Method Article

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

DOI:

10.3791/66863

⸱

May 24th, 2024

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Radiology, University of Washington, 3Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwodowe komórki jednojądrzaste (PBMC) wykazują silne zmiany w zdolności oddechowej mitochondriów w odpowiedzi na zdrowie i chorobę. Chociaż zmiany te nie zawsze odzwierciedlają to, co dzieje się w innych tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe, komórki te są dostępnym i cennym źródłem żywotnych mitochondriów od ludzi. PBMC są narażone na sygnały ogólnoustrojowe, które wpływają na ich stan bioenergetyczny. Tak więc rozszerzenie naszych narzędzi do badania metabolizmu mitochondrialnego w tej populacji wyjaśni mechanizmy związane z postępem choroby. Testy funkcjonalne mitochondriów są często ograniczone do wykorzystania danych wyjściowych oddechowych zgodnie z maksymalnymi stężeniami substratu, inhibitora i rozprzęgacza w celu określenia pełnego zakresu wydolności oddechowej, która może być nieosiągalna in vivo. Konwersja difosforanu adenozyny (ADP) do trifosforanu adenozyny (ATP) przez syntazę ATP powoduje zmniejszenie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i wzrost zużycia tlenu. Aby zapewnić bardziej zintegrowaną analizę dynamiki mitochondriów, w artykule opisano zastosowanie fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru jednoczesnej reakcji zużycia tlenu i potencjału błony mitochondrialnej (mMP) na fizjologicznie istotne stężenia ADP. Technika ta wykorzystuje metylester tetrametylorodaminy (TMRM) do pomiaru polaryzacji mMP w odpowiedzi na miareczkowanie ADP po maksymalnej hiperpolaryzacji z substratami kompleksu I i II. Technika ta może być wykorzystana do ilościowego określenia, w jaki sposób zmiany stanu zdrowia, takie jak starzenie się i choroby metaboliczne, wpływają na wrażliwość odpowiedzi mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w PBMC, limfocytach T i monocytach od ludzi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórki do funkcjonowania i przetrwania w okresie stresu fizjologicznego jest w dużej mierze zależna od jej zdolności do zaspokojenia zapotrzebowania energetycznego na przywrócenie homeostazy1,2. Zapotrzebowanie na energię wzrasta w odpowiedzi na różne bodźce. Na przykład zwiększony skurcz mięśni podczas ćwiczeń zwiększa wykorzystanie ATP i glukozy przez mięśnie szkieletowe, a wzrost syntezy białek po infekcji zwiększa wykorzystanie ATP przez komórki odpornościowe do produkcji i proliferacji cytokin3,4,5,6. Gwałtowny wzrost zapotrzebowania na energię uruchamia szereg procesów bioenergetycznych w celu przywrócenia stosunku ATP/ADP. W miarę zużywania ATP, poziom ADP wzrasta i stymuluje syntazę ATP F1F0 (kompleks V), która wymaga siły protonowej, aby napędzać jej mechaniczną rotację i katalityczną konwersję ADP do ATP w mitochondrium7. Siła protonowa to gradient elektrochemiczny powstały w wyniku pompowania protonów podczas przenoszenia elektronów z substratów do tlenu przez system transportu elektronów (ETS) w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Wynikająca z tego różnica w stężeniu protonów (delta pH) i potencjale elektrycznym (potencjał błonowy) tworzy siłę protonową, która napędza syntezę ATP i zużycie tlenu w odpowiedzi na zapotrzebowanie na energię, zmniejszając stosunek ATP/ADP lub podnosząc poziom ADP. Powinowactwo mitochondriów do ADP można określić przez obliczenie Km lub EC50 oddychania stymulowanego ADP izolowanych mitochondriów lub komórek przepuszczalnych8,9. Metoda ta wykazała, że przepuszczalne włókna mięśniowe starszych ludzi wymagają większego stężenia ADP, aby stymulować 50% ich maksymalnej zdolności fosforylacji oksydacyjnej niż u młodszych osobników9. Podobnie, starzejące się mięśnie szkieletowe myszy wymagają więcej ADP, aby obniżyć produkcję mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS)10,11. Dodatkowo, wrażliwość ADP jest zmniejszona w przepuszczalnych włóknach mięśniowych myszy z otyłością wywołaną dietą w porównaniu z grupą kontrolną i jest zwiększona w obecności insuliny i po spożyciu azotanów12,13. Tak więc zdolność mitochondriów do reagowania na zapotrzebowanie na energię różni się w różnych warunkach fizjologicznych, ale nie było to wcześniej badane w kontekście komórek odpornościowych.

