Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Streszczenie

Użycie histologii do badania różnorodności komórek odpornościowych w sekcjach tkankowych, takich jak te pochodzące z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), jest krytycznie ograniczone przez liczbę parametrów fluorescencyjnych, które mogą być obrazowane w tym samym czasie. Większość podzbiorów komórek odpornościowych została zdefiniowana za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu złożonych kombinacji markerów białkowych, często wymagających czterech lub więcej parametrów do jednoznacznej identyfikacji, co wykracza poza możliwości większości konwencjonalnych mikroskopów. Ponieważ cytometria przepływowa dysocjuje tkanki i traci informacje przestrzenne, istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą zachować informacje przestrzenne podczas badania ról złożonych typów komórek. Zagadnienia te zostały tutaj rozwiązane poprzez stworzenie metody rozszerzania liczby parametrów fluorescencyjnych, które można obrazować, zbierając sygnały spektralnie nakładających się fluoroforów i wykorzystując demiksowanie widmowe do oddzielenia sygnałów każdego pojedynczego fluoroforu. Obrazy te są następnie przetwarzane przy użyciu potoku analitycznego w celu wykonania wysokoparametrowych obrazów histologicznych i wyodrębnienia pojedynczych komórek z tych obrazów, tak aby unikalne właściwości fluorescencyjne każdej komórki mogły być analizowane na poziomie pojedynczej komórki. Korzystając ze strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, komórki można następnie profilować w podzbiory i mapować z powrotem na skrawki histologiczne, aby nie tylko określić ilościowo ich liczebność, ale także ustalić, w jaki sposób oddziałują ze środowiskiem tkankowym. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano prostotę i potencjał wykorzystania cytometrii przepływowej do badania złożonych populacji immunologicznych w sekcjach histologicznych.

Wprowadzenie

Stan zapalny wywołany przez komórki układu odpornościowego i komórki glejowe może przyczyniać się do przewlekłych zaburzeń OUN, gdzie każda populacja może promować aktywność drugiej^1,2,3. Zrozumienie, w jaki sposób układ odpornościowy oddziałuje z tymi elementami OUN w celu promowania zapalenia OUN, jest obecnie głównym tematem zainteresowania i zostało znacznie ułatwione dzięki technikom o wysokich parametrach, takim jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Dzięki sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki odkryliśmy, że istnieje rozległa komunikacja zachodząca między ko....

Protokół

Ten protokół nie obejmuje sekcji tkanek do histologii; zobacz Jain et al.¹⁸ lub¹⁹ w celu uzyskania opisów jak sekcjonować tkanki do histologii. Protokół ten może być stosowany z dowolnymi pociętymi tkankami na szkiełkach podstawowych. W tym artykule użyto pachwinowych węzłów chłonnych wyizolowanych od uodpornionego zwierzęcia, jak opisano wcześniej¹⁸. Procedura i harmonogram tego protokołu są podsumowane w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

Wyniki

Rycina 1: Schemat pracy histoflow cytometrii. Przekroje tkankowe są barwione barwnikami o nakładających się widmach (krok 1). Obrazy są zbierane przy użyciu poszczególnych laserów wzbudzających w połączeniu z regulowanymi filtrami przepustowymi w celu zminimalizowania przenikania spektralnego między fluoroforami (krok 2). Przenikanie spektralne.......

Dyskusja

W tym miejscu opisano zastosowanie cytometrii przepływowej, techniki, która została wcześniej zwalidowana¹⁸. Wykazano, że podczas barwienia skrawków tkanek barwnikami nakładającymi się spektralnie, przesączanie się przez kanały można usunąć za pomocą kompensacji spektralnej, co skutkuje wyraźną rozdzielczością większej liczby parametrów fluorescencyjnych, niż byłoby to normalnie możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod. Ponieważ obrazy histologiczne o wysokich parametrach są trudne do analizy pr.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100% etanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Mikroskopia elektronowa Nauki	157-4
Anakonda	N/A	N/A
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A4503-50G
Żelatyna z plam rybnych na zimno	Sigma	G7765
Sortowanie wielokanałowych danych ze skryptu Imaris.ipynb	N/	A N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Konwertuj
dane wyjściowe FlowJo na plik txt w celu wyboru komórki w skrypcie Imaris.ipynb	N	/A N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey
anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 stężenie
Osioł anty-szczurzy DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200
stężenie Surowica osła	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-koza anty-mysie IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 stężenie
FIDŻI	N/	A NIE DOTYCZY	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Oprogramowanie 4
Przeglądarka			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Świeżo mrożone ludzkie odcinki migdałków	amsbio	HF-707
Szklane szkiełko nakrywkowe	VWR	48393 106
Koza anty-ludzka IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400
stężenie Koza anty-ludzka IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400
stężenie Koza anty-ludzka IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300
stężenie Kozia anty-królik A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 stężenie
Koza anty-królik IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	stężenie 1:250
Serum dla koni	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A
Ilastik FIJI	plugin N/A	N/A
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris z modułem komórkowym	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mysz anty-ludzka CD20	VWR	CA95024-322	1:40 stężenie
Mysz anty-ludzka CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	Stężenie 1:20
Normalna surowica kozia	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normalna surowica myszy	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normalna surowica królika	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normalna surowica szczura	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Rozpuścić w DMSO w stężeniu 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4° C w ciemności
Długopis PAP	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Królik anty-ludzki Ki67	Abcam	ab15580	1:500 stężenie
Królik anty-mysz Iba1	Wako	019-19741	1:500 stężenie
Szczur anty-ludzki Sterowiec1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 stężenie
Szczurzy anty-mysz B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	stężenie 1:250
Szczurzy anty-mysz CD138	Biolegend	142502	stężenie 1:200
Szczurzy anty-mysz CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40
Szczur anty-mysz CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend		100529 stężenie 1:200
Szczur anty-mysz CD45 allofikocyjanina-R700	BD Biosciences	565478	stężenie 1:50
Szczur anty-mysi IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 stężenie
SP8 Mikroskop konfokalny	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Kulki koralikowe Sigma	P7949-500ml
Ultracomp	Thermofisher	01-2222-42

https://www.anaconda.com/download spektrawizora fluorescencji https://www.ilastik.org/ https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin