Artykuł metodologiczny

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/66945

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe grasicy (TEC) odgrywają istotną rolę w promowaniu rozwoju i selekcji repertuarowej limfocytów T. Korowe TEC (cTEC) w korze grasiczej indukują wczesny rozwój limfocytów T i pozytywną selekcję tymocytów korowych. W przeciwieństwie do tego, rdzeniaste TEC (mTEC) w rdzeniu grasicy przyciągają dodatnio wybrane tymocyty z kory i ustanawiają samotolerancję w limfocytach T. Różnorodne cząsteczki, w tym DLL4 i beta5t wyrażane w cTEC, a także Aire i CCL21 wyrażane w mTEC, przyczyniają się do funkcji grasicy, wspierając rozwój i selekcję limfocytów T. Analiza cytometryczna przepływowa funkcjonalnie istotnych cząsteczek w cTEC i mTEC jest przydatna do lepszego zrozumienia biologii TEC, mimo że obecne metody przygotowania jednokomórkowych zawiesin TEC mogą odzyskać tylko niewielką część TEC (około 1% dla cTEC i około 10% dla mTEC) z grasicy młodych dorosłych myszy. Ponieważ wiele z tych funkcjonalnie istotnych cząsteczek w TEC jest zlokalizowanych w komórkach, opisujemy nasze protokoły przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich TEC i barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grasica jest nabłonkowym organem mezenchymalnym, który wspomaga rozwój i selekcję repertuarową limfocytów T. W mikrośrodowiskach korowych i rdzeniastych w grasicy komórki nabłonka grasicy (TEC) odgrywają kluczową rolę w kierowaniu rozwojem i selekcją limfocytów T. Powszechnie przyjmuje się, że TEC korowe (cTEC) w korze grasicy, przede wszystkim przyczyniają się do indukcji wczesnego rozwoju limfocytów T i pozytywnej selekcji nowo wytworzonych tymocytów eksprymujących receptor antygenu komórek T (TCR). W przeciwieństwie do tego, rdzeniaste TEC (mTEC) w rdzeniu grasicy są niezbędne do przyciągania pozytywnie wybranych tymocytów z kory i ustanowienia centralnej samotolerancji poprzez eliminację samoreaktywnych limfocytów T i generowanie regulatorowych limfocytów T1,2. Te funkcje TEC we wspieraniu rozwoju i selekcji limfocytów T są pośredniczone przez różne cząsteczki wyrażane w cTEC i mTEC.

Należą do nich ligand 4 podobny do Delta (DLL4), ważny dla specyfikacji linii limfocytów T komórek macierzystych)3,4, beta5t (znany również jako Psmb11, ważny dla pozytywnej selekcji limfocytów T CD8)5,6, oraz Prss16 (znany również jako specyficzna dla grasicy proteaza serynowa lub TSSP, ważny dla pozytywnej selekcji limfocytów T CD4)7,8 wyrażony w cTEC, oraz regulator autoimmunologiczny (Aire, ważny dla rozwiązłej ekspresji własnych genów)9,10, Fez family zinc finger 2 (Fezf2, ważny dla rozwiązłej ekspresji genów niezależnych od Aire'a i generowania komórek kępek grasicy)11,12,13,14oraz ligand chemokinowy motywu C-C 21 (CCL21, ważny dla migracji rdzenia i akumulacji pozytywnie wybranych tymocytów)14,15,16 wyrażony w mTEC. Cytometria przepływowa umożliwia ilościowe wykrywanie tych funkcjonalnie istotnych cząsteczek w TEC, ułatwiając ocenę zarówno rozwoju, jak i funkcji cTEC i mTEC. Ponieważ wiele cząsteczek w TEC ulega ekspresji głównie w komórkach, takich jak cytoplazma (np. składnik proteasomu beta5t) i jądro (np. regulator transkrypcji Aire), korzystna jest ilościowa analiza cząsteczek wewnątrzkomórkowych w cTEC i mTEC przy użyciu cytometrii przepływowej.