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMCs) są powszechnie używane do badania bioenergetyki komórkowej u ludzi14,15,16,17,18,19,20. Wynika to w dużej mierze z tego, że komórki są łatwo dostępne z nieskrzepłych próbek krwi w badaniach klinicznych, wrażliwości komórek na zaburzenia metaboliczne oraz metod opracowanych przez różne grupy do badania metabolizmu mitochondriów za pomocą inhibitorów i rozprzęgaczy w celu określenia maksymalnej i minimalnej zdolności oddychania mitochondrialnego21,22. Metody te doprowadziły do docenienia roli bioenergetyki w starzeniu się, chorobach metabolicznych i funkcjonowaniu układu odpornościowego14,20,23,24. Mitochondrialna wydolność oddechowa jest często zmniejszona w mięśniach szkieletowych i PBMC w warunkach niewydolności serca18,25. Bioenergetyka PBMC jest również skorelowana z kardiometabolicznymi czynnikami ryzyka u zdrowych osób dorosłych17 i reaguje na leczenie, takie jak rybozyd nikotynamidu18. PBMC obejmują neutrofile, limfocyty (limfocyty B i limfocyty T), monocyty, komórki NK i komórki dendrytyczne, które przyczyniają się do pojemności mitochondriów PBMC26,27,28. Ponadto bioenergetyka komórkowa odgrywa kluczową rolę w aktywacji, proliferacji i odnowie komórek odpornościowych23. Jednak ograniczeniem tych metod jest to, że komórki nie funkcjonują w fizjologicznym zakresie substratów. W związku z tym potrzebne są dodatkowe metody badania funkcji mitochondriów w stężeniach substratów, które są bardziej istotne dla tego, czego komórki doświadczają in vivo.

Potencjał błony mitochondrialnej (mMP) jest głównym składnikiem siły protonmotywnej i jest niezbędny dla różnych procesów mitochondrialnych poza produkcją ATP, takich jak regulacja przepływu oddechowego, produkcja reaktywnych form tlenu, import białek i jonów, autofagia i apoptoza. mMP może być oceniany za pomocą sond elektrochemicznych lub barwników fluorescencyjnych wrażliwych na zmiany polaryzacji błony, takich jak JC-1, Rhod123, DiOC6, tetrametylo rodamina (TMRE) lub ester metylowy (TMRM) i safranina. Dwa ostatnie to lipofilowe barwniki kationowe, które są z powodzeniem stosowane we fluorespirometrii homogenów tkanek o wysokiej rozdzielczości, izolowanych mitochondriów i tkanek przepuszczalnych11,29,30,31,32,33. W tej technice TMRM jest stosowany w trybie wygaszania, w którym komórki są wystawione na działanie wysokiego stężenia TMRM, które gromadzi się w macierzy mitochondrialnej po polaryzacji (wysoka siła mMP i protonmotive), co powoduje wygaszenie cytozolowej fluorescencji TMRM. Kiedy mitochondria ulegają depolaryzacji w odpowiedzi na ADP lub rozprzęgacze, barwnik jest uwalniany z matrycy, zwiększając sygnał fluorescencyjny TMRM34,35. Celem tej metody jest jednoczesny pomiar zmian w oddychaniu mitochondrialnym i mMP w odpowiedzi na miareczkowanie ADP w PBMC pochodzenia ludzkiego, krążących monocytach i limfocytach T, a także może być stosowana do mysich limfocytów T śledziony.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj pobieranie próbek krwi do opracowania danych i metod zostało zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Reprezentatywne wyniki obejmują również dane dotyczące samców myszy C57BL / 6J (w wieku 5-7 miesięcy) zakupionych w Jackson Laboratories. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Przegląd protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1. Przygotowanie odczynnika do tego protokołu można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Przebieg pracy z wykorzystaniem fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian potencjału błony mitochondrialnej w izolowanych monocytach (CD14+) i limfocytach T (CD3+) ze świeżych próbek krwi ludzkiej. Skróty: TMRM, ester metylowy tetrametylorodaminy; SUIT, miareczkowanie substrat-rozprzęgacz-inhibitor; ADP, difosforan adenozyny; Kopać, digitonina; Mal, jabłczan; Pyr, pirogronian; Przesyt, glutaminian; D1-10, 10 kolejnych miareczkowań ADP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Oddzielenie kożuchy od pełnej krwi

UWAGA: Izolacja komórek jest zmodyfikowana przez Kramer et al.27.

  1. Pozwól, aby RPMI, gradient gęstości i wirówka osiągnęły temperaturę pokojową. Przed rozpoczęciem wysterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego i materiały.
  2. Zebrać krew żylną do trzech probówek K2EDTA o pojemności 10 ml. Odwróć rurki co najmniej 3 razy.
  3. Odwirować probówki przy 500 x g 10 min (22 °C, 9 przyspieszeń [acc], 2 opóźnienia [dec]).
  4. Pobrać 1 ml osocza z każdej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz.
  5. Przenieś osocze i połowę warstwy czerwonych krwinek z każdej probówki do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj RPMI do oznaczenia 40 ml. Odwróć co najmniej 3 razy.
  6. Powoli umieścić 10 ml roztworu osocza w czterech stożkowych probówkach o pojemności 15 ml zawierających 3 ml gradientu gęstości.
  7. Wirować przy 700 x g przez 30 min (22 °C, 5 acc, 2 Dec).
  8. Zebrać całe osocze i kożuchową powłokę zawierającą obwodowe komórki jednojądrzaste (PBMC) bez zakłócania czerwonych krwinek.
  9. Wirować przy 500 x g przez 10 minut (22 °C, 5 acc, 5 Dec) i odsysać supernatant.
  10. Przemyć granulat PBMC 1x-2x, ponownie zawieszając go w 10 ml RPMI i odwirowując przy 500 x g przez 10 minut (22 °C, 5 acc, 5 dec).

