Artykuł metodologiczny

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Streszczenie

Identyfikacja i charakterystyka limfocytów T specyficznych dla antygenu podczas zdrowia i choroby pozostaje kluczem do lepszego zrozumienia patofizjologii immunologicznej. Wyzwania techniczne związane ze śledzeniem populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w repertuarze endogennych limfocytów T zostały znacznie zaawansowane dzięki opracowaniu odczynników tetrameru peptydowego: MHC. Te znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne multimery cząsteczek MHC klasy I lub klasy II skompleksowane do epitopów peptydów antygenowych wiążą się bezpośrednio z komórkami T o odpowiedniej swoistości receptora limfocytów T (TCR) i dlatego mogą identyfikować specyficzne dla antygenu populacje komórek T w ich stanie natywnym bez konieczności odpowiedzi funkcjonalnej indukowanej przez ex vivo stymulacja. W przypadku niezwykle rzadkich populacji limfocyty T związane z tetramerami mogą być wzbogacane magnetycznie w celu zwiększenia czułości i niezawodności wykrywania.

W miarę pogłębiania się badań nad odpornością limfocytów T rezydujących w tkankach, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania limfocytów T specyficznych dla antygenu, które przemieszczają się do tkanek nielimfatycznych i w nich przebywają. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy zestaw instrukcji dotyczących izolacji i charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu obecnych w płucach myszy. Obejmuje to izolację limfocytów T z trawionej tkanki płucnej, a następnie ogólny etap wzbogacania magnetycznego limfocytów T i barwienie tetramerów w celu analizy i sortowania cytometrii przepływowej. Kroki przedstawione w tym protokole wykorzystują powszechne techniki i łatwo dostępne odczynniki, dzięki czemu są dostępne dla prawie każdego badacza zajmującego się immunologią mysich komórek T i są wysoce elastyczne do różnych dalszych analiz dowolnej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości znajdujących się w płucach.

Wprowadzenie

Istotą adaptacyjnego układu odpornościowego jest zdolność limfocytu T do rozpoznawania specyficznego antygenu i reagowania na niego. To, kiedy i gdzie limfocyt T reaguje na swój cognatywny antygen, determinuje równowagę między infekcją a autoimmunizacją, homeostazą a nowotworem, zdrowiem a chorobą1. Z tego wynika, że badanie limfocytów T w konkretnym kontekście odporności powinno koncentrować się na komórkach wykazujących specyficzność względem istotnego, badanego antygenu. Do postępów technologicznych, które znacząco zwiększyły możliwość charakteryzacji populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu, należą fluorescencyjnie znakowane rozpuszczalne multimery (zazwyczaj tetramery) cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub klasy II w kompleksie z epitopami peptydów antygenowych, znane jako „tetramery peptyd:MHC”2,3,4,5. Stanowiąc reprezentację naturalnych ligandów receptorów antygenowych limfocytów T (TCR), tetramery peptyd:MHC klasy I i klasy II umożliwiają bezpośrednią identyfikację odpowiednio limfocytów T CD8+ i CD4+ specyficznych dla antygenu w obrębie endogennego repertuaru limfocytów T w układzie odpornościowym, bez konieczności wywoływania odpowiedzi na stymulację antygenową w teście. Tetramery stanowią bardziej eleganckie podejście do badania limfocytów T specyficznych dla antygenu niż modele adoptywnego transferu transgenicznych limfocytów T TCR6 i są coraz częściej wykorzystywane do identyfikacji populacji limfocytów T specyficznych dla antygenów obcych i własnych zarówno w eksperymentalnych modelach mysich, jak i w chorobach ludzi4,5.

Podczas gdy tetramery pozwalają na łatwą identyfikację licznych populacji limfocytów T, które namnożyły się w odpowiedzi na stymulację antygenową, ich zastosowanie w przypadku naiwnych, specyficznych dla autoantygenów lub pamięciowych limfocytów T jest ograniczone ze względu na bardzo niską częstotliwość występowania tych populacji7. Nasza grupa oraz inne zespoły opracowały i spopularyzowały strategie magnetycznego wzbogacania oparte na tetramerach, które zwiększają czułość detekcji, umożliwiając badania tych populacji komórek w tkankach limfatycznych myszy8,9,10,11.

