Artykuł metodologiczny

Funkcjonalna ocena in vivo mięśnia masetera szczura po chirurgicznym utworzeniu urazu objętościowego (VML)

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66902

⸱

15 listopada 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 2Myologica LLC, 3Department of Orthopedic Surgery, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

Urazy objętościowe utraty mięśni (VML) przekraczają endogenne zdolności regeneracyjne, skutkując trwałymi deficytami funkcjonalnymi. Obecne badania nad VML koncentrują się głównie na mięśniach kończyn i tułowia. Aby rozszerzyć badania mechanistyczne VML na mięśnie czaszkowo-twarzowe, niniejszy artykuł opisuje metodę in vivo do podłużnej oceny funkcji mięśni żwaczowych przed i po urazie VML.

Streszczenie

Utrata mięśni objętościowa (VML) występuje zarówno wśród ludności cywilnej, jak i wojskowej i stanowi wyniszczające uszkodzenie mięśni szkieletowych, które przewyższa naturalną zdolność regeneracji organizmu. Te urazy zakłócają nie tylko włókna mięśniowe, ale także nerwy, naczynia krwionośne i macierz zewnątrzkomórkową, przyciążając regenerację mięśni szkieletowych i prowadząc do ciężkiej fibrozy oraz trwałych niedoborów struktury i funkcji mięśni. Obecne leczenie kliniczne ma wiele ograniczeń, dlatego trwają badania nad opracowaniem skuteczniejszych podejść terapeutycznych. Warto jednak zauważyć, że wiele przedklinicznych urazów spowodowanych urazami VML koncentrowało się na mięśniach kończyn i tułowia, z ograniczonymi badaniami nad mięśniami czaszkowo-twarzowymi. Różnice w biologii rozwojowej i zdolności regeneracyjnej między mięśniami czaszkowo-twarzowymi a mięśniami kończyn/tułowia mogą dostarczyć kluczowych informacji, które sprzyjają bardziej specyficznym urazom metodom leczenia VML. Ponadto ocena funkcjonalnego powrotu do zdrowia jest kluczowa dla ustalenia skuteczności terapeutycznej. W tym kontekście badania in vivo skurczu mięśni z przezskórną stymulacją nerwową są metodą minimalnie inwazyjną, która pozwala na powtarzaną ocenę funkcjonalną w trakcie badania – na tym samym organizmie. W świetle tych rozważań, niniejszy artykuł opisuje metodę oceny funkcji mięśni in vivo w mięśniu żwacza szczura przed i po urazie VML. Ten protokół jest pierwszym opublikowanym przypadkiem szczegółowo opisanym na temat powstania i funkcjonalnej oceny biologicznie istotnego urazu czaszkowo-twarzowego VML u szczura.

Wprowadzenie

Urazy urazowe i chirurgiczne tkanek miękkich, które obejmują mięśnie szkieletowe pod spodem, pozostają jednym z największych wyzwań w rekonstrukcji tkanek zarówno dla cywilów, jak i rannych wojowników1. W rzeczywistości prawie 20% obrażeń na polu bitwy występuje także w obszarach czaszkowo-twarzowych rannych wojowników (głowa i twarz)2. Łącznie, urazy kończyn oraz urazy głowy i szyi stanowią >80% obrażeń bojowych w ostatnich konfliktach2. Pomimo dość dobrze znanej zdolności mięśni szkieletowych do naprawy, regeneracji i przebudowy po urazie, te poważniejsze urazy, które wiążą się z utratą znacznej części tkanki mięśniowej, nie są w stanie samodzielnie się zagoić i nazywane są urazami objętościowymi utratą mięśni (VML). Z definicji VML powoduje trwałe deficyty estetyczne i funkcjonalne zarówno uszkodzonego mięśnia, jak i jednostkimięśniowej 3.

Co ciekawe, pomimo częstości urazów czaszkowo-twarzowych VML 2,4, większość dotychczasowych badań koncentruje się na mięśniach kończyn 5,6,7,8 oraz tułowiu 9,10,11, z zaledwie kilkoma doniesieniami o urazach VML w mięśniach czaszkowo-twarzowych 12,13,14. Stanowi to potencjalnie istotną lukę w badaniach translacyjnych, ponieważ zachowana literatura sugeruje, że istnieją istotne różnice zarówno w biologii rozwojowej, jak i w zdolności regeneracyjnej między mięśniami czaszkowo-twarzowymi a mięśniami kończyn i tułowia15,16. W rzeczywistości po każdej stronie twarzy jest ponad 20 mięśni — co odzwierciedla fakt, że obszar czaszkowo-twarzowy jest zaangażowany w wykonywanie wielu niezbędnych czynności tak różnorodnych jak mruganie, połykanie czy żucie15. Co więcej, nawet wśród mięśni czaszkowo-twarzowych pojawiają się różnice w zdolnościach regeneracyjnych. Na przykład mięśnie zewnętrzne wydają się regenerować szybciej niż mięśnie kończyn17. Natomiast żwacz wykazuje wolniejszą odpowiedź regeneracyjną niż mięśnia piszczelowa przednia (TA)18. Różnice te mogą wynikać przynajmniej częściowo z tego, czy pochodzenie mięśni jest gałęziowe czy somitowe — co skutkuje zarówno różnymi ilościami komórek satelitarnych, jak i różnymi profilami ekspresji genów w populacjach satelitarnych19. Uwzględnienie unikalnych cech mięśni czaszkowo-twarzowych, a także w odniesieniu do mięśni kończyn i tułowia, może dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w rozwój lepszych terapii spersonalizowanych metod leczenia specyficznych dla mięśni urazów VML. Te specyficzne dla mięśni różnice mogą również tłumaczyć znane ograniczenia mięśni przypominających arkusze, takich jak mięśnie grzbietowe szerega grzbietu, jako opcji transferu tkanki dawcy w operacjach rekonstrukcji głowy i szyi 20,21,22.

