Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model ostrego uszkodzenia płuc po reperfuzji niedokrwienia trzewnego za pomocą krzyżowego zaciskania aorty nadceliakialnej u szczurów

922 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W badaniu opisano model ostrego uszkodzenia płuc po niedokrwieniu trzewnym-reperfuzji podczas krzyżowego zaciskania aorty przez nadceliakię za pomocą laparotomii u szczurów. Umożliwia badanie zarówno klinicznych, jak i biologicznych skutków zaciskania aorty, a także wpływu niedokrwienno-reperfuzyjnego na leżące poniżej narządy i odległe urazy płuc.

Streszczenie

Otwarta operacja tętniaków aorty brzusznej wymaga przejściowego przerwania krążenia krwi, co powoduje niedokrwienie i reperfuzję narządów znajdujących się w dalszej części ciała. Może to być zajęte tętnice nerkowe, krezkowe i splanchniczne. Żadna terapia nie okazała się skuteczna w zapobieganiu zdalnym uszkodzeniom płuc spowodowanym niedokrwieniem-reperfuzją po zaciśnięciu aorty nadceliakii. Aby zbadać patofizjologiczne szlaki ostrego uszkodzenia płuc i leczenia farmakologicznego, opracowano eksperymentalny model zaciskania aorty u szczurów.

Przed zabiegiem podaje się znieczulenie podskórne z buprenorfiną (0,05 mg/kg). Znieczulenie ogólne ze spontaniczną wentylacją indukuje się za pomocą gazu halogenowego (izofluran 2,5%) przez maskę. Laparotomię ksylofonową wykonuje się na podgrzewanym stole (temperatura monitorowana doodbytniczo). Blok żołądkowo-śledzionowy i jelita są cofnięte do prawego boku, a wątroba jest mobilizowana do górnej części brzucha. Przepona i jej filary są identyfikowane w taki sposób, aby umożliwić stopniowe uwalnianie aorty nadceliakiacyjnej z jej przejścia wewnątrzprzeponowego. Rozwarstwienie wykonuje się delikatnie, aby uzyskać kontrolę obwodową aorty między filarami przepony. Leżący poniżej pień trzewny i tętnica krezkowa górna są starannie identyfikowane. Zacisk mikronaczyniowy może być stosowany do niedrożności aorty powyżej tętnic trzewnych. Prawidłowe zaciskanie potwierdza brak pulsacji aorty, związanej z bladość jelita cienkiego. Szczur pozostaje znieczulony przez cały czas trwania niedokrwienia. Pod koniec czasu trwania niedokrwienia mikrozacisk jest usuwany i sprawdzana jest pulsacja aorty, a także ponowne zabarwienie jelit. Ściana brzucha jest zamykana szwem, a następnie zamykana jest skóra szczura. Pod koniec okresu reperfuzji zwierzę jest znieczulane w ten sam sposób. Jest uśmiercany przez wykrwawienie podczas pobierania krwi, a następnie płuco może zostać pobrane. Uszkodzenie płuc można ocenić za pomocą gazometrii krwi, grawimetrii płuc i badania histologicznego. Próbki płuc mogą być również wykorzystywane do analiz RT-PCR i Western blot.

Wprowadzenie

Tętniak aorty to ogniskowe i trwałe rozszerzenie aorty1. Ewolucja tętniaka zmierza w kierunku pęknięcia, co wiąże się z masywnym krwotokiem, który niesie ze sobą znaczną śmiertelność2. Dlatego leczenie koncentruje się na zapobieganiu temu dramatycznemu powikłaniu. Tętniaki aorty są najczęściej podnerkowe i mogą być leczone za pomocą endoprotezy aortalnej. Endograft aortalno-dwubiodrowy to pokryty, rozwidlony stent, który jest wprowadzany w sposób minimalnie inwazyjny przez tętnice udowe przy użyciu dostępu przezskórnego. Ta technika nie wymaga zaciskania aorty i nie powoduje niedokrwienia trzewnego. Może być wykonywany w znieczuleniu miejscowym. Natomiast bardziej rozległe tętniaki aorty - takie jak tętniaki klatki piersiowej i brzucha i złożone tętniaki aorty brzusznej - są trudniejsze do leczenia przy użyciu technik wewnątrznaczyniowych. Wynika to z zajęcia tętnic nerkowych, tętnicy krezkowej górnej i pnia trzewnego w obrębie odcinka tętniaka (ryc. 1). Te główne tętnice trzewne muszą zostać zrekonstruowane oprócz samej aorty. Wewnątrznaczyniowe, małoinwazyjne podejście wymaga zatem bardziej złożonej procedury obejmującej zastosowanie fenestrowanych i/lub rozgałęzionych endoprzeszczepów do rekonstrukcji tętnicy trzewnej. Głównym ograniczeniem tych endoprzeszczepów jest długi czas produkcji – często kilka miesięcy – co sprawia, że nie nadają się one do leczenia w nagłych wypadkach. W takich przypadkach konwencjonalna otwarta naprawa chirurgiczna pozostaje wykonalną i niezawodną opcją.

Leczenie metodą naprawy otwartej wymaga laparotomii i zaciskania nadtrzewnego, czyli przejściowego niedokrwienia trzewnego. Częstość powikłań jest wysoka podczas leczenia tych tętniaków klatki piersiowej i jamy brzusznej. Śmiertelność waha się od 5 do 15%3. Powikłania płucne występują u 60%, a powikłania nerkowe u 40%4. Powikłania te, związane z ogólnoustrojową reakcją zapalną, mogą przekształcić się w niewydolność wielownętrzną5. Ta śmiertelność morbi jest wieloczynnikowa, obejmuje agresję chirurgiczną, znieczulenie, analgezję, zmiany hemodynamiczne, wstrząs krwotoczny i zjawiska niedokrwienno-reperfuzyjne. Agresja chirurgiczna przyczynia się do manifestacji powikłań, niezależnie od tego, czy podejście obejmuje torakotomię, frenotomię, lumbotomię czy laparotomię, poprzez modyfikację mechaniki wentylacji, w szczególności z upośledzeniem funkcji przepony6.

Tymczasowa reperfuzja niedokrwienia trzewnego wpływa na narządy położone dalej, w tym na przewód pokarmowy, układ splanchniczny, nerki i kończyny dolne7. Powikłania płucne są najczęstszymi zdarzeniami niepożądanymi po operacji aorty piersiowo-brzusznej. Ich pochodzenie jest wieloczynnikowe. Zaciskanie aorty naddomackiej nie powoduje bezpośrednio niedokrwienia płuc – reperfuzji. Jednak niedokrwienie-reperfuzja narządów trzewnych wyzwala poważną ogólnoustrojową odpowiedź zapalną. Hipoteza związku przyczynowego między niedokrwieniem trzewnym-reperfuzją a wystąpieniem odległego urazu - w szczególności uszkodzenia płuc - jest dobrze uzasadniona. Dysfunkcja śródbłonka płuc, krytyczny składnik błony pęcherzykowo-kapilarnej, wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc (ALI). Kluczową rolę w tym procesie odgrywa masywna ogólnoustrojowa reakcja zapalna i aktywacja neutrofili.

ALI jest często definiowany na podstawie kryteriów histologicznych, a nie obrazu klinicznego. ALI odnosi się do ostrego zaburzenia zapalnego charakteryzującego się przerwaniem bariery śródbłonka i nabłonka płuc. Błona pęcherzykowo-kapilarna, jednostka funkcjonalna płuc, składa się z trzech elementów: śródbłonka mikronaczyniowego, przestrzeni śródmiąższowej i nabłonka pęcherzyków płucnych.

Cechą charakterystyczną ALI jest zwiększona przepuszczalność tej bariery, napędzana przez infiltrację neutrofili i uwalnianie cytotoksycznych mediatorów prozapalnych. Uszkodzenie nabłonka pęcherzyków płucnych obejmuje zarówno pneumocyty typu I, jak i typu II. Komórki typu I, które pokrywają 95% powierzchni pęcherzyków płucnych, są bardzo podatne na uszkodzenia i odgrywają kluczową rolę w wymianie gazowej. Komórki typu II, liczniejsze, ale zajmujące mniejszy obszar, są niezbędne do produkcji środków powierzchniowo czynnych, naprawy nabłonka i transportu jonów. Po urazie komórki typu II przyczyniają się do przywrócenia integralności pęcherzyków płucnych poprzez swoją zdolność regeneracyjną i różnicowanie się w komórki typu I.

Wiele szlaków śmierci komórkowej jest zaangażowanych w uszkodzenie nabłonka podczas ALI, przy czym komórki typu I są szczególnie wrażliwe. ALI jest zwykle oceniany przez ocenę obrzęku płuc, z pomiarami przepuszczalności mikronaczyniowej lub bez nich w celu odzwierciedlenia dysfunkcji śródbłonka.

Celem tego modelu jest zbadanie związku między niedokrwieniem trzewnym-reperfuzją a rozwojem odległego uszkodzenia płuc, zarówno na poziomie metabolicznym, jak i mechanistycznym, jak pokazano na rysunku 2. Ten specyficzny związek pozostaje tylko częściowo zrozumiały. Nasz model zaciskania aorty przedstawia scenariusz niedokrwienia trzewnego i reperfuzji na zdrowej aorcie, bez obecności tętniaka aorty brzusznej u szczura. Powyżej pnia celiakii nie ma większych gałęzi ani u ludzi, ani u szczurów. Aorta powyżej tego poziomu odpowiada aorcie nadkoliacznej, która powoduje powstanie tylko małych gałęzi ciemieniowych zaopatrujących ścianę klatki piersiowej. Dlatego nie ma znaczącej różnicy w anatomii naczyń krwionośnych głównych naczyń na tym poziomie między ludźmi a szczurami.

Wykorzystanie tego modelu pozwala na szeroką eksplorację. Pomoże to zidentyfikować wczesne biomarkery rozwoju odległych uszkodzeń tkanek. Dodatkowo model ten umożliwia badanie potencjalnych inhibitorów, w tym inhibitorów mediatorów krążenia lub inhibitorów określonych odległych urazów narządów.

Inne modele niedokrwienno-reperfuzyjne są wykorzystywane do badania odległych urazów. Modele niedokrwienia mózgu, jelit i reperfuzji nerek są silnie reprezentowane 8,9,10. Istnieją szeroko zakrojone badania nad uszkodzeniem płuc po niedokrwieniu jelit z powodu przejściowej niedrożności tętnicy krezkowej górnej (SMA)11,12,13. Czas trwania niedokrwienia i reperfuzji jest niezwykle zmienny i waha się od kilku minut do kilku godzin14,15. Uzasadnieniem czasu trwania niedokrwienia jest wywołanie wystarczającej agresji, aby wywołać znaczącą reakcję prowadzącą do wystąpienia odległych urazów. Zbyt krótki czas trwania niedokrwienia może nie powodować istotnych zmian w badanym szlaku metabolicznym. Jeśli chodzi o czas trwania reperfuzji, uzasadnienie leży we wczesnym wystąpieniu odległych urazów i potencjalnie przejściowym charakterze zmian patofizjologicznych. Idealny czas trwania reperfuzji nie powinien być ani za wczesny, ani za późny, aby odpowiednio scharakteryzować upośledzenie metaboliczne.

Modele znajdują się głównie w gryzoniach. Zaletami gryzoni są ich niewielkie rozmiary, łatwość utrzymania, krótki cykl życia i obfite zasoby genetyczne16. Wykorzystanie dużych zwierząt, takich jak świnie, psy lub naczelne, nie wydaje się uzasadnione przy braku dodatkowych korzyści, co jest zgodne z zasadami etycznymi eksperymentów na zwierzętach dotyczącymi udoskonalania. Ponadto, ze względu na ich anatomiczne, fizjologiczne i genetyczne podobieństwo do ludzi, gryzonie umożliwiają badania translacyjne16.

Jednym z głównych ograniczeń modeli zaciskania SMA jest to, że w praktyce klinicznej początek okresu niedokrwienia jelit nie jest możliwy do zidentyfikowania. To sprawia, że ekstrapolacja na sytuacje kliniczne u ludzi jest bardziej niepewna. Natomiast podczas skomplikowanej chirurgii aorty wyraźnie identyfikuje się okresy niedokrwienia i reperfuzji różnych narządów. Co więcej, podczas zaciskania aorty nadceliakowej wszystkie leżące poniżej wnętrzności znajdują się w okresie niedokrwienia (przewód pokarmowy, wątroba, śledziona, nerki, narządy miednicy i kończyny dolne). Wszystkie te narządy ulegają zjawisku niedokrwienia-reperfuzji. I odwrotnie, modele niedokrwienno-reperfuzyjne skoncentrowane na określonym narządzie (jelicie, nerkach, wątrobie itp.), modele zaciskania aorty, a tym samym niedokrwienia-reperfuzji wielu narządów z patofizjologią metaboliczną, są mniej zbadane. Podobnie, odległe urazy, takie jak zmiany w płucach po zaciśnięciu aorty, są słabo zbadane pod względem metabolizmu17,18.

Istniejące modele zaciskania aorty koncentrują się przede wszystkim na zaciskaniu aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych. Ograniczeniem tego modelu jest to, że nie indukuje on reperfuzji niedokrwienia trzewnego. W związku z tym nie pozwala na wykazanie związku między niedokrwieniem trzewnym-reperfuzją a potencjalnymi odległymi urazami18,19. Poza tym nie istnieje model in vitro pozwalający na badanie niedokrwienno-reperfuzyjnej poprzez zaciskanie aorty, dlatego konieczna jest analiza z wykorzystaniem modeli in vivo.

W związku z tym ten eksperymentalny model zaciskania aorty w stanie nadceliakii u szczurów ułatwia kompleksowe badanie mechanizmów patofizjologicznych i interwencji farmakologicznych ukierunkowanych na odległe uszkodzenia płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Stworzenie tego modelu jest zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i eksperymentów, a także z prawodawstwem francuskim i europejskim. Model ten został zweryfikowany w eksperymentalnym badaniu na zwierzętach, które zostało zatwierdzone przez Regionalną Komisję Etyki Uniwersytetu w Normandii, Rouen, Francja (nr APAFIS: #18974).

1. Model zwierzęcy i aklimatyzacja

  1. Okres adaptacji modelu zwierzęcego
    UWAGA: Model jest zgodny z zasadami uszlachetnienia.
    1. Zwierzęta domowe w nieprzepełnionych obiektach przez tydzień, aby umożliwić adaptację przed operacją.
    2. Trzymaj szczury po dwie w klatce z dostępem ad libitum do wody i jedzenia, które będą codziennie sprawdzane przez doświadczony personel.
    3. Codziennie sprawdzaj czystość pościeli (paski papieru) i w razie potrzeby systematycznie zmieniaj ją doświadczony personel dwa razy w tygodniu lub częściej.
    4. Po tygodniowym okresie aklimatyzacji, podczas którego będą mieli codzienny kontakt z eksperymentatorem i ekspozycję na 12-godzinne cykle oświetleniowe, zabiegi odbędą się w oddzielnym, cichym pomieszczeniu z tym samym eksperymentatorem.
  2. Gatunki modeli zwierzęcych
    1. Należy użyć samców szczurów rasy Wistar lub Sprague Dawley, aby uniknąć wpływów hormonalnych, takich jak estradiol, podczas analizy fizjopatologii niedokrwienia trzewnego i reperfuzji z akredytowanego i certyfikowanego ośrodka hodowlanego11,20.
    2. Określ z wyprzedzeniem grupy doświadczalne i liczbę zwierząt w grupie.
    3. Wybierz wiek, do stosowania zalecane są szczury w wieku 6-10 tygodni (350 g).

2. Znieczulenie i analgezja

  1. Analgezja
    1. Zważ każde zwierzę w dniu zabiegu.
    2. Buprenorfinę (0,05 mg/kg) podawać podskórnie na poziomie skóry grzbietu szczura na 1 godzinę przed zabiegiem w celach przeciwbólowych za pomocą igły 25 G i strzykawki 2 ml.
    3. Nałóż żel chlorowodorku lidokainy 1% na skórę brzucha na poziomie przyszłego nacięcia skóry. Regularnie (co najmniej dwa razy dziennie) po operacji należy ponownie oceniać ból za pomocą skali do oceny wyrazu twarzy bólu u szczura21.
    4. W ciągu pierwszych 24 godzin należy podawać systematyczne wstrzyknięcia podskórne buprenorfiny (0,01 do 0,05 mg/kg) co 8 godzin.
    5. Następnie należy podać zastrzyki z buprenorfiny (0,01 do 0,05 mg/kg) w oparciu o skalę bólu twarzy Krajowego Centrum ds. Wymiany, Udoskonalenia i Redukcji Zwierząt w Badaniach i powtarzać co 8 godzin, jeśli to konieczne, w zależności od punktu czasowegoeutanazji 21.
  2. Znieczulenie ogólne
    1. Do znieczulenia ogólnego należy stosować gazy chlorowcowane (izofluran)22.
    2. Stosować wentylowaną komorę z izofluranem (5%) o natężeniu przepływu powietrza 2 l/min przez 2 minuty w fazie indukcyjnej.
    3. W celu podtrzymania znieczulenia należy przełączyć szczura na specjalnie dopasowaną maskę do spontanicznej wentylacji z izofluranem (2-2,5%) przy natężeniu przepływu powietrza 2 l/min przez cały czas trwania operacji.
    4. Oczyść górne drogi oddechowe, wysuwając język z jamy ustnej, aby umożliwić wentylację przez maskę.
    5. Stale monitoruj głębokość znieczulenia podczas zabiegu i w razie potrzeby dostosuj stężenie izofluranu.

3. Umieszczenie szczura podczas zabiegu

  1. Umieść szczura w pozycji leżącej grzbietowej z kończynami przednimi i tylnymi unieruchomionymi za pomocą taśmy klejącej, przestrzegając fizjologicznych zakresów ruchu stawów szczura.
  2. Umieść szczura na podkładce rozgrzewającej ustawionej na 37 °C z monitorowaniem temperatury w odbycie.
  3. Chroń oczy, nakładając dakriożel. Ogol sierść na brzuchu i dokładnie zdezynfekuj brzuch za pomocą 3 iteracji naprzemiennego szorowania jodem i alkoholem.