Odkrycie limfocytów T rezydujących w tkankach położyło większy nacisk na opracowanie nowych metod badania limfocytów T w przestrzeniach nielimfatycznych. Podobnie jak w przypadku wielu innych powierzchni błon śluzowych, limfocyty T w płucach stykają się z szeregiem antygenów własnych i obcych pochodzących z nabłonka gospodarza, drobnoustrojów komensalnych i zakaźnych oraz czynników środowiskowych, w tym alergenów. Analiza transkrypcyjna limfocytów T pobranych z tkanek nielimfatycznych (NLT) wykazuje fenotyp przypominający komórki pamięci, który cechuje się unikalnym, tkankowo specyficznym losem i funkcją, często ukierunkowanymi na migrację i homeostazę tkankową12. Co więcej, limfocyty T pamięci rezydujące w tkankach (Trms) wykazują tendencję do większej restrykcji klonalnej niż komórki krążące w obrazie krwi13. Określenie, w jaki sposób i dlaczego antygeny napędzają rezydencję limfocytów T w NLT, jest kluczowe dla zrozumienia, jak układ odpornościowy chroni przed infekcjami, utrzymuje homeostazę tkankową, a niekiedy przekształca się w autoimmunizację. Wydaje się jednak, że w przypadku limfocytów T rezydujących w płucach występuje większa atrycja w porównaniu z innymi NLT14. W związku z tym możliwość identyfikacji i charakterystyki endogennych limfocytów T płuc o danej swoistości antygenowej jest ograniczona przez ich naturalną rzadkość.

Dzięki połączeniu technik wzbogacania komórek z użyciem kulek magnetycznych oraz barwienia tetramerami peptyd:MHC, udało nam się wykryć ekspandowane, lecz rzadkie limfocyty T specyficzne dla autoantygenów w płucach myszy.15,16W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis protokołu, który zoptymalizowaliśmy w celu niezawodnej izolacji i charakterystyki każdej rzadkiej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu obecnych w płucach myszy (Rycina 1). Niniejszy protokół obejmuje in vivo etap barwienia przeciwciałami w celu odróżnienia limfocytów T rezydentnych w tkankach od limfocytów T naczyniowych17 następnie przedstawiono dwie różne metody przetwarzania tkanki płucnej, dostosowane do dostępności zasobów. Kolejne etapy obejmują ogólną magnetyczną wzbogacenie populacji limfocytów T, barwienie tetramerami oraz analizę metodą cytometrii przepływowej. Żywotność komórek oraz efektywność barwienia tetramerami zostały w niniejszym protokole dodatkowo zwiększone poprzez dodatek aminoguanidyny, która blokuje indukowaną przez syntazę tlenku azotu (iNOS) apoptozę wywołaną aktywacją limfocytów T.18 oraz dasatynib, który ogranicza zmniejszenie ekspresji TCR19Kroki opisane w niniejszym protokole wykorzystują powszechne techniki i łatwo dostępne odczynniki, co czyni go dostępnym dla niemal każdego badacza zajmującego się immunologią limfocytów T myszy oraz sprawia, że jest on wysoce adaptowalny do różnych analiz następczych. Chociaż jest mało prawdopodobne, aby w płucach znajdowały się naiwne limfocyty T, uważamy, że niniejszy protokół będzie szczególnie pomocny w badaniu limfocytów T specyficznych dla autoantygenów oraz limfocytów Trm w płucach.

Izolacja komórek płuc myszych: schemat, ustawienie wirówki, zawiesina jednokomórkowa, analiza cytometrii przepływowej.
Rycina 1: Przegląd przebiegu protokołu. Płuca są pobierane od myszy i dysocjowane do postaci pojedynczych komórek. Następnie próbki są wzbogacane w limfocyty T przed barwieniem tetramerami peptyd:MHC oraz przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie do analizy cytometrycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Procedury opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone i opracowane zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Massachusetts General Hospital, program zarządzania zwierzętami akredytowany przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Eksperymenty przeprowadzono na samcach i samicach myszy w wieku 8-12 tygodni o tle genetycznym C57BL/6, hodowanych i utrzymywanych w ośrodku dla zwierząt MGH w warunkach wolnych od określonych patogenów.