2. Magnetyczna separacja komórek CD14+ i CD3+

  1. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora magnetycznego (patrz Tabela materiałów). Przemyć kolumnę 3 ml RP-5.
  2. Zawiesić osad PBMC w 80 μl RP-5 i 20 μl mikrogranulek anty-CD14 (patrz Tabela materiałów). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml RP-5 i załadować zawiesinę na kolumnę. Zbierz nieoznakowane komórki, które przepływają do stożkowej rurki o pojemności 15 ml oznaczonej "Przepływem 1". Poczekaj, aż cała zawiesina komórkowa przejdzie przez kolumnę, a następnie kontynuuj płukanie 3 ml RP-5 3x, zbierając cały przepływ.
  4. Ostrożnie usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml RP-5 i natychmiast użyć tłoka, aby przepłukać zawartość kolumny do probówki zbiorczej oznaczonej "CD14+".
  5. Odwirować "Przepływowy 1" przy 500 x g przez 10 minut (22 °C, 5 acc, 5 Dec) i zassać supernatant.
  6. Używając komórek z Flow-through 1, powtórz kroki 2.2-2.5 za pomocą mikrogranulek anty-CD3 (patrz Tabela materiałów) w celu wyizolowania limfocytów T.
  7. Probówki wirówkowe zawierające limfocyty T (CD3+) i monocyty (CD14+) w dawce 300 x g przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RP-5.
  8. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Komórki można policzyć, dodając 10 μl rozcieńczenia komórek 1:10 lub 1:20 do hemocytometru. Można odwołać się do wcześniej opublikowanych protokołów zliczania komórek za pomocą hemocytometru36.
  9. Pipetować 2,5 miliona monocytów lub 5 milionów limfocytów T do nowej probówki wirówkowej. Wirować przez 30 s przy 2000 x g, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w MiR05 do całkowitej objętości 20 μl i końcowego stężenia 125 milionów monocytów lub 250 milionów limfocytów T na ml.
    UWAGA: Końcowe stężenie zostało wybrane do wstrzyknięcia 2,5 miliona monocytów lub 5 milionów limfocytów T w objętości 20 μL. Tą metodą przetestowano również mysie limfocyty T wyizolowane ze śledziony. Procedura znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

3. Fluorespirometria wysokiej rozdzielczości - Kalibracja tlenu i fluorescencji TMRM

UWAGA: Ta metoda została zaadaptowana z poprzednich prac wykonanych na włóknach permeabilized przez Pharaoh et al.11. Wysokie, niehamujące stężenie TMRM jest stosowane w trybie wygaszania, w którym zależność między stężeniem mMP i TMRM w matrycy jest odwrócona. Tak więc spadek mMP prowadzi do uwolnienia barwnika TMRM z matrycy i wzrostu fluorescencji32.

  1. Zainstalować komory o pojemności 0,5 ml w respirometrze O2K zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Włącz przyrząd i podłącz go do oprogramowania dostarczonego przez producenta w celu uzyskania danych.
  2. Ustaw temperaturę na 37 °C i prędkość mieszania na 750 obr./min.
  3. Umyj komory wodą destylowaną 3x. Zastąp wodę 0,54 ml Mir05, całkowicie zamknij korki i usuń nadmiar buforu za pomocą zintegrowanego systemu ssącego (ISS). Podnieś korki, aby umożliwić zrównoważenie tlenu w pomieszczeniu z tlenem w komorze za pomocą elementu dystansowego korka.
  4. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, wykonaj kalibrację tlenu w powietrzu (R1) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Ustabilizowanie się strumienia tlenu może zająć >30 minut. Czujniki tlenu wymagają określenia tlenu w punkcie zerowym (R0) i strumienia tlenu tła w zakresie 50-200 μM z oddzielnych eksperymentów z użyciem miareczkowania ditionitu. Konkretne metody można znaleźć w instrukcji producenta.
  5. Uszczelnij komorę, zamykając korki.
    UWAGA: W przeciwieństwie do eksperymentów z użyciem włókien przepuszczalnych, komory nie wymagają hipernatleniania dla PBMC. Uszczelnienie komory po kalibracji R1 zapewnia wystarczającą ilość tlenu do eksperymentu. Poziom tlenu powinien być utrzymywany w granicach 50-250 μM. Jeśli stężenie tlenu spadnie poniżej progu, komorę można częściowo otworzyć, tak aby tlen w komorze mógł zrównoważyć się z tlenem w powietrzu w pomieszczeniu.
  6. Kalibracja TMRM
    1. Używaj fluoczujników LED Green LED (np. 525 nm) z zestawem filtrów AmR (patrz Tabela materiałów). Ustaw wzmocnienie fluorometru na 1000 i intensywność na 1000. Włącz czujniki fluo-sensorów i rozpocznij rejestrowanie linii bazowej.
    2. Wstrzyknąć 2,5 μL 0,05 mM TMRM i pozwolić, aby sygnał ustabilizował się (~2 min) przed kolejnym wstrzyknięciem 2,5 μL, aż do wykonania łącznie 4 wstrzyknięć dla całkowitego stężenia TMRM 1 μM TMRM w komorze. Do wszystkich wstrzyknięć należy używać strzykawki Hamiltona.
    3. Skalibruj czujnik fluo, wybierając sygnał fluorescencyjny (napięcie) dla każdego wstrzyknięcia reprezentujące 0, 0,25, 0,5, 0,75 i 1,0 μM TMRM dla kalibracji pięciopunktowej.

