końcowego stężenia 125 milionów monocytów lub 250 milionów limfocytów T na mL.
    UWAGA: Końcowe stężenie wybrano tak, aby w objętości 20 µL wstrzyknąć 2,5 miliona monocytów lub 5 milionów limfocytów T. Metodą tą testowano również limfocyty T myszy wyizolowane ze śledziony. Procedura znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.

3. Fluorespirometria wysokiej rozdzielczości – kalibracja fluorescencji tlenu i TMRM

UWAGA: Metoda ta została opracowana na podstawie wcześniejszych prac nad przepuszczalnymi włóknami przeprowadzonych przez Pharaoh i wsp.11. W trybie wygaszania (quench mode) stosuje się wysoką, niehamującą stężenie TMRM, w którym zależność między mMP a stężeniem TMRM w macierzy jest odwrócona. W związku z tym spadek mMP prowadzi do uwolnienia barwnika TMRM z macierzy i wzrostu fluorescencji32.

  1. Zainstaluj komory o pojemności 0,5 ml w respirometrze O2K zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Lista materiałów). Włącz urządzenie i podłącz je do oprogramowania producenta służącego do akwizycji danych.
  2. Ustaw temperaturę na 37 °C oraz prędkość mieszania do 750 obr./min.
  3. Przemyj komory wodą destylowaną (3x). Zastąp wodę 0,54 ml buforu Mir05, całkowicie zamknij korki i usuń nadmiar buforu za pomocą zintegrowanego systemu ssącego (ISS). Podnieś korki za pomocą dystansera, aby umożliwić wyrównanie poziomu tlenu w komorach z tlenem z powietrza zewnętrznego.
  4. Po ustabilizowaniu się przepływu tlenu należy przeprowadzić kalibrację tlenem z powietrza (R1) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Może to zająć >30 min na stabilizację strumienia tlenu. Czujniki tlenu wymagają wyznaczenia punktu zerowego tlenu (R0) oraz tła strumienia tlenu z 50-200 µM z oddzielnych doświadczeń z wykorzystaniem miareczkowania ditionianem. Szczegółowe metody można znaleźć w instrukcji producenta.
  5. Uszczelnij komorę, zamykając korki.
    UWAGA: W przeciwieństwie do eksperymentów z wykorzystaniem przepuszczalnych włókien, komory nie wymagają hiperoksygenacji w przypadku PBMC. Uszczelnienie komory po kalibracji R1 zapewnia wystarczającą ilość tlenu na potrzeby eksperymentu. Poziom tlenu powinien zostać utrzymany w przedziale 50-250 µMJeśli stężenie tlenu spadnie poniżej wartości progowej, komorę można częściowo otworzyć, aby tlen w komorze mógł wyrównać się z poziomem tlenu w powietrzu w pomieszczeniu.
  6. Kalibracja TMRM
    1. Użyj zielonych czujników fluorescencyjnych LED (ex. 525 nm) z zestawem filtrów AmR (patrz Tabela materiałów). Ustaw fluorometr Wzmocnienie do 1000 i Intensywność do 1000Włącz czujniki fluorescencyjne i rozpocznij rejestrację linii bazowej.
    2. Wstrzyknąć 2.5 µL 0,05 mM TMRM i poczekać na stabilizację sygnału (~2 min) przed kolejnym 2.5 µL wstrzykiwanie do momentu wykonania łącznie 4 wstrzykiwań, aby uzyskać całkowite stężenie TMRM wynoszące 1 µM TMRM w komorze. Do wszystkich iniekcji należy używać strzykawki Hamiltona.
    3. Zkalibruj czujnik fluorescencji, wybierając sygnał fluorescencyjny (napięcie) dla każdego wtrysku odpowiadający wartościom 0, 0,25, 0,5, 0,75 oraz 1.0 µM TMRM do pięciopunktowej kalibracji.

4. Protokół miareczkowania substrat-odsprzęgacz-inhibitor (SUIT)

UWAGA: Należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne (blank), w których do komory wstrzykuje się 20 µL Mir05 zamiast 20 µL zawiesiny komórkowej, ponieważ sygnał TMRM zmienia się w odpowiedzi na same wstrzyknięcia (omówiono to w wynikach reprezentatywnych). Przed kolejnym wstrzyknięciem, zarówno w eksperymentach kontrolnych, jak i z próbkami, należy odczekać do ustabilizowania się sygnału strumienia tlenu (około 2-3 min). Poniższy protokół miareczkowania oraz oczekiwane obserwacje znajdują się w Tabeli 1.

  1. Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako „pre-cell”.
  2. Wstrzyknij ok. 20 µL zawiesiny komórkowej zawierającej 5 milionów limfocytów T lub 2,5 miliona monocytów i mierz przez około 10 min. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako „Cell”.
  3. Przeprowadź permeabilizację komórek, wstrzykując 2 µL digitonininy o stężeniu 1 mg/mL (stężenie końcowe: 4 µg/mL). Odczekaj 20 min. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako „Dig”.
    UWAGA: Zaleca się optymalizację stężenia digitonininy w oddzielnych eksperymentach.
  4. Dodaj 2,5 µL bursztynianu 1 M (stężenie końcowe: 5 mM). Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako „SUCC”.
  5. Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, dodaj 5 µL jabłczanu 100 mM (stężenie końcowe: 1,0 mM), 5 µL glutaminianu 1 M (stężenie końcowe: 10 mM) oraz 5 µL pirogronianu 500 mM (stężenie końcowe: 5 mM). Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako „MPG”.
  6. Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, przeprowadź miareczkowanie ADP. Wybierz wartości szybkości dla każdej miareczki i oznacz je kolejno od „D1” do „D10”, zależnie od liczby miareczkowania. Skorzystaj ze schematu miareczkowania przedstawionego w Tabeli 2.
  7. Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, wykonaj serię miareczkowań po 1 µL carbonyl cyanide p-(tri-fluromethoxy) phenyl-hydrazone (FCCP) o stężeniu 0,25 mM, aż sygnał fluorescencyjny osiągnie maksimum. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM reprezentujący minimalny potencjał błonowy jako „FCCP”.
    UWAGA: Do zniesienia potencjału błony mitochondrialnej zazwyczaj wymagane jest stężenie FCCP rzędu 0,5-1,0 µM.
    OSTROŻNIE: FCCP jest toksyczny. W celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z odczynnikiem zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji (SDS).
  8. OPCJONALNIE: Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, wstrzyknij 1 µL rotenonu 0,25 mM, aby zablokować kompleks I i określić wydolność oddechową poprzez kompleks II.
    UWAGA: Zmiany potencjału błonowego nie są już istotne po miareczkowaniu odsprzęgaczem.
    OSTROŻNIE: Rotenon jest toksyczny. W celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z odczynnikiem zapoznaj się z SDS.
  9. Gdy strumień tlenu stanie się stabilny, wstrzyknij 1 µL Antymycyny A o stężeniu 1,25 mM (stężenie końcowe: 2,5 µM), aby zahamować oddychanie mitochondrialne.
    OSTROŻNIE: Antymycyna A jest toksyczna. W celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z odczynnikiem zapoznaj się z SDS.

5. Obliczanie i analiza potencjału błony mitochondrialnej

  1. Wykorzystując eksperymenty z próbką ślepą, zarejestruj skalibrowane wartości TMRM (mikromolarna TMRM) przed wstrzyknięciem próbki ślepej („przed próbką”) oraz dla każdego z wstrzyknięć. Patrz Rysunek 2.
  2. Dla każdego eksperymentu z próbką ślepą oblicz stosunek tła, przyjmując koncentrację TMRM „przed próbką” za 1,0. Oblicz następujący proporcjonalny spadek TMRM. Oblicz średni stosunek tła ze wszystkich eksperymentów z próbką ślepą.
    UWAGA: Liczba eksperymentów z próbką ślepą do uwzględnienia może zależeć od precyzji instrumentu. Patrz przykład obliczeń w Tabeli 3 z pięciu różnych eksperymentów z próbką ślepą, gdzie odchylenie standardowe średniego stosunku tła mieściło się w zakresie od 0 do 0,016 dla każdego miareczkowania.
  3. Obliczanie tła: Oblicz tło dla każdego eksperymentu z próbką, mnożąc wartość TMRM „przed próbką” z eksperymentu z próbką przez średni stosunek tła dla każdego wstrzyknięcia. Patrz przykład obliczeń w Tabeli 3.
  4. Korekcja tła: Odejmij tło eksperymentu od zmierzonych wartości TMRM próbki. Patrz przykład obliczeń w Tabeli 4.
  5. Korekcja FCCP: Odejmij mMP po korekcie tła dla FCCP od każdego wstrzyknięcia. Patrz przykład obliczeń w Tabeli 4.
  6. Krzywa wrażliwości na ADP: Znormalizuj spadek mMP indukowany przez ADP, przyjmując najwyższy i najniższy potencjał błonowy odpowiednio jako 100% i 0%, wykorzystując wartości mMP zebrane podczas całego miareczkowania ADP. Dopasuj dane do nieliniowego modelu regresji za pomocą preferowanego oprogramowania statystycznego, aby obliczyć połowiczną maksymalną stężenie hamujące (IC50) ADP dla mMP.
    UWAGA: Krzywa odpowiada modelowi [Inhibitor] vs. normalized response - Variable slope w programie Prism.

