Artykuł metodologiczny

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66969

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Artios Pharma Ltd, Cambridge, 2The Francis Crick Institute, London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Streszczenie

Naprawa pęknięć podwójnej nici DNA (DSB) jest kluczowa dla utrzymania stabilności genomu i żywotności komórek. Naprawa DSB (DSBR) w komórkach odbywa się za pośrednictwem kilku mechanizmów: rekombinacji homologicznej (HR), niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzania pojedynczej nici (SSA). Testy komórkowe są niezbędne do pomiaru biegłości i modulacji tych szlaków w odpowiedzi na różne bodźce.

Tutaj prezentujemy zestaw pozachromosomalnych testów reporterowych, z których każdy mierzy rekonstytucję genu reporterowego nanolucyferazy przez jeden z czterech głównych szlaków DSBR w komórkach. Po przejściowej transfekcji do komórek będących przedmiotem zainteresowania, naprawę substratów reporterowych specyficznych dla szlaku można zmierzyć w czasie krótszym niż 24 godziny poprzez wykrycie luminescencji nanolucyferazy (NanoLuc).

Te solidne testy są ilościowe, czułe, miareczkowane i podatne na wysokoprzepustowy format przesiewowy. Właściwości te zapewniają szerokie zastosowanie w badaniach nad naprawą DNA i odkrywaniu leków, uzupełniając obecnie dostępny zestaw narzędzi komórkowych testów DSBR.

Wprowadzenie

Pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) reprezentują szczególnie toksyczną klasę uszkodzeń DNA1, dzięki czemu komórki wyewoluowały wiele ścieżek naprawy DSB (DSBR) w celu naprawy tych zmian. Cztery główne mechanizmy DSBR to rekombinacja homologiczna (HR), niehomologiczne łączenie końcówek (NHEJ), łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wyżarzanie pojedynczej nici (SSA)2,3. Szlaki DSBR przyczyniają się do utrzymania zdrowego rozwoju i fizjologii tkanek oraz chronią przed chorobami, takimi jak rak. Co więcej, te mechanizmy naprawcze mają potencjał terapeutyczny dla rozwoju modulatorów małocząsteczkowych w onkologii precyzyjnej. Na przykład celowanie w polimerazę DNA θ (Polθ), kluczowy enzym w szlaku naprawy MMEJ, wzbudziło zainteresowanie ze względu na jego syntetyczną śmiertelność z niedoborem HR w raku4.

Zrozumienie DSBR ma zatem szerokie implikacje kliniczne i potrzebne są funkcjonalne testy komórkowe zdolne do pomiaru aktywności wszystkich głównych szlaków DSBR5. Testy muszą nadawać się zarówno do badań genetycznych, jak i farmakologicznych oraz być możliwe do zastosowania w różnych modelach komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Aby wesprzeć wysiłki związane z odkrywaniem leków małocząsteczkowych, testy muszą być bardzo czułe, miareczkowe, mieć szybki czas realizacji i być skalowalne do formatów o wysokiej przepustowości, odpowiednich do badań przesiewowych związków.

Ogólnie, DSBR był wcześniej mierzony za pomocą systemów testów reporterowych opartych na fluorescencji, stabilnie zintegrowanych z genomem komórki6. Jednakże, podczas gdy fizjologiczna rekapitulacja chromosomalnego DSBR jest wyraźną zaletą, takie testy są ograniczone do modelu gospodarza, w którym reporter jest zintegrowany, wykorzystują pracochłonne przygotowanie i analizę próbek za pomocą cytometrii przepływowej i mają ograniczoną przepustowość, czas realizacji, solidność i czułość, wszystkie niezbędne cechy niezbędne do odkrywania leków.

