Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66954

⸱

31 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Streszczenie

Angiogeneza odgrywa kluczową rolę zarówno w fizjologicznych, jak i patologicznych procesach w organizmie, w tym w rozroście guza lub neowaskularnej chorobie oczu. Szczegółowe zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw badań przesiewowych i wiarygodne modele przesiewowe są niezbędne do skutecznego zwalczania chorób i opracowywania nowych opcji terapeutycznych. Opracowano kilka testów in vitro do modelowania angiogenezy, wykorzystując możliwości, jakie daje kontrolowane środowisko, aby wyjaśnić czynniki angiogenne na poziomie molekularnym i przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem celów terapeutycznych.

To badanie przedstawia procedury badania angiogenezy in vitro przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Szczegółowo opisujemy test migracji ran drapanych z wykorzystaniem systemu obrazowania żywych komórek mierzącego migrację komórek śródbłonka w ustawieniu 2D oraz test kiełkowania sferoidów oceniający kiełkowanie komórek śródbłonka w warunkach 3D zapewnianych przez matrycę kolagenową. Ponadto nakreślamy strategie przygotowania próbek, aby umożliwić dalsze analizy molekularne, takie jak transkryptomika, szczególnie w warunkach 3D, w tym ekstrakcja RNA, a także immunocytochemia. Ogólnie rzecz biorąc, ramy te oferują naukowcom niezawodny i wszechstronny zestaw narzędzi do prowadzenia badań naukowych w testach angiogenezy in vitro.

Wprowadzenie

Angiogeneza, która odnosi się do tworzenia nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących1, jest kluczowym procesem podczas rozwoju fizjologicznego i stanów patologicznych. Jest niezastąpiony do dostarczania energii do wysoce aktywnych metabolicznie tkanek, takich jak siatkówka2 lub rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy3 oraz podczas gojenia uszkodzonych tkanek4. Z drugiej strony nieprawidłowa angiogeneza jest podstawą wielu chorób. Guzy lite, takie jak rak jelita grubego lub niedrobnokomórkowy rak płuc, ułatwiają ich wzrost i niezbędne dostarczanie energii poprzez promowanie angiogenezy5. Oprócz raka, choroby neowaskularne oczu, takie jak retinopatia cukrzycowa lub zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, które stanowią główną przyczynę ślepoty w krajach rozwiniętych, wynikają z nieprawidłowego wzrostu naczyń krwionośnych6,7. Szczegółowe zrozumienie leżącego u podstaw patomechanizmu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób można wzmocnić fizjologiczną angiogenezę, na przykład w gojeniu się ran, przy jednoczesnym lepszym kontrolowaniu stanów patologicznych, takich jak choroby naczyń krwionośnych oczu.

Na poziomie komórkowym, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych są aktywowane przez różne cząsteczki sygnałowe w angiogenezie, inicjując proliferację i migrację komórek8. Komórki następnie organizują się w hierarchię, z nieproliferującymi komórkami wierzchołkowymi tworzącymi filopodia na krawędzi natarcia rozwijającej się gałęzi naczynia8. Obok szybko proliferujące komórki łodygi podążają za komórkami wierzchołkowymi, przyczyniając się do powstania wyłaniającego się naczynia. Następnie rekrutowane są inne typy komórek, takie jak perycyty lub komórki mięśni gładkich, w celu dalszej stabilizacji powstającego branch9.

Aby zbadać procesy molekularne na poziomie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, opracowano liczne protokoły in vitro, które zostały ostatnio przejrzane10. Testy te zazwyczaj dzielą się na dwie kategorie: bardziej uproszczone, ale skalowalne podejścia 2D i bardziej skomplikowane protokoły 3D. W niedawnym projekcie przeprowadziliśmy kompleksową analizę porównawczą między testem migracji ran drapanych 2D a testem kiełkowania sferoidów 3D11, aby ocenić zakres ich różnic i ich zdolność do modelowania różnych aspektów angiogenezy12.