Analiza potencjału błony mitochondrialnej; wykresy wyników sześciostopniowego testu TMRM; ocena polaryzacji.
Rysunek 2: Obliczanie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i wrażliwości na ADP na podstawie fluorescencji TMRM. Kroki obliczania potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i wrażliwości na ADP z pomiarów fluorescencji TMRM za pomocą wysokorozdzielczej fluorespirometrii jednej próbki limfocytów T (n = 1). Krok 1: Fluorescencję TMRM mierzy się w próbkach ślepych analogicznie jak w próbce biologicznej. Krok 2: Wyznaczenie stosunku sygnału TMRM dla każdego miareczkowania w odniesieniu do sygnału sprzed dodania próbki dla każdego eksperymentu z próbką ślepą. Obliczenie średniej dla każdego miareczkowania wszystkich eksperymentów z próbkami ślepymi. Krok 3: Obliczenie tła dla każdego eksperymentu z próbką poprzez pomnożenie fluorescencji „sprzed próbki” przez średni stosunek tła dla każdego miareczkowania. Krok 4: Obliczenie różnicy między fluorescencją tła a fluorescencją TMRM próbki dla każdego miareczkowania, aby przedstawić dane jako mMP lub mitochondrialne pobieranie TMRM. Krok 5: Korekta mMP tak, aby pełne rozprzęganie za pomocą FCCP odzwierciedlało wartość zero mMP. Krok 6: Przeprowadzenie regresji nieliniowej w celu przedstawienia zmian mMP wraz ze wzrostem stężeń ADP. Pomiary przeprowadzono w komorach o pojemności 0,5 mL, z czego jedna zawierała 5 milionów limfocytów T od zdrowego ochotnika. Dane uśrednione przedstawiono jako średnia ± SEM. Pojedyncze punkty danych z jednego powtórzenia przedstawiono bez słupków błędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Aby zilustrować różnice w optymalnym stężeniu komórek dla tego testu, 5 milionów limfocytów T wprowadzono do jednej komory 0,5 mL (10 milionów komórek/mL), a 1,25 miliona komórek wprowadzono do drugiej komory (2,5 miliona komórek/mL) zawierającej 1 µM TMRM (Rycyna 3A-G). Przeprowadzono również trzy eksperymenty kontrolne (blanki) w celu obliczenia tła TMRM. Stwierdzono, że wyższe stężenie limfocytów T skutkuje wyraźniejszą zmianą fluorescencji TMRM w stosunku do tła (Rycyna 3B,D). Ponadto wyższe stężenie komórek pozwoliło wykryć oczekiwany wzrost zużycia tlenu i jednoczesny spadek mMP w odpowiedzi na dodanie FCCP (Rycyna 3E,F). Zastosowanie niskiego stężenia komórek spowodowało słabą zmianę fluorescencji, zbliżoną do tła. Ponieważ obliczanie mMP polega na odjęciu tła od sygnału, niskie stężenie komórek nie pozwala na określenie zmian mMP w odpowiedzi na substraty i odsprzęgacze. Poza stosowaniem wyższych stężeń komórek w tym teście, zalecamy utrzymywanie stałego stężenia komórek dla każdego typu komórek pomiędzy eksperymentami.

Aby zweryfikować wpływ syntazy ATP na rozproszenie mMP podczas miareczkowania ADP, przeprowadziliśmy równoległe eksperymenty na PBMC i limfocytach T, w których jedna komora otrzymała oligomycynę przed miareczkowaniem ADP (Rycina 4). Nie stwierdzono rozproszenia mMP w odpowiedzi na ADP w komórkach traktowanych oligomycyną, co sugeruje, że stopniowy spadek mMP indukowany przez ADP jest wynikiem strumienia protonów przez syntazę ATP (Rycina 4A-F). Porównaliśmy również wrażliwość na ADP pomiędzy limfocytami T a PBMC tego samego uczestnika i stwierdzono, że wrażliwość na ADP była niższa (wyższa EC50) w frakcji limfocytów T (Rycina 4G,H).

Przeprowadziliśmy serię eksperymentów kontrolnych, aby określić wpływ czasu lub protokołu SUIT na fluorescencję TMRM. Stwierdziliśmy, że sygnał TMRM w eksperymentach kontrolnych jest w głównej mierze zależny od miareczkowania SUIT (Rysunek 5A), a nie od czasu przeprowadzenia miareczkowania (Rysunek 5B).

Porównaliśmy zmiany tempa zużycia tlenu (OCR) i mMP indukowane przez ADP w limfocytach T i monocytach pochodzących od 11 zdrowych ochotników z populacji ogólnej (Rysunek 6A-H). Podobnie jak w wynikach wcześniej opublikowanych eksperymentów z wykorzystaniem pomiarów przepływu zewnątrzkomórkowego i testów enzymatycznych, monocyty wykazywały większą wydolność oddechową mitochondriów niż limfocyty26,27 (Rysunek 6A,H). Jednak w żadnym z typów komórek nie stwierdzono typowego wzrostu OCR w odpowiedzi na dawkę ADP (Rysunek 6C,D), co jest sprzeczne z wynikami tej metody uzyskanymi przy użyciu tkanek o wysokim metabolizmie, takich jak wątroba myszy (Rysunek 7A-H). Z drugiej strony, zastosowanie TMRM pozwoliło nam wykryć stopniowy spadek mMP pod wpływem ADP w ludzkich komórkach odpornościowych (Rysunek 6E-G) oraz w limfocytach T śledziony myszy (Rysunek 7E-H). Chociaż nie porównaliśmy bezpośrednio ludzkich i mysich limfocytów T przy użyciu tego samego protokołu miareczkowania, stwierdziliśmy, że IC50 dla limfocytów T myszy było 10 razy niższe w porównaniu z limfocytami T krążącymi u ludzi.

