Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Streszczenie

Naprawa pęknięć podwójnej nici DNA (DSB) jest kluczowa dla utrzymania stabilności genomu i żywotności komórek. Naprawa DSB (DSBR) w komórkach odbywa się za pośrednictwem kilku mechanizmów: rekombinacji homologicznej (HR), niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzania pojedynczej nici (SSA). Testy komórkowe są niezbędne do pomiaru biegłości i modulacji tych szlaków w odpowiedzi na różne bodźce.

Tutaj prezentujemy zestaw pozachromosomalnych testów reporterowych, z których każdy mierzy rekonstytucję genu reporterowego nanolucyferazy przez jeden z czterech głównych szlaków DSBR w komórkach. Po przejściowej transfekcji do komórek będących przedmiotem zainteresowania, naprawę substratów reporterowych specyficznych dla szlaku można zmierzyć w czasie krótszym niż 24 godziny poprzez wykrycie luminescencji nanolucyferazy (NanoLuc).

Te solidne testy są ilościowe, czułe, miareczkowane i podatne na wysokoprzepustowy format przesiewowy. Właściwości te zapewniają szerokie zastosowanie w badaniach nad naprawą DNA i odkrywaniu leków, uzupełniając obecnie dostępny zestaw narzędzi komórkowych testów DSBR.

Wprowadzenie

Pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) reprezentują szczególnie toksyczną klasę uszkodzeń DNA¹, dzięki czemu komórki wyewoluowały wiele ścieżek naprawy DSB (DSBR) w celu naprawy tych zmian. Cztery główne mechanizmy DSBR to rekombinacja homologiczna (HR), niehomologiczne łączenie końcówek (NHEJ), łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzanie pojedynczej nici (SSA)^2,3. Szlaki DSBR przyczyniają się do utrzymania zdrowego rozwoju i fizjologii tkanek oraz chronią przed chorobami, takimi jak rak. Co więcej, te mechanizmy naprawcze mają potencjał terapeutyczny dla rozwoju modulatorów małocząsteczkowych w onkologii precyzyjnej. Na przykład celowanie w polimerazę DNA θ (Polθ), kluczowy enzym w szlaku naprawy MMEJ, wzbudziło zainteresowanie ze względu na jego syntetyczną śmiertelność z niedoborem HR w raku⁴.

Zrozumienie DSBR ma zatem szerokie implikacje kliniczne i potrzebne są funkcjonalne testy komórkowe zdolne do pomiaru aktywności wszystkich głównych szlaków DSBR⁵. Testy muszą nadawać się zarówno do badań genetycznych, jak i farmakologicznych oraz być możliwe do zastosowania w różnych modelach komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Aby wesprzeć wysiłki związane z odkrywaniem leków małocząsteczkowych, testy muszą być bardzo czułe, miareczkowe, mieć szybki czas realizacji i być skalowalne do formatów o wysokiej przepustowości, odpowiednich do badań przesiewowych związków.

Ogólnie, DSBR był wcześniej mierzony za pomocą systemów testów reporterowych opartych na fluorescencji, stabilnie zintegrowanych z genomem komórki⁶. Jednakże, podczas gdy fizjologiczna rekapitulacja chromosomalnego DSBR jest wyraźną zaletą, takie testy są ograniczone do modelu gospodarza, w którym reporter jest zintegrowany, wykorzystują pracochłonne przygotowanie i analizę próbek za pomocą cytometrii przepływowej i mają ograniczoną przepustowość, czas realizacji, solidność i czułość, wszystkie niezbędne cechy niezbędne do odkrywania leków.

Tutaj opisujemy zestaw testów reporterowych DSBR, które pozwalają na ocenę czterech głównych ścieżek DSBR. Zestaw substratów do testów reporterowych jest opisany w Rysunek 1 i szczegółowo opisany w niedawnej publikacji⁷. Są one pozachromosomalne, co pozwala na ich wprowadzenie do komórek przez prostą transfekcję przejściową i włączenie genu reporterowego nanolucyferazy⁸, który musi zostać odtworzony przez zaangażowanie w określone mechanizmy DSBR, rodzi czułość, solidność i skalowalność. W protokole uwzględniono następujące warianty substratu reporterowego DSBR (Rysunek 1):

Niezależny od resekcji MMEJ: Ten liniowy substrat składa się z regionu dwuniciowego DNA (dsDNA) z nawisami jednoniciowego DNA (ssDNA), które naśladują wycięte końcówki DNA⁹. Cztery mikrohomologie nukleotydowe na końcach regionów ssDNA kodują kodon start dla genu reporterowego. Naprawa tego substratu za pomocą MMEJ przywraca otwartą ramkę odczytu genu reporterowego (ORF).

MMEJ zależne od resekcji: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment zawierający kodon stop, który jest otoczony przez 8 mikrohomologii par zasad (bp). Resekcja końca nukleolitycznego jest wymagana przed naprawą za pośrednictwem MMEJ w celu przywrócenia nienaruszonego genu reporterowego.

Blunt NHEJ: Gen reporterowy jest podzielony na sekcje N- i C-końcowe, z których ta ostatnia jest umieszczona przed promotorem. DSB jest wytwarzany przy użyciu EcoRV i wymaga bezpośredniej ligacji (bez przetwarzania końcowego) przez NHEJ w celu ponownego połączenia obu części genu reporterowego i przywrócenia reporterowego ORF.

Non-blunt NHEJ: DSB znajduje się wewnątrz intronu i będzie miał spójne lub niespoiste końce, w zależności od wyboru enzymu restrykcyjnego. Naprawa tego podłoża przez NHEJ wymaga podwiązania poprzedzonego obróbką końcową.

Długa matryca HR: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment DNA zawierający miejsca restrykcyjne, które zastępują 22 pz oryginalnej sekwencji genu reporterowego. Aby przywrócić tę sekwencję, naprawa przez HR wykorzystuje szablon homologii 2,5 kilozasady (kb) umieszczony poniżej C-końcowego eksonu.

