Artykuł metodologiczny

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

DOI:

10.3791/66921

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania siatkówki. Dysfunkcja RPE bierze udział w patogenezie ważnych chorób siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Przedstawiamy uproszczone podejście do izolacji RPE od mysich oczu dorosłych. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, podejście to umożliwia izolację i hodowlę wysoce czystych RPE od dorosłych myszy. Ta prosta i szybka metoda nie wymaga rozległych umiejętności technicznych i jest osiągalna przy użyciu podstawowych narzędzi naukowych i odczynników. Pierwotne RPE izoluje się od myszy tła C57BL/6 w wieku od 3 do 14 tygodni poprzez enukleację oka, a następnie usunięcie przedniego odcinka. Enzymatyczna trypsyna i wirowanie służą do dysocjacji i izolacji RPE od muszli ocznej. Podsumowując, podejście to oferuje szybki i skuteczny protokół wykorzystania RPE w badaniu funkcji i chorób siatkówki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wyspecjalizowana monowarstwa komórkowa wyściełająca błonę Brucha znajdująca się między fotoreceptorami a naczyniówką1. Komórki RPE odgrywają kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu siatkówki. Komórki RPE transportują glukozę i witaminę A do fotoreceptorów, promują widzenie poprzez ponowną izomeryzację siatkówki all-trans do siatkówki 11-cis i utrzymują zewnętrzne segmenty fotoreceptora poprzez fagocytozę zrzucanych segmentów zewnętrznych, usuwają wodę z przestrzeni podsiatkówkowej, tworzą zewnętrzną barierę krew-siatkówka poprzez obecność ścisłych połączeń i wydzielają neurotropowe czynniki wzrostu (takie jak czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego, i Podstawowy Czynnik Wzrostu Fibroblastów), które wspierają fotoreceptory2. Dysfunkcja komórek RPE bierze udział w patogenezie różnych retinopatii, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki i retinopatii cukrzycowej3,4,5. Badania in vitro z wykorzystaniem komórek RPE mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy tych chorób. Pierwotne komórki RPE są znacznie preferowane w tych badaniach, ponieważ linie komórkowe RPE, choć łatwo dostępne, nie mają kluczowych cech pierwotnych komórek RPE.

Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródła pierwotnych komórek RPE, myszy mają tę przewagę, że korzystają z modyfikacji genetycznych, które pomagają zrozumieć patogenezę retinopatii. Poprzednio opisane protokoły izolacji komórek RPE od gryzoni albo wymagają użycia noworodków, są długotrwałe, wymagają umiejętności technicznych, albo nie nadają się do hodowli6,7,8,9,10,11,12. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania komórek RPE od dorosłych myszy, które dają wysoce czyste kultury tych komórek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Case Western Reserve.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować pożywkę buforową do mycia, uzupełniając zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej z 10 mM roztworem buforowym HEPES. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Przygotuj pożywkę RPE, uzupełniając Zmodyfikowaną Pożywkę Orła firmy Dulbecco o 4,5 g/l glukozy, 1,25x suplement GlutaMAX (stężenie podstawowe 100x lub 200 mM; końcowe stężenie 2,5 mM L-glutaminy), z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną i 1x roztworem aminokwasów endogennych MEM (100x). Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.

2. Ekstrakcja oka myszy

  1. Eutanazja myszy, najlepiej w wieku od 3 do 14 tygodni, przy użyciu zatwierdzonej przez IACUC metody eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu przy użyciu koktajlu ketamina/ksylazyna w dawce 0,1 ml na 20 g myszy [87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny] było metodą zastosowaną w tym badaniu).
    UWAGA: Oczy pobrane od młodszych myszy ułatwią z czasem zwiększenie wydajności komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i wydłużą zdolność do kolejnych pasaży.
  2. Połóż mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry.
  3. Umieść palec wskazujący i kciuk odpowiednio powyżej i poniżej oka. Delikatnie uciskaj strukturę kostną otaczającą oko, aby wywołać wysunięcie gałki ocznej.
  4. Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90°, aż oko odczepi się od oczodołu.
    UWAGA: Nie zamykaj nożyczek, aby przeciąć oko lub nerw wzrokowy, ponieważ utrudni to rozcięcie muszli ocznej.
  5. Natychmiast umieścić oko w 70% etanolu i przetoczyć je nie dłużej niż 5 sekund przed przeniesieniem go do bufora płuczącego przechowywanego na lodzie.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym przenoś jedno oko po oku na szalkę Petriego wypełnioną buforem do płukania i paskami namoczonej gazy.
  7. Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą. Delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata za pomocą noża chirurgicznego 3,00 mm 45° lub żyletki 0,009".
  8. Za pomocą nożyczek Vannas delikatnie włóż nożyczki do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste będzie można usunąć i wyrzucić.
  9. Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, uważając, aby nie naruszyć warstwy RPE.
    UWAGA: Aby ułatwić usunięcie siatkówki, napełnij pipetę transferową pożywką buforową do płukania i ostrożnie nałóż ją na krawędzie muszli ocznej, aby delikatnie unieść siatkówkę.
  10. Na koniec usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej za pomocą nożyczek. Uważaj, aby nie przebić muszli ocznej.