4. Protokół miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT)

UWAGA: Uruchom ślepe eksperymenty, w których do komory wstrzykuje się 20 μL Mir05 zamiast 20 μL zawiesiny komórek, ponieważ sygnał TMRM zmieni się w odpowiedzi na same wstrzyknięcia (omówione w reprezentatywnych wynikach). Poczekaj, aż sygnał strumienia tlenu ustabilizuje się (około 2-3 minut) przed następnym wstrzyknięciem zarówno w przypadku ślepej próby, jak i eksperymentów z próbką. Poniższy protokół miareczkowania i oczekiwane obserwacje przedstawiono w Tabeli 1.

  1. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM "pre-komórka".
  2. Wstrzyknij zawiesinę komórkową zawierającą 5 milionów limfocytów T lub 2,5 miliona monocytów w ~20 μL i mierz przez około 10 minut. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako "Komórka".
  3. Przepuszczalność komórek poprzez wstrzyknięcie 2 μl 1 mg/ml digitoniny (końcowe stężenie: 4 μg/ml). Odczekaj 20 min. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako "Dig".
    UWAGA: Sugeruje się optymalizację stężenia digitoniny w oddzielnych eksperymentach.
  4. Dodać 2,5 μl 1 M bursztynianu (końcowe stężenie: 5 mM). Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako "SUCC".
  5. Gdy strumień tlenu ustabilizuje się, dodaj 5 μl 100 mM jabłczanu (stężenie końcowe: 1,0 mM), 5 μl 1 M glutaminianu (stężenie końcowe: 10 mM) i 5 μl 500 mM pirogronianu (stężenie końcowe: 5 mM). Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako "MPG".
  6. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, miareczkować ADP. Wybierz szybkości dla każdego miareczkowania i oznacz je kolejno "D" od 1 do 10, w zależności od liczby miareczkowania. Należy zastosować schemat miareczkowania przedstawiony w Tabeli 2.
  7. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, należy wykonać serię miareczkowania 1 μl p-(tri-flurometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) cyjanku karbonylu o stężeniu 0,25 mM do momentu, gdy sygnał fluorescencyjny osiągnie maksimum. Wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM reprezentujący minimalny potencjał błony i oznacz go "FCCP".
    UWAGA: Stężenie FCCP 0,5-1,0 μM jest zwykle wymagane do wyczerpania potencjału błony mitochondrialnej.
    UWAGA: FCCP jest toksyczny. Zapoznaj się z kartą charakterystyki (SDS) w celu uzyskania informacji na temat prawidłowej obsługi.
  8. OPCJONALNIE: Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, wstrzyknąć 1 μl 0,25 mM rotenonu, aby zahamować kompleks I i określić wydolność oddechową przez kompleks II.
    UWAGA: Zmiany potencjału błonowego nie są już istotne po miareczkowaniu za pomocą uncouplingr.
    UWAGA: Rotenon jest toksyczny. Zapoznaj się z SDS, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej obsługi.
  9. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, wstrzyknij 1 μl 1,25 mM (końcowe stężenie: 2,5 μM) antymycyny A, aby zahamować oddychanie mitochondrialne.
    UWAGA: Antymycyna A jest toksyczna. Zapoznaj się z SDS, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej obsługi.

5. Obliczanie potencjału błony mitochondrialnej i analiza

  1. Korzystając z doświadczeń ze ślepą próbą, należy zapisać skalibrowane wartości TMRM (TMRM mikromolowe) przed wstrzyknięciem próbki ślepej ("próba wstępna") i dla każdego z wstrzyknięć. Zobacz Rysunek 2.
  2. Dla każdego ślepego eksperymentu oblicz stosunek tła, ustawiając stężenie TMRM "przed próbką" na 1,0. Oblicz późniejszy proporcjonalny spadek TMRM. Obliczanie średniego współczynnika tła ze wszystkich ślepych prób.
    UWAGA: Liczba ślepych prób, które należy uwzględnić, może zależeć od precyzji urządzenia. Patrz przykład obliczeniowy w tabeli 3 z pięciu różnych ślepych prób, w których odchylenie standardowe średniego stosunku tła mieściło się w przedziale od 0 do 0,016 dla każdego miareczkowania.
  3. Obliczanie tła: Oblicz tło dla każdego eksperymentu z próbką, mnożąc TMRM "przed próbką" eksperymentu z próbką razy średni stosunek tła dla każdego wstrzyknięcia. Patrz przykład obliczeń w tabeli 3.
  4. Korekcja tła: Odejmij tło eksperymentu od zmierzonych wartości TMRM próbki. Patrz przykład obliczeń w tabeli 4.
  5. Korekcja FCCP: Odejmij mMP z korekcją tła FCCP od każdego wstrzyknięcia. Patrz przykład obliczeń w tabeli 4.
  6. Krzywa czułości ADP: Normalizuj spadek mMP spowodowany ADP, ustawiając najwyższy i najniższy potencjał błony odpowiednio na 100% i 0%, używając wartości mMP zebranych podczas miareczkowania ADP. Dopasuj dane do nieliniowego modelu regresji dopasowania przy użyciu preferowanego oprogramowania statystycznego do obliczenia połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50) ADP na mMP.
    UWAGA: Krzywa pasuje do odpowiedzi [Inhibitor] w porównaniu ze znormalizowaną - Zmienne nachylenie w pryzmacie.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Obliczanie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i czułości ADP na podstawie fluorescencji TMRM. Etapy obliczania potencjału błony mitochondrialnej (mMP) i czułości ADP na podstawie pomiarów fluorescencji TMRM za pomocą fluorespirometrii o wysokiej rozdzielczości jednej próbki limfocytów T (n = 1). Krok 1: Fluorescencję TMRM mierzy się w ślepych próbkach, tak jak w próbce biologicznej. Krok 2: Określ stosunek sygnału TMRM przy każdym miareczkowaniu w stosunku do sygnału przed próbką dla każdego ślepego eksperymentu. Obliczyć średnią z każdego miareczkowania ze wszystkich ślepych prób. Krok 3: Oblicz tło dla każdego eksperymentu z próbką, mnożąc fluorescencję "przed próbką" przez średni stosunek tła dla każdego miareczkowania. Krok 4: Oblicz różnicę między fluorescencją TMRM tła i próbki dla każdego miareczkowania, aby wyrazić dane jako wychwyt mMP lub mitochondrialnego TMRM. Krok 5: Popraw mMP tak, aby pełne rozłączenie z FCCP odzwierciedlało zero mMP. Krok 6: Wykonaj regresję nieliniową, aby wyświetlić wykres zmian w mMP wraz ze wzrostem stężeń ADP. Pomiary przeprowadzono w komorze o pojemności 0,5 ml, z których jedna zawierała 5 milionów limfocytów T od zdrowego ochotnika. Uśrednione dane są wyrażane jako średnia ± SEM. Pojedyncze punkty danych pojedynczej repliki są wyrażane bez słupków błędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować różnice w optymalnym stężeniu komórek dla testu, 5 milionów limfocytów T załadowano do jednej komory 0,5 ml (10 milionów komórek/ml), a 1,25 miliona komórek załadowano do innej komory (2,5 miliona komórek/ml) zawierającej 1 μM TMRM (Rysunek 3A-G). Uwzględniono również trzy puste eksperymenty w celu obliczenia tła TMRM. Odkryliśmy, że wyższe stężenie limfocytów T skutkowało bardziej zauważalną zmianą fluorescencji TMRM w stosunku do tła (Rysunek 3B, D). Ponadto wyższe stężenie komórek pozwoliło nam wykryć oczekiwany wzrost zużycia tlenu i jednoczesne wyczerpanie mMP w odpowiedzi na dodanie FCCP (Rysunek 3E,F). Użycie niskiej koncentracji komórek dało słabą zmianę fluorescencji, która była równoległa do tła. Ponieważ obliczenie mMP odejmuje tło od sygnału, niskie stężenie komórek nie pozwala na określenie zmian w mMP w odpowiedzi na substraty i rozprzęgacze. Oprócz stosowania wyższych stężeń komórek w tym teście, zalecamy utrzymanie stałego stężenia komórek dla każdego typu komórki między eksperymentami.

Aby potwierdzić wpływ syntazy ATP na rozpraszanie mMP za pomocą miareczkowania ADP, przeprowadziliśmy równoległe eksperymenty na PBMC i limfocytach T, gdzie jedna komora otrzymała oligomycynę przed miareczkowaniem ADP (Rysunek 4). Nie znaleźliśmy dyssypacji mMP w odpowiedzi na ADP w komórkach traktowanych oligomycyną, co sugeruje, że stopniowy spadek mMP z ADP jest wynikiem przepływu protonów przez syntazę ATP (Figura 4A-F). Porównaliśmy również czułość ADP między limfocytami T i PBMC tego samego uczestnika i stwierdziliśmy, że czułość ADP jest niższa (wyższa EC50) we frakcji komórek T (Figura 4G, H).

Przeprowadziliśmy serię pustych eksperymentów, aby określić wpływ czasu lub protokołu SUIT na fluorescencję TMRM. Odkryliśmy, że na sygnał TMRM w ślepych próbach największy wpływ mają miareczkowanie SUIT (Rysunek 5A), a nie czas miareczkowania ( Rysunek 5B).

