Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66866

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Streszczenie

W ciągu ostatniej dekady, metody jednokomórkowe stały się złotym standardem w badaniu dynamiki ekspresji genów, heterogeniczności komórek i stanów komórek w próbkach. Przed osiągnięciem postępów w dziedzinie pojedynczych komórek możliwość uchwycenia dynamicznego krajobrazu komórkowego i szybkich przemian komórkowych we wczesnym okresie rozwoju była ograniczona. W artykule zaprojektowano solidny rurociąg do przeprowadzania analizy pojedynczych komórek i jąder na zarodkach myszy od dnia embrionalnego E6.5 do E8, co odpowiada początkowi i zakończeniu gastrulacji. Gastrulacja jest podstawowym procesem podczas rozwoju, który ustanawia trzy listki rozrodcze: mezodermę, ektodermę i endodermę, które są niezbędne do organogenezy. Dostępna jest obszerna literatura na temat omiki jednokomórkowej stosowanej do zarodków perigastrulujących typu dzikiego. Jednak analiza pojedynczych komórek zmutowanych zarodków jest nadal rzadka i często ogranicza się do populacji posortowanych za pomocą FACS. Wynika to częściowo z ograniczeń technicznych związanych z koniecznością genotypowania, ciążami w czasie, liczbą zarodków o pożądanych genotypach w ciąży oraz liczbą komórek na zarodek na tych etapach. W tym miejscu przedstawiono metodologię mającą na celu przezwyciężenie tych ograniczeń. Metoda ta ustala wytyczne dotyczące hodowli i ciąży w czasie, aby osiągnąć większą szansę na zsynchronizowane ciąże z pożądanymi genotypami. Etapy optymalizacji procesu izolacji zarodków w połączeniu z protokołem genotypowania tego samego dnia (3 godziny) pozwalają na wykonanie pojedynczej komórki na bazie mikrokropelek tego samego dnia, zapewniając wysoką żywotność komórek i wiarygodne wyniki. Metoda ta zawiera ponadto wytyczne dotyczące optymalnej izolacji jąder z zarodków. W związku z tym podejścia te zwiększają wykonalność podejść jednokomórkowych do zmutowanych zarodków na etapie gastrulacji. Przewidujemy, że metoda ta ułatwi analizę tego, w jaki sposób mutacje kształtują krajobraz komórkowy gastruli.

Wprowadzenie

Gasgulacja jest podstawowym procesem niezbędnym do normalnego rozwoju. Ten szybki i dynamiczny proces zachodzi, gdy komórki pluripotencjalne przekształcają się w prekursory specyficzne dla linii, które określają, jak powstają narządy. Przez lata gastrulacja była długo definiowana jako tworzenie trzech w dużej mierze jednorodnych populacji: mezodermy, ektodermy i endodermy. Jednak technologie o wysokiej rozdzielczości i pojawiająca się liczba modeli embrionalnych komórek macierzystych1,2 ujawniają bezprecedensową heterogeniczność wśród wczesnych listków zarodkowych3,4. Sugeruje to, że pozostaje jeszcze wiele do odkrycia na temat mechanizmów regulujących różne populacje komórek gastruli. Rozwój embrionalny myszy był jednym z najlepszych modeli do badania wczesnych decyzji dotyczących losu komórek podczas gastrulacji3,5. Gastrulacja u myszy jest szybka, ponieważ cały proces gastrulacji zachodzi w ciągu 48 godzin, od dnia embrionalnego E6.5 do E85.

Ostatnie osiągnięcia w technologiach jednokomórkowych umożliwiły szczegółowe mapowanie rozwoju embrionalnego myszy typu dzikiego, zapewniając kompleksowy przegląd komórkowych i molekularnych krajobrazów zarodków podczas gastrulacji3,4,6,7,8. Jednak analiza zmutowanych zarodków na tych etapach jest mniej powszechna i często ogranicza się do populacji posortowanych przez FACS9,10. Skąpa literatura odzwierciedla wyzwania techniczne związane z manipulacją i preparacją pojedynczych komórek zarodków gastrulatujących, które wymagają genotypowania. Uchwycenie dynamicznego procesu gastrulacji może stanowić wyzwanie ze względu na jego szybki charakter, zwłaszcza w celu zrozumienia zmutowanych zarodków. Czas i synchronizacja ciąż są niezbędne, ponieważ nawet niewielkie różnice między ciążami w czasie mogą być błędnie interpretowane jako fenotyp rozwojowy wynikający ze zmutowanego genu. Staje się to szczególnie ważne, gdy zmutowany gen wpływa na proces gastrulacji13,14. W tym badaniu ustalono wytyczne dotyczące uzyskania zsynchronizowanych ciąż poprzez wizualizację czopów dopochwowych (tj. masy skrzepłego płynu nasiennego powstałego w pochwie samicy po kryciu). Ponadto opracowano strategię mającą na celu uzyskanie wiarygodnych danych dotyczących pojedynczych komórek ze zmutowanych zarodków gastrulujących od E6,5 do E8. Strategia ta została opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z małą liczbą zarodków o pożądanym genotypie w ciąży oraz spadkiem żywotności spowodowanym zamrażaniem i rozmrażaniem zarodków lub komórek.

Ten artykuł opisuje zoptymalizowaną metodologię od ustanowienia ciąż w czasie za pomocą czopów dopochwowych do końcowego sekwencjonowania pojedynczych komórek/jąder. Metoda ta wyjaśnia, jak zwiększyć liczbę ciąż zsynchronizowanych w celu uzyskania większej liczby zarodków o pożądanym genotypie, izolacji komórek/jąder w celu poprawy żywotności komórek oraz protokołu genotypowania tego samego dnia. Manuskrypt ten opisuje również proces izolacji zarodka w różnych punktach czasowych gastrulacji. Metodologia ta przyczynia się do zwiększenia liczby końcowych żywotnych komórek/jąder zarodków do sekwencjonowania, zapewniając wysoką jakość danych sekwencjonowania. W związku z tym metoda ta otworzy drzwi do badań jednokomórkowych zarodków gastrulujących, które wymagają genotypowania.

Protokół

Ten protokół i wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały formalnie zatwierdzone i zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi ustanowionymi przez Temple University Institutional Animal Care and Use Committee, który przestrzega międzynarodowych wytycznych Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Wszystkie opisane myszy znajdowały się na szczepie tła C57 / BL6N. W badaniach tych nie zaobserwowano żadnych obaw związanych ze zdrowiem zwierząt.

