Artykuł metodologiczny

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja i charakterystyka limfocytów T specyficznych dla antygenu podczas zdrowia i choroby pozostaje kluczem do lepszego zrozumienia patofizjologii immunologicznej. Wyzwania techniczne związane ze śledzeniem populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w repertuarze endogennych limfocytów T zostały znacznie zaawansowane dzięki opracowaniu odczynników tetrameru peptydowego: MHC. Te znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne multimery cząsteczek MHC klasy I lub klasy II skompleksowane do epitopów peptydów antygenowych wiążą się bezpośrednio z komórkami T o odpowiedniej swoistości receptora limfocytów T (TCR) i dlatego mogą identyfikować specyficzne dla antygenu populacje komórek T w ich stanie natywnym bez konieczności odpowiedzi funkcjonalnej indukowanej przez ex vivo stymulacja. W przypadku niezwykle rzadkich populacji limfocyty T związane z tetramerami mogą być wzbogacane magnetycznie w celu zwiększenia czułości i niezawodności wykrywania.

W miarę pogłębiania się badań nad odpornością limfocytów T rezydujących w tkankach, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania limfocytów T specyficznych dla antygenu, które przemieszczają się do tkanek nielimfatycznych i w nich przebywają. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy zestaw instrukcji dotyczących izolacji i charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu obecnych w płucach myszy. Obejmuje to izolację limfocytów T z trawionej tkanki płucnej, a następnie ogólny etap wzbogacania magnetycznego limfocytów T i barwienie tetramerów w celu analizy i sortowania cytometrii przepływowej. Kroki przedstawione w tym protokole wykorzystują powszechne techniki i łatwo dostępne odczynniki, dzięki czemu są dostępne dla prawie każdego badacza zajmującego się immunologią mysich komórek T i są wysoce elastyczne do różnych dalszych analiz dowolnej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości znajdujących się w płucach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sercem adaptacyjnego układu odpornościowego jest zdolność limfocytów T do rozpoznawania i reagowania na określony antygen. Kiedy i gdzie limfocyt T reaguje na pokrewny antygen, określa równowagę między infekcją a autoimmunizacją, homeostazą i rakiem, zdrowiem i chorobą1. Wynika z tego, że badanie limfocytów T w określonym kontekście odporności powinno koncentrować się na komórkach ze swoistością dla odpowiedniego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Wśród osiągnięć technologicznych, które znacznie zwiększyły zdolność do charakteryzowania populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu, znajdują się znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne multimery (zwykle tetramery) cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub klasy II skompleksowanych do epitopów peptydów antygenowych, lepiej znanych jako "peptyd:Tetramery MHC"2,3,4,5. Reprezentując naturalne ligandy receptorów antygenu limfocytów T (TCR), tetramery peptydu: MHC klasy I i klasy II zapewniają środki do bezpośredniej identyfikacji specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + i CD4 + odpowiednio w endogennym repertuarze limfocytów T w układzie odpornościowym bez konieczności odpowiedzi na stymulację antygenową w teście. Tetramery reprezentują bardziej eleganckie podejście do badania limfocytów T specyficznych dla antygenu niż transgeniczne modele transferu adoptywnego limfocytów T TCR6 i są coraz częściej używane do identyfikacji obcych i specyficznych dla siebie populacji komórek T zarówno w eksperymentalnych modelach mysich, jak i chorobach ludzkich4,5.

Podczas gdy tetramery mogą łatwo zidentyfikować populacje limfocytów T o wysokiej częstotliwości, które rozrosły się w odpowiedzi na stymulację antygenową, ich użycie dla komórek T naiwnych, specyficznych dla własnego antygenu lub komórek pamięci jest ograniczone przez bardzo niskie częstotliwości tych populacji7. Nasza grupa i inni opracowali i spopularyzowali strategie wzbogacania magnetycznego oparte na tetramerach, które zwiększają czułość wykrywania, aby umożliwić badania tych populacji komórek w tkankach limfatycznych myszy8,9,10,11.