Niezależnie od miejsca urazu VML, obecnie nie ma leczenia, które mogłyby przywrócić pełną formę i funkcjonowanie. Złoty standard kliniczny obejmuje autologiczne przeniesienie tkanek oraz rehabilitację; Jednak pierwsze zazwyczaj nie poprawia siły i może prowadzić do zachorowalności w miejscu dawcy 3,23, podczas gdy drugie poprawia zakres ruchu, z minimalnym wpływem na funkcjonalną regenerację lub powrót siły kurczliwej w mięśniu 1,6. Z tych wszystkich powodów trwają badania nad opracowaniem skuteczniejszych metod terapeutycznych regeneracji funkcjonalnej tkanki mięśniowej po urazie VML. Niedawna analiza podkreśliła kluczowe znaczenie badań przedklinicznych nad modelami uszkodzeń VML na szczurach dla rozwoju rozwiązań technologii regeneracyjnych w naprawie VML1.

Jak zauważono w wcześniejszych badaniach 5,8,9,10,24,25, ocena funkcjonalnego powrotu do zdrowia po VML jest kluczowa dla oceny skuteczności interwencji terapeutycznych. Konkretnie, choć gojenie ran i regeneracja objętościowa są kluczowymi cechami naprawy VML, pomiar regeneracji siły po urazie i leczeniu pomaga rzucić światło na wieloskalowe mechanizmy biomechaniczne odpowiedzialne za deficyty VML, a także na mechanizmy napędzające funkcjonalną regenerację. Dlatego ustanowienie związku między naprawą tkanek, odzyskiem objętości a wzmocnieniem mięśni jest absolutnym wymogiem do określenia najbardziej skutecznych rozwiązań regeneracyjnych do naprawy VML9.

W tym kontekście istnieją trzy główne metody dokonywania tych pomiarów funkcjonalnych: (1) in vitro, (2) in situ oraz (3) testy in vivo — każda z nich oferuje swoje zalety i wady8. Na przykład testy in vitro polegają na badaniu funkcji mięśni izolowanych poza organizmem żywym i dają możliwość bezpośredniej/konkretnej manipulacji stymulacją mięśni za pomocą różnych leków i chemikaliów wpływających na pobudliwość i skurcz mięśni26. Chociaż ta metoda pozwala na szczegółowe badania komórkowych i molekularnych aspektów funkcji i regeneracji mięśni27, eliminuje dopływ krwi i unerwienie, co ogranicza skuteczność odwzorowania prawdziwej funkcji mięśni 8,26. Testy in situ oceniają funkcję mięśni, gdy mięsień pozostaje w swoim naturalnym położeniu anatomicznym, ale jest odizolowany od otaczających tkanek25,28. Chociaż ta metoda utrzymuje unerwienie i ukrwienie, rozdzielenie mięśni może nadal ograniczać zastosowanie wyników w środowisku in vivo. Dodatkowo, i być może najważniejsze, zarówno testy in situ, jak i in vitro to procedury końcowe, które wykluczają badania podłużne – co jest konieczne do śledzenia funkcjonalnej regeneracji w czasie u tego samego zwierzęcia. Natomiast testy in vivo, które polegają na ocenie funkcji mięśni w ich środowisku rodzimym, umożliwiają pełniejsze zrozumienie wydajności mięśniw kontekście fizjologicznym. Badania in vivo są również najmniej inwazyjną techniką i mogą być wykonywane wielokrotnie w trakcietrwania badania. Za pomocą przezskórnej stymulacji nerwów elektrycznych można zebrać funkcjonalne pomiary w określonych mięśniach, pozostawiając ścięgna, naczynia i unerwienia nienaruszone30. Te oceny podłużne mogą dostarczyć wglądu w subtelne, lecz istotne zmiany zachodzące na różnych etapach gojenia u tego samego zwierzęcia. Metoda ta jest powszechnie stosowana w modelach z małymi gryzoniami 8,31,32,33; Jednak był również używany w większych modelach zwierzęcych Świni30 i psa34.

Obecnie opublikowano trzy badania dotyczące oceny funkcjonalnej rekonwalescencji po urazach VML czaszkowo-twarzowych. Rodriguez i in. przedstawiają metodę naprawy modelu urazu czaszkowo-twarzowego VML w mięśniu owieczdusznym jarzmakiem major. Ich metoda określa protokół testów in situ , który można wdrożyć tylko w końcowym momencie badania, a zatem nie pozwala na ocenę podłużną w obrębie jednego zwierzęcia13. Kim i in. opisują metodę wykorzystania elektroniki nanomembranowej do śledzenia ciągłych danych elektromiograficznych dotyczących żucia myszy po urazie VML. Zgłaszali oni znacznie niższy sygnał od uszkodzonych myszy w porównaniu do grup kontrolnych, jednak zauważyli również, że artefakty ruchu wpływały na analizę sygnału i że myszy czasami próbowały zdrapać obwód. Dodatkowo zastosowano myszy atymiczne i nagie, aby umożliwić bezpieczne przymocowanie nanobłony do skóry, co obecnie uniemożliwia szersze zastosowanie tej metody w częściej stosowanych (i bardziej opłacalnych) modelach zwierzęcych12. Na koniec Zhao i in. opisują krytycznie dużą wadę VML w mysiej masierze, która zaburza odżywianie zwierząt, co odzwierciedla znaczący spadek masy ciała, jako funkcjonalny wynik14. Mając na uwadze te badania, niniejszy artykuł opisuje wszechstronną i minimalnie inwazyjną metodę podłużnej oceny in vivo funkcji kurczliwej szczęki szczura przed i po urazie VML poprzez stymulację nerwu trójdzielnego elektrodami podskórnymi. W trakcie testu przechodząc przez serię rosnących częstotliwości symulacyjnych (20-200 Hz), przetwornik mierzy generowaną siłę mięśnia. Te pomiary pozwalają na określenie sztywności mięśni i maksymalnego tężca, między innymi. Poniższy protokół ma na celu ocenę funkcjonalnego powrotu do zdrowia siły zgryzu po stronie ipsilateralnej po urazie urazu VML i zawiera również protokół chirurgicznego stworzenia potwierdzonego urazu VML. Metodę tę można łatwo zastosować na szerokiej gamie szczurów i myszy — a przy odpowiednich modyfikacjach sprzętu stosujesię ją także do większych modeli zwierzęcych oraz urazów VML.