Chociaż oba oferują zalety niezawodności i łatwości wdrożenia, na poziomie molekularnym, test kiełkowania sferoidów 3D okazał się korzystny w odniesieniu do kluczowych aspektów angiogenezy w porównaniu z danymi in vivo, takimi jak przełączniki metaboliczne lub interakcje komórka-macierz. Ponieważ testy angiogenezy in vitro są wykorzystywane do oceny potencjału angiomodulacyjnego szlaków sygnałowych13 oraz do badań przesiewowych pod kątem środków terapeutycznych, możliwość przeniesienia wyników in vitro do warunków in vivo jest niezbędna. Co więcej, możliwość przeprowadzenia analiz omicznych na poziomie RNA i białka w celu scharakteryzowania zmian molekularnych w odpowiedzi na ukierunkowaną modulację procesów angiogennych w kontrolowanych warunkach pozostaje ważną korzyścią w porównaniu z ustawieniami in vivo14,15.

W tej publikacji prezentujemy kluczowe testy do badania zagadnień związanych z angiogenezą poprzez wykorzystanie testu migracji obrazowania żywych komórek i testu kiełkowania sferoidowego, w tym późniejszych analiz molekularnych, takich jak sekwencjonowanie RNA do analizy transkryptomicznej i immunohistochemii na poziomie białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa HUVEC

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w sterylnych warunkach pracy (sterylny stół roboczy).

  1. Rozszerzanie HUVEC
    1. W obu testach angiogenezy należy użyć połączonych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) lub ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego (HMVEC).
    2. Hoduj komórki, aż osiągną 90% zbieżności, w niepowlekanej kolbie T75 z pożywką do wzrostu komórek śródbłonka (EGM) przed wykonaniem podziału. Wykonuj zmianę podłoża 3 razy w tygodniu.
      UWAGA: Aby przyspieszyć wzrost, podłoże można zmieniać codziennie. Nie używaj HUVEC poza szóstym przejściem. W badaniu uzyskano najbardziej spójne wyniki, przeprowadzając wszystkie eksperymenty z HUVEC tego samego pasażu.
  2. Rozdzielanie HUVEC
    1. Gdy HUVEC osiągną pożądane zbieganie w kolbie T75, przepłucz je raz 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie inkubuj komórki z 0,5% trypsyną przez 2 minuty w inkubatorze.
      UWAGA: Długotrwała ekspozycja na trypsynę może uszkodzić funkcję HUVEC.
    2. Delikatnie odłączyć komórki, stukając w kolbę. Potwierdź pomyślne odłączenie pod mikroskopem kontrastowym z odwróconymi fazami.
    3. Dodać 8 ml EGM, przenieść roztwór do probówki i granulować komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 3 min.
    4. Jeśli konieczne jest zliczanie komórek, ponownie zawiesić komórki w 5 ml EGM i użyć komory Neubauera. W przeciwnym razie dodać 40 ml EGM i rozprowadzić go na 4 świeżych kolbach do hodowli komórek T75.

2. Test migracji ran drapanych

UWAGA: Test migracji ran drapanych wymaga 3 dni na ukończenie (Rysunek 1). Wszystkie poniższe czynności należy wykonać w sterylnych warunkach pracy (sterylny stół roboczy).