1. Przygotowanie roztworów stokowych

  1. Przygotować bufor HEPES, rozpuszczając 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 150 mM NaCl oraz 1 mM MgCl2, a następnie dostosować pH do 7,4.
  2. Przygotować 10-krotny roztwór zapasu Liberase, rozpuszczając 700 µg/mL Liberase Thermolysin Medium (TM) (patrz Tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z Ca++ i Mg++ (patrz Tabela materiałów).
  3. Przygotować 10-krotny roztwór zapasu aminoguanidyny, rozpuszczając 100 mM półsiarczanu aminoguanidyny (patrz Tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z Ca++ i Mg++ (patrz Tabela materiałów).
  4. Przygotować pełną pożywkę Eagle's Ham's Amino Acids (EHAA), mieszając pożywkę EHAA (patrz Tabela materiałów) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/mL penicyliny/streptomycyny, 50 µg/mL gentamycyny, 2 mM L-glutaminy oraz 55 µM 2-merkaptoetanolu.
    UWAGA: Można również stosować inne powszechnie używane pożywki dla limfocytów T, takie jak RPMI lub DMEM.
  5. Przygotować bufor do sortowania, mieszając 1x PBS z 2% FBS i 0,05% azotku sodu.
  6. Przygotować blokadę Fc, rozcieńczając oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32 (patrz Tabela materiałów) w stosunku 1:100 v/v w buforze do sortowania.
  7. Przygotować roztwór trawienny Liberase TM/DNase, dodając 100 µg/mL Liberase TM i 50 µg/mL DNazy I (patrz Tabela materiałów) do pożywki RPMI 1640 bez L-glutaminy (patrz Tabela materiałów).
  8. Przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny, dodając 10 mg/mL ketaminy (patrz Tabela materiałów) i 1 mg/mL ksylazyny (patrz Tabela materiałów) do soli fizjologicznej (0,9% NaCl) (patrz Tabela materiałów).

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płucnej za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek

  1. Dla każdej myszy przygotuj 4 mL lodowatego buforu HEPES w specjalistycznej probówce do dysocjacji tkanek (patrz Tabela materiałów) i przechowuj go w lodzie.
  2. Zanurz myszy w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 150-200 µL mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Wstrzyknij dożylnie każdej z narkotyzowanych myszy 1-3 µg przeciwciała anty-mysiego CD45 sprzężonego z fluorophorem (patrz Tabela materiałów) rozpuszczonego w 100 µL soli fizjologicznej. Uśmierć mysz 3 min po podaniu przeciwciała poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 500-600 µL mieszaniny ketaminy i ksylazyny.
  3. Wykonaj resekcję płuc i umieść je w odpowiednich probówkach do dysocjacji tkanek schłodzonych w lodzie. Umieść probówki w automatycznym dysocjatorze tkanek (patrz Tabela materiałów) i uruchom pierwszy program (program domyślny) dla tkanki płucnej.
  4. Do każdej probówki zawierającej zdysocjowaną tkankę płucną dodaj 500 µL roztworu stokowego Liberazy oraz 500 µL roztworu stokowego aminogwanidyny. Inkubuj na mieszadle oscylacyjnym przez 30 min w temperaturze 37 °C.
  5. Umieść probówki ponownie w dysocjatorze i uruchom drugi program (program domyślny) dla tkanki płucnej.
  6. Przelej zawiesinę pojedynczych komórek z probówki do dysocjacji tkanek przez sitko komórkowe 100 µm (patrz Tabela materiałów) do probówki stożkowej 50 mL. Przepłucz probówkę do dysocjacji tkanek 5 mL pełnej pożywki EHAA (lub dowolnej równoważnej pożywki dla limfocytów T) i przepuść płuczkę przez sitko do probówki 50 mL.
  7. Usuń sitko i zwiększ objętość zawiesiny komórkowej do 50 mL za pomocą pełnej pożywki EHAA. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessaj nadsącz, pozostawiając około 100 µL nadsączu i osadu komórkowego.
  8. Dodaj około 100 µL roztworu Fc Block, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 µL, i energicznie wymieszaj w wortexie w celu resuspensji osadu.