Porównaliśmy zmiany w wskaźnikach zużycia tlenu (OCR) i w mMP w limfocytach T i monocytach od 11 zdrowych, mieszkających w społeczności ochotników (Rysunek 6A-H). Podobnie jak w przypadku wyników wcześniej opublikowanych eksperymentów z wykorzystaniem strumienia zewnątrzkomórkowego i testów enzymatycznych, monocyty wykazywały większą mitochondrialną wydolność oddechową niż limfocyty26,27 (Rysunek 6A,H). Jednak nie wykryliśmy typowego wzrostu dawki i odpowiedzi w OCR z ADP w żadnym typie komórki ( Figura 6C, D), w przeciwieństwie do tego, co ta metoda pokazuje przy użyciu wysoce metabolicznych tkanek, takich jak wątroba myszy (Figura 7A-H). Z drugiej strony, zastosowanie TMRM pozwoliło nam wykryć stopniowy spadek mMP z ADP w ludzkich komórkach odpornościowych (Figura 6E-G) oraz w limfocytach T śledziony od myszy (Figura 7E-H). Chociaż nie porównaliśmy bezpośrednio ludzkich i mysich limfocytów T przy użyciu tego samego protokołu miareczkowania, stwierdziliśmy, że IC50 mysich limfocytów T był niższy 10-krotnie w porównaniu z krążącymi limfocytami T od ludzi.

figure-results-1
Rysunek 3: Eksperymenty fluorespirometryczne w wysokiej rozdzielczości. (A-D) Ślad eksperymentów fluorespirometrycznych w wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem koncentracji limfocytów T wynoszących 10 milionów komórek/ml i 2,5 miliona komórek/ml w komorach 0,5 ml. (A) 10 milionów komórek/ml w komorach o pojemności 0,5 ml. (C) 2,5 miliona komórek/ml w komorach o pojemności 0,5 ml. Strumień tlenu (pmol/s/mL) jest pokazany na górnym panelu (czerwony), a skalibrowany sygnał TMRM jest pokazany na dolnym panelu (). Zmiany TMRM w całym SUIT dla próbki i jej obliczonego tła zostały wykreślone dla komór zawierających (B) 10 milionów komórek/ml i (D) 2,5 miliona komórek/ml. (E) Dla każdego stężenia komórki obliczono strumień tlenu (pmol/s/milion komórek) i (F) potencjał błony mitochondrialnej. (G) Krzywa czułości ADP została wykreślona i dopasowana do modelu regresji nieliniowej (linie ciągłe). Skróty: mMP, mitochondrialny potencjał błonowy; TMRM, ester metylowy tetrametylodaminy; SUIT, miareczkowanie substrat-rozprzęgacz-inhibitor; ADP, difosforan adenozyny; Kopać, digitonina; Mal, jabłczan; Pyr, pirogronian; Przesyt, glutaminian; D1-11, 11 kolejnych miareczkowań ADP; U, rozprzęgacz FCCP 0,5 i 1,0 μM; AMA, antymycyna A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Syntaza ATP powoduje spadek potencjału błonowego w limfocytach T i PBMC za pomocą ADP. (A-H) Opisany tutaj protokół został przetestowany na PBMC i limfocytach T. Dwóm komorom O2K wstrzyknięto PBMC, a dwóm komorom dodatkowego O2K wstrzyknięto limfocyty T od tego samego uczestnika. Po wstrzyknięciu substratów jabłczanu, pirogronianu i glutaminianu we wszystkich komorach, jedna komora PBMC i limfocytów T otrzymała oligomycynę. Oligomycyna zapobiegała jakiemukolwiek wzrostowi oddychania spowodowanemu ADP w (A) PBMC i (D) limfocytach T lub spadkowi potencjału błony mitochondrialnej w (B,C) PBMC i (E,F) limfocytach T. (G,H) Czułość ADP była większa w PBMC w porównaniu z limfocytami T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 5: Ślepe eksperymenty pokazują zmianę fluorescencji TMRM w odpowiedzi na czas i miareczkowanie substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów (SUIT). (A) Zmiana fluorescencji TMRM w odpowiedzi na miareczkowanie. (B) Zmiana fluorescencji TMRM w odpowiedzi na czas. Doświadczenia prowadzono w komorach o pojemności 0,5 ml wypełnionych Mir05 zawierającym 1 μM TMRM. W jednej komorze nie zastosowano miareczkowania metodą SUIT (brak iniekcji); Dwie komory w dwóch różnych instrumentach otrzymały standardowy protokół skafandrowy (standardowa iniekcja); jedna komora otrzymała takie same miareczkowanie SUIT, ale z opóźnieniem między każdym wstrzyknięciem (opóźniona iniekcja). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 6: Różnice w czułości ADP między limfocytami T a monocytami za pomocą OCR i mMP. (A) Ślad eksperymentu fluorespirometrycznego o wysokiej rozdzielczości z próbki monocytów i limfocytów T badanego. (B) Zużycie tlenu w monocytach (n = 11) i limfocytach T (n = 13) z krwi zdrowych ochotników. (C,D) Dopasowanie regresji nieliniowej wykreślonego wzrostu oddychania z miareczkowaniem ADP w celu obliczenia EC50. (E) Jednoczesny pomiar potencjału błony mitochondrialnej. (F,G) Dopasowanie regresji nieliniowej wykreślonego spadku potencjału błony mitochondrialnej za pomocą miareczkowania ADP w celu obliczenia IC50. (H) Parametry wydolności oddechowej monocytów i limfocytów T. Dane są wyrażane jako średnia ± SEM dla wykresów liniowych i średnia ± SD dla wykresów słupkowych. Różnice istotne statystycznie po testach t są wyrażone jako *p < 0,05. **p < 0,01, a ****p < dla 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 7: Porównanie odpowiedzi ADP w oddychaniu i potencjale błony mitochondrialnej (mMP) w permeabilizowanych mysich komórkach T śledziony i wątrobie. (A-D) Odpowiedź w oddychaniu w permeabilizowanych mysich komórkach T śledziony i wątrobie. (E-H) Odpowiedź w mMP w permeabilizowanych mysich komórkach T śledziony i wątrobie. Świeża wątroba i śledziona zostały wycięte od trzech myszy po zwichnięciu szyjki macicy. Limfocyty T Pan śledziony wyizolowano za pomocą separacji kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami. Obie próbki poddano temu samemu protokołowi SUIT w obecności 1 μM TMRM. (I,J) Porównanie EC50 obliczonego na podstawie wzrostu zużycia tlenu (OCR) i IC50 na podstawie spadku mMP w odpowiedzi na ADP. N = 3 na grupę. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykładowy protokół SUIT do oceny potencjału błony mitochondrialnej w świeżo wyizolowanych limfocytach T i monocytach przy użyciu komór 0,5 ml. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Zalecane miareczkowanie ADP dla komory 0,5 ml. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Obliczanie średniego współczynnika tła przy użyciu pięciu niezależnych pustych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Obliczanie potencjału błony mitochondrialnej (mMP) na podstawie próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Wpływ Mir05 i DMSO na oddychanie mitochondrialne i potencjał błony. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przygotowanie odczynnika i protokół izolacji limfocytów T ze śledziony myszy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do pomiaru wrażliwości odpowiedzi mitochondriów na zapotrzebowanie na energię poprzez pomiar rozpraszania mMP w odpowiedzi na rosnące poziomy ADP w PBMC, monocytach i limfocytach T. Odbywa się to poprzez dodanie złożonych substratów I i II w celu maksymalizacji potencjału błony mitochondrialnej i miareczkowanie ADP w celu stopniowej stymulacji syntazy ATP do wykorzystania gradientu protonów do generowania ATP.