Protokół

Wszystkie procedury i obsługa zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii (IACUC). Szczury użyte w tych eksperymentach to samce szczurów Lewisa w wieku 12-14 tygodni, ważące 324,8 g ± 12,72 g w chwili operacji. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Uraz mięśnia żwacza (VML)

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Przed operacją upewnij się, że wszystkie niezbędne narzędzia zostały odpowiednio wysterylizowane: zasłony chirurgiczne, skalpel, kleszcze, mikronożyczki, hemostaty, szwy i gazy.
    2. Włącz podgrzewaną platformę i ustaw ją na 37 °C.
    3. Stosuj sterylną maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec suchości oczu pod znieczuleniem i suchością. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i podaj 2%-3% izofluranu (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  2. Chirurgiczne powstanie urazu VML
    1. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone przed wyjęciem z komory.
      UWAGA: Można to ustalić, jeśli zwierzę nie reaguje na uszczypnięcie palca.
    2. Zważ i umieść zwierzę na desce chirurgicznej w pozycji bocznej po lewej stronie, z nosem mocno osadzonym w stożku nosa, aby umożliwić dalsze podawanie izofluranu.
    3. Przygotuj zwierzę do operacji, podając odpowiedni środek przeciwbólowy, goląc prawą stronę twarzy i sterylizując ten obszar za pomocą trzech zmian wymazów jodowych i alkoholowych. W tych badaniach zastosowano buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu w leczeniu przeciwbólowym (0,65 mg/kg masy ciała).
    4. Rozpocznij operację od wykonania około 2 cm nacięcia wzdłuż okolicy policzkowej szczura. Nacięcie powinno być w linii z nosem i uchem zwierzęcia. Użyj tępego rozwarstwienia, aby oddzielić skórę od powięzi.
    5. Zrób podobne nacięcie wzdłuż powięzi i delikatnie rozciń ją z dala od podłoża żwacza.
    6. Zlokalizuj nerwy policzkowe i marginalne (Rysunek 1A). Użyj sterylnego markera chirurgicznego i linijki, aby zaznaczyć miejsce do usunięcia. Obszar powinien mieć wymiary prostokąta o wymiarach 10 mm x 5 mm w centrum odsłoniętego żwacza, leżącego między nerwami twarzowymi (Rysunek 1B).
    7. Ostrożnie użyj mikronożyczek, aby rozpocząć usuwanie tkanek. Upewnij się, że ostateczne uraz osiąga głębokość około 4 mm przy użyciu 150 mg wyciętej tkanki (rysunek 1C). Usunięta tkanka będzie z pełnej grubości powierzchownego żwacza i częściowo przejdzie do głębokiego żwacza.
      UWAGA: Średnia masa tkanki usuniętej w tych eksperymentach wynosiła 146,1 mg ±1,16 mg.
    8. Zamknąć powięź i skórę odpowiednio za pomocą szwów przerwanych (6-0) i niechłonnych (5-0).
  3. Sprzątanie i monitorowanie
    1. Po zszyciu wyłącz gaz znieczulony i trzymaj zwierzę na rozgrzanej powierzchni, aby monitorować jego powrót do przytomności. Gdy szczur zacznie odzyskiwać przytomność, umieść je z powrotem w klatce i kontynuuj monitorowanie, aż się obudzi i będzie poruszać.
    2. Przez 3 dni po operacji obserwuj zwierzę i obserwuj wszelkie objawy bólu lub dyskomfortu.
    3. Przez 7 dni po operacji podawaj zwierzęciu miękką karmę, aby zmniejszyć obciążenie szczęki i zapewnić odpowiednie nawodnienie/karmienie.
    4. Usuń przerwane szwy 7-10 dni po operacji, upewniając się, że rana jest całkowicie zamknięta przed usunięciem.
    5. Po upływie końcowego czasu badania należy uśpić zwierzęta zgodnie z wytycznymi IACUC. Wyciągnij mięśnie mężaczy i zamrożenie błyskawicznie, zanurzając w ciekłym aferze lub chłodzonym ciekłym azotem izopentan.
      UWAGA: Próbki zamrożonej tkanki mogą być przechowywane długoterminowo w temperaturze -80 °C na potrzeby przyszłej oceny histologicznej.