3. Izolacja pierwotnego RPE

  1. Przenieść muszlę oczną do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA.
    UWAGA: Do jednej porcji trypsyny-EDTA można dodać dwie muszle oczne, aby zwiększyć wydajność uprawywalnego RPE.
  2. Przenieść probówki do mikrowirówek do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut. Co 2 minuty wyjmuj rurki z łaźni wodnej i mocno postukaj dnem rurki 40 razy o blat.
  3. Po 10 minutach delikatnie rozbić muszlę oczną mechanicznie za pomocą pipety serologicznej P1000 lub pipety serologicznej o pojemności 2 ml, pipetując w górę i w dół nie więcej niż 3 razy.
    UWAGA: Rozdrobnienie arkuszy RPE jest niezbędne, ponieważ duże arkusze nie będą prawidłowo przylegać.
  4. Natychmiast zneutralizuj trypsynę, nakładając oderwane arkusze RPE, ale nie muszlę oczną, na 0,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  5. Następnie rozcieńczyć trypsynę, nakładając kroplami 3 ml pożywki RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE.
  6. Odwirować RPE przy 340 x g przez 3 minuty.
  7. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową (1,9 cm2 dołek) lub 48-dołkową (0,75 cm2 dołek).
    UWAGA: RPE można posiewać na płytkach dołkowych pokrytych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, w szczególności lamininą, kolagenem IV lub fibronektyną, w celu zwiększenia adherencji11. RPE można również ponownie zawiesić w 1 ml pożywki RPE i nałożyć warstwami na gradient separacji o gęstości 40% w celu dalszej izolacji czystych komórek RPE. Dodatkowo, obracanie płytki z prędkością 340 x g przez 3-5 minut może zwiększyć adhezję komórek13.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .

4. Hodowla RPE

  1. Nie należy zakłócać pracy odizolowanego RPE przez co najmniej 3 dni. Po 72 godzinach delikatnie usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką.
  2. Zmieniaj podłoże co 48 godzin po pierwszych 3 dniach.
  3. Gdy komórki osiągną konfluencję, przepuść komórki za pomocą 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA i zredukuj FBS w pożywce RPE do 2%,
    UWAGA: Wcześniej informowano, że pierwotne RPE zaczynają się deróżnicować po 5-7 przejściach i zaczną tracić swój sześciokątny kształt i pigmentację14.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół został użyty na myszach działających w tle C57BL/6. Wydaje się, że płeć nie zmienia zdolności do kulturowania RPE. Myszy poniżej 6 tygodnia życia dają ograniczone arkusze RPE w porównaniu ze starszymi myszami, a do osiągnięcia optymalnego zbiegu może być potrzebnych więcej oczu. Po izolacji komórki RPE potrzebują około 3 dni, aby ustabilizować się i przyłączyć do płytki hodowli komórkowej. Około 24 godziny po izolacji, okrągłe, pigmentowane komórki, które wydają się być bezjądrowe, zaczęły osiadać, ale nie przylgnęły w pełni do płytki (Rysunek 1A). W ciągu następnych 48-72 godzin komórki zaczynają się przyczepiać i rozprzestrzeniać, zachowując ciemną pigmentację i przezroczyste jądro (Rysunek 1B, C). Po 5 dniach RPE zwiększyły konfluencję i zaczęły tworzyć kontakty międzykomórkowe, przypominające spolaryzowaną monowarstwę o sześciokątnym kształcie (Rysunek 1D).

Izolowane RPE zostały ocenione pod kątem czystości i integralności ścisłego połączenia po 6 dniach w hodowli. RPE zostały najpierw ocenione pod kątem obecności izomerohydrolazy retinoidowej lub białka nabłonka barwnikowego siatkówki 65 kDA (RPE65), markera specyficznego dla RPE (Rysunek 2, zielony). Ponadto, aby RPE tworzył pojedynczą warstwę pigmentowanych komórek w kształcie sześciokąta, połączenia międzykomórkowe muszą pozostać nienaruszone. Białko ścisłego połączenia-1 lub zonula occludens-1 (ZO-1) to białka rusztowania niezbędne do utrzymania i integralności ścisłych połączeń między poszczególnymi komórkami RPE14. Zlewające się izolowane kultury RPE zachowały swoje międzykomórkowe białka połączeniowe, co wykazano przez barwienie ZO-1 znajdujące się na obrzeżach komórki (Rysunek 2, czerwony). Gdy komórki te osiągną zbieg w dużych arkuszach, utrzymują kontakty międzykomórkowe bez przerastania przez okres do 2 tygodni. Wcześniejsze badania wykazały, że ZO-1 ulega wysokiej ekspresji przez okres do 9 dni w culture15. Dodatkowe markery stosowane w hodowlach pierwotnego RPE to Collagen IV, CRALBP i OTX211.