Pojawienie się w tej dziedzinie limfocytów T rezydujących w tkankach położyło większy nacisk na opracowanie nowych sposobów badania limfocytów T w przestrzeni nielimfatycznej. Podobnie jak wiele innych powierzchni błony śluzowej, limfocyty T w płucach napotykają szereg własnych i obcych antygenów pochodzących z nabłonka gospodarza, drobnoustrojów komensalnych i zakaźnych oraz jednostek środowiskowych, w tym alergenów. Analiza transkrypcyjna limfocytów T pobranych z tkanki nielimfatycznej (NLT) wykazuje fenotyp podobny do pamięci, który ma unikalny los i funkcję specyficzną dla tkanki, często skierowaną na transport i homeostazę tkanek12. Co więcej, limfocyty T pamięci rezydującej w tkance (Trm) są zwykle bardziej ograniczone klonalnie niż te w krążeniu13. Ustalenie, w jaki sposób i dlaczego antygeny napędzają pobyt limfocytów T w NLT, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób układ odpornościowy chroni przed infekcją, utrzymuje homeostazę tkanek, a czasami przechodzi w autoimmunizację. Wydaje się jednak, że wśród rezydujących w tkance limfocytów T z płuc występuje większe wyczerpanie w porównaniu z innymi NLT14. W związku z tym zdolność do identyfikacji i scharakteryzowania endogennych limfocytów T płuc o danej specyficzności antygenowej jest ograniczona przez ich nieodłączną rzadkość.

Łącząc techniki wzbogacania komórek za pomocą magnetycznych kulek i barwienia tetramerów peptydowych:MHC, udało nam się wykryć rozszerzone, ale rzadkie limfocyty T specyficzne dla własnego antygenu w płucach myszy15,16. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis protokołu, który zoptymalizowaliśmy, aby niezawodnie wyizolować i scharakteryzować każdą rzadką populację limfocytów T specyficznych dla antygenu obecną w płucach myszy (Rysunek 1). Protokół ten obejmuje etap barwienia przeciwciał in vivo w celu odróżnienia limfocytów T rezydujących w tkance od limfocytów T naczyniowych17, a następnie dwie różne metody przetwarzania tkanki płucnej w celu dostosowania dostępności zasobów. Następnie następuje ogólny etap wzbogacania magnetycznego limfocytów T, barwienie tetramerów i analiza za pomocą cytometrii przepływowej. Żywotność komórek i barwienie tetramerów jest dodatkowo wzmocnione w tym protokole przez dodanie aminoguanidyny, która blokuje indukowalną syntazę tlenku azotu (iNOS) indukowaną aktywacją limfocytów T indukowaną apoptozą18 i Dazatynib, który ogranicza regulację w dół TCR19. Kroki przedstawione w tym protokole wykorzystują powszechne techniki i łatwo dostępne odczynniki, dzięki czemu jest on dostępny dla prawie każdego badacza zajmującego się immunologią mysich limfocytów T i jest wysoce elastyczny do różnych dalszych analiz. Chociaż prawdopodobnie nie znaleziono naiwnych limfocytów T w płucach, uważamy, że ten protokół będzie szczególnie pomocny w badaniu limfocytów T specyficznych dla własnego antygenu i Trm w płucach.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy z protokołem. Płuca są pobierane od myszy i dysocjowane na pojedyncze komórki. Próbki są następnie wzbogacane o limfocyty T przed barwieniem tetramerami peptydowymi: MHC i przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie do analizy cytometrycznej przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury opisane w tym protokole są zatwierdzone i opracowane zgodnie z wytycznymi określonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Massachusetts General Hospital, akredytowany program zarządzania zwierzętami American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Eksperymenty przeprowadzono na 8-12-tygodniowych samcach i samicach myszy na tle genetycznym C57BL/6 wyhodowanym i utrzymywanym w ośrodku dla zwierząt MGH w określonych warunkach wolnych od patogenów.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych

  1. Przygotować bufor HEPES, rozpuszczając 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 150 mM NaCl i 1 mM MgCl2 i dostosować do pH 7,4.
  2. Przygotować 10x roztwór podstawowy Liberazy, rozpuszczając 700 μg/ml pożywki termolizynowej liberazy (TM) (patrz tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanka z Ca++ i Mg++ (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotować 10x roztwór podstawowy aminoguanidyny, rozpuszczając 100 mM soli hemissiarczanu aminoguanidyny (patrz tabela materiałów) w zrównoważonym roztworze soli Hanka z Ca++ i Mg++ (patrz tabela materiałów).
  4. Przygotuj kompletną pożywkę z aminokwasami szynki orliej (EHAA), mieszając pożywkę EHAA (patrz tabela materiałów) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 50 μg/ml gentamycyny, 2 mM L-glutaminy i 55 μM 2-merkaptoetanolu.
    UWAGA: Można również stosować inne popularne pożywki z limfocytów T, takie jak RPMI lub DMEM.
  5. Przygotować bufor sortujący, mieszając 1x PBS z 2% FBS i 0,05% azydkiem sodu.
  6. Przygotować blok Fc, rozcieńczając oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32 (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:100 v/v w buforze sortującym.
  7. Przygotować roztwór do wytrawiania Liberase TM/DNazy, dodając 100 μg/ml Liberazy TM i 50 μg/ml DNazy I (patrz tabela materiałów) w pożywce RPMI 1640 bez L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
  8. Przygotować mieszaninę ketaminy/ksylazyny, dodając 10 mg/ml ketaminy (patrz tabela materiałów) i 1 mg/ml ksylazyny (patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) (patrz tabela materiałów).

2. Generowanie jednokomórkowej zawiesiny z tkanki płucnej za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek

  1. Dla każdej myszy przygotuj 4 ml lodowatego buforu HEPES w specjalistycznej probówce do dysocjacji tkanek (patrz Tabela materiałów) i trzymaj ją na lodzie.
  2. Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 150-200 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Wstrzyknąć dożylnie 1-3 μg sprzężonego z fluoroforem przeciwciała anty-mysiego CD45 (patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w 100 μl soli fizjologicznej do każdej znieczulonej myszy. Poddaj mysz eutanazji 3 minuty po podaniu przeciwciał z dootrzewnowym wstrzyknięciem 500-600 μl mieszaniny ketaminy/ksylazyny.
  3. Wyciąć płuca i umieścić je w odpowiedniej probówce dysocjatora tkanek schłodzonej na lodzie. Umieść probówki na automatycznym dysocjatorze tkanek (patrz Tabela materiałów) i uruchom pierwszy program (program zaprogramowany) dla tkanki płucnej.
  4. Dodać 500 μl roztworu podstawowego liberazy i 500 μl roztworu podstawowego aminoguanidyny do każdej probówki zawierającej zdysocjowaną tkankę płucną. Inkubować na mieszadle nutującym przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Umieść rurki z powrotem na dysocjatorze i uruchom drugi program (program zaprogramowany) dla tkanki płucnej.
  6. Przelać zawiesinę jednokomórkową z probówki do dysocjacji tkanek przez sitko do komórek o pojemności 100 μm (patrz tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać probówkę dysocjatora tkanek 5 ml kompletnego EHAA (lub innego równoważnego podłoża z komórek T) i przepuścić przez sitko do probówki o pojemności 50 ml.
  7. Usunąć sitko i zwiększyć objętość zawiesiny komórek do 50 ml za pomocą pełnego EHAA. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl supernatantu i osadu komórkowego.
  8. Dodać około 100 μl roztworu Fc Block, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 μl i energicznie wirować, aby ponownie zawiesić osad.

3. Alternatywny protokół: Generowanie zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki płucnej poprzez ręczną dysocjację

  1. Dla każdej myszy przygotuj 1 ml kompletnego EHAA w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie.
  2. Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 150-200 μl mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Wstrzyknąć dożylnie 1-3 μg sprzężonego z fluoroforem przeciwciała anty-mysiego CD45 rozcieńczonego w 100 μl normalnej soli fizjologicznej do każdej znieczulonej myszy. Poddaj mysz eutanazji 3 minuty po podaniu przeciwciał z dootrzewnowym wstrzyknięciem 500-600 μl mieszaniny ketaminy/ksylazyny.
  3. Wytnij płuca i umieść je w odpowiedniej probówce o pojemności 1,5 ml schłodzonej na lodzie.
  4. Po pobraniu wszystkich płuc przenieś każde płuco do świeżej probówki do mikrofuge bez żadnych pożywek komórkowych.
  5. Pokrój płuca na małe fragmenty (kawałki ~2-3 mm) za pomocą nożyczek w tubce do mikrofuge.
  6. Do każdej probówki dodać 1 ml koktajlu trawiącego Liberase TM/DNase I.
  7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Następnie umieść próbki z powrotem w lodzie, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
  8. Przelać próbkę przez sitko o wielkości 100 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Rozetrzyj chusteczkę o siatkę gumową końcówką tłoka ze sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml.
  9. Przepłukać sitko zimnym buforem sortującym, zbierając końcową objętość 7 ml do probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl supernatantu i osadu komórkowego.
  10. Dodaj 100 μl roztworu Fc Block, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 μl i energicznie wiruj, aby ponownie zawiesić granulkę.