2. Funkcjonalna ocena szczęki in vivo

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Sprawdź i upewnij się, że wszystkie urządzenia są prawidłowo podłączone.
    2. W kolejności włącz (1) komputer, (2) stymulator dwufazowy, (3) system dźwigni dwutrybowy oraz wreszcie (4) podgrzewaną platformę do podgrzewania do 37 °C.
      UWAGA: Instrukcja użytkownika podaje czas rozgrzewki 1 minutę, aby system stymulatora i dźwigni uzyskał dokładne odczyty. Dodatkowo, przed testowaniem zwierząt odczekaj 10-15 minut, aż platforma się całkowicie nagrzeje.
    3. Stosuj sterylną maść ocznu na oba oczy, aby zapobiec suchości oczu pod znieczuleniem. Umieść zwierzę do komory indukcyjnej i podaj 2%-3% izofluranu.
    4. Sterylizuj końcówki elektrod pokryte politetrafluoretylenem, umieszczając je w 70% etanolu.
    5. Zlokalizuj i otwórz oprogramowanie Dynamic Muscle Control (DMC). Będzie to konieczne do przeprowadzenia oceny funkcjonalnej.
  2. Konfiguracja oprogramowania
    1. W oprogramowaniu DMC znajdź Instant Stim w menu ustawień i zmień parametry na pożądane wartości. W tym badaniu nie zmieniają się parametry względem ich presetów (Rysunek 2A).
    2. W menu Setup utwórz i wybierz folder autosave do przechowywania danych.
    3. Na dole ekranu oprogramowania znajdziesz pole zatytułowane Autosave Base. Zmień to na tytuł specyficzny dla testowanego zwierzęcia, na przykład "rat#-timepoint" (Rysunek 2B).
    4. Wybierz Sequencer na górze ekranu oprogramowania. W nowym oknie, które się otworzy, wybierz Otwórz sekwencję na dole ekranu. Wybierz gotową sekwencję w eksploratorze plików, który się otwiera. To wypełni okno Sekwencji listą parametrów, takich jak częstotliwość, czas trwania bodźców i czas spoczynku (Rysunek 2C).
      1. Kliknij na Load Sequence , a następnie Close Window.
        UWAGA: Sekwencja używana w tym protokole składa się z 9 kroków (twitch, 20 Hz, 40 Hz, 50 Hz, 60 Hz, 80 Hz, 100 Hz, 150 Hz, 200 Hz) z 20 sekundami przerwy między nimi. Poza stymulacją drgawek, wszystkie kroki trwają 500 ms. Protokół sekwencji powinien być dostosowany do indywidualnych celów testowych każdego laboratorium.
    5. Aby otworzyć nowe okno i umożliwić przegląd akwizycji danych w czasie rzeczywistym, wybierz Plik > Live Data Monitor.
    6. W oknie Live Data Monitor ustaw skalę czasu, minimum wartości y i wartość y maksymalną ręcznie lub zaznaczając pole włączenia automatycznego skalowania.
  3. Przygotowanie zwierząt
    1. Upewnij się, że zwierzę znajduje się w odpowiednim planie znieczulenia przed wyjęciem z komory znieczulenia.
    2. Umieść zwierzę w pozycji leżącej z nosem mocno w stożku nosa, aby umożliwić dalsze podawanie izofluranu. Załóż pętlę zabezpieczającą na górnej połowie szczęki szczura, aby bezpiecznie przytrzymać jego nos do platformy.
    3. Ogol szyję i twarz zwierzęcia po stronie szczęki eksperymentalnej.
    4. Zabezpiecz górną połowę zwierzęcia, zakładając i przypinając pasek na jego ramionach i klatce piersiowej.
    5. Reguluj pozycję dźwigni gryzu za pomocą trzech obrotowych pokręteł umieszczonych w pobliżu platformy zestawu, aby kontrolować płaszczyzny X, Y i Z (rysunek 3A). Używając górnego pokrętła, opuszczaj dźwignię gryzienia w stronę zwierzęcia i użyj pozostałych dwóch pokręteł, aby ustawić koniec dźwigni tuż nad brodą zwierzęcia.
    6. Użyj pęsety, aby zaczepić pęsetę wokół dolnych zębów zwierzęcia, aby zabezpieczyć głowę i zapobiec jej przesuwaniu się (Rysunek 3B).
      UWAGA: Pętla znajduje się w otworze wywierconym w dźwigni zgryzania, 3 cm od przetwornika siły. System powinien być skalibrowany przed pierwszym użyciem.
    7. Reguluj wysokość dźwigni, aby zwiększyć napięcie szczęki. Powtarzalne napięcie bazowe użyte w tych eksperymentach wynosiło ~0,5 N.
  4. Umieszczenie elektrod
    1. Palpuj szczękę zwierzęcia i zlokalizuj tylny róg żuchwy. Elektrody ustaw podskórnie po obu stronach narożnika, w odległości około 2-3 mm od siebie. Elektrody powinny być wstawiane na głębokości 3-5 mm. Użyj klipsa i stojaka z aligatora, aby utrzymać elektrody na miejscu.
    2. W oknie Live Data Monitor kliknij duży pomarańczowy przycisk oznaczony Instant Stim , aby go aktywować.
    3. Monitor powinien zacząć wykazywać skoki w górę podczas każdej stymulacji. Dostosowuj położenie elektrod i pozycję dźwigni za pomocą pokręteł, w zależności od potrzeby. Należy obserwować tylko aktywację po stronie ipsilateralnej szczęki (Rysunek 4).
    4. W wysokowydajnym stymulatorze dwufazowym znajdują się dwa pokrętła w centrum, oznaczone jako "Zasięg" i "Regulacja". Zacznij kręcić pokrętłem Range , aby modulować natężenie. Wraz ze wzrostem natężenia prądu szczyty natychmiastowej stymulacji zaczynają nabierać wartości aż do momentu stagnacji – określanego jako poziom, na którym trzy kolejne stymulacje wywołują identyczne reakcje kurczliwe.
      1. Unikaj nadmiernego podkręcania natężenia prądu, czyli nie więcej niż 20% powyżej poziomu zaobserwowanego maksymalnego szczytu — ponieważ może to prowadzić do rekrutacji sąsiednich mięśni i niedokładnych odczytów siły.
    5. Przekręć pokrętło Reguluj , aby modulować procent aktualnego "zakresu" używanego do stymulacji szczęki. Może być konieczne zwiększenie lub zmniejszenie prądu, aby zoptymalizować reakcję drgawkową.
    6. Upewnij się, że elektrody są nadal dobrze umieszczone i zatrzymaj natychmiastową stymulację.
    7. Pod pomarańczowym przyciskiem "Instant Stim" w monitorze danych na żywo znajdź szary przycisk Start Sequence i kliknij go.
    8. Kontynuuj monitorowanie krzywizn przez cały czas trwania protokołu stymulacyjnego. Wraz ze wzrostem częstotliwości stymulacji, rośnie także maksymalna wytworzona siła. Gdy tężec zostanie osiągnięty, krzywe siły ustabilizują się (rysunek 5A).
  5. Sprzątanie
    1. Po zakończeniu sekwencji stymulacji funkcjonalnej usuń elektrody i wytrzyj je 70% etanolem. Jeśli to ostatnie zwierzę do testu, elektrody można umieścić z powrotem w pokrywach.
    2. Wyłącz gaz znieczulowy, ale pozostaw zwierzę na rozgrzanej powierzchni, aby monitorować jego powrót do przytomności. Gdy szczur zacznie odzyskiwać przytomność, umieść go z powrotem w klatce i kontynuuj monitorowanie, aż zwierzę się obudzi i będzie poruszać.
    3. Wyłącz sprzęt używany do akwizycji danych i wytrzyj wszystkie powierzchnie.