Krótki szablon HR: Miejsce restrykcyjne potrzebne do wygenerowania DSB zastępuje część natywnej sekwencji genu reporterowego i wprowadza kodon stop w ramce. Podobnie jak wersja z długim szablonem, ten substrat HR wymaga dalszego szablonu homologii (360 pz) w celu dokładnej naprawy i przywrócenia reportera ORF.

SSA: Ten substrat zawiera przedwczesny kodon stop znajdujący się w N-końcowym eksonie genu reporterowego. Usunięcie tego kodonu stop i przywrócenie nienaruszonej sekwencji genu reporterowego wymaga naprawy przez SSA, która obejmuje dwukierunkową resekcję dalekiego zasięgu przed wyrównaniem homologii.

Dla generowania DSB, niektóre z substratów reporterowych mogą być trawione za pomocą I-SceI (Rysunek 1). W ten sposób zostanie wygenerowany liniowy substrat z niespójnymi końcami w zależnym od resekcji MMEJ, nietępym NHEJ, długich matrycach HR i reporterach SSA, które mają tandemowe miejsca I-SceI w odwróconej orientacji. W krótkim szablonowym substracie reporterowym HR, trawienie pojedynczego miejsca I-SceI wygeneruje spójne końce. Nietępe NHEJ, zależne od resekcji plazmidy MMEJ, długie matryce HR i SSA mogą być również trawione za pomocą HindIII, co wytworzy komplementarne spójne końce.

Udostępniamy protokoły generowania substratów testowych reporterowych i opisujemy, jak testy mogą być przeprowadzane, dostarczając szczegółów na temat tego, jak można je wykorzystać do ilościowego oznaczania DSBR, w tym miareczkowych odpowiedzi na małe cząsteczki, oceny siły komórkowej, aktywności na miejscu i selektywności szlaku.

Protokół

1. Przygotowanie i kontrola jakości (QC) substratów reporterowych

UWAGA: Plazmidy kodujące substraty reporterowe mogą być rozmnażane w standardowych szczepach Escherichia coli (np. DH5α i pochodne) i odzyskiwane przez izolację plazmidu. Szczegóły dotyczące plazmidu (wielkość i oporność na antybiotyki) są opisane w Tabeli 1 i Rysunek 1.

Rysunek 1: Schematy pozachromosomalnych testów reporterowych DSBR opartych na NanoLuc. Schematyczne przedstawienie substratów reporterowych DSBR, w tym ich lokalizacja w każdym plazmidzie źródłowym, cechy sekwencji głównej i ostateczny układ po naprawie specyficznej dla ścieżki. Niezależny od resekcji rdzeń substratu MMEJ jest wycinany z plazmidu źródłowego przez trawienie za pomocą XhoI/HindIII, po czym kapeczki muszą zostać podwiązane do obu końców w celu wytworzenia substratu dla MMEJ. substrat reporterowy NHEJ jest generowany przez wycięcie z plazmidu źródłowego za pomocą EcoRV. Zależne od resekcji substraty reporterowe MMEJ, nietępe NHEJ, długie matryce HR i SSA są generowane przez linearyzację plazmidów źródłowych przy użyciu I-SceI (który wytwarza niespoiste końce) lub HindIII (który wytwarza spójne końce). Krótki substrat reportera matrycowego HR jest generowany przez linearyzację plazmidu źródłowego za pomocą I-SceI (który wytwarza spójne końce). Naprawa każdego substratu reporterowego przez docelowy szlak DSBR odtwarza nienaruszoną funkcjonalną NanoLuc ORF kodującą nanolucyferazy. Ten rysunek został zaadaptowany z Rajendra et al.⁷. Skróty: DSBR = naprawa zerwania podwójnej nici; NanoLuc = Nanoluciferaza; MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końcówek; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie jednopasmowe; ORF = otwarta ramka do odczytu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie niezależnego od resekcji podłoża reporterowego MMEJ (Rysunek 1 i Rysunek 2A-C)
   1. Przygotowanie czapek ssDNA/dsDNA (Rysunek 2A)
      1. Zawiesić pojedynczo cztery oligonukleotydy wymienione w tabeli 2 w buforze do wyżarzania (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl w wodzie klasy biologii molekularnej) w celu wytworzenia roztworu podstawowego o stężeniu 100 μM.
      2. Wyżarzanie czapek ss/dsDNA
         1. Zmieszać po 50 μl każdego z długich i krótkich oligonukleotydów (100 μM roztwór podstawowy) dla lewej nakrętki z kroku 1.1.1.1 w probówce o pojemności 0,2 ml.
         2. Powtórz dla oligonukleotydów o prawej czapeczce.
         3. Za pomocą termocyklera inkubować każdą mieszaninę oligonukleotydów w temperaturze 99 °C przez 5 minut, a następnie zmniejszyć do 10 °C w temperaturze 1 °C/min.
            UWAGA: Spowoduje to wyprodukowanie wyżarzonej lewej i prawej nasadki.
      3. (QC, opcjonalnie) Weryfikacja wyżarzania oligonukleotydów metodą elektroforezy
         1. Elektroforeza 100 ng każdego produktu z etapu 1.1.1.2 wraz z pojedynczymi oligonukleotydami z etapu 1.1.1.1 i drabinką DNA o niskiej masie cząsteczkowej w 20% żelu akrylamid-tris-boran-EDTA (TBE) pod napięciem 200 V przez 80 min.
         2. Żel należy wybarwić buforem do biegania TBE zawierającym odpowiedni fluorescencyjny barwnik DNA do wizualizacji zarówno ssDNA, jak i dsDNA przez co najmniej 10-15 minut.
         3. Wizualizacja fluorescencji w systemie dokumentacji żelu (Rysunek 2A).
            UWAGA: Kroki od 1.1.1.3.1 do 1.1.1.3.3 służą do sprawdzenia, czy nasadki zostały prawidłowo wyżarzone. Pozorne rozmiary lewej i prawej nasadki powinny wynosić odpowiednio ~120 pz i ~175 pz.
   2. Oczyszczanie rdzenia substratu reporterowego (Rysunek 2B)
      1. Wymieszaj 100 μg plazmidu rdzenia reporterowego z 4 μl HindIII i 4 μl XhoI (4 U/μg plazmidu dla każdego enzymu) i 20 μl 10x buforu. Doprowadzić całkowitą objętość do 200 μl wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny do nocy w celu strawienia plazmidu.
         UWAGA: W przypadku trawienia większych lub mniejszych ilości należy proporcjonalnie skalować reakcję.
      2. Inkubować reakcję trawienia w temperaturze 80 °C przez 20 minut w celu podgrzania dezaktywujących enzymów restrykcyjnych.
      3. Dodać 40 μl fosfatazy alkalicznej (plazmid 2 U/μg) i 27 μl buforu 10x do mieszaniny reakcyjnej z kroku 1.1.2.2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu defosforylacji plazmidu.
         UWAGA: W razie potrzeby skaluj reakcję w górę lub w dół.
      4. Dodać 60 μl 6-krotnie obciążającego barwnika do reakcji z kroku 1.1.2.3. Elektroforeza wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w żelu o sile 1,5 % (w/v) agarozo-tris-octanu-EDTA (TAE) zawierającym fluorescencyjne barwienie dsDNA pod napięciem 120 V przez 2,5 godziny lub do momentu, gdy prążki będą wystarczająco rozdzielcze.
      5. Wizualizacja fluorescencji w systemie dokumentacji żelu (Rysunek 2B).
      6. Fragment rdzenia reporterowego (~1,5 kb) należy usunąć z żelu za pomocą czystego skalpela, uważając, aby nie zanieczyścić szkieletu wektora (~2,5 kb).
      7. Wyodrębnij fragment rdzenia reporterowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      8. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A_260/280) za pomocą spektrofotometrii.
   3. Podwiązanie rdzenia substratu reporterowego za pomocą czapek ssDNA/dsDNA i oczyszczenie końcowego substratu reporterowego (Rysunek 2C)
      1. Wymieszać 30 μg fragmentu rdzenia reporterowego z kroku 1.1.2.7 z 3,85 μl każdej wyżarzonej lewej i prawej nasadki z kroku 1.1.2 (stosunek molowy DNA kapu do rdzenia ok. 6:1), 30 μl 10-krotnego buforu ligazy i 1,5 μl ligazy DNA T4 (20 U/μg DNA). Doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 300 μl za pomocą ddH₂O i inkubować przez noc w temperaturze 16 °C w celu podwiązania czapeczek do fragmentu rdzenia reporterowego.
         UWAGA: Skaluj reakcję w górę lub w dół zgodnie z wymaganiami.
      2. (QC, opcjonalnie) Elektroforeza 200 ng otrzymanego produktu z kroku 1.1.3.1 wraz z rdzeniem substratu reporterowego i drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% (w/v) żelu agaroza-TAE zawierającym fluorescencyjne barwienie dsDNA przy napięciu 120 V przez co najmniej 1,5 godziny. Sprawdzić, czy pasmo odpowiadające ligaciałemu produktowi migruje nieco wolniej niż nieligowany rdzeń substratu reporterowego (Rysunek 2C).
         UWAGA: Ten krok kontroli jakości ma na celu sprawdzenie, czy podwiązanie nasadek do fragmentu rdzenia reporterowego odbyło się prawidłowo.
      3. Oczyścić DNA z reakcji trawienia w kroku 1.3.1. przy użyciu preferowanej metody (np. metody opartej na kulkach lub kolumnach), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
         UWAGA: Etap oczyszczania 1.1.3.3 znacznie zmniejsza obecność nieligowanych nakrętek.
   4. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A_260/280) za pomocą spektrofotometrii.
2. Przygotowanie podłoża reporterowego NHEJ (Rysunek 1 i Rysunek 2D,E)
   1. Zmieszaj 100 μg plazmidu rdzenia reporterowego z 5 μl EcoRV (plazmid 5 U/μg) i 20 μl 10x buforu. Doprowadzić całkowitą objętość do 200 μl z ddH₂O i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny do nocy w celu strawienia plazmidu.
      UWAGA: W przypadku trawienia większych lub mniejszych ilości należy proporcjonalnie skalować reakcję.
   2. Inkubować reakcję trawienia w temperaturze 65 °C przez 20 minut w celu podgrzania dezaktywującego enzymu restrykcyjnego.
   3. Dodać 50 μl 6-krotnie obciążającego barwnika do reakcji z kroku 1.2.2. Elektroforeza wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 1,5% (w/v) żelu agarozowym-TAE zawierającym fluorescencyjne barwienie dsDNA pod napięciem 120 V przez 2 godziny lub do momentu, gdy prążki zostaną wystarczająco rozwiązane.
   4. Wizualizacja fluorescencji w systemie dokumentacji żelu (Rysunek 2D).
   5. Usuń substrat reporterowy (~1,7 kb) z żelu za pomocą czystego skalpela, uważając, aby nie zanieczyścić szkieletu wektora (~2,6 kb).
   6. Wyodrębnij fragment rdzenia reporterowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta ( Rysunek 2E).
   7. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A_260/280) za pomocą spektrofotometrii.
3. Przygotowanie podłoży reporterowych opartych na I-Sce(Rysunek 1)
   UWAGA: Substraty te obejmują MMEJ zależny od resekcji (Rysunek 2F), nietępy NHEJ (Rysunek 2G), długi szablon HR (Rysunek 2H), krótki szablon HR (Rysunek 2I) oraz SSA (Rysunek 2J).
   1. Wymieszać 100 μg plazmidu rdzenia reporterowego z 50 μl I-SceI (5 U/μg plazmidu) i 60 μl 10x buforu. Doprowadzić całkowitą objętość do 600 μl z ddH₂O i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny do nocy w celu strawienia plazmidu.
      UWAGA: W przypadku trawienia większych lub mniejszych ilości należy proporcjonalnie skalować reakcję. Nietępe NHEJ, zależne od resekcji plazmidy MMEJ, długie matryce HR i SSA mogą być również trawione za pomocą HindIII, co wygeneruje komplementarne spójne końce.
   2. Inkubować reakcję wytrawiania w temperaturze 65 °C przez 20 minut w celu podgrzania, dezaktywować I-SceI. Na tym etapie ustawić temperaturę na 80 °C, jeśli do trawienia użyto HindIII.
   3. Oczyścić DNA z inaktywowanej reakcji trawienia w kroku 1.3.2 przy użyciu preferowanej metody (np. metody opartej na kulkach lub kolumnach), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Zmierzyć stężenie i czystość DNA A_260/280) metodą spektrofotometrii.
4. Kontrola jakości podłoży reporterowych
   1. Elektroforeza 200 ng substratu reporterowego wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% (w/v) żelu agaroza-TAE zawierającym fluorescencyjne barwienie dsDNA przy 120 V przez 2 godziny lub do momentu, gdy prążki zostaną wystarczająco rozwiązane. Załaduj oryginalny, nieoszlifowany plazmid reporterowy obok jako kontrolę.
   2. Sprawdź, czy dla każdego podłoża reporterowego zaobserwowano zdefiniowane pasma o odpowiednim rozmiarze (patrz Tabela 1 i Rysunek 2F-J).

Rysunek 2: Analizy elektroforetyczne żelu generowania substratu reporterowego DSBR. (A-C) Reprezentatywne obrazy z żelowej analizy elektroforetycznej produktów pośrednich i końcowego konstruktu wymaganego do wytworzenia niezależnego od resekcji substratu reporterowego MMEJ. Sąsiednie obrazy w panelach (A) i (C) pochodzą z tych samych żeli; Nieistotne pasy ruchu zostały pominięte. (D,E) Reprezentatywne obrazy z analizy elektroforetycznej żelu dla plazmidu źródłowego, produktów trawionych przez EcoRV i ekstrahowanego żelem konstruktu końcowego wymaganego do wytworzenia substratu reporterowego NHEJ. (F-J) Reprezentatywne obrazy z żelowej analizy elektroforetycznej plazmidów źródłowych i zlinearyzowanych konstruktów DSBR dla substratów reporterowych trawionych I-SceI: MMEJ zależny od resekcji, nietępy NHEJ, długa matryca HR, krótka matryca HR, SSA. Skróty: DSBR = naprawa zerwania podwójnej nici; MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końcówek; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie jednoniciowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Transfekcja przejściowa substratów reporterowych DSBR

UWAGA: Przegląd eksperymentalnego przepływu pracy testów i niektóre potencjalne permutacje są przedstawione w Rysunek 3. Poniższy protokół opisuje eksperyment z użyciem komórek HEK-293, w którym są one transfekowane odwrotnie substratem reporterowym. Poniższe liczby można skalować w górę lub w dół w zależności od liczby studzienek, które mają być użyte na płytkę. Poniższe kroki oblicza się dla testu wykonanego na jednej płytce 96-dołkowej; zobacz Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe uwagi.

Rysunek 3: Eksperymentalny przepływ pracy dla testów reporterowych DSBR. Komórki będące przedmiotem zainteresowania są transfekowane zlinearyzowanym substratem DSBR (kodującym NanoLuc ORF, który musi zostać naprawiony przez określone zdarzenie naprawy DNA) i plazmidem Firefly (kontrola transfekcji). Następnie, 6-24 godziny po transfekcji, luminescencję Firefly i luminescencję NanoLuc można odczytać sekwencyjnie po dodaniu odczynników Nano-Glo Dual-Lucyferazy. Przykładowe permutacje podstawowych etapów (pokazane w jasnoniebieskich ramkach) można wykorzystać do przetestowania, w jaki sposób modulacja genetyczna (nokaut, knockdown lub nadekspresja) lub leczenie farmakologiczne wpływają na biegłość szlaku DSBR w komórkach. Skróty: DSBR = naprawa zerwania podwójnej nici; NanoLuc = Nanoluciferaza; WT = typ dziki; KO = nokaut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. (Opcjonalnie) W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, należy dozować związki rozpuszczone w nośniku (np. dimetylosulfotlenek [DMSO]) do studzienek na 96-dołkowej płytce zgodnie z wcześniej określonym układem doświadczalnym. Normalizacja stężenia nośnika we wszystkich studzienkach.
   UWAGA: Zalecane są repliki techniczne. Uwzględnij studzienki kontrolne (np. tylko dla pojazdów).
2. W probówce o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly (lucyferaza kontrolna) i substrat reporterowy NanoLuc DSBR (lucyferaza reporterowa) wygenerowany w krokach 1,1, 1,2 lub 1,3 w 500 μl buforu transfekcyjnego. Użyj 0,66 μg kontrolnego plazmidu lucyferazy na 1 × 10⁶ komórek. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z ilościami substratu reporterowego NanoLuc DSBR, które należy zastosować.
   UWAGA: Plazmid kontroli pozytywnej, który konstytutywnie wyraża lucyferazy reporterowej, może być użyty do walidacji konfiguracji instrumentu i warunków transfekcji lub do sprawdzenia niespecyficznych skutków dla samej lucyferazy reporterowej. Jako punkt wyjścia zalecamy 0,1 μg plazmidu lucyferazy reporterowej i 0,66 μg plazmidu lucyferazy kontrolnej na 1 × 10⁶ komórek.
3. Dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów do rozcieńczonego DNA z kroku 2.2 w stosunku zalecanym przez producenta (np. odczynnik 1:2, μg DNA:μL dla odczynnika opisanego w Tabeli Materiałów), dobrze wymieszać przez krótkie wirowanie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zbierz komórki przez trypsynizację, zawieś je ponownie w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i policz je.
5. Przenieś 3 × 10⁶ komórek do probówki o pojemności 15 ml i ponownie zawieś w 8,5 ml pożywki.
6. Dodać mieszaninę transfekcji DNA z kroku 2.3 do zawiesiny komórkowej i wymieszać kilkakrotnie przez inwersję.
7. Płytka 80 μl zawiesiny komórek (około 2,7 × 10⁴ komórek) na basenik.
   UWAGA: Zawiesina zawierająca komórki i mieszaninę do transfekcji DNA może być dozowana na płytkę przez pipetowanie ręczne lub przy użyciu automatycznego urządzenia do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia eksperymentów o wyższej przepustowości.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 godziny.

3. Wykrywanie luminescencji

1. Przygotowanie odczynników
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania i dodawania odczynników reporterowych (NanoLuc) i kontrolnych (Firefly), które dostarczają substratów dla obu lucyferazy (odpowiednio furimazyny i 5'-fluorolucyferyny):
   2. Przygotować kontrolny odczynnik lucyferazy. Rozpuścić zgodnie z instrukcją producenta i mieszać przez odwrócenie, aż substrat lucyferazy całkowicie się rozpuści.
   3. Przygotować świeży odczynnik reporterowy lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. Obliczyć ilość odczynnika potrzebną do dodania 80 μl / studzienkę i dodać substrat do odpowiedniej objętości buforu testowego w stosunku 1:100 (substrat lucyferazy: bufor). Na jedną 96-dołkową płytkę rozcieńczyć 88 μl substratu lucyferazy w 8 800 μl buforu i wymieszać przez inwersję.
      UWAGA: Ilości te zawierają około 10% udziału własnego. Po rozpuszczeniu, kontrolny odczynnik lucyferazy może być przechowywany zgodnie z instrukcjami producenta do wykorzystania w przyszłości. Odczynnik reporterowy lucyferazy musi być przygotowany świeży do każdego użycia.
2. Seryjna detekcja luminescencji z lucyferazy kontrolnej i reporterowej (płytka 96-dołkowa)
   1. Pozwól, aby płytka i odczynniki lucyferazy osiągnęły temperaturę pokojową.
   2. Dodać 80 μl kontrolnego odczynnika lucyferazy do dołka.
   3. Potrząsaj płytką przez 3 minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obr./min.
   4. Zmierz kontrolny sygnał luminescencji lucyferazy za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.
      UWAGA: Odczyt emisji przy 580 nm (filtr pasmowo-przepustowy 80 nm) lub całkowitej luminescencji na studzienkę. Ta luminescencja jest używana jako miara wydajności transfekcji i gęstości komórek, a także może informować o toksyczności komórkowej spowodowanej przez testowe zabiegi.
   5. Dodać 80 μl odczynnika reporterowego lucyferazy na basenik.
      UWAGA: Ten odczynnik hamuje kontrolną lucyferazę; Zawiera również substrat dla lucyferazy reporterowej.
   6. Potrząsaj płytką przez 3 minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obr./min.
   7. Pozostaw talerz na odpoczynek na 7 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.
      UWAGA: Odczyt emisji przy 470 nm (filtr pasmowo-przepustowy 80 nm) lub, alternatywnie, całkowita luminescencja na studzienkę. Ta luminescencja dostarcza informacji o ilości substratu reporterowego, który został naprawiony przez interesujący nas szlak DSBR.
   9. Eksport odczytów luminescencji do dalszej analizy.

4. Analiza danych

1. Podziel sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej (NanoLuc) przez sygnał luminescencji lucyferazy kontrolnej (Firefly) pochodzący z tej samej studni, aby obliczyć sygnał testowy. Zastosuj to obliczenie do wszystkich studzienek, jak pokazano w równaniu (1).
   (1)
2. Obliczyć średnią sygnałów testowych dla studzienek kontrolnych (np. tylko dla nośnika).
3. Znormalizuj sygnały testowe dla dołków testowych do średniej studzienki kontrolnej, używając równania (2) do obliczenia naprawy (%) na studzienkę.
   (2)
4. (Opcjonalnie, dopasowanie krzywej) W przypadku testowania wielu dawek związków należy wykreślić obliczoną naprawę (%) w stosunku do stężenia związku i dopasować krzywą dawka-odpowiedź przy użyciu modelu regresji nieliniowej. Użyj tej krzywej do późniejszej interpolacji EC₅₀.

Wyniki

Naprawa każdego z testów reporterowych może być wykryta i określona ilościowo przy użyciu tej samej procedury. Prawidłowa naprawa substratu przez pokrewny szlak naprawczy w komórkach odtworzy nienaruszony, funkcjonalny ORF kodujący NanoLuc. Ten sygnał luminescencji można wykryć za pomocą czytnika płytek.

Współtransfekcja z nienaruszonym plazmidem kodującym lucyferazy świetlików służy jako kontrola transfekcji. Ta kontrolka służy dwóm celom. Po pierwsze, zapewnia standard normalizacji sygnału NanoLuc, ponieważ nie powinien on być zakłócony przez modulację DSBR za pomocą środków genetycznych lub farmakologicznych. Po drugie, może wskazać perturbacje komórkowe poza celem, które wpływają na sygnał lucyferazy, takie jak modulacja cyklu komórkowego, wpływ na transkrypcję/translację lub ogólna toksyczność.

Stosunek NanoLuc do Firefly służy jako zastępczy odczyt naprawy. Wartości luminescencji można eksportować i analizować, normalizując dwa sygnały lucyferazy z tej samej studni. W przypadku badań nad zaburzeniami genetycznymi (np. Porównanie siRNA typu dzikiego i KO lub siRNA nieukierunkowanego i docelowego), naprawa jest zwykle normalizowana do próbki rodzicielskiej (komórki typu dzikiego lub komórki traktowane kontrolnym siRNA nieukierunkowanym). W przypadku modulacji farmakologicznej wartości z próbki poddanej działaniu związku są normalizowane do wartości uzyskanej w wyniku poddania działaniu nośnika.

Niedawno opublikowano pełną walidację opisanego zestawu reporterów⁷. Dane ilustrujące charakterystykę genetycznej i farmakologicznej modulacji DSBR przedstawiono na rysunku Rysunek 4 (zaadaptowany z ⁷). Polθ jest kluczowym mediatorem MMEJ i przewiduje się, że utrata lub zahamowanie tego enzymu spowoduje specyficzną ablację komórkowego MMEJ^3,10. Korzystając z linii komórkowej, w której POLQ, gen kodujący Polθ, został znokautowany¹¹, niezależny od resekcji test reporterowy MMEJ pokazuje, że MMEJ jest rzeczywiście prawie całkowicie stłumiony. Ocena komponentu Sygnały luminescencji NanoLuc i Firefly pokazuje, że obserwowana wada naprawcza jest napędzana przez redukcję sygnału NanoLuc (kodowanego przez podłoże reporterowe), podczas gdy sygnał Firefly (kontrola) jest niezakłócony (Rysunek 4A-C). W przeciwieństwie do tego, ocena biegłości NHEJ przy użyciu końca reportera NHEJ pokazuje, że nokaut POLQ nie hamuje naprawy substratu reporterowego (Rysunek 4D-F). Łącznie te dane genetyczne potwierdzają specyficzną rolę Polθ w naprawie za pośrednictwem MMEJ. Obserwacje te są w pełni podsumowane farmakologicznie za pomocą ART558^12,13, niedawno zgłoszonego bardzo silnego i specyficznego inhibitora domeny polimerazy Polθ (Rysunek 4G), gdzie obserwuje się miareczkowalne hamowanie MMEJ, które wynika z określonego spadku NanoLuc, a nie sygnału Firefly (Rysunek 4H). Ponadto, zgodnie z danymi genetycznymi, nie ma wpływu na NHEJ (Rysunek 4I,J). Łącznie dane te podkreślają, w jaki sposób te reportery mogą być wykorzystane do scharakteryzowania genetycznej modulacji szlaków DSBR i pokazania siły komórkowej i specyficzności celu/szlaku małych cząsteczek.

Rysunek 4: Wpływ genetycznego nokautu i farmakologicznego hamowania Polθ na sygnały reporterowe MMEJ i NHEJ. Komórki eHAP1 WT i POLQ^(-) transfekowano plazmidem kontrolnym Firefly oraz (A-C) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (D-F) końcem reportera NHEJ. Procent naprawy MMEJ lub NHEJ to stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany do kontroli traktowanej DMSO, 24 godziny po transfekcji. Dane reprezentują średnią ± SEM trzech kontrprób biologicznych, z których każda wynosi średnio 8 kontrprób technicznych. Komórki HEK-293 transfekowano plazmidem kontrolnym Firefly i (G,H) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (I,J) końcem reportera NHEJ i traktowano inhibitorem polimerazy Polθ ART558. Procent naprawy to stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany do kontroli leczonej DMSO, 24 godziny po transfekcji. Procentowe hamowanie poszczególnych sygnałów luminescencyjnych w (G) i (I) obliczono w stosunku do kontroli leczonej DMSO i pokazano odpowiednio w (H) i (J). Dane reprezentują średnią ± SEM wynoszącą 2 kontrpróby biologiczne, z których każda wynosi średnio 4 kontrpróby techniczne. Ten rysunek został zaadaptowany z Rajendra et al.⁷. Skróty: NanoLuc = Nanoluciferaza; MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końcówek; WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Hamowanie sygnału reporterowego HR przez inhibitor RAD51 CAM833. (A) Komórki HEK-293 transfekowano substratem reporterowym HR o długiej matrycy, plazmidem kontrolnym lucyferazy świetlika, i traktowano inhibitorem RAD51 CAM833¹⁴. Luminescencję NanoLuc i Firefly odczytano 16 godzin po transfekcji. Procent naprawy HR to stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany do kontroli traktowanej DMSO. Linie przerywane podkreślają procentowe zahamowanie tętna i stężenie CAM833 na krzywej EC₅₀. Dane reprezentują średnią ± SEM wynoszącą 2 kontrpróby biologiczne, z których każda wynosi średnio 4 kontrpróby techniczne. (B) Procentowe hamowanie poszczególnych sygnałów luminescencyjnych w (A) obliczono w stosunku do kontroli leczonej DMSO. Linie przerywane podkreślają procentowe hamowanie NanoLuc i świetlików przy 3,33 μM CAM833 (EC₅₀). Spadek sygnału świetlika przy stężeniach CAM833 ≥ 10 μM wskazuje na toksyczność związków w dużych dawkach; jednak redukcję sygnału NanoLuc obserwuje się w stężeniach, w których sygnał Firefly nie jest zakłócony, co sugeruje, że CAM833 indukuje hamowanie HR w miejscu docelowym. Ten rysunek został zaadaptowany z Rajendra et al.⁷. Skróty: NanoLuc = Nanoluciferaza; HR = rekombinacja homologiczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podłoże reportera		Źródło plazmidu (rozmiar w kb, opór)	generacja DSB			Oczekiwany rozmiar końcowego podłoża reporterowego (kb)
MMEJ niezależny od resekcji		4.0, Kan	Wycięte 3' ogony poprzez podwiązanie czapek			1.6
MMEJ zależne od resekcji		6.5, Kan	I-SceI (niespoisty), HindIII (spoisty)			6,5
NHEJ		4.3, Kan	kończy się po wycięciu z plazmidu przez EcoRV			Pytanie 1.7
Nietępy NHEJ		6.7, Kan	I-SceI (niespoisty), HindIII (spoisty)			6,5
Długi szablon HR		9.2, Kan	I-SceI (niespoisty), HindIII (spoisty)			Pytanie 9,2
Krótki szablon HR		9,3, Wzmacniacz	I-SceI (spójny)			9,3
SSA		9,5, Kan	I-SceI (niespoisty), HindIII (spoisty)			Pytanie 9,5

Tabela 1: Plazmidy substratu reporterowego. Skróty: DSB = double strand break; MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końcówek; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie jednopasmowe; Kan = kanamycyna; Amp = ampicylina.

Sekwencja (5'-3')			dostawca	oczyszczanie	funkcja
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCCCAGTCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			Sigma	strona	Lewa czapeczka, długi oligonukleotyd
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGAAGTCC			Sigma	strona	Lewa czapeczka, krótki oligonukleotyd
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			Sigma	strona	Prawe kołpak, długi oligonukleotyd
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			Sigma	strona	Prawe kołderko, krótki oligonukleotyd

Tabela 2: Oligonukleotydy dla czapek do generowania niezależnego od resekcji substratu reporterowego MMEJ. Skróty: ssDNA = jednoniciowy DNA; dsDNA = dwuniciowy DNA; MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; STRONA = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Mikrohomologie są podkreślone.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Test reporterowy	NanoLuc substrat reporterowy DNA (μg DNA/1x106 komórek)	Plazmid lucyferazy kontrolnej świetlika (μg DNA/1x106 komórek)
MMEJ niezależna od resekcji	0,5	0,66
MMEJ zależne od resekcji	1	0,66
NHEJ	0,5	0,66
Nietępy NHEJ	0,5	0,66
Długi szablon HR	1	0,66
Krótki szablon HR	cyfra arabska	0,66
Ssa	1	0,66

Tabela 3: Ilości DNA do przejściowej transfekcji substratów reporterowych NanoLuc i plazmidu lucyferazy kontrolnej Firefly (HEK-293, format płytki 96-dołkowej). Skróty: MMEJ = łączenie końcówek za pośrednictwem mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końcówek; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie jednoniciowe.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokoły generowania i wdrażania zestawu reporterów opartych na luminescencji pozachromosomalnej do pomiaru biegłości komórkowej czterech głównych szlaków DSBR (HR, NHEJ, MMEJ i SSA)⁷. Substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową i wykorzystywane do oceny aktywności DSBR przy użyciu czułego i solidnego odczytu luminescencji NanoLuc na płytce, która jest odtwarzana po zaangażowaniu w pokrewne szlaki komórkowe DSBR.

Kilka etapów generowania substratu reporterowego, transfekcji substratów do komórek i interpretacji danych ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia tych testów. Chociaż do generowania substratów reporterowych stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej, wizualizacja procesu za pomocą elektroforezy żelowej zapewnia najwyższą jakość i czystość substratów przed transfekcją. Ponieważ testy te opierają się na transfekcji przejściowej, zastosowanie mają wspólne względy dotyczące tych metod. Obejmują one optymalizację gęstości wysiewu, warunków transfekcji (w tym odczynników i ilości DNA) oraz ocenę przydatności w formatach transfekcji do przodu i do tyłu. Te testy reporterowe zostały z powodzeniem przeprowadzone przy użyciu szeregu protokołów elektroporacji i lipofekcji, a opcje powinny być w pełni zbadane przed wykonaniem tych testów. Należy również zwrócić uwagę na kontrolę składowych sygnałów NanoLuc i Firefly, a nie tylko kompozytowego sygnału naprawy uzyskanego przez normalizację sygnału NanoLuc (substrat reporterowy) do sygnału Firefly (kontrola). Artefakty mogą wynikać ze współczynnika napędzanego przez zmiany w sygnale Firefly. Na przykład, ocena inhibicji w trybie dawka-odpowiedź przy użyciu wysoce specyficznego związku powinna tłumić sygnał NanoLuc w sposób miareczkowany bez zakłócania sygnału Firefly, który powinien pozostać stabilny (Figura 4G,H). Jednak w przypadkach, gdy sygnały Firefly są zakłócone, użyteczny wpływ na naprawę można nadal określić, identyfikując okno dawki, w którym sygnał Firefly nie jest zakłócony (ryc. 5).

W porównaniu z najczęściej stosowanymi testami reporterowymi DSBR, te pozachromosomalne testy reporterowe oparte na luminescencji mają pewne wyraźne zalety. Ponieważ szlaki DSBR są wysoce konserwatywne, nawet jeśli maszyneria komórkowa różni się w zależności od modelu komórkowego, testy mogą nadal informować o biegłości DSBR i wyborze ścieżki. Otwiera to ocenę DSBR na dowolny model, który może być interesujący dla użytkownika, o ile z góry zostaną ustalone optymalne warunki transfekcji przejściowej.

Zastosowanie nanolucyferazy jako genu reporterowego ma również przewagę nad opcjami fluorescencyjnymi, które były tradycyjnie stosowane w testach reporterowych DSBR. NanoLuc szybko dojrzewa, a luminescencja jest wykrywana z dużą czułością za pomocą czytnika płytek⁸. W połączeniu z szybkością naprawy substratu (ponieważ substraty reporterowe są transfekowane do komórek z gotowymi do naprawy końcami DSB), ten format testu reporterowego DSBR jest idealny do szybkiej realizacji i odporności ilościowej wymaganej do badań przesiewowych małych cząsteczek w ramach kaskady odkrywania leków przemysłowych. Rzeczywiście, niedawno opisaliśmy implementację niezależnego od resekcji testu reporterowego MMEJ w kaskadzie odkryć wykorzystywanej do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów domeny polimerazy Polθ¹³.