4. Wzbogacanie próbki płuc w limfocyty T poprzez wzbogacanie kulkami magnetycznymi

  1. Dodać 50 μl mikrogranulek anty-mysich CD90.2 (patrz tabela materiałów). Wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: CD90.2 odpowiada allelowi wyrażonemu przez limfocyty T u myszy C57BL / 6. Sprawdź genotyp alleli, jeśli używane są inne szczepy myszy.
  2. W międzyczasie umieść paramagnetyczną kolumnę separacji komórek (patrz Tabela materiałów) na jedno- lub czteropozycyjnym magnesie do separacji komórek (patrz Tabela materiałów). Umieść otwartą stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod każdą kolumną, aby uchwycić przepływ. Zalać kolumnę 3 ml buforu do sortowania na zimno, umożliwiając grawitacyjne opróżnienie kolumny do stożkowej rurki poniżej.
  3. Po inkubacji komórek z mikrogranulkami przez 10 minut, dodać bufor do sortowania na zimno do objętości 1 ml i przenieść przez sitko do komórek o wielkości 100 μm umieszczone na szczycie kolumny. Zebrać przepływ z kolumny do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 ml umieszczonej pod kolumną.
  4. Gdy zawiesina komórek całkowicie odpłynie przez kolumnę grawitacyjnie, umyj kolumnę, przepłukując oryginalną probówkę dodatkowymi 3 ml buforu do sortowania na zimno i nakładając ją na kolumnę przez siatkę, przepłukując w ten sposób sitko. Wyjmij sitko.
  5. Gdy próbka ponownie całkowicie spłynie do kolumny i nie będzie już wypływać z kolumny, wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na świeżej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  6. Dodać 5 ml buforu do sortowania na zimno do kolumny.
  7. Natychmiast wymyj komórki związane z kolumną, wciskając tłok kolumny do góry jednym ciągłym ruchem i wypychając bufor sortujący z dna kolumny do nowej probówki.
  8. Odwirować eluowane próbki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl supernatantu i osadu komórkowego.
  9. Dodaj 100 μl bufora do sortowania na zimno, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 μl i energicznie wiruj, aby ponownie zawiesić granulki.
  10. W razie potrzeby przeanalizować przepływającą próbkę zawierającą niezwiązaną frakcję komórkową.

5. Barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą tetramerów peptydowych:MHC

  1. Dodać 1 μl 10 μM dazatynibu (patrz tabela materiałów) do każdej próbki, odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać peptyd sprzężony z PE lub APC tetramer MHC do końcowego stężenia 10 nM (lub empirycznie zoptymalizowanego stężenia dla danego tetrameru).
  3. Wirować i inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (lub empirycznie zoptymalizowanym czasie i temperaturze).