Tutaj opisujemy zestaw testów reporterowych DSBR, które pozwalają na ocenę czterech głównych ścieżek DSBR. Zestaw substratów do testów reporterowych jest opisany w Rysunek 1 i szczegółowo opisany w niedawnej publikacji7. Są one pozachromosomalne, co pozwala na ich wprowadzenie do komórek przez prostą transfekcję przejściową i włączenie genu reporterowego nanolucyferazy8, który musi zostać odtworzony przez zaangażowanie w określone mechanizmy DSBR, rodzi czułość, solidność i skalowalność. W protokole uwzględniono następujące warianty substratu reporterowego DSBR (Rysunek 1):

Niezależny od resekcji MMEJ: Ten liniowy substrat składa się z regionu dwuniciowego DNA (dsDNA) z nawisami jednoniciowego DNA (ssDNA), które naśladują wycięte końcówki DNA9. Cztery mikrohomologie nukleotydowe na końcach regionów ssDNA kodują kodon start dla genu reporterowego. Naprawa tego substratu za pomocą MMEJ przywraca otwartą ramkę odczytu genu reporterowego (ORF).

MMEJ zależne od resekcji: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment zawierający kodon stop, który jest otoczony przez 8 mikrohomologii par zasad (bp). Resekcja końca nukleolitycznego jest wymagana przed naprawą za pośrednictwem MMEJ w celu przywrócenia nienaruszonego genu reporterowego.

Blunt NHEJ: Gen reporterowy jest podzielony na sekcje N- i C-końcowe, z których ta ostatnia jest umieszczona przed promotorem. DSB jest wytwarzany przy użyciu EcoRV i wymaga bezpośredniej ligacji (bez przetwarzania końcowego) przez NHEJ w celu ponownego połączenia obu części genu reporterowego i przywrócenia reporterowego ORF.

Non-blunt NHEJ: DSB znajduje się wewnątrz intronu i będzie miał spójne lub niespoiste końce, w zależności od wyboru enzymu restrykcyjnego. Naprawa tego podłoża przez NHEJ wymaga podwiązania poprzedzonego obróbką końcową.

Długa matryca HR: N-końcowy ekson genu reporterowego jest przerywany przez segment DNA zawierający miejsca restrykcyjne, które zastępują 22 pz oryginalnej sekwencji genu reporterowego. Aby przywrócić tę sekwencję, naprawa przez HR wykorzystuje szablon homologii 2,5 kilozasady (kb) umieszczony poniżej C-końcowego eksonu.

Krótki szablon HR: Miejsce restrykcyjne potrzebne do wygenerowania DSB zastępuje część natywnej sekwencji genu reporterowego i wprowadza kodon stop w ramce. Podobnie jak wersja z długim szablonem, ten substrat HR wymaga dalszego szablonu homologii (360 pz) w celu dokładnej naprawy i przywrócenia reportera ORF.

SSA: Ten substrat zawiera przedwczesny kodon stop znajdujący się w N-końcowym eksonie genu reporterowego. Usunięcie tego kodonu stop i przywrócenie nienaruszonej sekwencji genu reporterowego wymaga naprawy przez SSA, która obejmuje dwukierunkową resekcję dalekiego zasięgu przed wyrównaniem homologii.

Dla generowania DSB, niektóre z substratów reporterowych mogą być trawione za pomocą I-SceI (Rysunek 1). W ten sposób zostanie wygenerowany liniowy substrat z niespójnymi końcami w zależnym od resekcji MMEJ, nietępym NHEJ, długich matrycach HR i reporterach SSA, które mają tandemowe miejsca I-SceI w odwróconej orientacji. W krótkim szablonowym substracie reporterowym HR, trawienie pojedynczego miejsca I-SceI wygeneruje spójne końce. Nietępe NHEJ, zależne od resekcji plazmidy MMEJ, długie matryce HR i SSA mogą być również trawione za pomocą HindIII, co wytworzy komplementarne spójne końce.

Udostępniamy protokoły generowania substratów testowych reporterowych i opisujemy, jak testy mogą być przeprowadzane, dostarczając szczegółów na temat tego, jak można je wykorzystać do ilościowego oznaczania DSBR, w tym miareczkowych odpowiedzi na małe cząsteczki, oceny siły komórkowej, aktywności na miejscu i selektywności szlaku.

Protokół

1. Przygotowanie i kontrola jakości (QC) substratów reporterowych

UWAGA: Plazmidy kodujące substraty reporterowe mogą być namnażane w standardowych szczepach Escherichia coli (np. DH5α i ich pochodnych) i odzyskiwane poprzez izolację plazmidową. Szczegóły dotyczące plazmidów (rozmiar i oporność na antybiotyki) opisano w Tabeli 1 oraz na Rysunku 1.