TEC są rzadkie u grasicy. Samica myszy w wieku 5 tygodni ma około 1 × 106 cTEC i około 2,5 × 106 mTEC, podczas gdy kora grasicy zawiera około 3 × 108 tymocytów CD4 + CD8 +, a rdzeń grasicy zawiera około 5 × 107 tymocytów CD4+CD8 i CD4-CD8+ i CD4-CD8+ class="xref">17. Dlatego zdecydowana większość (>99%) komórek w grasicy to komórki krwiotwórcze, w tym tymocyty, a nie TEC, u młodych dorosłych myszy. Co więcej, TEC są ściśle związane z sąsiednimi komórkami (np. Tymocytami) i architektonicznymi składnikami zewnątrzkomórkowymi (np. kolagenem) w grasicy, więc uwolnienie TEC do zawiesiny komórkowej wymaga trawienia proteazy grasicy. Konwencjonalne metody trawienia enzymatycznego dają tylko niewielką część TEC; około 1% (1 ×10 4) i 10% (2 × 105) odpowiednio dla cTEC i mTEC z 5-tygodniowej myszy grasicy17,18,19. Niska skuteczność uwalniania TEC z grasicy jest prawdopodobnie spowodowana podatnością TEC na enzymy proteolityczne i naprężenia mechaniczne oraz ścisłym powiązaniem TEC z sąsiednimi komórkami, szczególnie między cTEC a tymocytami CD4+CD8+20. W związku z tym wyniki analizy pojedynczych komórek mysich TEC, w tym analizy cytometrii przepływowej i analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, oparte na obecnych metodach przygotowania komórek za pośrednictwem trawienia enzymatycznego, są reprezentatywne tylko dla niewielkiej części TEC i dlatego są dalekie od kompleksowości. Niemniej jednak, pomimo takich ograniczeń w enzymatycznym pozyskiwaniu TEC, analiza cytometryczna przepływowa mysich TEC w zawiesinie pojedynczej komórki jest nadal przydatna do analizy ilościowej funkcjonalnie istotnych cząsteczek w cTEC i mTEC. W zawiesinie komórkowej TEC zdefiniowano jako komórki dodatnie dla cząsteczki powierzchni nabłonka EpCAM (CD326) i ujemne dla cząsteczki powierzchni hematopoetycznej CD45. W obrębie EpCAM+CD45-TEC poziomy ekspresji na powierzchni komórki cząsteczek Ly51 (znanych również jako BP-1 i CD249) oraz zdolność wiązania aglutyniny Ulex Europaeus I (UEA1) (głównie wiązanie z glikoproteinami i glikolipidami zawierającymi fukozę połączoną z α) zostały wykorzystane do fenotypowego oznaczania cTEC (Ly51wysokiUEA1niski) i mTEC (Ly51niskiUEA1wysoki). Tutaj opisujemy nasze protokoły eksperymentalne dotyczące konwencjonalnego przygotowania jednokomórkowej zawiesiny mysich TEC i barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej, koncentrując się na analizie ilościowej wewnątrzkomórkowych cząsteczek beta5t, CCL21 i Aire w świeżo przygotowanych mysich TEC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Raka (ASP21-431, ASP21-432 i EIB-076-3).

1. Przygotowanie zawiesiny komórek grasicy

UWAGA: Ontogeneza myszy wpływa na efektywność enzymatycznego uwalniania TEC z grasicy. Trzy metody w zależności od wieku myszy są opisane poniżej.