6. Analiza limfocytów T znakowanych tetramerem za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Podczas gdy próbka jest barwiona tetramerami peptydowymi: MHC, należy przygotować główną mieszankę przeciwciał w celu wybarwienia markerów powierzchniowych komórek (Tabela 1).
    UWAGA: Unikaj fluoroforów, które kolidują z podawanym dożylnie przeciwciałem CD45 lub tetramerami.
  2. Pozostawiając 15 minut w okresie inkubacji do barwienia tetramerem, do każdej próbki dodać powierzchniową mieszaninę główną przeciwciał w stosunku 1:100 (lub empirycznie zoptymalizowanym stężeniu).
  3. Kontynuować inkubację w ciemności w temperaturze pokojowej przez pozostałą część 1-godzinnego okresu inkubacji.
  4. Dodać 50 000 kulek zliczających cytometrię przepływową (patrz tabela materiałów) i dodać bufor do sortowania na zimno do końcowej objętości około 5 ml. Odwirować wybarwioną próbkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl supernatantu i osad komórka/kulka.
  5. Ponownie zawiesić próbkę z dodatkowymi 200 μl buforu sortującego i przenieść próbkę do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) o pojemności 5 ml.
  6. Przeanalizować próbkę na cytometrze przepływowym. Zbierz jak najwięcej komórek, maksymalnie do 2 500 000 wszystkich zdarzeń. Upewnij się, że zebrano co najmniej 20 000 zdarzeń zliczania ściegów. Utrzymuj szybkość pozyskiwania na poziomie lub niższym niż 5 000 zdarzeń na sekundę.
  7. Zapisz wszystkie dane jako pliki FCS.

Nożnej (
Fluorochromprzeciwciało
Zobacz materiał BUV395CD90.2
Błękit PacyfikuCD45 (dodany wcześniej przez iniekcję dożylną)
Pomarańcza pacyficznaPłyta CD8
Fioletowy brylantowy 785Płyta CD4
Międzynarodowa Federacja PiłkiPłyta CD3
Certyfikat PerCP-Cy5.5Zrzut (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PeTetramer pMHC lub marker fenotypowy
PE-CY7Marker fenotypowy (np. CD44, PD-1, CD69 itp.)
ApcTetramer pMHC lub marker fenotypowy
AlexaFluor 700Marker fenotypowy (np. CD44, PD-1, CD69 itp.)
APC-CY7Żywa/martwa plama

Tabela 1: Matryca barwienia próbki. Typowy panel przeciwciał cytometrii przepływowej sprzężonych z fluoroforem wykorzystywany do identyfikacji i charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu.

7. Analizowanie danych

  1. Przeanalizuj pliki danych FCS za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej.
    1. Ustaw sekwencję kolejnych bramek inkluzji, aby zidentyfikować 1) podobne do limfocytów, 2) pojedyncze, 3) żywe, 4) pozanaczyniowe, 5) ujemne i 6) CD90.2-dodatnie, które są CD4 lub CD8 dodatnie (Figura 2).
    2. Zidentyfikuj tetramerowo-dodatnie limfocyty T w tych populacjach.
  2. Określ bezwzględną liczbę komórek tetramerowo-dodatnich, obliczając stosunek dodanych kulek (50 000) do liczby kulek zebranych podczas pobierania próbki i mnożąc wartość przez całkowitą liczbę zebranych komórek tetramerowo-dodatnich.
    figure-protocol-1

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną strategię bramkowania stosowaną do identyfikacji rzadkich, specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4+ w płucach z tetramerami peptydu:MHC klasy II. Ten sam proces można zastosować do specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + z tetramerami peptyd: MHC klasy I (dane nie pokazane).

Ze względu na dużą liczbę komórek nielimfoidalnych w płucach, niezawodne wykrywanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu przez tetramer wymaga pewnej formy wcześniejszego wzbogacenia interesujących limfocytów T, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Rysunek 3 ilustruje skuteczność magnetycznego wzbogacania wszystkich limfocytów T z tkanki płucnej za pomocą przeciwciał CD90.2, które opisaliśmy w tym protokole. Średnio dzięki temu procesowi wzbogacania odzyskujemy ponad 99% wszystkich limfocytów T CD90.2+ z płuc o czystości większej niż 90%. Rysunek 4 ilustruje lepsze wykrywanie rzadkich tetramerowo-dodatnich limfocytów T CD4+ wynikających z tego wzbogacenia w porównaniu z brakiem wzbogacania lub bezpośrednią strategią wzbogacania komórek opartą na tetramerach.