1. Kolonia hodowlana i ciąże w określonym czasie

  1. Zmierz czas ciąży poprzez wizualizację czopa dopochwowego. Południe w dniu wtyczki jest uważane za E0,5.
  2. Myszy domowe w klatkach z materiałem ściółkowym zawierającym rozdrobnioną ściółkę z twardego drewna i papierowy materiał gniazdowy.
    1. Każda klatka zawiera karmę dla myszy, świeżą wodę i przedmiot wzbogacający (np. tunel i materiał do gniazdowania). Śledź i zbieraj informacje o koloniach codziennie podczas hodowli z pomiarem czasu.
    2. Rejestruj wszystkie informacje, takie jak wiek myszy, liczba ciąż samicy myszy, liczba zatyczek umieszczonych przez samca myszy oraz stadium rui (Rysunek 2) dla samic myszy.
      UWAGA: Samice, które urodziły już 1-2 razy, będą rodzić większe rozmiary miotu w przyszłych ciążach.
  3. Przed rozpoczęciem ciąży w czasie trzymaj samca myszy samotnie w klatce na 1 tydzień przed rozmnażaniem. W tygodniu rozpoczęcia hodowli należy wprowadzić do klatki co najmniej 1 samicę na samca.
    UWAGA: W zależności od zatwierdzonego protokołu dla zwierząt, dodanie 2-3 samic do klatki hodowlanej może być dozwolone i jest preferowane w celu zwiększenia wytwarzania zatyczek.
  4. Ustaw co najmniej 4 tria hodowlane (2 samice myszy na 1 samca), aby zwiększyć szanse na zsynchronizowane ciąże w klatkach (czyli wiele zatyczek tego samego dnia). Zwiększy to liczbę zarodków izolowanych na tym samym etapie rozwoju.
  5. Zorganizuj idealne krycie po południu lub wieczorem przed godziną 17, a samice umieszcza się w klatce samca lub odwrotnie. Jeśli rozmnażanie nie nastąpi w ciągu 4-5 dni, rozważ zmianę partnerów do krycia co drugi dzień.
    UWAGA: Jeśli nie możesz sprawdzić, czy następnego ranka nie ma czopa dopochwowego, oddziel parę lęgową poprzedniego wieczoru (tj. w weekend/święta).
  6. Sprawdzaj, czy nie ma czopów dopochwowych codziennie wczesnym rankiem, preferowane jest przed 9 rano.
    1. Aby sprawdzić, czy nie ma zatyczek dopochwowych, delikatnie podnieś samice myszy za podstawę ogona i obserwuj otwór pochwy. Poszukaj białej lub kremowej galaretowatej masy. Często czop dopochwowy może być widoczny, ale jeśli nie jest jasny, weź pęsetę i delikatnie zbadaj otwór pochwy. Weź pod uwagę tylko bardziej widoczne wtyczki do izolacji. Patrz Rysunek 2C.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma zatyczek dopochwowych tak wcześnie, jak to możliwe rano, aby uniknąć przegapienia potencjalnej ciąży. Korki mogą wypadnąć lub rozpuścić się po 12 godz.
      UWAGA: Nawet jeśli zaobserwuje się wtyczkę, nie gwarantuje to, że samica myszy będzie w ciąży. Jeśli zaobserwuje się częściowy czop lub jego brak, ale w pobliżu otworu pochwy samic myszy występuje zaczerwienienie, nie należy brać tych samic do izolacji, ponieważ istnieje mniejsze prawdopodobieństwo, że zatyczka się przyklei. Prawdopodobieństwo zajścia w ciążę po kryciu różni się w zależności od szczepu myszy i zależy od fazy cyklu rujowego podczas krycia (Ryc. 2).
  7. Po zaobserwowaniu czopa dopochwowego zapisz dzień. Południe tego samego dnia, w którym obserwuje się czop dopochwowy, uważa się za E0,5. Oddzielić samice myszy od klatki hodowlanej i odizolować zarodki w zależności od pożądanego stadium gastrulacji.
    UWAGA: Ta metoda nie zapewnia dokładnego czasu krycia. Tradycyjnie zakłada się, że krycie ma miejsce około północy poprzedniej nocy. W związku z tym uważa się, że zarodki mają pół dnia (E0,5) do południa w dniu, w którym zaobserwowano czop pochwowy.