  1. Dla myszy po urodzeniu w wieku powyżej 3 tygodni
    1. Zbierz grasicę (dwa płaty grasicy) z jednej myszy. Umieść grasicę w 5 ml RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm na lodzie.
    2. Usuń krew, tkanki inne niż grasica i tłuszcz za pomocą zakrzywionej pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym. Pokrój grasicę na małe kawałki (o wielkości około 1-2 mm) nożyczkami do preparowania.
    3. Przenieś kawałki grasicy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 1 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    4. Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Inkubować przez kolejne 20 minut, na wypadek, gdyby fragmenty tkanek były nadal widoczne.
    5. Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Inkubować przez kolejne 10 minut, jeśli fragmenty tkanek są nadal widoczne.
    6. Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml. Dodaj 5 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS.
    7. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę 60 μm i do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu FACS (1x HBSS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 0,1% NaN3).
    9. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
  2. Dla nowonarodzonych myszy w wieku od 1 do 2 tygodni
    1. Wykonaj krok 1.1.1.
    2. Usuń krew i tkanki inne niż grasica za pomocą pęsety preparacyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieś grasicę do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl RPMI1640 z 10 mM HEPES i pokrój grasicę na małe kawałki (o wielkości około 1-2 mm) nożyczkami do preparowania.
    3. Pozwól, aby fragmenty grasicy osiadły na dnie probówki, a następnie delikatnie usuń zawiesinę za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.
    4. Przenieś kawałki grasicy do 5 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej zawierającej 2 ml 0,5 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    5. Delikatnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml, a następnie za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml wyposażonej w plastikową końcówkę w celu dalszej homogenizacji.
    6. Dodaj 2 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez siatkę nylonową o grubości 60 μm i do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml RPMI1640 zawierającego 10 mM HEPES.
    7. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu FACS.
    8. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
  3. Dla myszy embrionalnych i nowonarodzonych myszy w wieku do 1 tygodnia życia
    1. Zbierz grasicę (dwa płaty grasicy) z jednej myszy. Umieść grasicę w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm i usuń krew, tkanki inne niż grasica i tłuszcz za pomocą zakrzywionej pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym.
    2. Umieść grasicę w 0,2 ml RPMI1640 zawierającej 10 ml HEPES w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wylać płyn za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.
    3. Dodać 0,5 ml 0,5 mg/ml kolagenazy/dypazy i 1 j./ml roztworu DNazy do RPMI1640 zawierającej 2% FBS. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką.
    4. Dodaj 0,5 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 60 μm i do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Dodać 9 ml RPMI1640 zawierającego 10 mM HEPES.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 1-3 ml buforu FACS.
    6. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
  4. Alternatywna metoda: trawienie liberazą
    1. Wykonaj kroki 1.1.1 i 1.1.2.
    2. Pozwolić, aby fragmenty grasicy osiadły na dnie probówki, a następnie delikatnie usunąć zawiesinę za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl. Przenieś kawałki grasicy do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml 0,5 U/ml liberazy i 1 U/ml DNazy w RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    3. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką. Inkubować przez kolejne 15 minut, na wypadek, gdyby fragmenty tkanek były nadal widoczne.
    4. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml z plastikową końcówką. Dodaj 1 ml 5 mM EDTA do 1x HBSS zawierającego 1% FBS.
    5. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę 60 μm i do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 18 ml RPMI1640 zawierającej 10 mM HEPES.
    6. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 350 × g, 4 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu FACS (1x HBSS zawierający 1% BSA i 0,1% NaN3).
    7. Przechowuj komórki na lodzie i określaj liczbę komórek za pomocą licznika komórek.