  1. Posiewanie i głodzenie komórek (dzień 1)
    1. Używając specjalistycznej 96-dołkowej płytki do obrazowania żywych komórek, wysiewaj 20 000 HUVEC w 100 μl EGM na dołek. Pozostawić komórki na 6 godzin w inkubatorze.
      UWAGA: Zaleca się optymalizację liczby komórek, biorąc pod uwagę różną szybkość wzrostu komórek śródbłonka naczyń krwionośnych między dostawcami i laboratoriami. Celem jest uzyskanie idealnej warstwy monowarstwowej następnego dnia przed rozpoczęciem drapania. Przeludnione studzienki mogą zmieniać zachowanie komórek śródbłonka, np. poprzez hamowanie kontaktu16, podczas gdy niekompletna monowarstwa drastycznie utrudnia analizę.
    2. Zagłodź wszystkie studzienki przez noc za pomocą 100 μl EBM na studzienkę uzupełnioną 2% FBS.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić monowarstwy komórek, zwłaszcza w przypadku korzystania z pipety wielokanałowej.
  2. Przygotowanie roztworów stymulacyjnych (dzień 2)
    1. Rozcieńczyć pożądane substancje i kontrole w podłożu podstawowym wzrostu komórek śródbłonka (EBM) uzupełnionym 2% FBS. Do każdej studzienki użyj 100 μl roztworu.
      UWAGA: EBM uzupełniony 2% FBS służy jako kontrola negatywna, podczas gdy rekombinowany ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w stężeniu 25 ng / ml może być stosowany jako kontrola pozytywna. Stosując płytki 96-dołkowe, zaleca się, aby eksperymenty były projektowane z minimalną liczbą powtórzeń technicznych (4 dołki o identycznych warunkach), chociaż sugeruje się, aby w celu uzyskania optymalnych wyników użyć 8 dołków. Staraj się zminimalizować potencjalne efekty krawędzi lub narożników podczas planowania układu.
  3. Tworzenie zadrapań (dzień 2)
    1. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zweryfikować zlewającą się monowarstwę komórek i żywotność komórek. Umieść 96-dołkową płytkę w 96-dołkowym narzędziu do nawijania i wygeneruj zadrapanie, naciskając dźwignię urządzenia. Ostrożnie zdejmij pokrywę narzędzia do robienia ran przed zwolnieniem dźwigni, aby zapobiec podwójnemu zadrapaniu.
    2. Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie, używając 200 μl EBM na studzienkę, uzupełnionej 2% FBS. Upewnij się pod mikroskopem, że zanieczyszczenia zostały pomyślnie usunięte.
  4. Stymulacja komórek (dzień 2)
    1. Dodać 100 μl przygotowanych roztworów stymulujących lub kontrolnych do studzienki.
  5. Obrazowanie (dzień 2-3)
    1. Rejestruj obrazy raz na godzinę przez okres do 24 godzin, korzystając z automatycznego harmonogramu dostarczonego przez mikroskop do obrazowania żywych komórek.
      UWAGA: Aby zapewnić dobrą jakość obrazu, należy zeskanować każdą studzienkę natychmiast po przeniesieniu jej do inkubatora, w którym znajduje się system obrazowania żywych komórek. 30-minutowy czas aklimatyzacji w inkubatorze pomaga uzyskać lepszą jakość obrazu. Oprogramowanie mikroskopu jest zaprogramowane tak, aby rejestrować jeden obraz na godzinę dla każdego dołka na linii środkowej zdefiniowanej rysy.
  6. W przypadku braku narzędzia do usuwania ran i aparatu do obrazowania żywych komórek należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Użyj końcówki pipety w 24-dołkowej płytce, aby wywołać zadrapanie. Wykonuj zdjęcia za pomocą klasycznego mikroskopu do hodowli komórkowych w określonych odstępach czasu. W tym celu należy użyć zmotoryzowanego mikroskopu wyposażonego w precyzyjne śledzenie x i y. Umożliwia to automatyczne pozycjonowanie, zapewniając spójne przechwytywanie obrazu w predefiniowanych lokalizacjach.
      UWAGA: Gdy konieczne jest obrazowanie ręczne, realną opcją jest obrazowanie tylko T0, a także jednego punktu czasowego "x" godzin po zabiegu. W opisanym protokole z zastosowaniem HUVEC punkt czasowy T12 (12 godzin po stymulacji) był atrakcyjnym punktem czasowym z wyraźnym oddzieleniem kontroli pozytywnej negatywnej od stymulowanej przez VEGF. Zaleca się jednak przeprowadzanie wstępnych eksperymentów w czasie z obrazowaniem co 2 godziny lub 1 godzinę w celu określenia optymalnego punktu czasowego dla określonych warunków eksperymentalnych w każdym laboratorium.
  7. Analiza (dzień 3)
    1. Oprogramowanie mikroskopu do obrazowania żywych komórek może umożliwiać bezpośrednią analizę uzyskanych obrazów. Zdefiniuj maski wyznaczające obszar trawnika komórkowego, początkowe zadrapanie i względną gęstość rany. Określ granice komórek na podstawie różnic kontrastu.
      UWAGA: W eksperymentach przeprowadzonych z HUVEC zastosowano korektę segmentacji 1,6, plik otworów 500 μm2, skorygowany rozmiar 1 piksela, obszar >500 μm i mimośród >0,6. Niezbędna jest dokładna wizualna weryfikacja parametrów wykrywania komórek w stosunku do rzeczywistych obrazów. Dzięki zoptymalizowanym konfiguracjom oprogramowanie automatycznie oblicza względną gęstość urazu (RWD) w czasie i generuje odpowiednie wykresy czasowe z odchyleniem standardowym (SD) powtórzeń technicznych. Dane te można następnie wykorzystać do analizy statystycznej.

3. Ekstrakcja RNA za pomocą komórek hodowanych w 2D

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki aż do kroku 3.3 w sterylnych warunkach pracy (sterylny stół roboczy).