Rysunek 5 ilustruje ulepszone znakowanie tetramerów limfocytów T specyficznych dla antygenu leczonych dazatynibem, szczególnie w rzadkich populacjach.

figure-results-1
Rysunek 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. Sekwencyjne bramki włączenia i wykluczenia stosowane do identyfikacji rzadkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla własnego antygenu, które gromadzą się w płucach po ostrym uszkodzeniu tkanek. Koraliki można zidentyfikować bezpośrednio na podstawie ich fluorescencji wzdłuż kanału FITC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Magnetyczne wzbogacanie wszystkich limfocytów T w płucach oparte na przeciwciałach CD90.2. Przedstawiono reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej dla frakcji niezwiązanej (po lewej) i związanej (po prawej) próbki płuc po wzbogaceniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Porównanie strategii wzbogacania komórek w celu wykrycia rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach. Trzy myszy wykazujące ekspresję modelowego własnego antygenu w nabłonku płuc uodporniono podskórnie epitopem peptydowym z własnego antygenu zemulgowanego w Complete Freund's Adjuwantt (CFA). Po 7 dniach płuca myszy zostały zebrane, połączone i podzielone na trzy równe próbki w celu barwienia tetramerem bez wzbogacania komórek (po lewej), wzbogacania komórek na podstawie przeciwciała CD90.2 (w środku) lub wzbogacania komórek na bazie tetramerów (po prawej). Próbki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej dla nie więcej niż 1 500 000 całkowitych zdarzeń (pokazano zdarzenia bramkowane CD4 +). Liczba zdarzeń tetramerowo-dodatnich jest zaznaczona na czarno, podczas gdy obliczona całkowita liczba limfocytów T specyficznych dla antygenu w próbkach płuc jest oznaczona kolorem czerwonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Leczenie dazatynibem wzmacnia barwienie tetramerów. Myszy typu dzikiego (po lewej) lub myszy wyrażające modelowy własny antygen w nabłonku płuc (po prawej) zostały uodpornione podskórnie epitopem peptydowym z autoantygenu emulgowanego w CFA. Śledziony i narządy limfatyczne od myszy zostały pobrane, połączone i podzielone na dwie równe próbki w celu znakowania tetramerami peptydowymi: MHC klasy II z lub bez wstępnej obróbki dazatynibem. Histogramy barwienia tetramerami są nakładane na siebie, porównując próbki poddane działaniu (czerwonego) i bez (niebieskiego) dazatynibu. Wskazana jest mediana intensywności fluorescencji każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze charakterystyki limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc skorzystały z dużej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu, które rozszerzają się po ostrym zdarzeniu pobudzającym, takim jak immunizacja donosowa lub infekcja 20,21,22. Jednak rzadsze populacje limfocytów T w płucach, takie jak limfocyty T specyficzne dla własnego antygenu lub limfocyty T pamięci rezydujące w tkance, są trudne do wykrycia bez jakiejś formy wzbogacenia próbki dla limfocytów T będących przedmiotem zainteresowania 15,16,23. Osiągnęliśmy ten cel, łącząc opisane wcześniej techniki dysocjacji tkanki płucnej w celu uzyskania wysokiego odsetka żywotnych limfocytów24,25 ze strategią rozróżniania wewnątrznaczyniowych od miąższowych limfocytów T i ogólnym procesem wzbogacania opartym na limfocytach T, po którym następuje barwienie tetramerów17. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy zdolność do identyfikacji i scharakteryzowania rzadkich limfocytów T, które są specyficzne wobec własnych antygenów w płucach, które powstają w odpowiedzi na bezpośrednią immunizację egzogennym peptydem lub pośrednią aktywację z uwalniania antygenu podczas uszkodzenia tkanki15,16. Przy opracowywaniu tego protokołu wzięto pod uwagę kilka kwestii.

Opisaliśmy dwa różne protokoły przetwarzania tkanki płucnej, które zadziałały dobrze. Jeden z nich polega na użyciu zautomatyzowanego narzędzia do dysocjacji tkanek, podczas gdy drugi opiera się na procesie ręcznym. Co ważne, obie metody wykorzystują Liberazę TM, mieszankę kolagenazy I i II, która zawiera również termolizynę metaloprotazy. Wykazano, że ta mieszanka enzymów zwiększa aktywność trawienną w porównaniu z pojedynczym koktajlem kolagenazy i wykazano, że dobrze współpracuje z odzyskiwaniem leukocytów z tkanki płucnej26.