3. Protokół alternatywny: Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płucnej poprzez dysocjację manualną

  1. Dla każdej myszy przygotować 1 mL kompletnego EHAA w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i przechowywać na lodzie.
  2. Zanurzyć myszy w znieczuleniu poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 150-200 µL mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Wstrzyknąć dożylnie każdej znieczulonej myszy 1-3 µg przeciwciała anty-mysie CD45 sprzężonego z fluorophorem, rozcieńczonego w 100 µL soli fizjologicznej. Eutanazować mysz 3 min po podaniu przeciwciała poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 500-600 µL mieszaniny ketaminy i ksylazyny.
  3. Wyciąć płuca i umieścić je w odpowiednich probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, schłodzonych na lodzie.
  4. Po pobraniu wszystkich płuc przenieść każde z nich do nowej probówki do mikrowirówki bez pożywki komórkowej.
  5. Pokroić płuca na małe fragmenty (kawałki o wielkości ~2-3 mm) za pomocą nożyczek wewnątrz probówki do mikrowirówki.
  6. Dodać 1 mL koktajlu trawiennego Liberase TM/DNase I do każdej probówki.
  7. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Następnie przenieść próbki na lód, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
  8. Przelać próbkę przez sitko komórkowe o oczkach 100 µm umieszczone na górze stożkowej probówki o pojemności 50 mL. Rozetrzeć tkankę o siatkę gumową końcówką tłoka ze sterylnej strzykawki 1 mL.
  9. Przepłukać sitko zimnym buforem do sortowania, zbierając w probówce końcową objętość 7 mL. Wirować zawiesinę komórkową z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając około 100 µL nadsączu i osadu komórkowego.
  10. Dodać 100 µL roztworu Fc Block, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 µL, a następnie intensywnie wymieszać na wortexie w celu resuspensji osadu.

4. Wzbogacanie próbki płuc w limfocyty T za pomocą wzbogacania koralikami magnetycznymi

  1. Dodaj 50 µL mikrokulek anty-mysich CD90.2 (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj w wirówce typu vortex i inkubuj przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: CD90.2 odpowiada allelowi eksprymowanemu przez limfocyty T u myszy C57BL/6. W przypadku użycia innych szczepów myszy należy sprawdzić genotyp allelu.
  2. W międzyczasie umieść kolumnę do paramagnetycznej separacji komórek (patrz Tabela materiałów) na magnesie do separacji komórek z jednym lub czterema gniazdami (patrz Tabela materiałów). Pod każdą kolumną umieść otwartą stożkową probówkę o pojemności 15 mL, aby zebrać prześwit. Przygotuj kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL zimnego buforu do sortowania, pozwalając na odpływ cieczy grawitacyjnie do probówki stożkowej znajdującej się poniżej.
  3. Po 10-minutowej inkubacji komórek z mikrokulkami, dodaj zimny bufor do sortowania do uzyskania objętości 1 mL i przenieś zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 100 µm umieszczone na górze kolumny. Zbierz prześwit z kolumny do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL umieszczonej pod kolumną.
  4. Gdy zawiesina komórkowa całkowicie spłynie grawitacyjnie przez kolumnę, przemyj kolumnę, płucząc pierwotną probówkę dodatkowymi 3 mL zimnego buforu do sortowania i aplikując go na kolumnę przez siatkę, płucząc w ten sposób sitko. Usuń sitko.
  5. Kiedy próbka ponownie całkowicie spłynie do kolumny i z kolumny nie będzie już wypływać ciecz, zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją nad nową probówką stożkową o pojemności 15 mL.
  6. Dodaj do kolumny 5 mL zimnego buforu do sortowania.
  7. Natychmiast eluej komórki związane z kolumną, wciskając tłok kolumny od góry jednym ciągłym ruchem i wymuszając wypływ buforu do sortowania z dołu kolumny do nowej probówki.
  8. Wirowarkuj eluowane próbki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessaj nadsącz, pozostawiając około 100 µL nadsączu i osad komórkowy.
  9. Dodaj 100 µL zimnego buforu do sortowania, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 µL, i energicznie wymieszaj w wirówce typu vortex, aby resuspendować osad.
  10. Opcjonalnie przeanalizuj próbkę prześwitu zawierającą frakcję komórek nie związanych.

5. Barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu tetramerami peptyd:MHC

  1. Do każdej próbki dodać 1 µL 10 µM Dasatinibu (patrz Tabela materiałów), wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Dodać tetramer peptyd:MHC sprzężony z PE lub APC do stężenia końcowego 10 nM (lub do stężenia zoptymalizowanego empirycznie dla danego tetrameru).
  3. Wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w ciemności przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT) (lub w czasie i temperaturze zoptymalizowanych empirycznie).