figure-results-1
Rysunek 1. Morfologia mysiego pierwotnego RPE hodowanego na standardowej 24-dołkowej płytce polistyrenowej. (A) Pierwotny RPE wyizolowany z obu oczu myszy C57BL/6 i wyhodowany w jednym dołku na 24-dołkowej płytce z polistyrenu do niepowlekanych kultur tkankowych bezpośrednio po izolacji. (B,C) Po 48 godzinach i 72 godzinach pierwotne RPE zaczynają przylegać do płytki i tworzyć pigmentowane, dwujądrzaste komórki. (D) Po 5 dniach mikroskopia jasnego pola pokazuje, że przebarwione, sześciokątne komórki zwiększają zlewność i zaczynają tworzyć kontakty międzykomórkowe. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Marker specyficzny dla RPE, RPE-65 i marker połączenia międzykomórkowego, ZO-1, są konserwatywne w izolowanym pierwotnym mysim RPE. Pierwotne RPE od trzech myszy C57BL/6 hodowano przez 6 dni przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem. Komórki przesiąknięto 0,1% Triton-X w PBS przez 5 minut, zablokowano 5% normalną surowicą kozią i inkubowano z przeciwciałami przeciwko RPE-65 (zielony) lub ZO-1 (czerwony). Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Uproszczone schematyczne przedstawienie protokołu izolacji nabłonka barwnikowego siatkówki. Po wyjęciu gałki ocznej z myszy wysterylizuj oko, zanurzając je na krótko w 70% etanolu przed przeniesieniem do buforu do mycia. W buforze do płukania przeciąć wzdłuż ora serrata i usunąć przedni segment. Usuń siatkówkę i umieść muszlę oczną w probówce z trypsyną/EDTA. Delikatnie postukaj probówką o ladę co 2 minuty przez łącznie 10 minut, przenieś supernatant do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj osad RPE. Ponownie zawiesić komórki i płytkę na płytce 24- lub 48-dołkowej. Grafika wygenerowana przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy uproszczony protokół izolacji i hodowli nabłonka barwnikowego mysiej siatkówki. Komórki RPE wyizolowane z oczu dorosłych myszy wykazywały ekspresję markera specyficznego dla RPE, RPE65, i markera połączenia międzykomórkowego, ZO-1. Dodatkowo wyhodowane komórki rozwinęły się w kulturze w pigmentowane, sześciokątne arkusze.

Wcześniej opublikowano kilka metod izolacji RPE u gryzoni: 6,7,8,9,10,11,12. Wiele protokołów odrywa warstwy RPE od błony Brucha, co wymaga umiejętności technicznych i zwiększa ryzyko uszkodzenia RPE lub śmierci komórki 6,7,9,11,12,16. W związku z tym protokół ten wykorzystuje enzymatyczne odrywanie warstwy RPE, a nie dysocjację mechaniczną, w celu promowania przetrwania i utrzymania integralności arkuszy RPE w hodowli. Ta metoda daje mysie RPE w hodowli, która utrzymuje morfologię RPE z wysoce pigmentowanymi i sześciokątnymi komórkami, które zachowują ekspresję białek ścisłego połączenia. Ponadto w protokole tym brakuje użycia złożonych odczynników lub materiałów stosowanych w innych protokołach, takich jak przepuszczalne wkładki błonowe, dodatkowe białka powlekające macierz zewnątrzkomórkową lub specjalistyczne odczynniki dysocjacji tkanek. Zamiast tego protokół ten wykorzystuje proste trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA w połączeniu z mieszaniem tkanek w celu dysocjacji warstwy RPE od błony Brucha. Protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony na myszach w wieku od 3 do 14 tygodni; Jednak może być potrzebnych więcej oczu, aby pomyślnie uzyskać zlewającą się kulturę u młodych myszy.