Procesy edycji genów, schemat, szlaki MMEJ, NHEJ, HR, SSA, mechanizmy naprawy oparte na plazmidach.
Rycina 1: Schematy pozachromosomalnych testów reporterowych DSBR opartych na NanoLuc. Schematyczne przedstawienie substratów reporterowych DSBR, w tym ich lokalizacji w każdym plazmidzie źródłowym, głównych cech sekwencji oraz końcowego układu po naprawie specyficznej dla danego szlaku. Rdzeń substratu MMEJ niezależny od resekcji jest wycinany z plazmidu źródłowego poprzez trawienie enzymami XhoI/HindIII, po czym do obu końców muszą zostać przyłączone ligazy w celu wytworzenia substratu dla MMEJ. Tępy substrat reporterowy NHEJ jest generowany poprzez wycięcie z plazmidu źródłowego za pomocą EcoRV. Substraty reporterowe dla MMEJ zależnego od resekcji, NHEJ nietępego, HR z długą matrycą oraz SSA są generowane poprzez linearyzację plazmidów źródłowych przy użyciu I-SceI (który tworzy końce nielepkie) lub HindIII (który tworzy końce lepkie). Substrat reporterowy HR z krótką matrycą jest generowany poprzez linearyzację plazmidu źródłowego przy użyciu I-SceI (który tworzy końce lepkie). Naprawa każdego substratu reporterowego przez docelowy szlak DSBR odtwarza nienaruszoną ORF nanolucyferazy kodującą funkcjonalną NanoLuc. Rycina została zaadaptowana z Rajendra et al.7. Skróty: DSBR = naprawa pęknięć dwuniciowych; NanoLuc = nanolucyferaza; MMEJ = łączenie końców zapśredniczone przez mikrohomologię; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici; ORF = otwarta ramka odczytu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie niezależnego od resekcji substratu reporterowego MMEJ (Rysunek 1 oraz Rysunek 2A-C)
    1. Przygotowanie końców (caps) ssDNA/dsDNA (Rysunek 2A)
      1. Rozpuścić cztery oligonukleotydy wymienione w Tabeli 2 oddzielnie w buforze do wyżarzania (20 mM Tris pH 7.5, 50 mM NaCl w wodzie klasy molecular biology), aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 100 µM.
      2. Wyżarzanie końców ss/dsDNA
        1. Wymieszać po 50 µL długiego i krótkiego oligonukleotydu (roztwór zapasowy 100 µM) dla lewej końcówki z kroku 1.1.1.1 w probówce 0,2 mL.
        2. Powtórzyć procedurę dla oligonukleotydów prawej końcówki.
        3. Za pomocą termocyklera inkubować każdą mieszaninę oligonukleotydów w temperaturze 99 °C przez 5 min, a następnie obniżać temperaturę do 10 °C w tempie 1 °C/min.
          UWAGA: W ten sposób zostaną otrzymane wyżarzone końcówki lewa i prawa.
      3. (QC, opcjonalnie) Weryfikacja wyżarzania oligonukleotydów za pomocą elektroforezy
        1. Przeprowadzić elektroforezę 100 ng każdego produktu z kroku 1.1.1.2 wraz z poszczególnymi oligonukleotydami z kroku 1.1.1.1 oraz markerem DNA o niskiej masie cząsteczkowej w żelu 20% akrylamid-Tris-Borat-EDTA (TBE) przy 200 V przez 80 min.
        2. Barwić żel buforem do elektroforezy TBE zawierającym odpowiedni fluorescencyjny barwnik DNA przez co najmniej 10-15 min, aby zwizualizować zarówno ssDNA, jak i dsDNA.
        3. Wizualizować fluorescencję w systemie dokumentacji żeli (Rysunek 2A).
          UWAGA: Kroki od 1.1.1.3.1 do 1.1.1.3.3 służą do weryfikacji prawidłowego wyżarzenia końcówek. Pozorne wielkości dla lewej i prawej końcówki powinny wynosić odpowiednio ok. 120 bp i ok. 175 bp.
    2. Oczyszczanie rdzenia substratu reporterowego (Rysunek 2B)