2. Izolacja zarodków myszy podczas gastrulacji

  1. Przed rozpoczęciem izolacji zarodków należy przygotować wszystkie wymagane odczynniki i sprzęt.
    1. Dokładnie oczyść obszar 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania (kleszcze i nożyczki) są umyte i wysterylizowane. Uzyskać sterylne 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)/10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20 ml DPBS-/- i umieścić na lodzie.
    2. Wykonaj wszystkie izolacje za pomocą mikroskopu stereoskopowego ze stolikiem ze światłem przechodzącym i kamerą, aby pomóc w fenotypowaniu rozwoju ogólnego.
  2. Poddaj ciężarnej mysiej zaporze i natychmiast rozpocznij izolację.
    1. Umieść ciężarną koferdam w komorze CO2 z natężeniem przepływu CO2 dostosowanym tak, aby przemieszczać 20% objętości klatki na minutę. Uważnie monitoruj mysz i potwierdź śmierć, obserwując brak ruchów oddechowych.
    2. Utrzymuj przepływ CO2 przez dodatkowe 2 minuty po braku ruchów oddechowych. Potwierdź eutanazję, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Ustaw myszy w normalnej pozycji stojącej na twardej, płaskiej powierzchni. Następnie, trzymając kciuk i pierwszy palec jednej ręki na karku u podstawy czaszki, pchnij do przodu i w dół, jednocześnie ciągnąc do tyłu drugą ręką, trzymając podstawę ogona.
    4. Sprawdź skuteczność zwichnięcia, czując separację kręgów szyjnych. Po przecięciu rdzenia kręgowego wyczuwalna będzie przestrzeń 2-4 mm między kłykciami potylicznymi a pierwszym kręgiem szyjnym.
      UWAGA: Nie należy poddawać eutanazji wielu ciężarnych matek jednocześnie, ponieważ wpłynie to na żywotność komórek. Izofluoran może być stosowany jako alternatywny środek znieczulający, jeśli zostanie zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) lub równoważny organ.
  3. Połóż ciężarną koferdam na plecach i wysterylizuj obszar w pobliżu otworu pochwy etanolem.
    1. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety podnieś fałd skórny w pobliżu otworu pochwy i wykonaj małe nacięcie w kształcie litery V, powoli odsłaniając macicę ciężarnej matki (Rysunek 3 [żółta strzałka]).
    2. Wypreparuj róg macicy ciężarnej matki, przytrzymując jeden jego koniec pęsetą i przecinając wzdłuż niego, upewniając się, że usunąłeś szyjkę macicy. Umieść róg macicy na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej DPBS-/- na lodzie (Rysunek 3).
      UWAGA: W zależności od etapu izolacji zarodka, macica będzie przypominać mniejsze lub większe miejsca zagnieżdżenia się (tj. "perły" na sznurku).
  4. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety odetnij każde miejsce implantacji ("perły") zawierające znajdujące się w środku obrzęki liściaste i umieść w świeżym DPBS-/- na 6-centymetrowej szalce Petriego na lodzie (Rycina 3).
    UWAGA: Przeciętna ciężarna matka będzie miała około 6-8 zagnieżdżonych zarodków.
  5. Weź jedno miejsce implantacji i umieść je na nowej 6 cm szalce Petriego na stoliku mikroskopu stereoskopowego i dodaj do niego 500 μl DPBS-/-. Dostosuj ostrość mikroskopu i źródła światła (Rysunek 3).
    UWAGA: W zależności od wielkości miejsca implantacji, ilość DPBS może się różnić; celem jest uzyskanie wystarczającej ilości DPBS, aby miejsce implantacji było zanurzone.
  6. Za pomocą pęsety preparacyjnej z cienką końcówką usuń mięsień macicy z miejsca implantacji. Przytrzymaj miejsce implantacji jednym zestawem pęsety w jednej ręce, a drugą ręką powoli włóż kolejną parę kleszczyków w koniec miejsca implantacji wyciętego z rogu macicy, powoli odsłaniając obrzęk decidua (Rycina 3).
    UWAGA: Nie ciągnij ani nie ciągnij zbyt mocno powierzchni macicy, ponieważ może to doprowadzić do pęknięcia obrzęku dziesiętnego, a nawet lizy zarodka.
  7. Po wyizolowaniu obrzęku dziesiętnego przystąp do odsłonięcia zarodka.
    1. Przytrzymaj antymesometrialny koniec obrzęku dziesiętnego jedną parą kleszczy, a drugą parą powoli wykonaj poziome cięcie około 1/4 wielkości obrzęku dziesiętnego od końca mesometrialu (tj. często bardziej spiczasty koniec obrzęku dziesiętnego).
    2. Teraz, za pomocą obu kleszczy, powoli odepchnij od końca antymesometrialnego obrzęku dziesiętnego, a zarodek wyskoczy ze świeżo ściętego końca mesometrialu (Ryc. 3).
      UWAGA: Nie rozdzierać obrzęku dziesiętnego, ponieważ spowoduje to złamanie zarodka. W razie potrzeby wykonaj mniejsze nacięcia wzdłuż mesometrialnego końca obrzęku dziesiętnego.
  8. Po ujawnieniu zarodka należy usunąć wszelkie przyczepione tkanki pozazarodkowe.
    1. Ciemieniowy worek endodermalny i stożek ektołożyskowy mogą spontanicznie oderwać się od zarodka podczas procesu odsłaniania, ale jeśli nie, użyj kleszczy i usuń je wraz z powiązaną krwią matki. Następnie za pomocą dwóch kleszczy przytrzymaj zarodek jedną parą i powoli oderwij woreczek żółtkowy trzewny od zarodka za pomocą drugiego zestawu.
    2. Za pomocą pipety P20 umieść woreczek żółtkowy z nie więcej niż 10 μl DPBS-/- z naczynia w 8-paskowej probówce z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) na lodzie, ponieważ będzie ona używana do genotypowania tego samego dnia.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby próbka woreczka żółtkowego nie była zanieczyszczona tkanką pochodzącą od ciężarnej matki. Zakażenie może prowadzić do nieprawidłowego przypisania genotypu zarodka.
  9. Rób jasne zdjęcia terenowe świeżo wyizolowanych zarodków, aby upewnić się, że stopień zaawansowania rodzeństwa z miotu jest podobny. Za pomocą pipety P200 powoli odpipetuj zarodek za pomocą 50 μl DMEM/10% FBS i umieść go w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Niech zarodki pozostaną na lodzie, dopóki genotypy nie zostaną potwierdzone.
    UWAGA: Zarodki trzymano na lodzie przez 3-4 godziny bez widocznej degradacji, ale nie należy przekraczać tego czasu, ponieważ nastąpi spadek żywotności komórek. Należy odpowiednio oznaczyć zarodki i probówki do genotypowania. Zachęca się do wykonywania zdjęć w jasnym polu w celu identyfikacji i opisu dużych różnic fenotypowych między zarodkami.
  10. Powtórz te kroki dla wszystkich pozostałych obrzęków dziesiętnych. Wyczyść wszystkie narzędzia do preparowania i używaj nowych tworzyw sztucznych do każdej izolacji, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń z poprzednich izolacji.
    UWAGA: Należy upewnić się, że zabiegi preparacyjne są ograniczone do 1 godziny od momentu pobrania miejsca implantacji od ciężarnej matki.
  11. Przystąp do izolowania zarodków od następnej ciężarnej matki (jeśli zidentyfikowano mnogość ciąż zsynchronizowanych) przed przejściem do etapu genotypowania tego samego dnia.