Wykresy oddychania mitochondrialnego i potencjału błonowego; wpływ ADP na bioenergetykę limfocytów T.
Rysunek 3: Eksperymenty z fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości. (A-D) Przebieg eksperymentów z fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości z zastosowaniem stężeń limfocytów T wynoszących 10 milionów komórek/mL oraz 2,5 miliona komórek/mL w komorach o objętości 0,5 mL. (A) 10 milionów komórek/mL w komorach 0,5 mL. (C) 2,5 miliona komórek/mL w komorach 0,5 mL. Strumień tlenu (pmol/s/mL) przedstawiono na górnym panelu (kolor czerwony), a skalibrowany sygnał TMRM na panelu dolnym (kolor czarny). Zmiany TMRM w trakcie protokołu SUIT dla próbki oraz obliczonego tła naniesiono na wykres dla komór zawierających (B) 10 milionów komórek/mL oraz (D) 2,5 miliona komórek/mL. (E) Dla każdego stężenia komórek obliczono strumień tlenu (pmol/s/milion komórek) oraz (F) potencjał błony mitochondrialnej. (G) Wykreślono krzywą wrażliwości na ADP i dopasowano ją do modelu regresji nieliniowej (linie ciągłe). Skróty: mMP, potencjał błony mitochondrialnej; TMRM, ester metylowy tetrametylorodaminy; SUIT, miareczkowania substrat-odsprzęgacz-inhibitor; ADP, adenozynodifosforan; Dig, digitonin; Mal, malonian; Pyr, pirogronian; Glut, glutaminian; D1-11, 11 kolejnych miareczkowań ADP; U, odsprzęgacz FCCP o stężeniu 0,5 i 1,0 μM; AMA, antymycyna A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zużycie tlenu w mitochondriach i potencjał błonowy, wykresy wpływu ADP na PBMC i limfocyty T.
Rysunek 4: Syntaza ATP napędza zależny od ADP spadek potencjału błonowego w limfocytach T i PBMC. (A-H) Opisany tutaj protokół został przetestowany na PBMC i limfocytach T. Do dwóch komór O2K wstrzyknięto PBMC, a do dwóch komór dodatkowego urządzenia O2K wstrzyknięto limfocyty T od tego samego uczestnika. Po wstrzyknięciu substratów: malonianu, pirogronianu i glutaminianu do wszystkich komór, do jednej komory z PBMC i jednej z limfocytami T podano oligomycynę. Oligomycyna zapobiegła wzrostowi respiracji zależnemu od ADP w (A) PBMC i (D) limfocytach T oraz spadkowi potencjału błony mitochondrialnej w (B,C) PBMC i (E,F) limfocytach T. (G,H) Wrażliwość na ADP była większa w PBMC w porównaniu z limfocytami T. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres miareczkowania TMRM, ADP μM, sekwencja SUIT, analiza TMRM w funkcji czasu, wstrzyknięcia standardowe/opóźnione.
Rysunek 5: Eksperymenty z próbą ślepą wykazują zmiany fluorescencji TMRM w odpowiedzi na czas oraz miareczkowania substratów, odsprzęgaczy i inhibitorów (SUIT). (A) Zmiana fluorescencji TMRM w odpowiedzi na miareczkowanie. (B) Zmiana fluorescencji TMRM w funkcji czasu. Eksperymenty przeprowadzono w komorach o pojemności 0,5 mL wypełnionych buforem Mir05 zawierającym 1 μM TMRM. Do jednej komory nie wprowadzono żadnych miareczkowań SUIT (brak wstrzyknięcia); dwie komory w dwóch różnych urządzeniach poddano standardowemu protokołowi SUIT (wstrzyknięcie standardowe); jedna komora otrzymała te same miareczkowania SUIT, lecz z opóźnieniem między kolejnymi wstrzyknięciami (wstrzyknięcie opóźnione). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza funkcji mitochondrialnych; wykresy zużycia tlenu i potencjału błonowego, wpływ ADP oraz EC50.
Rysunek 6: Różnice w wrażliwości na ADP pomiędzy limfocytami T a monocytami z wykorzystaniem OCR i mMP. (A) Przebieg eksperymentu wysokorozdzielczej fluorespirometrii z próbki monocytów i limfocytów T badanego osobnika. (B) Zużycie tlenu w monocytach (n= 11) i limfocytach T (n= 13) z krwi zdrowych ochotników. (C,D) Dopasowanie nieliniowej regresji do wykreślonego wzrostu oddychania podczas miareczkowania ADP w celu obliczenia EC50. (E) Jednoczesny pomiar potencjału błony mitochondrialnej. (F,G) Dopasowanie nieliniowej regresji do wykreślonego spadku potencjału błony mitochondrialnej podczas miareczkowania ADP w celu obliczenia IC50. (H) Parametry wydolności oddechowej monocytów i limfocytów T. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM dla wykresów liniowych oraz średnia ± SD dla wykresów słupkowych. Statystycznie istotne różnice po testach t wyrażono jako *p < 0.05, **p < 0.01 oraz ****p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy miareczkowania ADP, OCR i analiza nMMP dla limfocytów T i wątroby, przedstawiające funkcję mitochondriów.
Rycina 7: Porównanie odpowiedzi na ADP w odniesieniu do respiracji i potencjału błony mitochondrialnej (mMP) w permeabilizowanych limfocytach T śledziony myszy oraz w wątrobie. (A-D) Odpowiedź w respiracji w permeabilizowanych limfocytach T śledziony myszy i w wątrobie. (E-H) Odpowiedź w mMP w permeabilizowanych limfocytach T śledziony myszy i w wątrobie. Świeżą wątrobę i śledzionę wypreparowano z trzech myszy po zwichnięciu stawów szyjnych. Limfocyty T Pan śledziony wyizolowano metodą separacji za pomocą magnetycznych kulek sprzężonych z przeciwciałami. Obie próbki poddano temu samemu protokołowi SUIT w obecności 1 μM TMRM. (I,J) Porównanie wartości EC50 obliczonych na podstawie wzrostu zużycia tlenu (OCR) oraz IC50 na podstawie spadku mMP w odpowiedzi na ADP. N = 3 na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Przykładowy protokół SUIT do oceny potencjału błony mitochondrialnej w świeżo izolowanych limfocytach T i monocytach z użyciem komór 0,5 mL. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Tabela 2: Zalecane miareczkowanie ADP dla komory 0,5 mL. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Obliczanie średniego stosunku tła z wykorzystaniem pięciu niezależnych prób kontrolnych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Obliczanie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) na podstawie eksperymentu próbnego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Wpływ Mir05 i DMSO na oddychanie mitochondrialne i potencjał błonowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przygotowanie odczynników i protokół izolacji limfocytów T ze śledziony myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do pomiaru wrażliwości odpowiedzi mitochondriów na zapotrzebowanie na energię poprzez pomiar rozpraszania mMP w odpowiedzi na rosnące poziomy ADP w PBMC, monocytach i limfocytach T. Odbywa się to poprzez dodanie złożonych substratów I i II w celu maksymalizacji potencjału błony mitochondrialnej i miareczkowanie ADP w celu stopniowej stymulacji syntazy ATP do wykorzystania gradientu protonów do generowania ATP.