2. Barwienie komórek grasicy przeciwciałami

  1. Umieść 16 × 106 komórek w probówce okrągłodennej o pojemności 5 ml z polistyrenu. Odwirować komórki w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  2. Dodać 10 μl stężenia roboczego przeciwciała monoklonalnego receptora anty-Fc (mAb, klon 2,4G2) do buforu FACS, aby zablokować niespecyficzne wiązanie barwiącej IgG z receptorem Fc na powierzchni komórki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  3. Dodaj po 40 μl każdego ze stężeń roboczych mAb anty-CD45 (specyficznych dla komórek krwiotwórczych; np. znakowanych BV421), anty-EpCAM mAb (specyficznych dla komórek nabłonkowych; np. znakowanych PE-Cy7), anty-Ly51 mAb (wykrywających cTEC; np. znakowanych AF647) i aglutyniny Ulex europaeus I (UEA-1) (wykrywającej mTEC; np. znakowanej AF594) w buforze FACS. Równolegle przygotuj probówki na jednokolorowe barwione komórki i niebarwione komórki do ustawienia cytometru przepływowego.
  4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Dobrze mieszać co 10 minut. Dodać 2 ml buforu FACS.
  5. Odwirować komórki o stężeniu 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad.
  6. Dodać 1 μl Ghost Dye Violet 510 (w celu odróżnienia komórek żywotnych od martwych w analizie cytometrycznej przepływowej komórek utrwalonych i przepuszczalnych). Użyj nierozcieńczonego odczynnika Ghost Dye; Dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut; Dobrze mieszaj co 10 minut.
  7. Dodać 2 ml buforu FACS. Odwirować komórki 350 × g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  8. Utrwal komórki, dodając 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) do PBS i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Dodać 3,5 ml PBS do probówki i odwirować komórki o stężeniu 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
  10. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 1 ml wewnątrzkomórkowego buforu do utrwalania/permeabilizacji i inkubację w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  11. Odwirować komórki o masie 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
  12. Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
  13. Dodać po 100 μl każdego z roboczych stężeń przeciwciała anty-beta5t lub przeciwciała anty-CCL21 lub 40 μl roboczych stężeń przeciwciała anty-Aire (np. AF488) w 1x bufor permeabilizacyjny, dobrze wymieszać i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
  15. Powtórz krok 2.14.
  16. Dodać 100 μl stężeń roboczych anty-króliczej IgG (np. znakowanej AF555) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Dodaj 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować komórki w temperaturze 700 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
  18. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i dobrze wymieszać.
  19. Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
  20. Przefiltruj komórki przez siatkę nylonową 60 μm przed analizą cytometryczną przepływową.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza wymaga cytometru przepływowego, który pozwala na wykrycie co najmniej sześciu kanałów fluorescencyjnych (dla CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye i beta5t, CCL21 i/lub Aire), a także parametrów rozpraszania do przodu i z boku. Reprezentatywne profile cytometrii przepływowej komórek grasicy trawionych kolagenazą/dispazą od myszy 0-dniowych i 2-tygodniowych myszy przedstawiono odpowiednio na Rysunek 1 i Rysunek 2. Na obu rysunkach wykres punktowy w panelu A pokazuje intensywność rozpraszania