3. Genotypowanie tego samego dnia (Rysunek 4)

  1. Trawić każdy woreczek z żółtka trzewnego w 8-paskowej probówce do PCR. Za pomocą pipety P20 dodaj 19,3 μl buforu do lizy DNA matrycy PCR i 0,7 μl 0,2 μg/ml proteinazy K do każdej próbki woreczka żółtkowego.
  2. Wirować próbkę przez 10 s i wirować w dół, aby umieścić próbki na dnie probówki za pomocą mini wirówki z adapterem paskowym przy 1 000 x g przez 10 s. Umieścić 8-paskową probówkę do PCR w bloku grzewczym o temperaturze 85 °C na 45 minut i wirować przez 5 s co 5 minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby wirować próbki podczas trawienia, aby zmaksymalizować lizę komórek w ciągu 45 minut.
  3. Po 45 minutach odwirować probówkę za pomocą mini wirówki z adapterem paskowym o wartości 1 000 x g przez 10 sekund i kontynuować PCR w celu pożądanej identyfikacji genetycznej. W celach informacyjnych podano przykładowy protokół dla systemu Cre-lox. Poniżej znajduje się przykład warunków PCR do genotypowania Cre. Zaprojektuj podkłady, aby wzmocnić obszary 5' i 3' docelowego miejsca Cre.
  4. Aby przeprowadzić reakcję PCR do genotypowania Cre, należy przygotować główną mieszankę PCR w 8-paskowej probówce PCR dla każdego woreczka żółtkowego zawierającego 10 μL mieszaniny polimerazy DNA Taq, 0,5 μL 0,5 μM startera Cre do przodu, 0,5 μL 0,5 μM startera odwróconego Cre, 5 μL wody certyfikowanej do PCR, i 4 μl genomowego DNA woreczka żółtkowego.
    UWAGA: Jeśli używasz protokołu, który został zoptymalizowany pod kątem genotypowania ogona myszy, dodaj podwójną ilość DNA, która jest zwykle używana w celu uzyskania czystszych wyników.
  5. Po przygotowaniu mieszanki głównej PCR uruchom program amplifikacji cyklu termicznego PCR. W przypadku genotypowania Cre cykl jest następujący: (1) 95 °C przez 3 minuty, (2) 95 °C przez 30 s, (3) 55 °C przez 30 s, (4) 72 °C przez 30 s, powtarzany krok 2-4 przez 34 cykle, (5) 72 °C przez 10 minut, (6) 4 °C utrzymywanie. Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym, aby wyciągnąć wnioski dotyczące genotypowania.
    UWAGA: Jeśli do identyfikacji genetycznej konieczny jest więcej niż jeden PCR, należy przeprowadzić reakcje PCR jednocześnie, aby zoptymalizować czas. Aby przyspieszyć ten proces, należy przygotować żel agarozowy dzień wcześniej w dniu eksperymentu i przechowywać go przez noc w temperaturze 4 °C. Nie należy brać pod uwagę próbek bez wyraźnych genotypów. W przypadku próbek należy wziąć pod uwagę zarówno genotyp, jak i etap rozwoju, ponieważ rodzeństwo z miotu może znajdować się na różnych etapach gastrulacji i potencjalnie zniekształcone wyniki. Podczas wykonywania genotypowania alleli LoxP, prążki PCR oczekiwane w żelu mogą się różnić w zależności od zastosowanego sterownika Cre. Na przykład, jeśli czynnik Cre ulega ekspresji w trzewnym woreczku żółtkowym, prążek Loxp będzie wydawał się przesunięty w zarodkach Cre-dodatnich (Cre+) w porównaniu z Cre-ujemnymi (Cre-). Jeśli jednak Cre nie ulega ekspresji w trzewnym woreczku żółtkowym, rozmiar prążka Loxp będzie taki sam jak w Cre+ i Cre- zarodkach (tj. allele Loxp nie będą floksowane w linii woreczka żółtkowego). Zarodek będący nosicielem jednego allelu Cre+ i dwóch alleli Loxp jest uważany za zarodek warunkowy KO. Jednakże, aby potwierdzić delecję genu floksowanego, zaleca się wykonanie potwierdzenia nokautu genu na komórkach, które wyrażają czynnik Cre, albo poprzez powtórzenie protokołu genotypowania, albo przez analizę qPCR poziomów mRNA genu floksowanego (Figura 4D, E).
  6. Pozostałe strawione próbki woreczka żółtkowego należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Dysocjacja komórek zarodków i żywotność komórek

  1. Po potwierdzeniu genotypów należy wziąć pipetę P200 i odpipetować 50 μl DMEM/10% FBS. Zebrać zarodki o tym samym genotypie w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i umieścić probówkę na lodzie.
    UWAGA: Nie należy kontynuować eksperymentu, jeśli nie ma co najmniej 5 zarodków w grupie (E7-E7.5) lub 3 (E7.75-E8), ponieważ liczba komórek i żywotność ogromnie się zmniejszy.
  2. Po zebraniu zarodków na podstawie genotypów, pozwól im osiąść na dnie probówki. Umyj połączone zarodki, dodając 50 μl DPBS-/-, a następnie poczekaj, aż zarodki się uspokoją, zanim usuniesz jak najwięcej DPBS-/- bez wyjmowania zarodków z probówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    UWAGA: Trzymanie probówki o pojemności 1,5 ml do źródła światła lub w kierunku okna ułatwi zobaczenie zarodków osiadających na dnie probówki.
  3. Dodać 100 μl trypsyny do połączonych zarodków i inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym przez 5 minut. Delikatnie przesuwaj probówki o pojemności 1,5 ml co 30 sekund, aby pomóc komórkom w dysocjacji.
    UWAGA: Nie używaj wiru ani pipety podczas procesu trypsynizacji, ponieważ uszkadza to komórki. Jeśli łączy się więcej niż 5 zarodków (E7-E7,5) lub 3 zarodki (E7,75-E8), należy przeprowadzić trawienie trypsyny w innej probówce z równoważną ilością trypsyny (~20 μl na 1 zarodek). Użyj ~20 μl trypsyny na zarodek (E6.5-E7.5), 35 μl na zarodek (E7.75) i 40 μl na zarodek (E8).
  4. Po 5 minutach zneutralizuj trypsynę za pomocą 300 μL DMEM/10% FBS. Odwirować zebrane zarodki w stężeniu 100 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Po odwirowaniu dla wszystkich próbek pojawi się mały osadek. Zawiesić granulki w 40 μl DMEM/10% FBS i umieścić je na lodzie.
    UWAGA: Wielkość osadu będzie się różnić w zależności od liczby połączonych zarodków. Możliwe, że granulka nie jest widoczna, ale przejdź do następnego kroku. Ilość DMEM/10% FBS wymagana do neutralizacji trypsyny będzie zależeć od ilości dodanej trypsyny. Dodaj 3 razy więcej DMEM/10% do ilości trypsyny.
  5. Oznaczyć stężenie zawieszonych komórek (40 μl) za pomocą automatycznego licznika komórek. Wymieszaj 5 μl komórek z 5 μl błękitu trypanowego w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Dokładnie wymieszać pipety i pipetować na szkiełku, aby określić liczbę komórek i żywotność komórek. Optymalne stężenie komórek wynosi 700-1200 komórek/μl, a żywotność komórek wynosi 90% lub więcej.
    UWAGA: Jeśli stężenie jest niższe niż 200 komórek/μl, a żywotność jest mniejsza niż 50%, nie kontynuuj eksperymentu. Jeśli stężenie komórek jest zbyt wysokie, rozcieńczyć zawiesinę komórek i ponownie przeliczyć komórki. Jeśli zaobserwuje się grudki komórek, użyj sitka do komórek, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową.
  6. Przejdź do partycjonowania pojedynczych komórek za pomocą chipa mikroprzepływowego i postępuj zgodnie z protokołem producentów chipów mikroprzepływowych11.

5. Izolacja jąder myszy (opcja dla większych embrionalnych punktów czasowych od E8)

  1. Przygotować świeże do lizy i płukania przedstawione w tabeli 1 i umieścić je na lodzie.
    UWAGA: Izolację jąder można przeprowadzić na próbkach świeżych lub mrożonych. Jeśli próbki są zamrożone, pozwól im rozmrozić się przez 2-5 minut na lodzie.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy potwierdzić wszystkie genotypy i zebrać tylko zarodki o czystych genotypach.
  3. Za pomocą pipety P200 dodaj 50 μl buforu do lizy jąder do połączonych zarodków w probówce o pojemności 1,5 ml, dążąc do uzyskania co najmniej 3 zarodków na grupę mutantów. Pozostawić próbki na lodzie z buforem do lizy przez 5 minut i wirować co 30 sekund.
  4. Po 5 minutach inkubacji odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety P200 usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu do przemywania . Po ponownym zawieszeniu odwirowywać przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 40 μl DPBS-/-. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Wymieszaj 5 μl jąder z 5 μl błękitu trypanowego w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Dokładnie odpipetować mieszaninę i umieścić ją na szkiełku podstawowym w celu określenia liczby komórek i żywotności.
    UWAGA: Membrana jądrowa jest przepuszczalna dla błękitu trypanowego; Dlatego wyizolowane barwienie jąder jest dodatnie dla błękitu trypanowego. W automatycznym liczniku komórek procent martwych komórek jest używany do oszacowania procentu izolowanych jąder (Rysunek 5A).
  6. Jeśli procent nienaruszonych jąder jest większy niż 90% (co oznacza, że co najmniej 90% jąder jest zabarwionych błękitem trypanowym i wykazuje zaokrąglony kształt i jędrny wygląd; patrz Rysunek 5B, C), przystąp do korzystania z chipa mikroprzepływowego i postępuj zgodnie z protokołem producentów chipów mikroprzepływowych11.