Podczas wykonywania tego protokołu może pojawić się kilka wyzwań. Wymagane są umiejętności techniczne, aby precyzyjnie przeciąć okolicę ora serrata i ostrożnie usunąć siatkówkę bez naruszania warstwy RPE. Siatkówka może zostać zaburzona podczas przecinania obwodu twardówki, co może zmienić żywotność RPE. Udoskonalenie tej techniki można osiągnąć tylko poprzez powtarzalną, ciągłą praktykę. Dodatkowo arkusze RPE mogą pozostać przyczepione do warstwy siatkówki po usunięciu. Aby uniknąć nadmiernej utraty RPE, należy stymulować odwarstwienie siatkówki za pomocą strzykawki lub pipety transferowej wypełnionej pożywką buforową do płukania, aby delikatnie oderwać krawędzie siatkówki od muszli ocznej. Inkubacja hialuronidazy może również ułatwić oderwanie16. W przypadku, gdy RPE nie odłączają się prawidłowo od błony i naczyniówki Brucha, należy wydłużyć czas inkubacji z trypsyną w kąpieli wodnej. Dodatkowo należy zamrozić porcje świeżej trypsyny w temperaturze -20 °C i rozmrozić bezpośrednio przed użyciem, aby utrzymać optymalną aktywność enzymatyczną. Niepowodzenie RPE w przyczepieniu się do płytki studzienkowej po izolacji może wystąpić, jeśli komórki zostaną wysiane przy zbyt niskiej gęstości lub jeśli RPE zostały uszkodzone podczas procesu izolacji. Ponadto nasz protokół nie wymaga powlekania białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do hodowli. Wykazano jednak, że białka ECM, takie jak fibronektyna, kolagen IV, laminina lub kolagen I, zwiększają przyczepienie komórek i powinny być brane pod uwagę, jeśli przestrzeganie zaleceń jest słabe11.

Aby zwiększyć wydajność monowarstw hodowanych w RPE, zbierz co najmniej 2-3 oczy myszy w tym samym wieku o tym samym tle genetycznym; Komórki mogą z czasem stracić swój sześciokątny kształt i pigment, jeśli nie zostaną zasiane w wystarczająco dużej gęstości. W przypadku myszy w wieku powyżej 8 tygodni 2 oczy na 24-dołkową płytkę powinny wystarczyć dla optymalnego zbiegu. Jeśli myszy są w wieku poniżej 8 tygodni, 3-4 oczy spowodują lepsze przyleganie i zbieżność. Z biegiem czasu komórki mogą być podatne na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) z utratą pigmentacji i uzyskaniem wydłużonego kształtu. Dodanie inhibitorów kinazy Rho i TGFβR-1 / ALK5, takich jak odpowiednio Y27632 i Repsox, może zapobiec EMT hodowanych komórek RPE12. Podczas gdy protokół izolacji jest krótki i wymaga tylko 1 godziny na izolację 2-4 oczu, hodowla pierwotna może potrzebować do 7-10 dni, aby osiągnąć pełne zlanie. Ponadto pasażowanie RPE jest ograniczone, ze zwiększonym ryzykiem EMT przy każdym kolejnym przejściu.

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki są komórkami krytycznymi dla utrzymania homeostazy oka. RPE działają jak fagocyty, pomagając w utrzymaniu fotoreceptorów, zapobiegając uszkodzeniom warstw nerwowych przez światło i działają jako szczelna bariera nabłonkowa regulująca transport17. Choroby bezpośrednio wpływające na RPE, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa, mogą zaostrzać stan zapalny, zwiększać apoptozę i zakłócać połączenia komórkowe, prowadząc do zwiększonego prawdopodobieństwa zwyrodnienia siatkówki i ślepoty17. Uprawa pierwotnego RPE ułatwia badanie patogenezy chorób oczu wpływających na RPE. Podsumowując, nasz protokół skraca czas trwania izolacji i upraszcza niezbędne techniki i odczynniki przy jednoczesnym zachowaniu hodowli komórek o wysokiej czystości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ujawnia się żadnych istotnych informacji finansowych ani niefinansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) oraz P30 EY011373. Organizacja finansująca nie odgrywała żadnej roli w projektowaniu ani prowadzeniu tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,009 RD Ostrza jednoostrzowePersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVz 4,5 g/l glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu
Surowica bydlęcapłodu Corning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Zbilansowany roztwór soli HankaGibco14175095bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej
Roztwór buforowy HEPES (1M)Gibco15630106
MEM Aminokwasy endogenne, 100xGibco11140050
Nóż Micro-UnitomeBVI Beaver377546
Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100xCorning30-002-CI
Mikropłytki polistyrenoweFalcon08-772-124-dołkowa lub 48-dołkowa
regularna płodowa surowica bydlęcaCorning35-010-CV
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200056z czerwienią fenolową
Nożyczki VannasFine Science Tools10091-12

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
  3. Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
  4. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  5. Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
  6. Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
  7. Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
  8. Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
  9. Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
  10. Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
  11. Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
  12. Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
  13. Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
  14. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
  15. Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
  16. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  17. Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nab onek pigmentowy siatk wkiizolacja RPERPE doros ej myszyhodowla RPEchoroby siatk wkimetoda trypsynizacjidysocjacja kom rekpierwotne kom rki RPEintegralno po cze cis ychtechnika enukleacji

Powiązane artykuły