3. Analiza danych

UWAGA: Metoda ta była wcześniej opisywana jako dokumentacja badań funkcjonalnych in vivo szczura TA8. Analiza danych ma na celu określenie intencji tego badania, a protokoły mogą się zmieniać w zależności od celów użytkownika.

  1. Znajdź i otwórz oprogramowanie Dynamic Muscle Analysis .
  2. Kliknij w menu Wysoka Przepustowość i wybierz Analizę Częstotliwości Siły , aby przeanalizować wiele próbek jednocześnie.
  3. Wybierz pliki Wybierz i podświetl tyle plików danych, ile chcesz, do analizy. Przycisk "Wybierz folder" może być również użyty, jeśli sample są wyraźnie nazwane w systemie plików.
  4. Zaznacz pole Usuń Baseline. Automatycznie usunie to bazową siłę z maksymalnej siły rejestrowanej dla każdej próby, dając absolutne maksymalne wartości.
  5. Kliknij przycisk Analizuj , a następnie kliknij Eksportuj tabelę do Excela , gdzie dane można zapisać jako arkusz kalkulacyjny. Upewnij się, że wartości "Start Cursor" i "End Cursor" dokładnie oddają znacznik czasu stymulacji. Wartości te można ustawić ręcznie, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  6. Otwórz zapisany arkusz kalkulacyjny.
    UWAGA: Korzystając z kolumny "Maksimum", użytkownik może obliczyć maksymalną siłę wytwarzaną na wszystkich częstotliwościach. Można również wygenerować krzywą siły-częstotliwość (Rysunek 5).

Wyniki

Jak opisano w wcześniejszej publikacji, krzywe tetaniczne mogą być używane do rozróżniania wyników optymalnych od wyników suboptymalnych8. Idealny efekt uzyskuje się, gdy mięsień jest stymulowany do maksymalnej siły i utrzymuje tę maksymalną przez cały czas trwania skurczu tężencowego. Suma poszczególnych drgawek do krzywych tetanicznych zwykle zaczyna się pojawiać przy lub po 100 Hz. Rysunek 5A pokazuje ten punkt, ponieważ idealna krzywa przy 150 Hz ma gwałtowny wzrost na początku stymulacji, płaską fazę plateau przy maksymalnej wartości siły przy minimalnych oscylacjach, a gwałtowny, pionowy spadek po zakończeniu stymulacji. Nieidealne krzywe tetaniczne mogą wykazywać oscylacje podczas fazy płaskowyżu i mogą wykazywać ujemne lub dodatnie nachylenie (rysunek 5C,D).