6. Analiza limfocytów T znakowanych tetramerami metodą cytometrii przepływowej

  1. Podczas barwienia próbki tetramerami peptyd:MHC, przygotować mieszaninę główną (master mix) przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych komórek (Tabela 1).
    UWAGA: Należy unikać fluoroforów, które kolidują z przeciwciałem anty-CD45 podanym dożylnie lub z tetramerami.
  2. Na 15 min przed zakończeniem okresu inkubacji dla barwienia tetramerami, dodać do każdej próbki mieszaninę główną przeciwciał powierzchniowych w rozcieńczeniu 1:100 (lub w empirycznie zoptymalizowanym stężeniu).
  3. Kontynuować inkubację w ciemności w RT przez pozostały czas z całkowitego 1 h okresu inkubacji.
  4. Dodać 50 000 kulek zliczających do cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów) i dodać zimny bufor do sortowania do uzyskania objętości końcowej około 5 mL. Odwirować zbarwioną próbkę przy 400 x g przez 5 min w 4 °C. Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając około 100 µL nadsączu oraz osad z komórek i kulek.
  5. Resuspendować próbkę, dodając kolejne 200 µL buforu do sortowania, a następnie przenieść próbkę do probówki 5 mL do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).
  6. Próbkę analizować na cytometrze przepływowym. Zebrać jak najwięcej komórek, maksymalnie do 2 500 000 zdarzeń całkowitych. Upewnić się, że zebrano co najmniej 20 000 zdarzeń odpowiadających kulkom zliczającym. Utrzymać szybkość akwizycji na poziomie 5 000 zdarzeń na sekundę lub niższym.
  7. Wszystkie dane zapisać jako pliki FCS.

  

FluorochromPrzeciwciało
BUV395CD90.2
Pacific BlueCD45 (dodany wcześniej poprzez wstrzyknięcie dożylne)
Pacific OrangeCD8
Brilliant Violet 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Kanał Dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEtetramer pMHC lub marker fenotypowy
PE-Cy7Marker fenotypowy (np. CD44, PD-1, CD69 itd.)
APCtetramer pMHC lub marker fenotypowy
AlexaFluor 700Marker fenotypowy (np. CD44, PD-1, CD69 itp.)
APC-Cy7Barwienie żywe/martwe

Tabela 1: Matryca barwienia próbek. Typowy panel przeciwciał do cytometrii przepływowej sprzężonych z fluoroforami, wykorzystywany do identyfikacji i charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu.

7. Analiza danych

  1. Przeanalizuj pliki danych FCS przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej.
    1. Ustaw sekwencję kolejnych bram włączających, aby zidentyfikować zdarzenia: 1) podobne do limfocytów, 2) pojedyncze, 3) żywe, 4) naczyniowe, 5) dump-negatywne oraz 6) CD90.2-pozytywne, które są jednocześnie dodatnie dla CD4 lub CD8 (Rycina 2).
    2. Zidentyfikuj tetramer-pozytywne limfocyty T w obrębie tych populacji.
  2. Wyznacz bezwzględną liczbę komórek tetramer-pozytywnych, obliczając stosunek liczby dodanych kuleczek (50 000) do liczby kuleczek zebranych podczas analizy próbki, a następnie mnożąc tę wartość przez całkowitą liczbę zebranych komórek tetramer-pozytywnych.
    Równanie analizy tetramerów, wzór na obliczanie całkowitej liczby komórek tetramer-pozytywnych w badaniu immunologicznym.

Wyniki

Rycina 2 przedstawia reprezentatywną strategię bramkowania wykorzystaną do identyfikacji rzadkich antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ w płucach przy użyciu tetramerów peptyd:MHC klasy II. Ten sam proces można zastosować dla antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ z użyciem tetramerów peptyd:MHC klasy I (dane nie przedstawiono).

Ze względu na wysoką liczbę komórek nielimfoidalnych w płucach, wiarygodne wykrywanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą tetramerów wymaga pewnej formy wstępnego wzbogacenia populacji interesujących limfocytów T w celu poprawy stosunku sygnału do szumu. Rysunek 3 ilustruje skuteczność magnetycznego wzbogacenia całkowitej populacji limfocytów T z tkanki płucnej opartego na przeciwciałach CD90.2, które opisaliśmy w niniejszym protokole. Średnio, dzięki temu procesowi wzbogacania, odzyskujemy ponad 99% wszystkich limfocytów T CD90.2+ z płuc przy czystości przekraczającej 90%. Rysunek 4 ilustruje poprawę wykrywania rzadkich tetramer-dodatnich limfocytów T CD4+ w wyniku tego wzbogacenia w porównaniu do braku wzbogacenia lub strategii bezpośredniego wzbogacania komórek za pomocą tetramerów.

Rysunek 5 przedstawia poprawione znakowanie tetramerami przeciwgenowych limfocytów T leczonych Dasatinibem, szczególnie w rzadkich populacjach.