do przodu (FSC) i intensywność fluorescencji Ghost Dye Violet 510 całkowitych sygnałów cząstek stałych. Ponad 90% sygnałów cząstek stałych reprezentuje żywe komórki, co można ocenić na podstawie ujemnego barwienia odczynnikiem Ghost Dye i rozpraszania do przodu odzwierciedlającego rozmiar komórki. Panel B pokazuje sygnały fluorescencji powierzchni komórek żywotnych komórek grasicy dla CD45, cząsteczki wyrażanej przez komórki hematopoetyczne i EpCAM, cząsteczki wyrażanej przez komórki nabłonkowe. Mała, ale charakterystyczna populacja komórek to CD45-EpCAM+, a zatem reprezentująca TEC.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne profile cytometryczne cytometrii przepływowej komórek grasicy trawionych przez kolagenazę/dispazę od 0-dniowych myszy C57BL/6-tła typu dzikiego. (A) Intensywność rozpraszania do przodu i intensywność fluorescencji Ghost Dye Violet 510 całkowitych sygnałów cząstek stałych. Czerwona ramka wskazuje sygnały żywotnych komórek. (B) Sygnały fluorescencyjne żywotnych komórek (czerwona ramka w panelu A) dla CD45 i EpCAM. Czerwone pole oznacza TEC CD45-EpCAM+. (C) Sygnały barwienia powierzchni komórek Ly51 i UEA1 w TEC (czerwona ramka w panelu B) ujawniają dwie główne populacje: komórki Ly51o wysokiej zawartości UEA1 wzbogacone o cTEC i komórki Ly51o niskiej zawartości UEA1 wzbogacone o mTEC. (D-F) Wykrywanie (D) beta5t, (E) CCL21 i (F) Aire w cTEC (górne panele) i mTEC (dolne panele) zgodnie z definicją w panelu C. Szare histogramy pokazują profile kontrolne barwione tylko przeciwciałem drugorzędowym (D,E) i (F) barwione przy użyciu komórek myszy z niedoborem Aire. Skróty: FSC = forward scatter; TEC = komórki nabłonka grasicy; cTEC = TEC korowe; mTECs = rdzeniowe TEC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne profile cytometryczne cytometrii przepływowej komórek grasicy trawionych przez kolagenazę/dispazę od 2-tygodniowych myszy C57BL/6-tła typu dzikiego. (A) Intensywność rozpraszania do przodu i intensywność fluorescencji Ghost Dye Violet 510 całkowitych sygnałów cząstek stałych. Czerwona ramka wskazuje sygnały żywotnych komórek. (B) Sygnały fluorescencyjne żywotnych komórek (czerwona ramka w panelu A) dla CD45 i EpCAM. Czerwone pole oznacza TEC CD45-EpCAM+. (C) Sygnały barwienia powierzchni komórek Ly51 i UEA1 w TEC (czerwona ramka w panelu B) ujawniają dwie główne populacje: komórki Ly51o wysokiej zawartości UEA1 wzbogacone o cTEC i komórki Ly51o niskiej zawartości UEA1 wzbogacone o mTEC. (D-F) Wykrywanie (D) beta5t, (E) CCL21 i (F) Aire w cTEC (górne panele) i mTEC (dolne panele) zgodnie z definicją w panelu C. Szare histogramy pokazują profile kontrolne wybarwione tylko przeciwciałem drugorzędowym (D,E) i wybarwione IgG dopasowanymi izotypem (F) FITC. Skróty: FSC = forward scatter; TEC = komórki nabłonka grasicy; cTEC = TEC korowe; mTEC = rdzeniowe TEC; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sygnały barwienia powierzchni komórek Ly51 i UEA1, jak pokazano w Panelu C, ujawniają dwie główne populacje w TEC; populację stosunkowo wysoką w Ly51 i niską w UEA1 wzbogaconą w cTEC, oraz inną stosunkowo niską w Ly51 i wysoką w UEA1 wzbogaconą o mTECs21,22,23,24,25. W stadiach embrionalnych i noworodkowych, w tym w wieku 0 dni, częstość występowania cTEC jest większa niż w przypadku mTEC. W stadiach postnatalnych częstość występowania mTEC dominuje głównie dlatego, że skuteczność uwalniania cTEC z grasicy staje się niezwykle niska (około 1% cTEC i 10% mTEC można odzyskać do zawiesiny pojedynczej komórki)17.