4. Zabieg chirurgiczny

  1. Warunek zabiegu chirurgicznego
    1. Zabieg należy wykonać pod lupą mikrochirurgiczną, aby ułatwić delikatne manewry, choć nie jest to niezbędne.
    2. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi przed wykonaniem nacięcia.
  2. Cięcie
    1. Po badaniu palpacyjnym wyrostka mieczykowatego na górnej granicy nacięcia należy naciąć skórę na środku brzucha, odsłaniając linię białą mięśni brzucha.
    2. Środkowe nacięcie mięśnia brzucha na kresie białym, aby uniknąć krwawienia z mięśni brzucha.
  3. Ekspozycja wewnątrzbrzuszna
    1. Utrzymuj ścianę brzucha po obu stronach za pomocą samopodtrzymujących się zwijaczy.
    2. Upewnij się, że nie ma anomalii (guzów), zmobilizuj wnętrzności, żołądek, śledzionę i wątrobę po prawej stronie brzucha, a następnie odsłoń aortę nadceliakiczną.
    3. Utrzymuj wszystkie wnętrzności w jamie brzusznej tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą małego kompresu złożonego wzdłuż i nasączonego ciepłym (37 °C) roztworem soli fizjologicznej.
    4. Przykryj wszystkie wnętrzności kompresem nasączonym roztworem soli fizjologicznej podgrzanym do 37 °C, aby zapobiec hipotermii i odwodnieniu.
  4. Identyfikacja głównych naczyń wewnątrzbrzusznych
    1. Zidentyfikuj aortę nadceliakalną na podstawie jej pulsacji i lokalizacji między filarami przepony.
    2. Kontrola aorty między filarami przepony za pomocą delikatnego i ostrożnego wypreparowania za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i kleszczy preparacyjnych, aby uwolnić aortę tak atraumatycznie, jak to możliwe.
    3. Owiń aortę nadtrzewiową za pomocą szwu 5-0 z kleszczami preparacyjnymi i ligaturowymi.
    4. Sprawdź pochodzenie pnia trzewnego i leżącej pod nim tętnicy krezkowej. Czas trwania tego zabiegu chirurgicznego wynosi od 10 do 15 minut na szczura.
    5. Podstawowa identyfikacja żyły głównej podnerkowej dolnej jest łatwa ze względu na przezroczystość przestrzeni zaotrzewnowej.
      UWAGA: Aorta naddolna jest identyfikowana do zaciskania krzyżowego, dolna aorta jest odsłaniana w celu potwierdzenia braku pulsacji, a żyła główna dolna jest używana do wstrzykiwania (przed lub po kondycjonowaniu) oraz do pobierania krwi podczas eutanazji.
    6. Żyłę główną podnerkową dolną należy uwolnić tylko na jej przedniej powierzchni, co pozwala na bezpośrednie dożylne podanie dowolnego środka farmakologicznego.
  5. Wstrzyknięcie dożylne
    1. W tym celu należy użyć igły 30-G do wstrzykiwań i umieścić kilka milimetrów kompresu hemostatycznego, aby uzyskać hemostazę.
    2. W przypadku wstępnego kondycjonowania farmakologicznego należy wykonać wstrzyknięcie przed zaciśnięciem aorty. W przypadku leczenia kondycjonującego należy go podawać w trakcie lub po zaciśnięciu aorty.
    3. W protokole tym badano wstępne kondycjonowanie farmakologiczne, więc podawaj 5 minut przed zaciśnięciem aorty.
  6. Okres niedokrwienny
    1. Zacisnąć aortę trzewną za pomocą atraumatycznego zacisku mikronaczyniowego przez cały 40-minutowy okres niedokrwienia. Sprawdź skuteczność zacisku poprzez zanik leżących pod spodem pulsacji aorty oraz wielokrotne przebarwienie wnętrzności i kończyn podczas zaciskania.
    2. Zamknij częściowo brzuch za pomocą trzech prostych, plecionych szwów wchłanialnych 5-0, aby ograniczyć utratę wody i ciepła. Przykryj nacięcie chirurgiczne sterylnym kompresem nasączonym ciepłym roztworem soli fizjologicznej przez cały czas trwania niedokrwienia.
  7. Okres reperfuzji
    1. Pod koniec okresu niedokrwiennego ponownie otwórz jamę brzuszną i odsłoń aortę w taki sam sposób, jak opisano wcześniej.
    2. Usuń zacisk naczyniowy i sprawdź, czy wznowienie leżącej pod spodem pulsacji aorty oraz ponowne zabarwienie wnętrzności i kończyn. Okres reperfuzji rozpoczyna się natychmiast po zdjęciu mikroklamry.
  8. Zamykanie brzucha
    1. Przywróć wnętrzności do ich pierwotnej pozycji i zamknij brzuch plecionym szwem wchłanialnym 5-0 na kresie białym, a skórę wchłanialnym szwem monofilamentowym 5-0.
  9. Przebudzenie zwierząt
    1. Umieść szczura w lewej bocznej pozycji odleżynowej, aby uniknąć ucisku żyły głównej dolnej przez masę trzewną i kontekst hipowolemii. Umieść szczura w indywidualnej klatce z lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę do przebudzenia, około 10 minut później.
  10. Drugie znieczulenie ogólne
    1. Pod koniec 180-minutowego okresu reperfuzji znieczulić szczura za pomocą tego samego znieczulenia gazowego przez wentylowaną komorę z izofluranem (5%) przy natężeniu przepływu powietrza 2 l/min przez 2 minuty dla fazy indukcyjnej.
    2. W celu podtrzymania znieczulenia należy przełączyć szczura na specjalnie dopasowaną maskę do spontanicznej wentylacji za pomocą izofluranu (2-2,5%) przy natężeniu przepływu powietrza 2 l/min przez cały okres pobierania tkanek.
    3. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi przed wykonaniem nacięcia.