Krytyczne kroki w protokole obejmują ustawienie wzmocnienia i intensywności fluoroforu na 1000 oraz upewnienie się, że sygnał fluorescencyjny TMRM jest odbierany podczas miareczkowania TMRM. Ponieważ fluorescencja TMRM zmniejsza się po każdym miareczkowaniu (ograniczenie tej metody), konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów w tle przy użyciu ślepych próbek. Odkryliśmy również, że DMSO działa hamująco na oddychanie mitochondrialne i potencjał błonowy, dlatego zalecamy rozcieńczenie roztworu roboczego TMRM w Mir05 (rysunek uzupełniający 1).

Niektóre modyfikacje, które można zastosować podczas wypróbowywania tego protokołu, to dostosowanie stężeń komórek i użycie standardowej komory o pojemności 2 ml. Jednak komora o pojemności 0,5 ml jest preferowana dla limfocytów T i monocytów ze względu na wysokie stężenie komórek potrzebnych do optymalnej odpowiedzi w potencjale błonowym i strumieniu tlenu. Niższe stężenie komórek może być optymalne podczas testowania komórek o większej pojemności oddechowej, takich jak makrofagi.

Dodatkowym ograniczeniem przedstawionej metody jest wymóg co najmniej 5 milionów limfocytów T i 2,5 miliona monocytów. Często możemy uzyskać wystarczającą ilość komórek z ~20 ml krwi od zdrowych uczestników, ale liczby te mogą się różnić w zależności od stanu zdrowia, wieku i płci26. Ponadto, podobnie jak w przypadku większości metod oceniających pojemność mitochondriów, komórki muszą być świeżo wyizolowane. Jednak w przyszłości metoda ta może zostać wypróbowana w komórkach kriokonserwowanych. W porównaniu z wydajnością z krwi ludzkiej, wydajność limfocytów T ze śledziony zdrowych myszy jest wystarczająco wysoka, aby przeprowadzić ten test.

Krążące limfocyty T, szczególnie komórki pamięci długowiecznej (TM) i regulatorowe (Treg), polegają na fosforylacji oksydacyjnej w celu uzyskania energii37. Chociaż ich zapotrzebowanie na energię i zużycie tlenu są niskie (np. w porównaniu z mięśniami spoczynkowymi), ich przeżycie jest niezbędne dla skutecznej odpowiedzi immunologicznej na ponowne zakażenie i raka 38,39,40. Zmniejszenie fosforylacji oksydacyjnej komórek T powoduje upośledzenie zdolności proliferacyjnej i sprzyja wyczerpaniu i starzeniu się komórek T 5,41. Dodatkowo, hiperpolaryzacja mitochondriów sprzyja zrównoważonej produkcji cytokin (IL-4 i IL-21) przez efektorowe limfocyty T CD4 podczas aktywacji42. Po zakażeniu zapotrzebowanie energetyczne na aktywację i proliferację komórek odpornościowych może wynosić nawet 25%-30% podstawowej przemiany materii43. Dlatego komórki odpornościowe funkcjonują w szerokim i ekstremalnym zakresie zapotrzebowania na energię, a ten protokół może testować odpowiedzi mitochondrialne w tym zakresie.