  1. Komórki galwaniczne (dzień 1)
    1. Odłącz HUVEC zgodnie z krokiem 1.2 protokołu hodowli komórkowej HUVEC.
    2. Wysiewaj 50 000 komórek na dołek na 12-dołkowej płytce z 2 ml EGM na dołek.
    3. Zmień pożywkę po 6 godzinach na EBM zawierającą 2% FBS (pożywki głodowe) na głodówkę przez noc.
  2. Leczenie komórek (dzień 2)
    1. Rozcieńczone środki będące przedmiotem zainteresowania w EBM uzupełnione 2% FBS. Zastąp głodujące podłoże przygotowanym rozcieńczeniem i inkubuj komórki przez żądany czas w inkubatorze.
  3. Ekstrakcja RNA (dzień 2-3)
    1. Poddać komórki lizie z 750 μl Trizolu na dołek i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.
    2. Ponownie zawiesić próbki za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, a następnie przechowywać je w określonych probówkach RNA o niskim poziomie wiązania (objętość 1,5 ml). Przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Immunocytochemia z komórkami hodowanymi w 2D

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki aż do kroku 4.4 w sterylnych warunkach pracy (sterylny stół roboczy).

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. Inkubować 100 szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm w 5% wodorotlenku potasu w metanolu w probówce o pojemności 50 ml przez 30 minut, wstrząsając nałożonym roztworem.
      UWAGA: Jest to bardzo ważny krok w deprotonacji powierzchni szkiełek nakrywkowych i poprawie warunków powlekania i hodowli. W tym momencie zdecydowanie zaleca się upewnienie się, że szkiełka nakrywkowe są dobrze rozprowadzone w podłożu i nie wysychają i nie są ze sobą sklejone.
    2. Szkiełka nakrywkowe myć przez 30 minut 4 razy wodą demineralizowaną.
    3. Po umyciu przenieś je do 70% roztworu izopropylu do przechowywania.
  2. Powlekanie szkiełek nakrywkowych
    1. Oprzyj szkiełka nakrywkowe pojedynczo o ściankę kwadratowej szalki Petriego, aby umożliwić odparowanie alkoholu izopropylowego.
    2. Po 5 minutach przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę 24-dołkową (jedno szkiełko nakrywkowe na studzienkę). Do każdego dołka nanieść 1 ml roztworu 10 mg/ml kolagenu I w PBS i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe 4-5 razy przez 5 minut za pomocą PBS.
  3. Hodowla komórek
    1. Odłącz HUVEC zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1.2 protokołu hodowli komórkowej HUVEC.
    2. Wysiej 50 000 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce z 2 ml EGM na dołek.
    3. Po 6 godzinach zmień pożywkę na EBM zawierającą 2% FBS, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do studzienki i zagłodzenie komórek przez noc.
    4. Następnego dnia rozcieńczone środki będące przedmiotem zainteresowania EBM uzupełnione o 2% FBS. Zastąp głodujący roztwór w studzienkach przygotowanym rozcieńczeniem i inkubuj komórki przez żądany czas w inkubatorze.
  4. Utrwalanie i blokowanie
    1. Hoduj komórki przez żądany czas, a następnie myj komórki PBS przez 5 minut.
    2. Utrwal komórki za pomocą 2% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Umyć PBS 3-4 razy przez 5 min.
    4. Próbki inkubować z buforem blokującym zawierającym 5% normalnej surowicy koziej (NGS), 0,1% Triton-X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze RT.
      UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby umyć próbki, aby zagwarantować, że PFA zostanie całkowicie usunięty. Wybierz gatunek surowicy na podstawie pochodzenia przeciwciała drugorzędowego.
  5. Barwienia
    1. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym z przeciwciałem pierwszorzędowym.
    2. Następnego dnia, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, przemyj próbki 3-4 razy PBS przez 5 minut każda.
    3. Następnie inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym i falloidyną-FITC, rozcieńczonymi razem w buforze blokującym.
    4. Umyj dodatkowo 3-4 razy.
    5. Odwróć szkiełka nakrywkowe na szkiełka z małą kroplą medium montażowego zawierającego DAPI, pozostaw do wyschnięcia w ciemności i uszczelnij lakierem do paznokci. Próbki należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.

5. Test kiełkowania sferoidów

UWAGA: Test kiełkowania sferoidów wymaga 3 dni na ukończenie (Rysunek 2). Wykonaj wszystkie poniższe kroki aż do kroku 5.7 w sterylnych warunkach pracy (sterylny stół roboczy).