Istnieje również elastyczność w realizacji testów reporterowych w celu odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące genetycznych i farmakologicznych zaburzeń DSBR (ryc. 3). Na przykład, przed transfekcją substratów reporterowych, komórki mogą być transfekowane siRNA przeciwko genowi będącemu przedmiotem zainteresowania przez 48-72 godziny. Alternatywnie, wpływ nadekspresji genów na szlaki DSBR można przetestować, wykonując transfekcję plazmidu 24-48 godzin przed transfekcją substratów reporterowych. W przypadku badań farmakologicznych niniejszy protokół opisuje już, w jaki sposób wykorzystanie małych cząsteczek może zostać włączone do standardowego przepływu pracy, ale alternatywne formaty mogą obejmować zmiany w schematach leczenia związkami, takie jak wstępna inkubacja lub wymłukiwanie.

Skalowalność transfekcji w stanach nieustalonych może również wspierać podejścia przesiewowe na dużą skalę, w których transfekcja partiowa substratów reporterowych jest przeprowadzana przed badaniem przesiewowym. Co więcej, czas trwania testu od transfekcji do odczytu może być również różny. Chociaż standardowy czas trwania może wynosić 16-24 godziny, niektóre testy można odczytać już w ciągu 6 godzin⁷. Przy określaniu czasu trwania testu należy również wziąć pod uwagę obawy dotyczące toksyczności małych cząsteczek lub siRNA, które mogą zagrozić żywotności komórek.

Podsumowując, testy przedstawione w tym badaniu i w pełni opisane w niedawnej publikacji⁷ zapewniają szybką i solidną ocenę biegłości w zakresie komórkowego DSBR. Są bardzo czułe i miareczkowane, dzięki czemu można je poddać badaniom genetycznym i farmakologicznym. Co najważniejsze, ponieważ substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową, mają one potencjał do wykorzystania w dowolnym modelu komórki transfekcyjnej, który jest przedmiotem zainteresowania, a nie ograniczają się do określonych linii komórkowych poprzez stabilną integrację, jak ma to miejsce w przypadku chromosomalnych reporterów DSBR. Jednak wyraźnym ograniczeniem tych reporterowych testów pozachromosomalnych jest to, że brak integracji z genomem może nie w pełni podsumować fizjologiczny, chromatynowy kontekst naprawy DNA i związanych z nim wskazówek regulacyjnych i orkiestracji¹⁵. W tym celu pozachromosomalne testy reporterowe stanowią uzupełnienie istniejących metod oceny DSBR i rozszerzają zestaw narzędzi odpowiednich zarówno do badań podstawowych, jak i odkrywania leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x Bufor TBE	Thermo Fisher	AM9863
20% żel akryloamidowy TBE	Invitrogen	EC6315BOX
50x Bufor TAE	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, fioletowy	NEB	B7024S
(z przezroczystym dnem i pokrywką)	Porvair	204012
Agaroza	Tasak Scientific	CSL-AG500
Koraliki AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Do oczyszczania DNA
z fosfatazy antarktycznej i bufora 10X	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	Czytnik płytek
Countess II Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher	AMQAX1000	Licznik komórek
Niestandardowe oligonukleotydy	Sigma-Aldrich	Zamówienie niestandardowe	Do niezależnego od resekcji substratu MMEJ. Patrz tabela 2.
Dozownik związków D300e	Tecan	30100152	na bazie DMSO
Kaseta D300e D4+ Tecan		30097371	Kaseta o dużej objętości do dozownika związków D300e
Kaseta D300e T8+	Tecan	30097370	Kaseta o małej objętości do dozownika związków D300e
Sultlenek dimetylu, klasa hodowli komórkowych	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Nośnik dla związków, używany na rysunku 4 i Ryc. 5
Plazmidy źródłowe reportera DSBR	Artios		Dostępne dla społeczności akademickiej na żądanie
EcoRV-HF i 10x bufor CutSmart	NEB	R3195M
Absolut etanolu	VWR	20821.365
Surowica bydlęca	płodu PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder	Thermo Fisher	SM1211	Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej
Komórki HEK-293	ATCC	CRL-1573	Przykładowa linia komórkowa używana w protokole
HindIII-HF i 10x bufor CutSmart	NEB	R3104M
HyClone Biologia molekularna klasa wody	Fisher Scientific	10275262
SceI i 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME odczynnik i bufor	PolyPlus	114-15	Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Wirówka do probówek 15 lub 50 ml
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Pożywka hodowlana do komórek HEK-293
Mikropłytka Wytrząsarka	Fisherbrand	15504070	Wytrząsarka orbitalna MicroStar
17R	VWR	521-1647	Wirówka do probówek 1,5 lub 2 ml
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Dozownik odczynników na bazie komórek lub wody
MultiDrop Standard Kaseta	Thermo Fisher	24072670	Kaseta do dozownika odczynników MultiDrop
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630 lub N1650	Reporter (NanoLuc) do gaszenia luminescencji Firefly i wykrywania luminescencji NanoLuc. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System
ONE-Glo EX Luciferazy Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 lub N1650	Control lucyferazy (Firefly) do wykrywania Firefly. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System
PBS (bez wapnia i magnezu)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Plazmid Firefly (lub podobny)	Promega	E1310 (lub równoważny)	Plazmid kontrolny Firefly
pNL1.1 Plazmid NanoLuc (lub podobny)	Promega	N1091 (lub równoważny)	Plazmid kontrolny NanoLuc, do regulacji ustawień sprzętu/eksperymentów optymalizacyjnych
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb Drabinka DNA	NEB	N0552S	Drabinka DNA o wysokiej masie cząsteczkowej
Octan sodu (3 M), pH 5,5	Thermo Fisher	AM9740	Do regulacji pH podczas ekstrakcji żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick
SYBR Gold (10 000x)	Invitrogen	S11494	Do wizualizacji ssDNA i dsDNA
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	Do wizualizacji dsDNA tylko
Ligaza DNA T4 i 10x bufor ligazy	NEB	M0202L
Barwienie błękitem trypanowym 0,4%	Invitrogen	T10282	Do pomiaru żywotności podczas liczenia komórek
Roztwór trypsyny-EDTA; 0,25% trypsyna i 0,53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI oraz 10x bufor CutSmart	NEB	R0146M