Przewlekły stan zapalny jest powszechną cechą otyłości, cukrzycy i starzenia się. Rozregulowany poziom krążących hormonów, lipidów i glukozy ma wpływ ogólnoustrojowy, a tym samym może wpływać na to, jak mitochondria reagują na wyzwanie energetyczne. W tym miejscu przedstawiliśmy metodę oceny wrażliwości mitochondrialnego ADP w krążących PBMC. Potrzebne są dalsze badania, aby określić, w jaki sposób wrażliwość ADP może być modulowana w chorobie metabolicznej i jak wpływa na stan zdrowia.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować życzliwym wolontariuszom, którzy oddali krew na ten projekt. Wyrażamy również nasze szczere uznanie dla dr Ellen Schur i jej zespołu za dostarczenie nam dodatkowych próbek z ich badania. Chcielibyśmy również podziękować Andrew Kirshowi za przejrzenie manuskryptu i zredagowanie go pod kątem czytelności. Prace te były wspierane przez następujące źródła finansowania: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Difosforan adenozynySigma-AldrichA5285Fluorespirometria
Antymycyna ASigma-AldrichA8674Fluorespirometria
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA6003Mir05 Bufor
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA6003Izolacja komórek
4-(trifluorometoksy) cyjanku karbonylufenylohydrazonSigma-AldrichC2920Fluorespirometria
Sitka komórkoweFisher Scientific22-363-548Izolacja limfocytów T z śledziony myszy protokół
CD14 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-201Izolacja komórek
CD3 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-101Izolacja komórek
DatLabOroborosWersja 8
DigitoninaSigma-AldrichD141Fluorespirometria
D-SacharozaSigma-Aldrich84097Mir05 bufor
Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma-AldrichE4378Mir05 bufor
Zestaw filtrów AmROroboros44321-01
HBSS (10x)Gibco12060-040
HEPES  sól sodowaSigma-AldrichH7523Bufor Mir05
Histopaque 1077Sigma-Aldrich10771Izolacja komórek
K2EDTA probówki do pobierania krwiBD Vacutainer366643Izolacja komórek
Kwas laktobionowySigma-Aldrich153516Mir05 bufor
Kwas L-glutaminowySigma-AldrichG1626Fluorespirometria
Kwas L-jabłkowySigma-AldrichM1000Fluorespirometria
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401Izolacja komórek
Chlorek magnezu ( MgCl2)Sigma-AldrichM9272Mir05 bufor
Multi-MACS podstawka i separator MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-301Izolacja komórek
O2k-Fluo Inteligentny modułOroboros12100-03
O2k-FluoRespirometer seria JOroboros10201-03
O2k-sV - Moduł (0,5 komory)Oroboros11200-01
OligomycynaSigma-Aldrich04876Fluorespirometria
Pan T Cell Isolation Kit II, myszMiltenyi130095130Izolacja limfocytów T z śledziony myszy protokół
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662Mir05 bufor
Wodorotlenek potasu ( KOH)Sigma-Aldrich221473Mir05
bufor PrismGraphPadWersja 10
RotenonSigma-AldrichR8875Fluorespirometria
Bufor RPMICorning17-105-CVIzolacja komórek
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256Fluorespirometria
Bursztynian sóldisodowaSigma-AldrichS2378Fluorespirometria
TaurynaSigma-AldrichT0625Mir05 bufor
Nadchloryn estru metylowego tetrametylodaminySigma-AldrichT5428Fluorespirometria

Bibliografia

  1. Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
  2. Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224, Pt Suppl 1 236802(2021).
  3. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells). Biochem J. 312, Pt 1 163-167 (1995).
  4. Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
  5. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
  6. Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
  7. Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070(2019).
  8. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  9. Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
  10. Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
  11. Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
  12. Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
  13. Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307(2022).
  14. Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
  15. Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489(2020).
  16. Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol. 126 (2), 454-461 (2019).
  17. DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
  18. Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
  19. Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239(2021).
  20. Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes). Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
  21. vander Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 11-14 (2016).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
  24. Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857(2020).
  25. Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
  26. Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899(2021).
  27. Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. (85), e51301(2014).
  28. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
  29. Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
  30. Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
  31. Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147 (2020).
  32. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  33. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), 00286(2015).
  34. Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
  35. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  36. JoVE, JoVE. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  37. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  38. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
  39. Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
  40. MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
  41. Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
  42. Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, 06376(2015).
  43. Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zu ycie tlenumonocyty i limfocyty krwi obwodowejmiareczkowanie ADPfluorescencja TMRModdychanie mitochondrialneizolacja limfocyt w Tizolacja monocyt w
Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.