Krytyczne kroki w protokole obejmują ustawienie wzmocnienia i intensywności fluoroforu na 1000 oraz upewnienie się, że sygnał fluorescencyjny TMRM jest odbierany podczas miareczkowania TMRM. Ponieważ fluorescencja TMRM zmniejsza się po każdym miareczkowaniu (ograniczenie tej metody), konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów w tle przy użyciu ślepych próbek. Odkryliśmy również, że DMSO działa hamująco na oddychanie mitochondrialne i potencjał błonowy, dlatego zalecamy rozcieńczenie roztworu roboczego TMRM w Mir05 (rysunek uzupełniający 1).

Niektóre modyfikacje, które można zastosować podczas wypróbowywania tego protokołu, to dostosowanie stężeń komórek i użycie standardowej komory o pojemności 2 ml. Jednak komora o pojemności 0,5 ml jest preferowana dla limfocytów T i monocytów ze względu na wysokie stężenie komórek potrzebnych do optymalnej odpowiedzi w potencjale błonowym i strumieniu tlenu. Niższe stężenie komórek może być optymalne podczas testowania komórek o większej pojemności oddechowej, takich jak makrofagi.

Dodatkowym ograniczeniem przedstawionej metody jest wymóg co najmniej 5 milionów limfocytów T i 2,5 miliona monocytów. Często możemy uzyskać wystarczającą ilość komórek z ~20 ml krwi od zdrowych uczestników, ale liczby te mogą się różnić w zależności od stanu zdrowia, wieku i płci26. Ponadto, podobnie jak w przypadku większości metod oceniających pojemność mitochondriów, komórki muszą być świeżo wyizolowane. Jednak w przyszłości metoda ta może zostać wypróbowana w komórkach kriokonserwowanych. W porównaniu z wydajnością z krwi ludzkiej, wydajność limfocytów T ze śledziony zdrowych myszy jest wystarczająco wysoka, aby przeprowadzić ten test.

Krążące limfocyty T, szczególnie komórki pamięci długowiecznej (TM) i regulatorowe (Treg), polegają na fosforylacji oksydacyjnej w celu uzyskania energii37. Chociaż ich zapotrzebowanie na energię i zużycie tlenu są niskie (np. w porównaniu z mięśniami spoczynkowymi), ich przeżycie jest niezbędne dla skutecznej odpowiedzi immunologicznej na ponowne zakażenie i raka 38,39,40. Zmniejszenie fosforylacji oksydacyjnej komórek T powoduje upośledzenie zdolności proliferacyjnej i sprzyja wyczerpaniu i starzeniu się komórek T 5,41. Dodatkowo, hiperpolaryzacja mitochondriów sprzyja zrównoważonej produkcji cytokin (IL-4 i IL-21) przez efektorowe limfocyty T CD4 podczas aktywacji42. Po zakażeniu zapotrzebowanie energetyczne na aktywację i proliferację komórek odpornościowych może wynosić nawet 25%-30% podstawowej przemiany materii43. Dlatego komórki odpornościowe funkcjonują w szerokim i ekstremalnym zakresie zapotrzebowania na energię, a ten protokół może testować odpowiedzi mitochondrialne w tym zakresie.