  1. Generowanie sferoid w wiszących kroplach (dzień 1)
    1. Odłącz HUVEC zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1.2 protokołu hodowli komórkowej HUVEC.
    2. Połącz 200 000 komórek z 8 ml EGM i 2 ml roztworu podstawowego methocel, zapewniając dokładne wymieszanie. Proszę zapoznać się z plikiem uzupełniającym 1 w celu uzyskania instrukcji dotyczących przygotowania roztworu podstawowego methocel.
    3. Dozować 25 μl kropelek roztworu na odwróconą wewnętrzną powierzchnię dużej, kwadratowej szalki Petriego. Delikatnie obróć pokrywkę o 180° i umieść ją na dnie naczynia do hodowli komórkowej tak, aby kropelki zwisały. Umieścić naczynie na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  2. Przygotuj żel kolagenowy (dzień 2)
    1. Dokładnie wymieszaj 2,3 ml kolagenu typu I z ogona szczura z 0,280 ml 10x Medium 199, aż mieszanina uzyska jednolity, równomierny żółty odcień. Utrzymuj tę mieszaninę na lodzie przez cały proces.
  3. Miareczkowanie żelu kolagenowego (dzień 2)
    1. Miareczkować mieszaninę w celu uzyskania fizjologicznego pH, oznaczonego pomarańczowym kolorem, przy użyciu NaOH (2 N).
    2. Dodać 50 μl buforu HEPES do produktu końcowego.
      UWAGA: Aby zapewnić optymalny zakres dynamiki testu, konieczne jest jak najbliższe zbliżenie się do fizjologicznego pH. Różne partie kolagenu mogą wymagać różnych ilości NaOH. Utrzymuj mieszaninę ściśle na lodzie przez cały czas i cały czas jednorodnie wymieszaj.
  4. Zbieranie sferoid (dzień 2)
    1. Przepłukać wiszące krople z pokrywek kultur komórkowych 20 ml PBS.
    2. Odwirowywać roztwór przez 7 minut przy 250 x g. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić sferoidy w 0,1 ml FBS i 0,4 ml EGM, delikatnie stukając w probówkę.
    3. Dodać 2 ml roztworu podstawowego methocel i dokładnie wymieszać. Użyj pipety o minimalnej pojemności 5 ml, aby uniknąć uszkodzenia sferoidów.
  5. Dodawanie sferoid do macierzy kolagenowej 3D (dzień 2)
    1. Do zawieszonych sferoid dodać 2 ml przygotowanej mieszanki kolagenowej i dokładnie wymieszać.
    2. Dozować 0,5 ml powstałej mieszaniny do dołków 24-dołkowej płytki i inkubować w inkubatorze komórkowym przez 30 minut.
  6. Stymulacja sferoid w matrycy kolagenowej 3D (dzień 2)
    1. Przygotować rozcieńczenie pożądanych substancji w EBM. Do każdej studzienki użyj 100 μl roztworu.
      UWAGA: EBM służy jako kontrola ujemna, podczas gdy czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) w stężeniu 25 ng/ml (końcowe stężenie w 500 μl matrycy kolagenowej i 100 μl warstwy EBM) może być stosowany jako kontrola pozytywna.
    2. Inkubuj przez żądany czas.
      UWAGA: W standardowym teście zalecane jest 18-24 godziny, ale czas musi być starannie zoptymalizowany w każdym laboratorium.
  7. Obrazowanie sferoid (dzień 3)
    1. Wykorzystaj odwrócony mikroskop i platformę do obrazowania, aby uchwycić obrazy wszystkich sferoid, które nie stykają się z krawędzią studni, ze sobą nawzajem lub wykazują oznaki uszkodzenia. Utrzymuj spójne ustawienia i poziomy powiększenia we wszystkich warunkach.
  8. Analiza (dzień 3)
    1. Użyj narzędzia pomiarowego w ImageJ Fidżi, aby ustalić długość wszystkich kiełków z każdej sferoidy na każdym obrazie.
      UWAGA: Użyj wtyczki dostarczonej w pliku uzupełniającym 2, która zwiększa wydajność analizy i generuje plik .txt wyjściowy.
    2. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, R lub innego preferowanego oprogramowania i użyj średniej skumulowanej długości wszystkich pędów na sferoidę jako odczytu dla każdego warunku.
      UWAGA: Wyniki z różnych żeli nie mogą być łączone w postaci bezwzględnych długości kiełkowania. Dane z każdej grupy badanej muszą zostać znormalizowane do grupy kontrolnej EBM lub VEGF (względna długość kiełkowania), zanim dane będą mogły zostać połączone.