Schemat strategii bramkowania cytometrii przepływowej identyfikujący limfocyty, limfocyty T, CD4, CD8 oraz tetramery.
Rycina 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. Sekwencyjne bramki inkluzyjne i ekskluzyjne wykorzystane do identyfikacji rzadkich limfocytów T CD4+ specyficznych dla autoantygenu, które gromadzą się w płucach po ostrym uszkodzeniu tkanek. Koraliki zliczające można zidentyfikować bezpośrednio na podstawie ich fluorescencji w kanale FITC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzbogacanie limfocytów T z płuc, cytometria przepływowa, wykres kropkowy, CD90.2 vs. Dump, frakcja niezwiązana vs. związana.
Rycina 3: Magnetyczne wzbogacanie całkowitej populacji limfocytów T w płucach z użyciem przeciwciała CD90.2. Przedstawiono reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej dla frakcji niezwiązanej (lewa) i związanej (prawa) próbki z płuc po wzbogaceniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat cytometrii przepływowej barwienia CD44 względem tetrameru; przedstawia wyniki wzbogacania komórek.
Rycina 4: Porównanie strategii wzbogacania komórek w celu wspomagania detekcji rzadkich limfocytów T swoistych dla antygenu w płucach. Trzy myszy wykazujące ekspresję modelowego autoantygenu w nabłonku płuc zostały zimmunizowane podskórnie epitopem peptydowym autoantygenu zemulgowanym w pełnym adjuwancie Freunda (CFA). Po 7 dniach pobrano płuca myszy, połączono je i podzielono na trzy równe próbki w celu barwienia tetramerem po: braku wzbogacania komórek (lewo), wzbogaceniu komórek z użyciem przeciwciała CD90.2 (środek) lub wzbogaceniu komórek z użyciem tetrameru (prawo). Próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej dla nie więcej niż 1 500 000 zdarzeń całkowitych (pokazano zdarzenia bramkowane jako CD4+). Liczbę zdarzeń dodatnich dla tetrameru zaznaczono na czarno, natomiast obliczoną całkowitą liczbę limfocytów T swoistych dla antygenu w próbkach płuc wskazano na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogramy cytometrii przepływowej; Wpływ dasatynibu na oporność na tetramery w typie dzikim vs. CC10-USA.
Rycina 5: Leczenie dasatynibem zwiększa barwienie tetramerami. Myszy typu dzikiego (lewo) lub myszy wykazujące ekspresję modelowego autoantygenu w nabłonku płuc (prawo) zostały zimmunizowane podskórnie epitopem peptydowym z autoantygenu zemulgowanym w CFA. Śledziony i organy limfatyczne myszy zostały pobrane, połączone i podzielone na dwie równe próbki w celu znakowania tetramerami peptyd:MHC klasy II z wstępnym leczeniem dasatynibem lub bez niego. Histogramy barwienia tetramerami są nałożone na siebie, porównując próbki traktowane (czerwony) i nietraktowane (niebieski) dasatynibem. Wskazano medianę intensywności fluorescencji dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wcześniejsze charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc skorzystały z dużej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu, które rozszerzają się po ostrym zdarzeniu pobudzającym, takim jak immunizacja donosowa lub infekcja 20,21,22. Jednak rzadsze populacje limfocytów T w płucach, takie jak limfocyty T specyficzne dla własnego antygenu lub limfocyty T pamięci rezydujące w tkance, są trudne do wykrycia bez jakiejś formy wzbogacenia próbki dla limfocytów T będących przedmiotem zainteresowania 15,16,23. Osiągnęliśmy ten cel, łącząc opisane wcześniej techniki dysocjacji tkanki płucnej w celu uzyskania wysokiego odsetka żywotnych limfocytów24,25 ze strategią rozróżniania wewnątrznaczyniowych od miąższowych limfocytów T i ogólnym procesem wzbogacania opartym na limfocytach T, po którym następuje barwienie tetramerów17. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy zdolność do identyfikacji i scharakteryzowania rzadkich limfocytów T, które są specyficzne wobec własnych antygenów w płucach, które powstają w odpowiedzi na bezpośrednią immunizację egzogennym peptydem lub pośrednią aktywację z uwalniania antygenu podczas uszkodzenia tkanki15,16. Przy opracowywaniu tego protokołu wzięto pod uwagę kilka kwestii.