6. Partycjonowanie pojedynczych komórek (w tym amplifikacja cDNA i budowa biblioteki)

  1. Natychmiast postępuj zgodnie z protokołem sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, postępując zgodnie z protokołem producenta chipa mikroprzepływowego11, aby uzyskać najbardziej optymalne wyniki. Ustaw odzyskiwanie komórek docelowych na 6000 komórek lub więcej.

7. Sekwencjonowanie

  1. Po zbudowaniu bibliotek zmierz rozkład wielkości fragmentów i stężenia próbek za pomocą automatycznego analizatora elektroforetycznego.
    UWAGA: Optymalny rozkład wielkości fragmentów wynosi od 300 do 1000 pz.
  2. Próbki są gotowe do załadowania do sekwencera. Łącz ze sobą biblioteki z różnych przykładów. Końcowe stężenie ładowania bibliotek w puli wynosi 750 pM w całkowitej objętości 24 μL. Załaduj biblioteki w puli do kasety z odczynnikiem, postępując zgodnie z protokołem producenta sekwencjonowania12.
  3. Sekwencjonuj biblioteki załadowane do wstępnie zmontowanej komory przepływowej i wkładu zgodnie z żądaną głębokością sekwencjonowania z podwójnym indeksowaniem na dwóch końcach. Odczyty sekwencjonowania zgodne z protokołem opisanym przez producentów chipów mikroprzepływowych są następujące11: Odczyt 1: 28 cykli, Indeks i7: 10 cykli, Indeks i5: 10 cykli i Odczyt 2: 90 cykli. Po zakończeniu sekwencjonowania dane poddawane są analizie bioinformatycznej.
  4. Korzystaj z metod bioinformatycznych do przeprowadzania kontroli jakości. Obejmuje to ocenę liczby zsekwencjonowanych komórek, odczytów na komórkę i liczby genów zmapowanych na komórkę.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, liczba zsekwencjonowanych komórek wynosi co najmniej 80% komórek docelowych. Zaleca się, aby liczba odczytów na komórkę wynosiła co najmniej 30 000, a liczba wykrytych genów była wyższa niż 3000 (dla próbek myszy).

Wyniki

Metodologia opisana w niniejszej pracy została zaprojektowana specjalnie w celu usprawnienia przygotowania próbek embrionów do analiz omicznych pojedynczych komórek (single-cell omics) z okresu od E6.5 do E8. Ten niezawodny schemat składa się z pięciu głównych etapów: synchronizacji ciąż, izolacji embrionów, genotypowania w tym samym dniu, dysocjacji komórek oraz oceny żywotności komórek (Rycina 1A). Choć przedstawione dane koncentrują się na punktach czasowych od E7 do E7.5, metodę tę można zastosować do embrionów aż do etapu E8 (Rycina 1B) z niewielkimi modyfikacjami w procedurze (patrz uwagi w protokole). Synchronizację ciąż osiągnięto poprzez umieszczenie dwóch samic myszy w klatce z samcem. Obecność czopów pochwowych sprawdzano codziennie rano przed godziną 10:00; jeśli stwierdzono obecność czopu, uznawano to za dzień E0.5 do południa tego samego dnia (Rycina 2A). W niniejszym badaniu optymalne warunki uzyskania czopów wymagały sparowania samicy myszy w fazie rujej lub proruji z samcem, który w poprzednich cyklach rozrodczych z sukcesem doprowadził do powstania kilku czopów (Rycina 2B). Do izolacji embrionów dopuszczano wyłącznie przypadki z ewidentną obecnością czopów (Rycina 2C).

Czas rozwoju szacowano zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 2A. W przypadku etapu E7.5 sekcję embrionów rozpoczęto o godzinie 12:00 w 7ym dniu po dniu stwierdzenia występowania czopa. Rysunek 3 obrazuje prawidłową izolację embrionu w stadium E7.5. Po eutanazji ciężarnej samicy wypreparowano róg macicy, a następnie poszczególne obrzęki decydualne przecięto, odsłaniając embrion; worek żółtkowy odizolowano w celu przeprowadzenia genotypowania (Rysunek 3).

Genotypowanie w tym samym dniu przeprowadzono w ciągu 3 h od izolacji zarodków, postępując zgodnie z krokami przedstawionymi na Rysunku 4A. Podczas procesu genotypowania zarodki przechowywano w lodzie, aby zachować ich integralność. Nie należy zamrażać zarodków, ponieważ zmniejszy to liczbę żywotnych komórek w każdym zarodku. Rysunek 4B,C przedstawiają trzewny worek żółtkowy, ścienny worek endodermalny oraz stożek ektoplacentalny wraz z towarzyszącą krwią matczyną. Do genotypowania wykorzystano trzewny worek żółtkowy (Rysunek 4C). Po strawieniu worka żółtkowego przygotowano mieszaninę do PCR i przeprowadzono reakcję PCR. Otrzymany produkt PCR rozdzielono następnie w żelu agarozowym. Rysunek 4D przedstawia oczekiwane wielkości fragmentów dla alleli LoxP i typu dzikiego (odpowiednio 597 bp i 498 bp) oraz allelu Cre (650 bp). Na Rysunku 4E zaprezentowano przykład genotypowania worków żółtkowych 6 zarodków uzyskanych z par hodowlanych niosących allele Cre i LoxP (flox). Żele obrazują produkty PCR alleli Cre i LoxP u 6 analizowanych zarodków. Zarodki nr 2 i nr 5 niosą 2 allele flox i 1 allel cre; w związku z tym są one uznawane za zarodki kondycjonalnego KO (Rysunek 4E, czerwone kropki). Zarodki 1 i 3 posiadają 2 allele flox, ale są negatywne pod kątem Cre; zatem są one uznawane za kontrole flox. Zarodek 4 posiada 2 allele flox i słabą prążkowanie dla allelu Cre, co skutkuje „niejasnym” genotypem. Zarodek ten nie był dalej przetwarzany (alternatywnie badacz może rozważyć powtórzenie genotypowania lub przeprowadzenie wtórnej walidacji kondycjonalnego KO z użyciem komórek wykazujących ekspresję Cre). Należy zauważyć, że driver Cre użyty w tym eksperymencie nie jest eksprymowany w trzewnym worku żółtkowym15; w związku z czym allele LoxP nie wykazują przesunięcia na żelu zarodków Cre-dodatnich w porównaniu z zarodkami Cre-ujemnymi.