Utrwalenie i przenikanie komórek pozwala na wykrycie wewnątrzkomórkowych cząsteczek w TEC. Panel D pokazuje ekspresję beta5t wykrytą w większości cTEC, ale nie w mTEC; panel E pokazuje wykrycie CCL21 we frakcji mTEC, ale nie w cTEC, a panel F pokazuje Aire wyrażony w subpopulacji mTEC.

Dodatkowe profile cytometryczne przepływu cząsteczek wewnątrzkomórkowych w mysich TEC można znaleźć w opublikowanych artykułach; dla beta5t6,20, CCL2114,16,26, oraz Aire27,28, a także dla dodatkowych cząsteczek wewnątrzkomórkowych, w tym keratyny22,29 oraz Fezf211,30.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolagenaza, z lub bez Dispase, jest szeroko stosowana do trawienia grasicy myszy w celu przygotowania TEC 4,5,9,18,21. Liberaza, która zawiera mieszankę proteaz, w tym kolagenazę, jest również używana do trawienia grasicy w celu wytworzenia TEC17,22. Stosowanie kolagenazy i liberazy daje zasadniczo równoważne plony i jakość cTEC i mTEC z grasicy myszy, chociaż mogą pojawić się niewielkie różnice w zależności od partii produktu enzymów. Trypsyna jest również wykorzystywana do efektywnego trawienia grasicy21,23, chociaż wykazano, że wiele cząsteczek na powierzchni komórki, w tym EpCAM i CD80 wyrażane przez TEC, jest podatnych na trawienie trypsyny21. Do enzymatycznego trawienia grasicy często dodaje się DNazę w celu zmniejszenia lepkości z powodu uwalniania DNA z uszkodzonych komórek17,21.

Trawienie enzymatyczne grasicy jest niezbędne do uwolnienia TEC z grasicy. Grasica powinna być wystarczająco strawiona, aż fragmenty tkanek staną się niewidoczne, a zawiesina komórkowa stanie się jednorodna. Nie należy jednak pozostawiać trawienia zbyt długo, ponieważ nadmierna obróbka enzymatyczna uszkadza komórki i zmniejsza ich żywotność. W każdym eksperymencie ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na okres inkubacji i siłę pipetowania podczas trawienia grasicy. Ważne jest również, aby mieć świadomość, że obecna technologia trawienia enzymatycznego pozwala na uwolnienie tylko niewielkiej części TEC, jak szczegółowo opisano we Wstępie i jak opisano wcześniej 17,18,19.

Ponieważ TEC są rzadkie w całkowitej zawiesinie komórek grasicy, analiza TEC metodą cytometrii przepływowej przy użyciu całkowitej zawiesiny komórek grasicy wymaga barwienia wielu komórek, zwykle 8 × 106 do 16 × 106 komórek na pomiar.

TEC pochodzące z trawionych enzymatycznie komórek grasicy mogą być wzbogacane za pomocą kulek magnetycznych anty-CD4522 i/lub wirowania w gradiacji gęstości Percoll31. Te procedury wzbogacania pozwalają zaoszczędzić czas, zwłaszcza gdy TEC są następnie oczyszczane za pomocą cytometrycznego sortownika komórek. Należy również zauważyć, że wzbogacenie w anty-CD45 usunęłoby subpopulację TEC, które są ściśle związane z tymocytami20 wykazującymi ekspresję CD45, a odwirowanie Percoll mogłoby usunąć nieoczekiwanie gęstą subpopulację TEC.

Jeśli chodzi o wiązanie TEC, wiadomo, że leczenie PFA obkurcza komórki i zmniejsza intensywność rozpraszania do przodu w analizie cytometrii przepływowej. Delikatne pipetowanie komórek natychmiast po dodaniu 2% PFA, a następnie dodanie PBS może pomóc w zapobieganiu nadmiernemu kurczeniu się komórek.

W przypadku analizy cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę rzadkie występowanie TEC w grasicy, ich wyznaczenie wymaga odrębnego podejścia w porównaniu z tymocytami lub splenocytami. Wstępna klasyfikacja opiera się na wykorzystaniu CD45, hematopoetycznego markera pan-markera wszechobecnego na tymocytach i innych komórkach krwiotwórczych, w tym komórkach dendrytycznych i makrofagach. I odwrotnie, TEC, będąc pochodzenia niehematopoetycznego, nie mają ekspresji CD45. Zamiast tego TEC wyrażają EpCAM na swojej powierzchni, co pozwala na prostą strategię bramkowania CD45-ujemnego i EpCAM-dodatniego w celu rozpoznania TEC. W naszej analizie cytometrii przepływowej zaczynamy od zdefiniowania tej populacji, a następnie zapewniamy odpowiednie skalowanie parametrów rozpraszania do przodu i boku, biorąc pod uwagę znaczną rozbieżność wielkości między TEC a tymocytami oraz biorąc pod uwagę duży rozmiar i wysoką autofluorescencję TEC.