Opisaliśmy dwa różne protokoły przetwarzania tkanki płucnej, które zadziałały dobrze. Jeden z nich polega na użyciu zautomatyzowanego narzędzia do dysocjacji tkanek, podczas gdy drugi opiera się na procesie ręcznym. Co ważne, obie metody wykorzystują Liberazę TM, mieszankę kolagenazy I i II, która zawiera również termolizynę metaloprotazy. Wykazano, że ta mieszanka enzymów zwiększa aktywność trawienną w porównaniu z pojedynczym koktajlem kolagenazy i wykazano, że dobrze współpracuje z odzyskiwaniem leukocytów z tkanki płucnej26.

Zautomatyzowany protokół dysocjacji tkanek wymaga dużych kosztów początkowych za maszynę i specjalistyczne rurki do dysocjacji tkanek, ale probówki można myć i ponownie używać wraz z sitkami do komórek, które są również zazwyczaj wielokrotnego użytku. Protokół ręcznej dysocjacji nie wiąże się z początkowymi kosztami specjalistycznego sprzętu, ale jest pracochłonny i wydłuża zbiory, ponieważ każda próbka jest rozdrabniana indywidualnie. Istnieją inne różnice między protokołami dotyczące stosowania aminoguanidyny lub DNazy I w celu ograniczenia śmierci komórek i zlepiania się komórek, ale nie porównaliśmy dokładnie wpływu tych dodatków. Decyzja o zastosowaniu któregokolwiek z tych protokołów powinna zależeć od osobistego doświadczenia w rodzaju przeprowadzanego badania, a także od dostępności automatycznego instrumentu do dysocjacji tkanek, który stanowiłby największy czynnik kosztowy. Rzeczywiście, elementy tych dwóch protokołów mogą być mieszane i dopasowywane, aby zapewnić najlepszą wydajność dla konkretnych potrzeb badania.

Wspomniany powyżej protokół w szczególności wyklucza stosowanie gradientu gęstości do izolowania limfocytów z zawiesiny jednokomórkowej przygotowanej w wyniku dysocjacji tkanek. Odkryliśmy, że etap magnetycznego wzbogacania limfocytów T potrzebny do identyfikacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu eliminuje ten etap. Jednak w przypadkach, gdy częstość występowania limfocytów T specyficznych dla antygenu jest wystarczająco wysoka, aby całkowicie wyeliminować potrzebę etapu wzbogacania limfocytów T, zaleca się gradient gęstości, ponieważ zapewni on znaczne wzbogacenie komórek docelowych poprzez usunięcie dużej liczby komórek nielimfatycznych. Dodatkowo, jeśli preparaty jednokomórkowe płuc są szczególnie duże i/lub niechlujne, przed wzbogacaniem magnetycznym można zastosować etap gradientu gęstości w celu usunięcia nadmiaru resztek komórek, które mogą później zatkać kolumny (kroki 4.4-4.7).

Zdecydowaliśmy się na ogólne wzbogacenie wszystkich limfocytów T w oparciu o marker limfocytów T pan CD90 (CD90.2 dla allelu wyrażonego u myszy C57BL / 6) zamiast bardziej bezpośredniej strategii wzbogacania komórek opartej na tetramerach. Ma to kilka zalet. (1) Wzbogacenie oparte na CD90 powoduje większą liczbę zdarzeń specyficznych dla antygenu wykrytych w cytometrii przepływowej niż próbki wzbogacone niewzbogacone lub oparte na tetramerach (ryc. 4). Przyczynia się to do lepszego oszacowania częstości występowania rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu bez konieczności zbierania nadmiernej liczby zdarzeń ogółem (2 500 000 >), co wydłuża czas pobierania próbek i pogarsza rozdzielczość sygnału do szumu. (2) W przeciwieństwie do wzbogacania opartego na tetramerach, wzbogacanie oparte na CD90 pozwala na ocenę całego przedziału limfocytów T płuc, w tym limfocytów T CD4 + i CD8 + , wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych limfocytów T oraz specyficznych dla antygenu w porównaniu z antygenem niespecyficznym, wszystko w jednej próbce (ryc. 2). (3) Ponieważ etap wzbogacania oparty na CD90 zachodzi przed barwieniem tetrameru, minimalizuje czas przed analizą komórek znakowanych tetramerem na cytometrze przepływowym, ograniczając w ten sposób potencjalną utratę sygnału z oderwania tetrameru.