Prawidłowa liczba komórek oraz ich dobra żywotność są niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu jednokomórkowego. Zawiesiny o niskiej żywotności komórek, wysokim odsetku komórek martwych, występującym agregowaniu lub znacznej ilości debris nie nadają się do dalszego przetwarzania. Optymalne warunki to 700-1200 żywych komórek na µL i żywotność >90%. Rysunek 5A przedstawia panel ilustrujący zarówno dobrą, jak i suboptymalną żywotność komórek. Te same kryteria można zastosować również do izolacji jąder komórkowych, co pokazano na Rysunku 5B. Należy jednak pamiętać, że ocena z użyciem błękitu trypanu różni się w przypadku komórek i jąder: żywe komórki nie wchłaniają błękitu trypanu, podczas gdy żywe jądra tak. Jeśli zawiesina komórek/jąder jest optymalna (>90% żywotności), należy przystąpić do rozdzielania pojedynczych komórek przy użyciu chipa mikrofluidycznego zgodnie z procedurami producenta11. Opcje rozwiązywania problemów przedstawiono dla zawiesin, w których żywotność komórek/jąder mieści się w przedziale 60%-89%, co zilustrowano na Rysunku 5C. Jeśli żywotność, niezależnie od całkowitej liczby komórek, spadnie poniżej 60%, należy rozważyć przerwanie eksperymentu.

Cały proces, od uśmiercenia ciężarnej samicy do konstrukcji biblioteki, trwa łącznie 8 godzin w tym samym dniu (tj. etapy protokołu od 2 do 6 muszą zostać wykonane tego samego dnia). Zgodnie z procedurami opracowanymi przez producentów systemów do analizy pojedynczych komórek11, biblioteki do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) przygotowano z komórek uzyskanych z embrionów E7, przy żywotności komórek od poziomu suboptymalnego do optymalnego, dążąc do szacowanej odzyskiwalności 2000 komórek (Rycina 6). Rycina 6A przedstawia reprezentatywny rozkład wielkości fragmentów bibliotek scRNA-seq zarówno dla warunków suboptymalnych, jak i optymalnych, co wskazuje, że żywotność komórek nie wpływa znacząco na cały proces partycjonowania pojedynczych komórek. Rozkład wielkości fragmentów mieścił się w zakresie 400-500 bp. Wskazuje to, że warunki suboptymalne nie wpływają na proces przygotowania biblioteki. Rycina 6B pokazuje wyniki zarówno udanych, jak i suboptymalnych eksperymentów scRNA-seq. Po sekwencjonowaniu przeprowadzono kontrolę jakości próbek, w wyniku której zaobserwowano, że w przypadkach suboptymalnej żywotności komórek pomyślnie zsekwencjonowano tylko 10% komórek. W przeciwieństwie do tego, próbki optymalne wykazały wyższy odsetek – zsekwencjonowano 91% wszystkich komórek. Potwierdzają to wykresy kodów kreskowych (barcode plots), wskazujące, że warunki suboptymalne charakteryzują się większym szumem tła w porównaniu z warunkami optymalnymi. W obu eksperymentach przeprowadzono analizę klastrowania, która ujawniła 9 klastrów w warunkach optymalnych i 4 w suboptymalnych. Adnotacja klastrów z wykorzystaniem znanych markerów3 ujawniła oczekiwane typy komórek w embrionach E7, w tym epiblast i prążek pierwotny (Rycina 6B). Adnotacja klastrów w eksperymencie suboptymalnym nie była możliwa ze względu na brak wzbogacenia w znane markery dla poszczególnych klastrów. Podkreśla to znaczenie wysokiej jakości komórek, niezbędnych do prawidłowej reprezentacji danych na tych etapach rozwoju.