5. Kontrola wyrywkowa

  1. Próbki krwi
    1. Próbki krwi należy pobrać za pomocą igły 23 G i strzykawki o pojemności 5 ml przez bezpośrednie nakłucie do żyły głównej dolnej poniżej żył nerkowych.
    2. Użyć małej porcji (100 μl) całkowitej krwi do gazu i standardowej analizy krwi na jednej karcie testowej w temperaturze pokojowej.
    3. Zebrać pozostałą krew pełną do probówki EDTA o pojemności 4 ml i odwirować ją w temperaturze 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
    4. Zamrozić plazmę w krioprobówkach w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
  2. Próbki tkanek
    1. Pobieranie próbek tkanek
      1. Pobieraj próbki tkanek (płuc, jelit, nerek, wątroby i serca) podczas eutanazji zwierzęcia. Przeprowadzić eutanazję poprzez pobranie krwi prowadzącą do wykrwawienia po znieczuleniu ogólnym izofluranem zgodnie z tym samym protokołem, jak wspomniano wcześniej.
      2. Przez otwarty brzuch pobierz 50 mg każdej tkanki: górny biegun lewej nerki, lewy płat wątroby i dystalne jelito cienkie 1 cm przed jelitem ślepym.
      3. Następnie szybko wykonaj sternotomię pośrodkową, aby zidentyfikować serce i płuca.
      4. Uwolnij lewe płuco z więzadła i usuń je całkowicie do analizy histologicznej. Uwolnij prawe płuco wielopłatowe z więzadeł. Oddzielić płat przedni do analizy kwasów nukleinowych i białek, resztę przechowywać w filiżance z surowicą fizjologiczną w temperaturze 37 °C przez kilka minut, aby następnie wykonać grawimetrię.
      5. Wyodrębnij serce jako cały blok z odcinkami aorty, tętnicy płucnej i obu żył głównych. Pobrać próbkę z lewej komory do analizy kwasów nukleinowych i białek, pozostałą część przechowywać w kubku z surowicą fizjologiczną w temperaturze 37 °C przez kilka minut, aby następnie wykonać grawimetrię.
    2. Analiza kwasów nukleinowych
      1. Do analizy kwasów nukleinowych należy natychmiast pobrać porcję 50 g tkanki. Zamrozić go w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
      2. Ekstrakcja całkowitego RNA za pomocą gotowego do użycia odczynnika do izolacji wysokiej jakości całkowitego RNA zgodnie z protokołem producenta.
      3. Określić stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Zmierzyć stężenie RNA, używając 2 μl próbki, z 2 μl wody wolnej od RNaz jako ślepym punktem odniesienia. Użyj absorbancji przy 260 nm, aby oznaczyć stężenie RNA.
        UWAGA: Dopuszczalna czystość RNA została zdefiniowana jako współczynnik absorbancji 260/280 i 260/230 w zakresie od 1,7 do 2,0.
      4. Użyj 1 μg każdej próbki RNA do odwrotnej transkrypcji.
      5. Zmierz poziomy mRNA cytokin prozapalnych (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) i wewnętrznego odniesienia (beta2-mikroglobuliny) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w szybkim, opartym na płytce, termicznym cyklerze blokowym ze zintegrowanymi możliwościami wykrywania w czasie rzeczywistym online przy użyciu gotowej do użycia mieszanki reakcyjnej gorącego startu (startery są wymienione w tabeli 1).
      6. Obliczyć względny poziom mRNA metodą 2-ΔΔCT.
    3. Analiza białek
      1. W celu analizy białka umieść 50 mg tkanki w probówce lizującej o pojemności 2 ml zawierającej pięćdziesiąt kulek ceramicznych z tlenku cyrkonu o średnicy 2,8 mm. Ta probówka lizująca zawiera 1 ml buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) z tabletką inhibitora proteazy i tabletką inhibitora fosfatazy.
      2. Ekstrahować białko z próbek przez homogenizację w laboratoryjnym młynie rurowym z 3 powtórzeniami 5-sekundowej kontroli, po której następuje 10-sekundowy okres spoczynku.