Proces wzbogacania limfocytów T w tym protokole opiera się na pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych CD90.2, ale podobne wyniki można osiągnąć za pomocą strategii selekcji negatywnej zapewnianych przez zestawy do izolacji limfocytów T CD4, CD8 lub pan. Opisujemy zastosowanie konkretnej marki mikrokulek, kolumn i magnesów, ale inne systemy wzbogacania magnetycznego również powinny działać. Również w tym przypadku decyzje powinny opierać się na wynikach w konkretnym przeprowadzanym badaniu, a także na ogólnych kosztach, które mogą być znaczne. Z naszego doświadczenia z protokołami wzbogacania wynika, że istnieje ogólny kompromis między wydajnością komórek docelowych a czystością, a w przypadku wykrywania bardzo ograniczonej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu wydajność ma pierwszeństwo.

Podczas gdy reprezentatywne wyniki przedstawiają eksperymenty z udziałem limfocytów T CD4 + i tetramerów peptyd: MHC klasy II, protokół ten jest równie skuteczny w przypadku limfocytów T CD8 + i tetramerów peptydowych: MHC klasy I. W takich przypadkach należy wziąć pod uwagę potencjalnie różne warunki wymagane przez barwienie tetramerem klasy I (stężenie, czas, temperatura). Co więcej, nie widzimy żadnych powodów, które wykluczałyby jego stosowanie do badań komórek B specyficznych dla antygenu z odpowiednimi odczynnikami antygenu komórek B znakowanymi fluorochromem27.

Wreszcie, opisany tutaj protokół obejmuje dodanie inhibitora kinazy białkowej Dazatynibu do próbki przed barwieniem tetramerowym. Dazatynib blokuje sygnalizację i internalizację TCR, co poprawia znakowanie tetramerów limfocytów T, jednocześnie potencjalnie zmniejszając śmierć komórek T indukowaną przez tetramery19. Stwierdziliśmy korzyści z leczenia dazatynibem najbardziej widoczne w wykrywaniu rzadszej populacji swoistej dla własnego antygenu. Jest to prawdopodobnie spowodowane faktem, że limfocyty T specyficzne dla własnego antygenu wyrażają niższe powinowactwo TCR ze względu na skutki selekcji negatywnej podczas tolerancji centralnej 28,29,30,31.

Zastosowany tutaj protokół został z powodzeniem połączony z protokołami barwienia wewnątrzkomórkowego w celu analizy ekspresji czynnika transkrypcyjnego i cytokin w rzadkich limfocytach T specyficznych dla antygenu w płucach. Udało nam się również posortować te rzadkie populacje pod kątem przepływowym do dalszych analiz, w tym transkryptomiki pojedynczych komórek i sekwencjonowania TCR. Dalsze stosowanie i rozwijanie tego protokołu powinno przynieść ogromne korzyści badaniom nad odpornością adaptacyjną w patofizjologii płuc.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy L. Kuhnowi za pomoc techniczną w przetwarzaniu tkanek i produkcji tetramerów. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (R01 AI107020 i P01 AI165072 do J.J.M., T32 AI007512 do D.S.S.), Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (JM) oraz Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sitko do komórek 100 mmFisher Scientific22-363-549
10x PBS bez Ca++ lub Mg++Corning46-013-CM
1x PBS bez Ca++ lub Mg++Corning21-031-CV
ActuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Sól hemisiarczanu aminoguanidynySigma-AldrichA7009
CD90.2 mikrogranulki, myszMiltenyi130-121-278
Magnes do separacji komórek (separator MidiMACS)Miltenyi130-042-302Mieści pojedynczą kolumnę LS
Magnes do separacji komórek (separator QuadroMACS)Miltenyi130-090-976Mieści 4 kolumny LS
DazatynibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle" s Szynka" s Aminokwasy mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automatyczny dysocjator tkanek
gentleMACS C ProbówkiMiltenyi130-093-237Automatyczne rurki do dysocjacji tkanek
Zbilansowany roztwór soli Hanka z Ca++ lub Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anty-mysie przeciwciało CD45 (klon: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetyczne kolumny do separacji komórek (kolumny LS)Miltenyi130-042-401W zestawie z tłokiem
Oczyszczony anty mysz Przeciwciało CD16/32 (klon: 93)Biolegend101302
Pożywka RPMI 1640 bez L-glutaminyCorning15-040-CM
Chlorek sodu 0,9% (sól fizjologiczna)CytivaZ1376
KsylazynaPivetalNDC 466066-750-02

Bibliografia

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tetramery MHC z peptydemimmunologia płuc myszylimfocyty T tkankowo rezydentnewzbogacanie magnetycznecytometria przepływowadysocjacja tkanki płucnejlimfocyty T pamięcimarkery powierzchniowe komórekizolacja limfocytów T
Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.