Zautomatyzowany protokół dysocjacji tkanek wymaga dużych kosztów początkowych za maszynę i specjalistyczne rurki do dysocjacji tkanek, ale probówki można myć i ponownie używać wraz z sitkami do komórek, które są również zazwyczaj wielokrotnego użytku. Protokół ręcznej dysocjacji nie wiąże się z początkowymi kosztami specjalistycznego sprzętu, ale jest pracochłonny i wydłuża zbiory, ponieważ każda próbka jest rozdrabniana indywidualnie. Istnieją inne różnice między protokołami dotyczące stosowania aminoguanidyny lub DNazy I w celu ograniczenia śmierci komórek i zlepiania się komórek, ale nie porównaliśmy dokładnie wpływu tych dodatków. Decyzja o zastosowaniu któregokolwiek z tych protokołów powinna zależeć od osobistego doświadczenia w rodzaju przeprowadzanego badania, a także od dostępności automatycznego instrumentu do dysocjacji tkanek, który stanowiłby największy czynnik kosztowy. Rzeczywiście, elementy tych dwóch protokołów mogą być mieszane i dopasowywane, aby zapewnić najlepszą wydajność dla konkretnych potrzeb badania.

Wspomniany powyżej protokół w szczególności wyklucza stosowanie gradientu gęstości do izolowania limfocytów z zawiesiny jednokomórkowej przygotowanej w wyniku dysocjacji tkanek. Odkryliśmy, że etap magnetycznego wzbogacania limfocytów T potrzebny do identyfikacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu eliminuje ten etap. Jednak w przypadkach, gdy częstość występowania limfocytów T specyficznych dla antygenu jest wystarczająco wysoka, aby całkowicie wyeliminować potrzebę etapu wzbogacania limfocytów T, zaleca się gradient gęstości, ponieważ zapewni on znaczne wzbogacenie komórek docelowych poprzez usunięcie dużej liczby komórek nielimfatycznych. Dodatkowo, jeśli preparaty jednokomórkowe płuc są szczególnie duże i/lub niechlujne, przed wzbogacaniem magnetycznym można zastosować etap gradientu gęstości w celu usunięcia nadmiaru resztek komórek, które mogą później zatkać kolumny (kroki 4.4-4.7).

Zdecydowaliśmy się na ogólne wzbogacenie wszystkich limfocytów T w oparciu o marker limfocytów T pan CD90 (CD90.2 dla allelu wyrażonego u myszy C57BL / 6) zamiast bardziej bezpośredniej strategii wzbogacania komórek opartej na tetramerach. Ma to kilka zalet. (1) Wzbogacenie oparte na CD90 powoduje większą liczbę zdarzeń specyficznych dla antygenu wykrytych w cytometrii przepływowej niż próbki wzbogacone niewzbogacone lub oparte na tetramerach (ryc. 4). Przyczynia się to do lepszego oszacowania częstości występowania rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu bez konieczności zbierania nadmiernej liczby zdarzeń ogółem (2 500 000 >), co wydłuża czas pobierania próbek i pogarsza rozdzielczość sygnału do szumu. (2) W przeciwieństwie do wzbogacania opartego na tetramerach, wzbogacanie oparte na CD90 pozwala na ocenę całego przedziału limfocytów T płuc, w tym limfocytów T CD4 + i CD8 + , wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych limfocytów T oraz specyficznych dla antygenu w porównaniu z antygenem niespecyficznym, wszystko w jednej próbce (ryc. 2). (3) Ponieważ etap wzbogacania oparty na CD90 zachodzi przed barwieniem tetrameru, minimalizuje czas przed analizą komórek znakowanych tetramerem na cytometrze przepływowym, ograniczając w ten sposób potencjalną utratę sygnału z oderwania tetrameru.

Proces wzbogacania limfocytów T w tym protokole opiera się na pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych CD90.2, ale podobne wyniki można osiągnąć za pomocą strategii selekcji negatywnej zapewnianych przez zestawy do izolacji limfocytów T CD4, CD8 lub pan. Opisujemy zastosowanie konkretnej marki mikrokulek, kolumn i magnesów, ale inne systemy wzbogacania magnetycznego również powinny działać. Również w tym przypadku decyzje powinny opierać się na wynikach w konkretnym przeprowadzanym badaniu, a także na ogólnych kosztach, które mogą być znaczne. Z naszego doświadczenia z protokołami wzbogacania wynika, że istnieje ogólny kompromis między wydajnością komórek docelowych a czystością, a w przypadku wykrywania bardzo ograniczonej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu wydajność ma pierwszeństwo.