Przewlekły stan zapalny jest powszechną cechą otyłości, cukrzycy i starzenia się. Rozregulowany poziom krążących hormonów, lipidów i glukozy ma wpływ ogólnoustrojowy, a tym samym może wpływać na to, jak mitochondria reagują na wyzwanie energetyczne. W tym miejscu przedstawiliśmy metodę oceny wrażliwości mitochondrialnego ADP w krążących PBMC. Potrzebne są dalsze badania, aby określić, w jaki sposób wrażliwość ADP może być modulowana w chorobie metabolicznej i jak wpływa na stan zdrowia.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować życzliwym wolontariuszom, którzy oddali krew na ten projekt. Wyrażamy również nasze szczere uznanie dla dr Ellen Schur i jej zespołu za dostarczenie nam dodatkowych próbek z ich badania. Chcielibyśmy również podziękować Andrew Kirshowi za przejrzenie manuskryptu i zredagowanie go pod kątem czytelności. Prace te były wspierane przez następujące źródła finansowania: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Difosforan adenozynySigma-AldrichA5285Fluorespirometria
Antymycyna ASigma-AldrichA8674Fluorespirometria
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA6003Mir05 Bufor
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA6003Izolacja komórek
4-(trifluorometoksy) cyjanku karbonylufenylohydrazonSigma-AldrichC2920Fluorespirometria
Sitka komórkoweFisher Scientific22-363-548Izolacja limfocytów T z śledziony myszy protokół
CD14 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-201Izolacja komórek
CD3 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-101Izolacja komórek
DatLabOroborosWersja 8
DigitoninaSigma-AldrichD141Fluorespirometria
D-SacharozaSigma-Aldrich84097Mir05 bufor
Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma-AldrichE4378Mir05 bufor
Zestaw filtrów AmROroboros44321-01
HBSS (10x)Gibco12060-040
HEPES  sól sodowaSigma-AldrichH7523Bufor Mir05
Histopaque 1077Sigma-Aldrich10771Izolacja komórek
K2EDTA probówki do pobierania krwiBD Vacutainer366643Izolacja komórek
Kwas laktobionowySigma-Aldrich153516Mir05 bufor
Kwas L-glutaminowySigma-AldrichG1626Fluorespirometria
Kwas L-jabłkowySigma-AldrichM1000Fluorespirometria
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401Izolacja komórek
Chlorek magnezu ( MgCl2)Sigma-AldrichM9272Mir05 bufor
Multi-MACS podstawka i separator MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-301Izolacja komórek
O2k-Fluo Inteligentny modułOroboros12100-03
O2k-FluoRespirometer seria JOroboros10201-03
O2k-sV - Moduł (0,5 komory)Oroboros11200-01
OligomycynaSigma-Aldrich04876Fluorespirometria
Pan T Cell Isolation Kit II, myszMiltenyi130095130Izolacja limfocytów T z śledziony myszy protokół
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662Mir05 bufor
Wodorotlenek potasu ( KOH)Sigma-Aldrich221473Mir05
bufor PrismGraphPadWersja 10
RotenonSigma-AldrichR8875Fluorespirometria
Bufor RPMICorning17-105-CVIzolacja komórek
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256Fluorespirometria
Bursztynian sóldisodowaSigma-AldrichS2378Fluorespirometria
TaurynaSigma-AldrichT0625Mir05 bufor
Nadchloryn estru metylowego tetrametylodaminySigma-AldrichT5428Fluorespirometria

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
  2. Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224, Pt Suppl 1 236802(2021).
  3. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells). Biochem J. 312, Pt 1 163-167 (1995).
  4. Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
  5. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
  6. Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
  7. Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070(2019).
  8. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  9. Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
  10. Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
  11. Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
  12. Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
  13. Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307(2022).
  14. Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
  15. Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489(2020).
  16. Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol. 126 (2), 454-461 (2019).
  17. DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
  18. Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
  19. Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239(2021).
  20. Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes). Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
  21. vander Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 11-14 (2016).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
  24. Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857(2020).
  25. Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
  26. Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899(2021).
  27. Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. (85), e51301(2014).
  28. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
  29. Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
  30. Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
  31. Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147 (2020).
  32. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  33. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), 00286(2015).
  34. Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
  35. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  36. JoVE, JoVE. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  37. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  38. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
  39. Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
  40. MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
  41. Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
  42. Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, 06376(2015).
  43. Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Membrane PotentialHigh Resolution FluorespirometryOxygen ConsumptionPeripheral Blood Mononuclear CellsADP TitrationTMRM FluorescenceMitochondrial RespirationHuman Immune CellsT Cell IsolationMonocyte Isolation

Related Articles