Wyniki tego protokołu testów funkcjonalnych mogą być reprezentowane inaczej w zależności od celów badaczy oraz projektu eksperymentalnego badania. W przypadku tego protokołu maksymalna siła absolutna jest empirycznie określana na podstawie wszystkich częstotliwości stymulacji i wyświetlana na wykresie dla każdego punktu czasu podczas testowania. Pozwala to porównywać bazową maksymalną siłę produkcji z maksymalną siłą co 4 tygodnie po powstaniu opisanego urazu VML w żwaczu (Rysunek 1D). Dla porównania, w każdym punkcie przebadano także kohortę nieuszkodzonych zwierząt (n = 4) (Rysunek 1E). Porównano również wagę zwierząt w każdym momencie (Rysunek 1F). Odpowiednio 4, 8 i 12 tygodni po VML szczury wygenerowały średnią maksymalną siłę 7,958 N ±1,797 N, 7,183 N ±1,450 N oraz 7,823 N ± 0,626 N. Jednokierunkowa analiza wariancji powtarzanych (ANOVA) z najmniejszą istotną różnicą Fishera (LSD) po parach wykazała, że nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między tymi wartościami w żadnym momencie po urazie VML, jednak wszystkie różniły się znacząco od średniej bazowej siły 10,031 N ±0,564 N.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat chirurgiczny i wyniki funkcjonalne dla mięśnia żwacza uszkodzonego przez VML. Zbudowany mięsień żwaczy wykazujący anatomiczną orientację oraz punkty orientacyjne nerwowe umożliwiające powstanie urazu (A). Zwierzę podczas operacji przed (B) i po (C) powstaniu urazu VML. Wszystkie obrazy są prezentowane z mięśniami w tej samej orientacji co (A). Żółta przerywana linia wskazuje obszar, w którym mięsień ma zostać usunięty. Maksymalna produkcja siły na poziomie wyjściowym i w czasie u szczurów, które doznały urazu VML (n = 9) na żwaczu (D), a także u szczurów kontrolnych w odpowiednim wieku, które nie odniosły obrażeń (n = 4) (E). Wykres masy ciała szczurów w czasie (F). (D) reprezentuje jednokierunkową ANOVA z powtórnymi pomiarami Fishera z porównaniami LSD po hoc, gdzie **= p < 0,01, ***= p < 0,001, ****= p < 0,0001. Linijki w (A) i (C) są w centymetrach, z podziałami w milimetrach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Inicjalizacja oprogramowania do testów funkcjonalnych. Konfiguracja parametrów dla oprogramowania DMC. Ustawianie Instant Stim do pożądanych wartości (A). Graficzny interfejs użytkownika oraz lokalizacja podstawowego pola AutoSave (B). Wybór 9-krokowej sekwencji protokołu używanej do testowania (C). Przedstawione tutaj wartości są przykładowymi wartościami użytymi w tym badaniu, ale mogą wymagać optymalizacji i dostosowania w zależności od konkretnych zastosowań innych osób. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Funkcjonalne osie ruchu rigu i prawidłowe ustawienie zwierząt. Schemat ilustruje relację między każdym z trzech kółek regulacyjnych na funkcjonalnym układzie testowym a odpowiadającymi im osiami ruchu ramienia dźwigni (A). Przykładowe zdjęcie szczura poddawanego testom funkcjonalnym, pokazujące prawidłowe położenie zwierzęcia na plecach na platformie oraz inne ważne elementy platformy (B). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykład jednostronnej i obustronnej aktywacji szczęki podczas testowania. (A) pokazuje szczękę szczura w spoczynku przed jakąkolwiek stymulacją. Nieprawidłowo umieszczone elektrody mogą powodować obustronny skurcz szczęki, co wskazują żółte strzałki (B), natomiast prawidłowo umieszczone elektrody powodują pożądany skurcz ipsilateralny (C). Żółte strzałki wskazują miejsca skurczu w szczęce. Pokazano także przykładowe krzywe siłowo-czasowe przy 150 Hz dla obustronnej (D) i jednostronnej (E) aktywacji mięśni. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne krzywe bodźca-odpowiedź dla testów akceptowalnych i nieakceptowalnych. Przykładowe krzywe stymulacyjne w 40, 80 i 150 Hz (A), aby pokazać, na co zwracać uwagę przed i podczas skurczu tetanicznego. Wraz ze wzrostem częstotliwości stymulacji, zarejestrowane szczytowe napięcie jest również wyższe, co można zaobserwować na krzywych siły-częstotliwość (B) pokazujących średnią rannych zwierząt (n = 9) na poziomie wyjściowym oraz 8 tygodni po utworzeniu VML. (C,D) prezentują reprezentatywne przykłady kształtu odpowiedzi siłowej, które wskazują na konieczność regulacji elektrod z powodu nieprawidłowego tężca. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Protokół ten opisuje prostą i wiarygodną metodę funkcjonalnego badania in vivo siły ugryzienia po stronie bocznej wywołanej w szczęce szczura. Opisana jest także metoda chirurgicznego powstania urazu VML w mięśniu żwacza szczura. W połączeniu te metody dostarczają biologicznie istotnego modelu zwierzęcego do przeprowadzenia podłużnej oceny funkcjonalnej rekonwalescencji przed i po urazie czaszki i twarzy. Chociaż inne metody testowania, takie jak in vitro i in situ, również mogą dostarczyć cennych informacji, wymagają one izolacji ścięgna i usunięcia tkanki z jej środowiska rodzimego, co ogranicza ich zastosowanie do lepszego zrozumienia wyników funkcjonalnych in vivo 8,25,26,27,28. Dzięki odpowiedniemu treningowi i praktyce badacz będzie w stanie szybko ustawić zwierzę do testów i wprowadzić niezbędne korekty, aby osiągnąć maksymalną produkcję siły mięśniowej.

Istnieją szczegóły techniczne, które należy zweryfikować dla każdego zwierzęcia, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie elektrod i stymulację. Po pierwsze, górne siekacze powinny być zabezpieczone tak, aby głowa szczura w pełnym kontakcie z podgrzewaną platformą. To również utrzymuje nos szczura w stożku nosa podczas ciągłego podawania znieczulenia wziewnego. Jeśli głowica nie jest utrzymywana we właściwej pozycji, pojawią się niespójności w odczytach siły, ponieważ napięcie bazowe się zmienia. Dodatkowo ciało zwierzęcia powinno leżeć na plecach, a kręgosłup prosty. Utrzymanie zwierzęcia w odpowiedniej pozycji pomoże w odpowiednim ustawieniu elektrod i ich utrzymaniu. Wreszcie, rozmieszczenie elektrod może być trudne, ponieważ muszą być umieszczone na odpowiedniej głębokości i w odpowiednich odstępach, aby stymulować tylko eksperymentalną stronę szczęki. Czujność i praktyka są istotne, aby opanować umiejętności umieszczania elektrod dla powtarzalnych i wiarygodnych rezultatów. Elektrody szybko stają się tępe, dlatego należy je często wymieniać. Charakterystyczne dla złego rozmieszczenia elektrod to aktywacja mięśni pomocniczych, odczyty siły o dodatnim/ujemnym nachyleniu (ruch elektrod podczas stymulacji) lub niezespolona/oscylujący przebieg tetaniczny8 (rysunek 5C,D).

