Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania siatkówki. Dysfunkcja RPE bierze udział w patogenezie ważnych chorób siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Przedstawiamy uproszczone podejście do izolacji RPE od mysich oczu dorosłych. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, podejście to umożliwia izolację i hodowlę wysoce czystych RPE od dorosłych myszy. Ta prosta i szybka metoda nie wymaga rozległych umiejętności technicznych i jest osiągalna przy użyciu podstawowych narzędzi naukowych i odczynników. Pierwotne RPE izoluje się od myszy tła C57BL/6 w wieku od 3 do 14 tygodni poprzez enukleację oka, a następnie usunięcie przedniego odcinka. Enzymatyczna trypsyna i wirowanie służą do dysocjacji i izolacji RPE od muszli ocznej. Podsumowując, podejście to oferuje szybki i skuteczny protokół wykorzystania RPE w badaniu funkcji i chorób siatkówki.
Wprowadzenie
Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wyspecjalizowana monowarstwa komórkowa wyściełająca błonę Brucha znajdująca się między fotoreceptorami a naczyniówką1. Komórki RPE odgrywają kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu siatkówki. Komórki RPE transportują glukozę i witaminę A do fotoreceptorów, promują widzenie poprzez ponowną izomeryzację siatkówki all-trans do siatkówki 11-cis i utrzymują zewnętrzne segmenty fotoreceptora poprzez fagocytozę zrzucanych segmentów zewnętrznych, usuwają wodę z przestrzeni podsiatkówkowej, tworzą zewnętrzną barierę krew-siatkówka poprzez obecność ścisłych połączeń i wydzielają neurotropowe czynniki wzrostu (takie jak czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego, i Podstawowy Czynnik Wzrostu Fibroblastów), które wspierają fotoreceptory2. Dysfunkcja komórek RPE bierze udział w patogenezie różnych retinopatii, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki i retinopatii cukrzycowej3,4,5. Badania in vitro z wykorzystaniem komórek RPE mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy tych chorób. Pierwotne komórki RPE są znacznie preferowane w tych badaniach, ponieważ linie komórkowe RPE, choć łatwo dostępne, nie mają kluczowych cech pierwotnych komórek RPE.
Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródła pierwotnych komórek RPE, myszy mają tę przewagę, że korzystają z modyfikacji genetycznych, które pomagają zrozumieć patogenezę retinopatii. Poprzednio opisane protokoły izolacji komórek RPE od gryzoni albo wymagają użycia noworodków, są długotrwałe, wymagają umiejętności technicznych, albo nie nadają się do hodowli6,7,8,9,10,11,12. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania komórek RPE od dorosłych myszy, które dają wysoce czyste kultury tych komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Case Western Reserve.
1. Przygotowanie odczynników
- Przygotować pożywkę buforową do mycia, uzupełniając zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej z 10 mM roztworem buforowym HEPES. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Przygotuj pożywkę RPE, uzupełniając Zmodyfikowaną Pożywkę Orła firmy Dulbecco o 4,5 g/l glukozy, 1,25x suplement GlutaMAX (stężenie podstawowe 100x lub 200 mM; końcowe stężenie 2,5 mM L-glutaminy), z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną i 1x roztworem aminokwasów endogennych MEM (100x). Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
2. Ekstrakcja oka myszy
- Eutanazja myszy, najlepiej w wieku od 3 do 14 tygodni, przy użyciu zatwierdzonej przez IACUC metody eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu przy użyciu koktajlu ketamina/ksylazyna w dawce 0,1 ml na 20 g myszy [87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny] było metodą zastosowaną w tym badaniu).
UWAGA: Oczy pobrane od młodszych myszy ułatwią z czasem zwiększenie wydajności komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i wydłużą zdolność do kolejnych pasaży. - Połóż mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry.
- Umieść palec wskazujący i kciuk odpowiednio powyżej i poniżej oka. Delikatnie uciskaj strukturę kostną otaczającą oko, aby wywołać wysunięcie gałki ocznej.
- Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90°, aż oko odczepi się od oczodołu.
UWAGA: Nie zamykaj nożyczek, aby przeciąć oko lub nerw wzrokowy, ponieważ utrudni to rozcięcie muszli ocznej. - Natychmiast umieścić oko w 70% etanolu i przetoczyć je nie dłużej niż 5 sekund przed przeniesieniem go do bufora płuczącego przechowywanego na lodzie.
- Pod mikroskopem preparacyjnym przenoś jedno oko po oku na szalkę Petriego wypełnioną buforem do płukania i paskami namoczonej gazy.
- Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą. Delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata za pomocą noża chirurgicznego 3,00 mm 45° lub żyletki 0,009".
- Za pomocą nożyczek Vannas delikatnie włóż nożyczki do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste będzie można usunąć i wyrzucić.
- Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, uważając, aby nie naruszyć warstwy RPE.
UWAGA: Aby ułatwić usunięcie siatkówki, napełnij pipetę transferową pożywką buforową do płukania i ostrożnie nałóż ją na krawędzie muszli ocznej, aby delikatnie unieść siatkówkę. - Na koniec usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej za pomocą nożyczek. Uważaj, aby nie przebić muszli ocznej.
3. Izolacja pierwotnego RPE
- Przenieść muszlę oczną do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA.
UWAGA: Do jednej porcji trypsyny-EDTA można dodać dwie muszle oczne, aby zwiększyć wydajność uprawywalnego RPE. - Przenieść probówki do mikrowirówek do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut. Co 2 minuty wyjmuj rurki z łaźni wodnej i mocno postukaj dnem rurki 40 razy o blat.
- Po 10 minutach delikatnie rozbić muszlę oczną mechanicznie za pomocą pipety serologicznej P1000 lub pipety serologicznej o pojemności 2 ml, pipetując w górę i w dół nie więcej niż 3 razy.
UWAGA: Rozdrobnienie arkuszy RPE jest niezbędne, ponieważ duże arkusze nie będą prawidłowo przylegać. - Natychmiast zneutralizuj trypsynę, nakładając oderwane arkusze RPE, ale nie muszlę oczną, na 0,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Następnie rozcieńczyć trypsynę, nakładając kroplami 3 ml pożywki RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE.
- Odwirować RPE przy 340 x g przez 3 minuty.
- Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową (1,9 cm2 dołek) lub 48-dołkową (0,75 cm2 dołek).
UWAGA: RPE można posiewać na płytkach dołkowych pokrytych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, w szczególności lamininą, kolagenem IV lub fibronektyną, w celu zwiększenia adherencji11. RPE można również ponownie zawiesić w 1 ml pożywki RPE i nałożyć warstwami na gradient separacji o gęstości 40% w celu dalszej izolacji czystych komórek RPE. Dodatkowo, obracanie płytki z prędkością 340 x g przez 3-5 minut może zwiększyć adhezję komórek13. - Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
4. Hodowla RPE
- Nie należy zakłócać pracy odizolowanego RPE przez co najmniej 3 dni. Po 72 godzinach delikatnie usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką.
- Zmieniaj podłoże co 48 godzin po pierwszych 3 dniach.
- Gdy komórki osiągną konfluencję, przepuść komórki za pomocą 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA i zredukuj FBS w pożywce RPE do 2%,
UWAGA: Wcześniej informowano, że pierwotne RPE zaczynają się deróżnicować po 5-7 przejściach i zaczną tracić swój sześciokątny kształt i pigmentację14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany protokół został zastosowany u myszy w linii C57BL/6. Płeć nie wydaje się wpływać na możliwość hodowli RPE. Myszy poniżej 6. tygodnia życia dają ograniczone płaty RPE w porównaniu z myszami starszymi, przez co do osiągnięcia optymalnej konfluencji może być potrzebna większa liczba oczu. Po izolacji komórki RPE potrzebują około 3 dni na stabilizację i przytwierdzenie się do płytki hodowlanej. Około 24 h po izolacji okrągłe, pigmentowane komórki, które wydają się nie posiadać jądra, zaczynają osiadać, ale nie przylg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiliśmy uproszczony protokół izolacji i hodowli nabłonka barwnikowego mysiej siatkówki. Komórki RPE wyizolowane z oczu dorosłych myszy wykazywały ekspresję markera specyficznego dla RPE, RPE65, i markera połączenia międzykomórkowego, ZO-1. Dodatkowo wyhodowane komórki rozwinęły się w kulturze w pigmentowane, sześciokątne arkusze.
Wcześniej opublikowano kilka metod izolacji RPE u gryzoni: 6,7,8,9,10,11,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ujawnia się żadnych istotnych informacji finansowych ani niefinansowych.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) oraz P30 EY011373. Organizacja finansująca nie odgrywała żadnej roli w projektowaniu ani prowadzeniu tych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,009 RD Ostrza jednoostrzowe | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu |
| Surowica bydlęca | płodu Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka | Gibco | 14175095 | bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej |
| Roztwór buforowy HEPES (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Aminokwasy endogenne, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Nóż Micro-Unitome | BVI Beaver | 377546 | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Mikropłytki polistyrenowe | Falcon | 08-772-1 | 24-dołkowa lub 48-dołkowa |
| regularna płodowa surowica bydlęca | Corning | 35-010-CV | |
| Trypsyna-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | z czerwienią fenolową |
| Nożyczki Vannas | Fine Science Tools | 10091-12 |
Bibliografia
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
- Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
- Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
- Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
- Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
- Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
- Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
- Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
- Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
- Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