Podczas gdy reprezentatywne wyniki przedstawiają eksperymenty z udziałem limfocytów T CD4 + i tetramerów peptyd: MHC klasy II, protokół ten jest równie skuteczny w przypadku limfocytów T CD8 + i tetramerów peptydowych: MHC klasy I. W takich przypadkach należy wziąć pod uwagę potencjalnie różne warunki wymagane przez barwienie tetramerem klasy I (stężenie, czas, temperatura). Co więcej, nie widzimy żadnych powodów, które wykluczałyby jego stosowanie do badań komórek B specyficznych dla antygenu z odpowiednimi odczynnikami antygenu komórek B znakowanymi fluorochromem27.

Wreszcie, opisany tutaj protokół obejmuje dodanie inhibitora kinazy białkowej Dazatynibu do próbki przed barwieniem tetramerowym. Dazatynib blokuje sygnalizację i internalizację TCR, co poprawia znakowanie tetramerów limfocytów T, jednocześnie potencjalnie zmniejszając śmierć komórek T indukowaną przez tetramery19. Stwierdziliśmy korzyści z leczenia dazatynibem najbardziej widoczne w wykrywaniu rzadszej populacji swoistej dla własnego antygenu. Jest to prawdopodobnie spowodowane faktem, że limfocyty T specyficzne dla własnego antygenu wyrażają niższe powinowactwo TCR ze względu na skutki selekcji negatywnej podczas tolerancji centralnej 28,29,30,31.

Zastosowany tutaj protokół został z powodzeniem połączony z protokołami barwienia wewnątrzkomórkowego w celu analizy ekspresji czynnika transkrypcyjnego i cytokin w rzadkich limfocytach T specyficznych dla antygenu w płucach. Udało nam się również posortować te rzadkie populacje pod kątem przepływowym do dalszych analiz, w tym transkryptomiki pojedynczych komórek i sekwencjonowania TCR. Dalsze stosowanie i rozwijanie tego protokołu powinno przynieść ogromne korzyści badaniom nad odpornością adaptacyjną w patofizjologii płuc.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy L. Kuhnowi za pomoc techniczną w przetwarzaniu tkanek i produkcji tetramerów. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (R01 AI107020 i P01 AI165072 do J.J.M., T32 AI007512 do D.S.S.), Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (JM) oraz Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sitko do komórek 100 mmFisher Scientific22-363-549
10x PBS bez Ca++ lub Mg++Corning46-013-CM
1x PBS bez Ca++ lub Mg++Corning21-031-CV
ActuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Sól hemisiarczanu aminoguanidynySigma-AldrichA7009
CD90.2 mikrogranulki, myszMiltenyi130-121-278
Magnes do separacji komórek (separator MidiMACS)Miltenyi130-042-302Mieści pojedynczą kolumnę LS
Magnes do separacji komórek (separator QuadroMACS)Miltenyi130-090-976Mieści 4 kolumny LS
DazatynibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle" s Szynka" s Aminokwasy mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automatyczny dysocjator tkanek
gentleMACS C ProbówkiMiltenyi130-093-237Automatyczne rurki do dysocjacji tkanek
Zbilansowany roztwór soli Hanka z Ca++ lub Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anty-mysie przeciwciało CD45 (klon: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetyczne kolumny do separacji komórek (kolumny LS)Miltenyi130-042-401W zestawie z tłokiem
Oczyszczony anty mysz Przeciwciało CD16/32 (klon: 93)Biolegend101302
Pożywka RPMI 1640 bez L-glutaminyCorning15-040-CM
Chlorek sodu 0,9% (sól fizjologiczna)CytivaZ1376
KsylazynaPivetalNDC 466066-750-02

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tetramery MHC z peptydemimmunologia p uc myszylimfocyty T tkankowo rezydentnewzbogacanie magnetycznecytometria przep ywowadysocjacja tkanki p ucnejlimfocyty T pami cimarkery powierzchniowe kom rekizolacja limfocyt w T

Powiązane artykuły