      3. Odwirować próbki w temperaturze 10 000 g w temperaturze +4 °C przez 10 minut i przechowywać supernatanty w krioprobunkach w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
      4. Oznaczyć stężenia białka za pomocą testu białkowego metodą Bradforda i utrzymywać próbki w temperaturze -80 °C.
      5. Oddzielić równą ilość białek z każdej próbki za pomocą SDS-PAGE.
      6. Przenieś oddzielone białka na membrany nitrocelulozowe o wielkości 0,2 μm.
      7. Inkubować błonę po zablokowaniu z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku TBS-Tween przez 1 godzinę, z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko określonemu białemu z wyboru. Na przykład, aby zbadać heparanazę, należy użyć króliczego poliklonalnego pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko ludzkiej heparanazie (rozcieńczenie 1:2000) i białka kontrolnego jako GAPDH, użyć koziego monoklonalnego pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko GAPDH (rozcieńczenie 1:5000) przez noc w temperaturze 4 °C.
      8. Umyj plamy trzykrotnie buforem TBST-Tween 0,1%.
      9. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę w roztworze blokującym. Na przykład, aby zbadać heparanazę, użyj kozy przeciwko przeciwciału drugorzędowemu królika (rozcieńczenie 1:5000), a aby zbadać GAPDH, użyj królika przeciwko przeciwciału drugorzędowemu kozy (rozcieńczenie 1:10000).
      10. Wykrywanie kompleksów immunologicznych za pomocą systemu wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).
      11. Przeanalizuj membrany za pomocą dedykowanego oprogramowania w celu określenia wartości densytometrycznych pasm docelowych, wykorzystując GAPDH jako kontrolę wewnętrzną. Wykonaj analizę densytometryczną pasma odpowiadającego heparanazie (50 kDa) i znormalizuj je do pasma białka GAPDH (35 kDa) w celu określenia względnej intensywności sygnału.
    4. Analiza histologiczna
      1. Do analizy histologicznej weź lewe płuco jednokątowe na wnęce, a następnie wstrzyknij przez lewe oskrzela główne roztwór do krioprezerwacji za pomocą cewnika 16 G. Zamrozić go w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. Analiza grawimetryczna
      1. Po pobraniu próbek do analizy kwasów nukleinowych i białek, należy przeanalizować pozostałą część serca i prawego płuca wielopłatkowego za pomocą grawimetrii, z wysuszeniem w piecach w temperaturze 70 °C, pozwalając na oszacowanie obrzęku tkanek w stosunku mokrej do suchej masy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ten okazał się bezpieczny, z minimalnymi stratami zwierząt (mniej niż 5%) podczas znieczulenia i operacji oraz skuteczny w indukcji ostrego uszkodzenia płuc. Znieczulenie izofluranem było bezpieczniejsze niż ketamina w połączeniu ze znieczuleniem ksylazynowym (utrata około 15%), z szybkim przebudzeniem i lepszym powrotem do zdrowia szczurów (dane nie pokazane). Wszystkie znieczulone zwierzęta były w stanie poddać się bezpiecznemu i skutecznemu zaciskaniu aorty tą metodą. Wszystkie zwierzęta (100%) ze skutecznym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten chirurgiczny model zaciskania krzyżowego aorty ma tę zaletę, że umożliwia kompleksową analizę, zarówno tkankową, jak i osocza, ostrego uszkodzenia płuc po reperfuzji niedokrwienia trzewnego. Daje również możliwość testowania cząsteczek farmakologicznych po podaniu dootrzewnowym, dojelitowym lub dożylnym w fazie kondycjonowania wstępnego lub końcowego.