Następnie zwrócono uwagę na ocenę markerów cTEC i mTEC w populacji CD45-ujemnych EPCAM-dodatnich. Ze względu na niewielką liczebność tej populacji, etap ten staje się niezbędny do kompensacji cTEC i mTEC. Badanie całkowicie wybarwionego panelu (np. markera cTEC Ly51 i markera mTEC UEA-1 wraz z CD45 i EpCAM definiującym TEC) dodatkowo zapewnia adekwatność skalowania rozproszenia. Podczas konfiguracji cytometrii przepływowej naszym głównym celem jest rozpoznanie dodatnich i ujemnych populacji dla każdego przeciwciała.

W współbarwieniu Aire, beta5t i CCL21 zidentyfikowano odrębne populacje w podzbiorach TEC. Biorąc pod uwagę selektywną ekspresję Aire'a przez mTEC, skupiamy się na czterokolorowym barwieniu komórek CD45-ujemnych / EPCAM-dodatnich / UEA-1-dodatnich / Ly51-ujemnych. W tym przypadku komórki UEA-1-dodatnie są wykorzystywane do ustanowienia kontroli negatywnej dla Aire, ułatwiając wyraźną identyfikację komórek Aire-dodatnich. Podobne podejście przyjęto w odniesieniu do CCL21, który jest wyrażony w mTEC. I odwrotnie, dla beta5t, wyrażanego wyłącznie przez cTEC, stosuje się porównywalną strategię bramkowania, z naciskiem na komórki Ly51-dodatnie w czterokolorowym barwieniu, w celu ustalenia poziomów tła dla beta5t. Późniejsza analiza próbek wybarwionych anty-beta5t ułatwia identyfikację populacji dodatniej.

Przeciwciało anty-beta5t i przeciwciało anty-CCL21 są przeciwciałami króliczymi, dlatego nie należy mieszać tych przeciwciał bez uprzedniego znakowania fluorescencyjnego. Stężenia robocze przeciwciał powinny być wstępnie określone poprzez przeprowadzenie analizy cytometrycznej przepływowej komórek kontrolnych (np. TEC od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem) wybarwionych seryjnymi rozcieńczeniami przeciwciał.

W analizie cytometrii przepływowej cTEC i mTEC są często definiowane przez ekspresję Ly51 lub CD205 na powierzchni komórki dla cTEC oraz UEA1 i CD80 dla mTEC. Należy jednak pamiętać, że cTEC i mTEC muszą być ostatecznie zdefiniowane przez ich mikroanatomiczną lokalizację w grasicy. W grasicy embrionalnej pojawiające się dowody sugerują, że ekspresja Ly51 i CD205 nie ogranicza się do cTEC, ale rozciąga się na inne populacje TEC, w tym cTEC / mTEC-bipotencjalne progenitory i niedojrzałe mTEC32,33. Ponadto ekspresja Ly51 w cTEC pozostaje niska podczas embriogenezy i okresu okołoporodowego w porównaniu z okresem poporodowym33, jak pokazano również na rycinie 1 i rycinie 2.