Schemat genotypowania zarodków i oś czasu gastrulacji dla mikrofluidycznej analizy pojedynczych komórek.
Rysunek 1: Optymalizacja całych zarodków mysich w fazie gastrulacji do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. (A) Schemat procesu pozyskiwania wysokiej jakości komórek i/lub jąder komórkowych z zarodków w fazie gastrulacji. (B) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu oraz zaadaptowany schemat3 zarodków mysich podczas gastrulacji od E7 do E8. Pasek skali: 125 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Oś czasu hodowli myszy i etapy receptywności; wykrywanie czopów pochwowych; przewodnik po izolacji zarodków.
Rycina 2: Strategia wydajnych, zsynchronizowanych ciąż terminowych dla izolacji zarodków podczas gastrulacji. (A) Schemat przedstawiający przebieg ciąż terminowych oraz harmonogram określający czas od wykrycia czopu do izolacji zarodków w celu analizy konkretnych faz gastrulacji. (B) Reprezentatywne obrazy faz cyklu rujowego u samic myszy. Wskazano fazy najbardziej receptywne na rozród. (C) Schemat ilustrujący sposób sprawdzania obecności czopów pochwowych oraz przykłady ujść pochwy bez czopu, z czopem częściowym lub z wyraźnym czopem, które należy uwzględnić przy izolacji zarodków. Ujścia pochwy są powiększone pod każdym obrazem. Czop (skrzepłe nasienie w ujściu pochwy) jest zaznaczony czerwoną strzałką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat sekcji embrionów, przedstawiający krok po kroku wycięcie macicy i usuwanie embrionów.
Rycina 3: Sekcja i genotypowanie embrionów E7.5 do sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek. Schematy i zdjęcia procesu izolacji embrionów E7.5 oraz sekcji trzewnego worka żółtkowego. Żółta strzałka wskazuje macicę ciężarnej samicy, a żółta przerywana okrąg zaznacza położenie embrionu. Linie przerywane reprezentują miejsca nacięć wykonanych podczas sekcji. „M” oznacza koniec mezometrialny, natomiast „AM” oznacza koniec antymezometrialny. Paski skali na zdjęciach ze stereomikroskopu wynoszą 400 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Proces izolacji worka żółtkowego i PCR, schemat blokowy, obrazy zarodków, wyniki żelowania genotypowania, analiza DNA.
Rycina 4: Jednodniowe genotypowanie worków żółtkowych z gastrulujących zarodków myszy. (A) Schemat przepływu pracy dla jednodniowego genotypowania worków żółtkowych. (B) Reprezentatywny obraz ściennego worka endodermalnego i stożka ektoplacentalnego wraz z towarzyszącą krwią matczyną. (C) Trzewny worek żółtkowy w zarodkach E7.5 zaznaczony linią przerywaną. Pasek skali: 200 µm. (D) Reprezentatywne żele dla typu dzikiego (+/+), heterozygot (Flox/+) i homozygot flox (Flox/Flox) oraz genotypowanie Cre (Mesp1cre15) z zaobserwowanymi rozmiarami fragmentów DNA. (E) Przedstawiono wyniki jednodniowego genotypowania alleli Cre i flox z worków żółtkowych 6 zarodków (1-6). Dwa zarodki z genotypowaniem flox/flox i ujemnym (-) wynikiem Cre są kontrolami flox (niebieskie kropki), natomiast te z genotypowaniem flox/flox i dodatnim (+) wynikiem Cre są warunkowymi KO (czerwone kropki). Zarodek 4 nie jest optymalny ze względu na słabą prążek Cre (flox/flox i niejasny wynik Cre) i w konsekwencji zostaje wykluczony z dalszego przetwarzania. Zarodki o tym samym genotypie są łączone w pule i przetwarzane w celu sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Należy zauważyć, że obecność allelu Cre w worku żółtkowym nie wpływa na rozmiar prążków flox, ponieważ zastosowana Cre (Mesp1cre) nie jest eksprymowana w worku żółtkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza żywotności komórek, obrazy mikroskopowe i schemat rozwiązywania problemów dla protokołu mikrofluidycznego.
Rycina 5: Ocena jakości komórek i żywotności jąder. (A) Reprezentatywne obrazy optymalnych i suboptymalnych warunków żywotności komórek z embrionów E7.5. (B) Reprezentatywne obrazy optymalnych i suboptymalnych warunków żywotności jąder z embrionów E8. (C) Schemat rozwiązywania problemów wskazujący potencjalne rozwiązania pomagające zwiększyć żywotność komórek przed rozpoczęciem partycjonowania pojedynczych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza żywotności komórek; żel elektroforetyczny, histogram, wykres rankingu kodów kreskowych, wyniki klastrowania UMAP.
Rycina 6: Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek z embrionów myszy w stadium E7. (A) Reprezentatywny przebieg rozkładu wielkości fragmentów dla bibliotek sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek z embrionów myszy E7 dla suboptymalnych i optymalnych warunków żywotności komórek, z głównym pikiem w okolicy 400-500 bp. Należy zauważyć, że przebiegi są podobne w obu tych warunkach, co wskazuje, że żywotność komórek nie wpływa na kontrole jakości biblioteki. (B) Analiza wyników sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek dla embrionów myszy E7 w warunkach suboptymalnych i optymalnych, pokazująca obserwowany odzysk celu, ranking kodów kreskowych oraz klastrowanie typów komórek za pomocą rozkładu jednorodnej aproksymacji i projekcji rozmaitości (UMAP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bufor do lizy
Nazwa odczynnikaStężenie roztworu stokowegoStężenie końcoweObjętość całkowita 1 mL
Tris-HCL (Ph7)1 M10 mM10 µL
NaCl5 M10 mM2 µL
MgCl20.1 M3 mM3 µL
Tween-2020%0.10%5 µL
Nondiedt P4010%0.10%10 µL
Digitonin5%0.01%2 µL
DTT 1 M1 mM1 µL
Inhibitor RNazy40 U/µL1 U/µL25 µL
Woda wolna od nukleaz----924 µL
Bufor do płukania
Nazwa odczynnikaStężenie roztworu stokowegoStężenie końcoweObjętość całkowita 1 mL
BSA w PBS10%1%100 µL
PBS----900 µL

Tabela 1: Skład buforu lizującego do izolacji jąder oraz buforu płukającego.

Dyskusja

W artykule przedstawiono solidną metodę pozyskiwania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder z zarodków myszy w gastrulacji, specjalnie zaprojektowanych w celu ułatwienia badań nad mechanizmami specyfikacji losu komórki we wczesnym rozwoju. Metoda ta wypełnia istotną lukę w dziedzinie gastrulacji, optymalizując analizę zarodków wymagających genotypów, takich jak płeć lub geny somatyczne. Wykorzystując mysie modele mutacji genetycznych i sekwencjonowanie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości na całych zarodkach myszy, proces ten może jeszcze bardziej zwiększyć zrozumienie profili ekspresji genów wczesnej gastruli myszy. Metoda ta demonstruje wykonalność wykorzystania mysiego modelu mutacji genetycznej za pomocą systemu rekombinazy Cre w celu uzyskania wysokiej jakości komórek i jąder we wczesnych punktach rozwojowych dla omiki pojedynczej komórki. Metoda ta ewoluowała w wyniku wielu prób, podczas których próbki nie spełniały norm jakościowych wymaganych do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki. Wyjaśniona metodologia generuje wystarczającą liczbę komórek/jąder z zarodków młodszych niż E8 poprzez optymalizację trzech krytycznych etapów: (1) zsynchronizowane ciąże w czasie w celu zwiększenia liczby zarodków, (2) genotypowanie tego samego dnia w celu uniknięcia zamrożenia/rozmrożenia oraz (3) ocena żywotności komórek/jąder w celu uniknięcia sekwencjonowania umierających komórek. Protokół ten zapewnia pomyślne wyniki z jednokomórkowym RNASeq, ale zawiesiny komórek lub jąder uzyskane w tym protokole mogą być przetwarzane na innych platformach sekwencjonowania, w których żywotność komórek jest czynnikiem ograniczającym, takich jak smart-seq, drop-seq i cel-seq16.

W zarodku E7 liczba komórek może się różnić w zależności od szczepu i zmutowanego genotypu. Zazwyczaj zarodek E7 może mieć od setek do kilku tysięcy komórek, a uzyskanie zarodków o pożądanym genotypie jest wyzwaniem, ponieważ tylko 1 lub 2 zarodki na ciężarną matkę spełniają kryteria. Protokół ten pozwala na schwytanie około 300 żywotnych komórek na zarodek E7 do analizy pojedynczej komórki. Próby zwiększenia wielkości puli zarodków poprzez błyskawiczne zamrażanie zarodków pochodzących od ciężarnych matek w różnych dniach okazały się nieskuteczne, ponieważ żywotność komórek była poważnie zagrożona po rozmrożeniu, nawet po dodaniu środków krioprezerwujących. Aby sprostać temu wyzwaniu, zoptymalizowano strategię hodowlaną i synchronizację ciężarnych matek. Aby zwiększyć szanse na wielokrotne izolacje, zaleca się wykorzystanie samic myszy, które urodziły 1-2 razy przed rozmnażaniem, w celu izolacji, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że będą miały większe rozmiary miotu. Monitorowanie cyklu rujowego samicy ma kluczowe znaczenie; Krycie jest bardziej prawdopodobne w fazie rui i rui. Jeśli pojawią się trudności hodowlane, zmiana partnerów hodowlanych po czterech dniach pomoże również, jeśli nie zostanie wyprodukowana wtyczka.

Ważne jest, aby pamiętać, że ta metoda ma ograniczenie: opiera się na obserwowanych zatyczkach, a nawet jeśli zaobserwuje się czop, nie gwarantuje ciąży, a jedynie wskazuje na aktywność seksualną. Dlatego zwiększenie liczby obserwowanych zatyczek w ciągu doby zwiększy prawdopodobieństwo urodzenia więcej niż jednej ciężarnej matki w ciągu doby i bardziej pozytywnych genotypów. Protokół ten wykazał możliwość wykorzystania stadiów embrionalnych w zakresie od E7 do E7.75 jako dowodu słuszności koncepcji podczas gastrulacji. Jednak ten rurociąg może być stosowany od zarodków E6,5 do E8. W przypadku zarodków E6.5 zaleca się zwiększenie liczby ciąż zsynchronizowanych w celu uzyskania co najmniej 7 zarodków o pożądanym genotypie do połączenia. Zamiast tego w przypadku zarodków E8 zwiększ ilość trypsyny używanej do dysocjacji każdego zarodka do ~ 40 μL zamiast 20 μL. Celem jest uzyskanie zawiesiny komórka/jądro w zakresie stężeń 700-1200 komórek na μl przed przystąpieniem do partycjonowania.

Dobra żywotność komórek jest niezbędna dla powodzenia sekwencjonowania pojedynczych komórek. W projekcie chipa mikroprzepływowego dostarczonym przez producentów, pojedyncze komórki są podzielone na kulki żelowe w emulsji (GEM) w chipie zawierającym znane kulki żelowe z kodami kreskowymi11. Jednak zauważalnym ograniczeniem tego procesu jest to, że można dzielić na partycje zarówno pojedyncze komórki wysokiej jakości, jak i niskiej jakości. Nawet przy odpowiedniej liczbie żywych komórek (tj. 1000 komórek/μl), jeśli żywotność zawiesiny jest niska (tj. 1000 komórek żywych i 1000 komórek martwych, co daje 50% żywotności), eksperyment sekwencjonowania prawdopodobnie zakończy się niepowodzeniem. Aby uzyskać optymalne wyniki, zaleca się dążenie do rentowności na poziomie około 90%. Jeśli żywotność komórek spadnie między około 60% a 89%, można podjąć specjalne środki w celu zwiększenia żywotności eksperymentu. Jeśli jednak żywotność komórek jest mniejsza niż 60%, zdecydowanie odradza się kontynuowanie eksperymentu. Powodem tego jest to, że umierające komórki zostaną "wychwycone" w żelu do partycjonowania, a późniejsze przygotowanie biblioteki i kontrole jakości przejdą bez zauważalnych problemów. Jednak rzeczywisty eksperyment sekwencjonowania może się całkowicie nie powieść, ponieważ większość odczytów sekwencjonowania będzie mapować geny mitochondrialne, rybosomalne lub apoptozę, wskazując na oznaki słabej żywotności komórek od samego początku. Dane przedstawione w tym artykule ilustrują proces sekwencjonowania pojedynczych komórek zarodków myszy z gastrulacją z komórkami wysokiej jakości. Metodologia ta może być zastosowana do zrozumienia wielu różnych modeli mutacji genetycznych myszy podczas rozwoju.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Rdzeniowi Genomiki w Fox Chase Cancer Center oraz członkom laboratorium dr Johnathana Whetstine'a, Zachowi Grayowi, Madison Honer i Benjaminowi Fermanowi, za wsparcie techniczne dla eksperymentów sekwencjonowania. Wyrażamy uznanie dla członków laboratorium dr Estaras i Alexa Morrisa, rotacyjnego doktoranta, który przyczynił się do wstępnej analizy badań nad pojedynczymi komórkami. Ta praca jest finansowana z grantów NIH R01HD106969 i R56HL163146 dla Conchi Estaras. Dodatkowo Elizabeth Abraham otrzymała wsparcie w ramach grantu szkoleniowego T32 5T32HL091804-12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm szalka PetriegoGenesee Scientific25-202
1000 µ L Reach Końcówka barierowaGenesee Scientific23-430
20 µ L Reach Końcówka barierowaGenesee Scientific24-404
300 µ L Reach Końcówka barierowaGenesee Scientific24-415
37 & mikro; m Odwracalne sitko, małekomórki macierzyste27215
6 cm szalka PetriegoGenesee Scientific25-260
8-paskowe probówki do PCRGenesee Scientific27-125U
AgarozaApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini sucha kąpielGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Mikrowirówka z chłodzeniem HermleGenesee33-759R
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153
Kontroler chromu10XPN-1000127
Chromium Next GEM Zestawy odczynników jednokomórkowych 3' v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automatyczny licznik komórekInvitrogen
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 OdczynnikiAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninaThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR woreczek żółtkowyViagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1,5 mlEppendorf22431021
Dubecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Cienkie kleszczeFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF KleszczeFine Science Tools11252-00
EthanolKoptecV1401
EVOS M7000 System obrazowaniaInvitrogenAMF7000
Drobne nożyczki - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
GraefeKleszcze Fine Science Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
Odczynniki NextSeq 1000/2000 P2 (100 cykli) v3Illumina20046811
NastępnySeq2000Illumina
Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ 1000Nikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Tuba optyczna bez nukleaz WaterGenClone25-511
8x pasek (401428)Nasadka tubusu optycznego Agilent401428
8x Pasek (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, HS24 Mikrowirówka, z wirnikiem 24 x 1,5/2,0 mL, 1 wirówka/jednostkaGenesee31-511
Proteinaza KSigma-AldrichP6556
Zestawy do oznaczania ilościowego Qubit dsDNAInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
Fisher Scientific12-141-368
Standardowe kleszcze wzorcoweFine Science Tools11000-12
Stacja taśmowa Wskazówki dotyczące ładowaniaAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Jakość Biologiczna351-007-101
Niebieska plama trypanowa 0,4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Mieszalnik wirowy IKA MS3 z adapterem 96-dołkowej płytki do pobierania próbekIKA3617000
AMQAX2000 Inhibitor RNazy

Bibliografia

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
  3. Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
  4. Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).
  5. Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
  6. Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
  7. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  8. Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
  9. Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
  10. Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
  11. Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024).
  12. NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024).
  13. Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
  14. Li, Q., et al. editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).
  15. Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gastrulacja zarodk w myszyizolacja zarodk wdysocjacja kom rekizolacja j der kom rkowychprotok genotypowaniadeterminacja linii kom rkowychpartycjonowanie mikroprzep ywowedecyzje o losie kom rekembrionalne kom rki macierzyste
Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.