Jednym z krytycznych etapów pozostaje zaciskanie aorty nadstawczej podczas operacji. Po opanowaniu ten krok można wykonać szybko. Krzywa ucz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m membrany nitrocelulozowe Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500,2 &mikro; m Membrany nitrocelulozowe wstępnie przycięte
Strzykawka 1cc Luer Slip bez igłyTerumo (Ziemia)MDSS01SEStrzykawka 1cc Luer Slip bez igły
Strzykawka Luer Slip o pojemności 2 cm3 bez igłyBectona DinckinsonaStrzykawka Luer Slip o pojemności 2 cm3 bez igły
Probówka EDTA 4 ml BD K3 13 mm x75 mmOdkurzacz BDBD368860Probówka EDTA 5 ml BD K3 13 mm x 75 mm
Szew pleciony 5-0 / Vicryl 5-0 (Ethicon) lub Novosyn (B. Braun)Etyka - Johnson & JohnsonV7970EVicryl 5-0 Igła Stożek 1/2 koła 13 mm Długość 45 cm
5-0 szew wchłanialny monofilamentowy / Monocryil PoliglecaproneEtyka - Johnson & JohnsonY493GIgła 3/8 koła Długość 18 cali
Strzykawka Luer Slip o pojemności 5 cm3 bez igłyTerumo (Ziemia)Zobacz materiał SS-05LE1Strzykawka Luer Slip o pojemności 5 cm3 bez igły
Atraumatyczny zacisk mikronaczyniowy / Jednorazowe zaciski naczyń do żyłyAROSurgicznyTKF-1-20gAtraumatyczny zacisk mikronaczyniowy do stosowania dożylnego w celu zaciśnięcia aorty szczura
BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmOdkurzacz BD300800BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmOdkurzacz BD300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmOdkurzacz BD304000BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
beta-aktyna InvitrogenKarlowe Wary, Stany ZjednoczoneZobacz materiał 15G5A11/E2
Test białka metodą BradfordaBiorad, Marnes-la-Coquette, Francja5000201
BuprenorfinaBuprenorfina
Wirówka Sigma 3-30Sigma, Niemcy10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Wirówka do eppendorf
cOmplete MiniRoche11836153001Koktajl inhibitorów proteazy 25 tabletek
Wymazówka
Dacryogel /  Żel do oczu Lubrithal 10 gDechra Produkty weterynaryjneKod  ACL7376464Żel do oczu Lubrithal 10 g
Skalpel jednorazowyParamountKontroler PDSS11 powiedział:Jednorazowe ostrze do skalpela n° 11
ElektrokoagulacjiDentRMedEMB/87400Długopis hemostatyczny o wysokiej temperaturze
Ulepszony system wykrywania ECLBiorad, Hercules, Kalifornia, Stany ZjednoczoneNumer katalogowy: 1705060S
Młyn do koralików Fisherbrand 24Fisher naukowy15515799Używany do  mielenie, liza i homogenizacja próbek biologicznych przed ekstrakcją molekularną
Waciki z gazy Rafina.010106Waciki z gazy 
Oprogramowanie ImageLabTMBioradna dysku USB lub licencji
Izofluran 5%Izofluran 5%
Lidokaina Żel prylokainowy 5% Aguettant, Lyon, FrancjaLidokaina Żel prylokainowy 5% 
Przyrząd LightCycler 480Roche, Bâ le, Szwajcaria5015243001Cykler termiczny
Galaretka Smarująca Sterylna K-Y 82 gRECKITT BENCKISERGalaretka Smarująca Sterylna K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, Stany ZjednoczoneZobacz materiał ND-2000Spektrofotometr
Peha Pince anatomicznyHartmann991063Szczypce anatomiczne
Detektor PhosSTOPRoche4906837001Inhibitor fosfatazy 20 tabletek 
Plaster/taśma klejącaAnapore (Anapore)135320Chirurgiczna taśma klejąca/plaster
Povione-jod roztwór / Vé t&eaostry; obiad RozwiązanieVé tochinolRoztwór antyseptyczny do użytku zewnętrznego
Rurka z zestawem do lizowania Precellys Homogenizacja tkanek twardych CK28, BertinZobacz materiał CK28Rurka z zestawem do lizowania Precellys 
Prolè ne Szew prolipropylenowyEtyka - Johnson & Johnson7472HProlè ne 5-0 Igła Stożek szlif 3/8 koło 13 mm Długość 75 cm
Probówki Safe-Lock 1,5 mlEppendorf powiedział:.0030120086Probówki Safe-Lock 1,5 cm3 bez koloru 1000 probówek do wirowania
Probówki Safe-Lock 2 mlEppendorf powiedział:.0030120094Probówki Safe-Lock 2,0 cm3 bez koloru 1000 probówek do wirowania
Probówki Safe-Lock 5 mlEppendorf powiedział:.0030119401Probówki Safe-Lock 5,0 cm3 bez koloru 200 probówek do wirowania
Roztwór soli NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, Francja600502Roztwór soli fizjologicznej 0,9% 500 ml
STRONA SDSSigma-Alrich
Cewnik dożylny Surflash 16 gTerumo (Ziemia)SR*FF1651
SurgicelEtyka - Johnson & JohnsonHemostatyczne wymazy resorbowalne
Zestaw szwów n° 12Hartmann4701762Sterylny zestaw szwów z przyczepnym champem, cisorami, szczypcami Adson, uchwytem na igłę
SYBR Zielony zestaw Light Cycler 480 SYBR Zielony I MasternRoche4707516001SYBR Zielony
TBST-Tween 0,1% bufor Sigma-Alrich
Karty testowe Epoc 24 karty 13 parametrówSiemens-Healthineers
Tkanka TEKSakura FinetecRoztwór do krioprezerwacji 
Odczynnik TRIzol InvitrogenThermo Fisher Scientific, Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone15596026Odczynnik TRIzol

Bibliografia

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Chirurgiczny model szczurzyaorta nadbrzusznazapalenie płucanaliza gazometryczna krwihistologia płucobrzęk płucinfiltracja neutrofili
Model ostrego uszkodzenia płuc po reperfuzji niedokrwienia trzewnego za pomocą krzyżowego zaciskania aorty nadceliakialnej u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.