Ponadto istnieje kilka ograniczeń tej metody, które warto uwzględnić i rozważyć w przyszłych zastosowaniach tego systemu. Po pierwsze, choć pętla użyta do zabezpieczenia szczęki górnej może nie być najbardziej sztywnym układem. Zamiast tego stereotaksyjne podejście z użyciem drążek na uszy mogłoby lepiej utrzymać górną szczękę szczura. Dodatkowo jako pozycja ustawiona do testów tą metodą użyto wartości napięcia pasywnego, co może nie skutkować maksymalną generacją siły, jaką uzyskano, gdyby mięsień był ustawiony na optymalnej długości (Lo). W rzeczywistościLO można było określić, ustawiając zwierzę zgodnie z opisaną tutaj i manipulując okluzją szczęki w małych (0,5-1 mm) krokach podczas stymulacji drgawkowej – z Lo jako optymalną pozycją testową, w której generowano maksymalną siłę drgania. Jednak mięsień krzyżaczny ma dość unikalną geometrię i ruch35,36, dlatego działa na znacznie szerszym zakresie długości niż typowe dla np. mięśni kończyn (które zazwyczaj działają wokół lewegoo-a). Jednak żucie odbywa się w wąskim zakresie w porównaniu do gryzienia. W związku z tym nie ma idealnego podejścia do tego problemu. Tak więc, choć ustawienie napięcia bazowego nie jest jedynym sposobem podejścia do tego problemu, istnieje logiczna naukowa podstawa, ponieważ optymalna długość mięśni szczęki przekracza naturalne otwarcie szczęki. Niezależnie od tego, maksymalna siła przy danym napięciu biernym nadal daje istotny wgląd w aspekty funkcji – nawet jeśli różni się od maksymalnej siły w Lo. Oczywiście konieczne są dalsze badania zależności między siłą a długością mięśnia żwacza. Na koniec ta metoda analizuje stymulację nerwu trójdzielnego u szczura, który dzieli się na trzy gałęzie: V1-V3. Chociaż V3, czyli nerw żuchwywy, jest jedyną gałęzią z komponentem ruchowym, unerwia wiele mięśni, w tym mięśnie żwaczowe, skroniowe, skrzydłowe i mylohyoid37. Jest to ważne do rozważenia, ponieważ oznacza, że ta metoda nie obejmuje wyłącznie siły żwacza żwaczego, co może mieć znaczenie dla innych badań.

Pomimo tych technicznych aspektów i ograniczeń, metoda ta okazuje się solidna i spójna. Chociaż opisane są tu wyłącznie badania ipsilateralne, protokół można łatwo zmodyfikować, aby obejmować dodatkowe badania po drugiej stronie szczęki. Obustronne badania skurczu i funkcji żwaczy pozwoliłyby na porównanie zdrowia i urazu w obrębie jednego zwierzęcia, co być może wyjaśniłoby istotne zmiany kompensacyjne po stronie kontuzjowanej i/lub kontrolnej (po stronie zdrowej). Ogólnie rzecz biorąc, ten model stanowi potężne narzędzie do oceny funkcji mięśni podłużnych oraz funkcjonalnej regeneracji w sposób minimalnie inwazyjny. W związku z tym system ten będzie przydatny do oceny mechanizmów biomechanicznych związanych z deficytami funkcjonalnymi pośredniczonych przez VML, a także do testowania skuteczności różnych terapii w leczeniu urazów VML w okolicy czaszki twarzowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Myologica LLC za udostępnianie sprzętu używanego do przeprowadzania ocen funkcjonalnych. Badania opisane w tej publikacji zostały poparte przez National Institute of Dental & Craniofacial Research przy National Institutes of Health w ramach nagrody o numerze U24 DE029463. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Etanol 200 proofDecon LabsRozcieńczony do 70% wodą dejonizowaną
25 mm x 27 G elektrody igły monopolarneChalgren Enterprises111-725-24TPWykorzystywane do wykonywania pomiarów funkcjonalnych
Wymazy alkoholoweBD326895Do sterylizacji/czyszczenia
Klips i podstawka z aligatorem / Pomocna pomoc przy siedzeniu ręcznymEclipse Enterprise115584Utrzymywanie elektrod na miejscu
Sterylizator koralików18000-45Do operacji (ponowna sterylizacja narzędzi między zwierzętami)
Stymulator elektryczny dwufazowyAurora Scientific701CDostarczanie impulsów elektrycznych zwierzętom podczas testów funkcji
Dźwignia gryzieniaCustom Wydrukowane w 3D (szczegóły prosimy o kontakt z autorami)
Sprężony tlenPraxairUN1072
Aplicatory z bawełnianymi końcówkamiFisher22363157Do operacji
System dźwigni mięśniowej z podwójnym trybemAurora Scientific309CWykorzystywane do wykonywania pomiarów funkcjonalnych
System dynamicznego pozyskiwania i analizy danych mięśniowychAurora Scientific615AWykorzystywane do zbierania i analizy pomiarów funkcjonalnych
Maska na twarzPrzybij piątkęAM101Do operacji
KleszczeIntegra Miltex6-100 Do operacji
GazaMedlinePRM21408CDo operacji
Maszynki do strzyżania włosówPhillipsMG3750Usuwanie futer
HairnetVWR75829-204Do operacji
IzofluranCovetrud29405
Isofluran evaporizer funnel fillWyposażenie weteran911103
Vaporizer izofluranowyKent ScientificVetFlo-1231Podanie znieczulenia
Duże urządzenia dla gryzoni/małych zwierzątAurora Sceintific807BUżywany z silnikiem 309C do pomiarów funkcjonalnych
MikronożyceFST91500-09Do operacji
Wkręt igiełFST1200-13Do operacji
Povidone-jodMedlineMDS093943Do sterylizacji/czyszczenia
Prolene Sutures 5-0Ethicon8698GSzycie skóry
SkalpelPersonna Medical73-8030Do operacji
Ostrze skalpelaSzklany Van1834Do operacji
Zasłony chirurgiczne – materiał ACTNie maNie maCięcie do 8 x 11 cali i autoklaw przed operacją
Rękawice chirurgiczneBis5711103PFDo operacji
Fartuch chirurgicznyVWR414004-467Do operacji
Pompa grzewczo-chłodząca T/PompaBraintree Scientific, IncTP-700Podgrzewanie platform zwierzęcych do operacji i testów funkcji – ustawione na ciągły czas terapii w temperaturze 38/100
Filtr węgla aktywowanego VaporGuardWyposażenie weteran931401
Vicryl Sutures 6-0EthiconJ492GSzycie powięzi