Podsumowując, analiza cytometryczna przepływowa enzymatycznie uwolnionej zawiesiny jednokomórkowej TEC oferuje potężną technikę analizy ilościowej TEC i ich subpopulacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, pomimo ograniczonej skuteczności uwalniania TEC. W szczególności analiza cytometryczna przepływowa cząsteczek wewnątrzkomórkowych w zawiesinie TEC w pojedynczych komórkach jest przydatna do badania ekspresji różnych cząsteczek ważnych dla rozwoju i funkcji TEC i ich subpopulacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Izumi Ohigashi za przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program ZIA BC 011806 National Institutes of Health, National Cancer Institute i Center for Cancer Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza/Dypaza Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Zestaw barwiących czynnik transkrypcyjnyeBioscience00-5523-00
Ghost Dye Fioletowy 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 przeciwciało monoklonalne anty-mysie CD45, klon 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 przeciwciało monoklonalne anty-myszy Ly51, klon 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 przeciwciało monoklonalne EpCAM/CD326, klon G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex europaeus aglutynina I (UEA1)Wektor LaboratoriaDL-1067-1
Alexa Fluor 488 przeciwciało monoklonalne przeciw myszom Aire, klon 5H12eBioscience53-5934-82
Przeciwciało monoklonalne królika anty-mysie Psmb11 / beta5t, klon CPTC-PSMB11 (mysz) -1NIH NCICPTC-PSMB11 (mysz) -1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anty-mysie przeciwciało poliklonalne CCL21 / exodus 2Bio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anty-królicze IgG kozie przeciwciało rekombinowane kozy łańcucha ciężkiegoInvitrogenA27039
Anti-Mouse CD32 / CD16 – Oczyszczone (przeciwciało blokowe Fc)Leinco TechnologiesC247
Siatka nylonowa 60 mikronówDostawa komponentówW31436
Sprzęt
ThermomixerEppendorfBlok
Celometr Auto 2000 Licznik żywotności komórekNexcelomŻywotne liczenie
LSRFortessa Analizator komórekBD Nauki biologiczneCytometr przepływowyPięć laserów (355, 408, 488, 595 i 637 nm)
Oprogramowanie FACSDiva wersja 9.0.1BD BiosciencesAnaliza
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesAnaliza
Szybkość rozcieńczenia przeciwciał (stężenie robocze)rozcieńczający
Anti-Mouse CD32/CD16 – Oczyszczone (przeciwciało blokowe Fc)1:40FACS Buffer
BV421 anty-mysie przeciwciało monoklonalne CD451:25FACS Bufor
PE/Cy7 anty-mysie przeciwciało monoklonalne EpCAM/CD3261:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 anty-mysie przeciwciało monoklonalne Ly511:100FACS Bufor
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutynina I (UEA1)1:400Bufor FACS Anty-mysie
przeciwciało poliklonalne CCL21 / exodus 2 królik1: 2001x Bufor
Przeciwciało monoklonalne przeciw myszom Psmb11 / beta5t, klon CPTC-PSMB11 (mysz) -11: 10001x Bufor
Alexa Fluor 555 anty-królicze przeciwciało rekombinowane kozy o ciężkim łańcuchu IgG1:4001x Bufor buforowy
Przeznaczenie
RPMI1640 zawierające 10 mM HEPES Do RPMI1640 do przygotowania
zawierających 2% FBSDo przygotowania
bufor FACS (1x HBSS zawierający 1% BSA  i 0,1% azydek sodu)Do przygotowania komórek i barwienia
1 mg/ml Kolagenaza/Dispaza i 1U/ml roztworu DNazy w RPMI1640 zawierającego 2% FBSDo trawienia
2% PFA w PBSDo utrwalania
Bufor do utrwalania/permeabilizacji (1 część koncentratu do utrwalania/przepuszczalności z 3 częściami rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności)Do utrwalania komórek
1x Bufor permeabilizacyjny (1 część koncentratu 10X z 9 częściami wody destylowanej)Do barwienia przeciwciał międzykomórkowych 
ciepłakomórekcytometryczna przepływowadanych cytometrii przepływowejBufor permeabilizacyjnypermeabilizacyjnypermeabilizacjikomórekkomórekprzeciwciałenzymatycznegokomórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowabarwienie wewn trzkom rkowegrasica myszyizolacja kom rekkorowe TECrdzeniowe TECekspresja Beta5tdetekcja CCL21

Powiązane artykuły