6. Ekstrakcja RNA za pomocą komórek hodowanych w 3D

  1. Test kiełkowania sferoidów
    1. Przeprowadzić test kiełkowania sferoidów zgodnie z opisem w sekcji 5.
  2. Liza żelu kolagenowego
    1. Myj żele sferoidalne ciepłym PBS przez 5 min.
    2. Pokrój żele sferoidalne na ćwiartki i przenieś wszystkie 4 ćwiartki do probówki o pojemności 50 ml. Użyj skalpela do mechanicznego rozwarstwienia żeli.
    3. Próbki żelu należy potraktować roztworem do lizy (zawierającym 2 mg/ml kolagenazy D w PBS) i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce.
    4. Delikatnie przemyć żele PBS uzupełnionym o 2 mM EDTA, aby zatrzymać reakcję buforu do lizy.
  3. Ekstrakcja RNA
    1. Zawiesić lizowane żele w 750 μl Trizolu i inkubować przez 10 minut, aby zagwarantować wystarczającą ekstrakcję RNA, jak opisano w kroku 3.3.
    2. Kilkakrotnie zawiesić próbki za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przenieść próbki do określonych probówek RNA o niskim poziomie wiązania (objętość 1,5 ml). Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Immunocytochemia sferoid w matrycy kolagenowej 3D

  1. Test kiełkowania sferoidów
    1. Przeprowadzić test kiełkowania sferoidów zgodnie z opisem w sekcji 5.
  2. Utrwalanie i blokowanie
    1. Utrwal żele z 4% PFA w PBS przez 1 h.
      UWAGA: Aby zapewnić dobre utrwalenie komórek w żelu, po spłukaniu PBS żele należy ostrożnie odłączyć po bokach studzienek za pomocą skalpela i pęsety.
    2. Delikatnie umyj żele 3-4 razy PBS, a następnie całkowicie oderwij je od powierzchni studzienek i przenieś do nowych płytek 24-dołkowych.
    3. Inkubować żele przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (zawierającym 5% NGS i 0,1% Triton-X-100 w PBS) na wytrząsarce orbitalnej.
  3. Barwienia
    1. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w buforze blokującym.
      UWAGA: Obracanie żeli podczas tej inkubacji nie poprawiło jakości barwienia.
    2. Następnego dnia umyj żele delikatnie 4-5 razy PBS przez 5 minut każdy.
    3. Inkubować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczone falloidyną-FITC, w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
    4. Wykonaj 4-5 dodatkowych etapów mycia za pomocą PBS.
    5. Przenieś żele na szkiełka mikroskopowe i zamocuj je za pomocą dwóch kropli podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na każdym żelu. Pozostawić próbki do wyschnięcia przed uszczelnieniem lakierem do paznokci i przechowywać je w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. mikroskopia
    1. Zobrazuj wszystkie próbki pod mikroskopem konfokalnym. Użyj obiektywu 20x i skup się na obszarze zainteresowania. Uzyskuj obrazy jako stosy Z, a także obrazy pojedynczej płaszczyzny ogniskowej.
      UWAGA: Pozyskiwanie obrazów stosu Z i płaszczyzny ogniskowej w wielu sekcjach próbki 3D jest niezbędne do uchwycenia pełnej reprezentacji, szczególnie w przypadku grubych próbek 3D.

8. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMVECs)

UWAGA: Wszystkie opisane kroki można również wykonać z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego, np. ludzkimi komórkami mikronaczyniowymi siatkówki (HRMVECs). W takim przypadku pożywkę należy zmienić na specyficzną pożywkę z komórek śródbłonka mikronaczyniowego zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do hodowli, a także do określonych etapów każdego testu. Różnice specyficzne dla HRMVEC w stosunku do protokołów testów przedstawiono poniżej:

  1. Test ran drapanych
    1. Hoduj komórki w 10% pożywce z komórek śródbłonka mikronaczyniowego FBS zamiast EGM.
    2. Zasiej 20 000 komórek / dołek.
    3. Nie głodź komórek przez noc.
    4. Po wykonaniu drapania zmień pożywkę na pożywkę z komórek śródbłonka podstawnego zawierającą 5% FBS zamiast EBM z 2% FBS.
  2. Immunocytochemia HRMVEC hodowanych w 2D
    1. Hoduj komórki w 10% pożywce z komórek śródbłonka mikronaczyniowego zamiast EGM.
    2. Nie głodź komórek przez noc.
    3. Zmień pożywkę tuż przed zabiegiem na EBM + 5% FBS zamiast EBM + 2% FBS.
  3. Test kiełkowania sferoidów
    1. Zasiej komórki w postaci wiszących kropli za pomocą pożywki z komórek śródbłonka mikronaczyniowego zawierającej 10% FBS zamiast EGM.
  4. Immunocytochemia sferoid w matrycy kolagenowej 3D
    1. Zasiej komórki w postaci wiszących kropli za pomocą pożywki z komórek śródbłonka mikronaczyniowego zawierającej 10% FBS zamiast EGM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku testu migracji kluczowe jest dokładne zbadanie obrazów zarejestrowanych w punkcie czasowym t = 0 h, aby upewnić się, że system prawidłowo wykrył obecność w pełni uformowanej monowarstwy komórek (Ryc. 1B). Ponadto należy potwierdzić przejrzystość i prostopadłość krawędzi zadrapania (Ryc. 1B). Obszar wolny od komórek powinien być w dużej mierze oczyszczony z resztek komórkowych. Na koniec testu grupa stymulowana np. 25 ng/mL VEGF jako kontrola pozytywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiliśmy spektrum technik z odczytami funkcjonalnymi i molekularnymi do badania angiogenezy in vitro.

Test migracji stanowi ugruntowaną technikę stosowaną we wszystkich dziedzinach mokrych prac laboratoryjnych. Wybraliśmy dostępne na rynku podejście do obrazowania żywych komórek, aby wykorzystać format 96 dołków odpowiedni do badań przesiewowych i eksperymentów z odpowiedzią na dawkę, standaryzowany i powtarzalny rozmiar rany stworzony przez narzędzie Wo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w tym projekcie.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sophie Krüger i Gabriele Prinz za doskonałe wsparcie techniczne. Dziękujemy Sebastianowi Maierowi za opracowanie wtyczki ImageJ do ilościowego oznaczania kiełków sferoidalnych oraz Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Department of Medicine I, University Hospital Freiburg za korzystanie z systemu IncuCyte. Grafika została stworzona przy użyciu biorender.com. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft [BU3135/3-1 + BU3135/3-2 do F.B], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [-Ottenstein-Program dla naukowców klinicystów i zaawansowanych klinicystów dla F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 do F.B.], Niemieckie Konsorcjum Onkologiczne [stypendium CORTEX dla naukowców klinicystów dla J.R.] i Volker Homann Stiftung [do J.N.+F.B.] oraz "Freunde der Universit". #228; ts-Augenklinik Freiburg e.V." [do P.L.]

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-sprzężony AffiniPure F(ab)' 2-FragmentJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Kolagen typu 1 ogon szczuraCorning354236
Collagenase DRoche 
Podłoże śródbłonkowe PodłożeLonzaCC-3156EBM
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonkaLonzaCC-3162EGM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Serva11290.02EDTA
Płodowa surowica bydlęcaBio& SPRZEDAMS 0615FBS
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, połączoneLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-dołkowe płytki Sartorius4379
Incucyte S3 System analizy żywych komórekSartorius
MethocelSigmam-0512
Pożywka z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego z 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Izotiocyjanian falloidyny-fluoresceiny znakowany (0,5 mg / ml metanolu)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki człowiekaSystemy komórkoweACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant z NucBlueInvitrogen firmy ThermoFisherScientific 2260939
Odczynnikdo lizy QIAzolQIAGEN79306
rekombinowany ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowegoPeproTech100-20VEGF
Kwadratowa szalka PetriegoGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsynaPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoklonalna)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493
11088858001 podstawne

Bibliografia

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
  4. Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
  5. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).
  6. Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
  7. Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
  8. Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).
  9. Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  11. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).
  12. Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).
  13. Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).
  14. Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
  15. Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).
  16. Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
  17. Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
  18. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  19. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337(2017).
  20. Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  21. Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
  22. Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
  23. Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
  24. Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
  25. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
  26. Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
  27. Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Testy angiogenezymigracja komórek śródbłonkaludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowejmacierz kolagenowaobrazowanie żywych komórekimmunocytochemiaekstrakcja RNAczynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych
Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.