Bibliografia

  1. Kulwatno, J., Goldman, S. M., Dearth, C. L. Volumetric muscle loss: A bibliometric analysis of a decade of progress. Tissue Eng Part B: Rev. 29 (3), 299-309 (2023).
  2. Owens, B. D., et al. Combat wounds in Operation Iraqi Freedom and Operation Enduring Freedom. J Trauma. 64 (2), 295-299 (2008).
  3. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research Consortium. Volumetric Muscle Loss. J Am Acad Orthop Surg. 19, S35-S37 (2011).
  4. Lew, T. A., Walker, J. A., Wenke, J. C., Blackbourne, L. H., Hale, R. G. Characterization of craniomaxillofacial battle injuries sustained by United States service members in the current conflicts of Iraq and Afghanistan. J Oral Maxillofac Surg. 68 (1), 3-7 (2010).
  5. Dienes, J., et al. Semisynthetic hyaluronic acid-based hydrogel promotes recovery of the injured tibialis anterior skeletal muscle form and function. ACS Biomater Sci Eng. 7 (4), 1587-1599 (2021).
  6. Aurora, A., Garg, K., Corona, B. T., Walters, T. J. Physical rehabilitation improves muscle function following volumetric muscle loss injury. BMC Sports Sci Med Rehabil. 6, 41(2014).
  7. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. BioRes Open Access. 1 (6), 280-290 (2012).
  8. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. J Vis Exp. 116, e54487(2016).
  9. Passipieri, J. A., et al. In silico and in vivo studies detect functional repair mechanisms in a volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 25 (17-18), 1272-1288 (2019).
  10. Corona, B. T., et al. Further development of a tissue-engineered muscle repair construct in vitro for enhanced functional recovery following implantation in vivo in a murine model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 18 (11-12), 1213-1228 (2012).
  11. Chen, X. K., Walters, T. J. Muscle-derived decellularised extracellular matrix improves functional recovery in a rat latissimus dorsi muscle defect model. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 66 (12), 1750-1758 (2013).
  12. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci (Weinh). 8 (17), 2101037(2021).
  13. Rodriguez, B. L., et al. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
  14. Zhao, N., et al. A critical size volumetric muscle loss model in mouse masseter with impaired mastication on nutrition. Cell Prolif. 57 (6), e13610(2024).
  15. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
  16. Noden, D. M., Francis-West, P. The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles. Dev Dyn. 235 (5), 1194-1218 (2006).
  17. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Dev Biol. 397 (1), 31-44 (2015).
  18. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  19. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  20. Aladimi, M. T., et al. Factors to consider when deciding on the type of free-flap reconstruction of head and neck soft tissue defects. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 79 (4), 230-238 (2017).
  21. Maxwell, G. P., Leonard, L. G., Manson, P. N., Hoopes, J. E. Craniofacial coverage using the latissimus dorsi myocutaneous island flap. Ann Plast Surg. 4 (5), 410-421 (1980).
  22. Strübing, F., et al. Scalp reconstruction using the latissimus dorsi free flap: A 12-year experience. J Clin Med. 12 (8), 2953(2023).
  23. Carnes, M. E., Pins, G. D. Skeletal muscle tissue engineering: Biomaterials-based strategies for the treatment of volumetric muscle loss. Bioengineering. 7 (3), 85(2020).
  24. Mintz, E. L., et al. Long-term evaluation of functional outcomes following rat volumetric muscle loss injury and repair. Tissue Eng Part A. 26 (3-4), 140-156 (2020).
  25. Westman, A. M., et al. A coupled framework of in situ and in silico analysis reveals the role of lateral force transmission in force production in volumetric muscle loss injuries. J Biomech. 85, 118-125 (2019).
  26. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. 69, e4198(2012).
  27. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. J Vis Exp. (71), e50036(2013).
  28. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. (56), e3167(2011).
  29. Iyer, S. R., Valencia, A., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods Mol Biol. 1460, 293-307 (2016).
  30. Corona, B. T., Call, J. A., Borkowski, M., Greising, S. M. In vivo measurement of hindlimb dorsiflexor isometric torque from pig. J Vis Exp. (175), e62905(2021).
  31. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. J Vis Exp. (169), e62211(2021).
  32. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. J Vis Exp. (51), e2782(2011).
  33. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12 (1), 246(2011).
  34. Childers, M. K., Grange, R. W., Kornegay, J. N. In vivo canine muscle function assay. J Vis Exp. (50), e2623(2011).
  35. Cox, P. G., Jeffery, N. Reviewing the morphology of the jaw-closing musculature in squirrels, rats, and guinea pigs with contrast-enhanced micro CT. Anat Rec. 294, 915-928 (2011).
  36. Nordstrom, S. H., Yemm, R. Sarcomere length in the masseter muscle of the rat. Arch Oral Biol. 12 (5), 895-902 (1972).
  37. Huff, T., Weisbrod, L. J., Daly, D. T. Neuroanatomy, Cranial Nerve 5 (Trigeminal). , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ocena in vivofunkcja mięśniuraz mięśni twarzoczepalnychprzezskórna stymulacja nerwówregeneracja mięśnipowrót funkcjimodel szczurzyskurcz mięśnia
Funkcjonalna ocena in vivo mięśnia masetera szczura po chirurgicznym utworzeniu urazu objętościowego (VML)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.