      1. Wymieszać 100 µg plazmidu rdzenia reporterowego z 4 µL HindIII i 4 µL XhoI (4 U/µg plazmidu dla każdego enzymu) oraz 20 µL buforu 10x. Uzupełnić całkowitą objętość do 200 µL wodą dwukrotnie destylowaną (ddH2O) i inkubować w 37 °C przez 2 h lub przez noc w celu trawienia plazmidu.
        UWAGA: W przypadku trawienia większej lub mniejszej ilości, przeskalować reakcję proporcjonalnie.
      2. Inkubować reakcję trawienia w 80 °C przez 20 min, aby termicznie inaktywować enzymy restrykcyjne.
      3. Do mieszaniny reakcyjnej z kroku 1.1.2.2 dodać 40 µL fosfatazy alkalicznej (2 U/µg plazmidu) i 27 µL buforu 10x. Inkubować w 37 °C przez 2 h w celu defosforylacji plazmidu.
        UWAGA: Przeskalować reakcję w górę lub w dół zgodnie z potrzebami.
      4. Do reakcji z kroku 1.1.2.3 dodać 60 µL 6x barwnika do nakładania próbek. Przeprowadzić elektroforezę wraz z markerem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w żelu 1,5% (w/v) agaroza-Tris-Octan-EDTA (TAE) zawierającym fluorescencyjny barwnik dsDNA przy 120 V przez 2,5 h lub do momentu wystarczającego rozdzielenia prążków.
      5. Wizualizować fluorescencję w systemie dokumentacji żeli (Rysunek 2B).
      6. Wyciąć fragment rdzenia reporterowego (~1,5 kb) z żelu za pomocą czystego skalpela, uważając, aby nie zanieczyścić go szkieletem wektora (~2,5 kb).
      7. Wyekstrahować fragment rdzenia reporterowego za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, zgodnie z instrukcją producenta.
      8. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A260/280) za pomocą spektrofotometrii.
    3. Ligacja rdzenia substratu reporterowego z końcówkami ssDNA/dsDNA i oczyszczanie końcowego substratu reporterowego (Rysunek 2C)
      1. Wymieszać 30 µg fragmentu rdzenia reporterowego z kroku 1.1.2.7 z 3,85 µL każdej z wyżarzonych lewej i prawej końcówki z kroku 1.1.2 (przybliżony stosunek molowy końcówka:rdzeń DNA 6:1), 30 µL buforu do ligazy 10x i 1,5 µL ligazy T4 DNA (20 U/µg DNA). Uzupełnić całkowitą objętość reakcji do 300 µL wodą ddH2O i inkubować przez noc w 16 °C, aby podligować końcówki do fragmentu rdzenia reporterowego.
        UWAGA: Przeskalować reakcję w górę lub w dół zgodnie z wymaganiami.
      2. (QC, opcjonalnie) Przeprowadzić elektroforezę 200 ng otrzymanego produktu z kroku 1.1.3.1 wraz z rdzeniem substratu reporterowego i markerem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w żelu 0,7% (w/v) agaroza-TAE zawierającym fluorescencyjny barwnik dsDNA przy 120 V przez co najmniej 1,5 h. Zweryfikować, czy prążek odpowiadający produktowi ligacji migruje nieco wolniej niż niepodligowany rdzeń substratu reporterowego (Rysunek 2C).
        UWAGA: Ten krok kontroli jakości służy do weryfikacji, czy ligacja końcówek do fragmentu rdzenia reporterowego przebiegła prawidłowo.
      3. Oczyścić DNA z reakcji trawienia w kroku 1.3.1. za pomocą preferowanej metody (np. metody opartej na kuleczkach lub kolumnie), zgodnie z instrukcją producenta.
        UWAGA: Krok oczyszczania 1.1.3.3 znacznie redukuje obecność niepodligowanych końcówek.
    4. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A260/280) za pomocą spektrofotometrii.
  2. Przygotowanie substratu reporterowego blunt NHEJ (Rysunek 1 oraz Rysunek 2D,E)
    1. Wymieszać 100 µg plazmidu rdzenia reporterowego z 5 µL EcoRV (5 U/µg plazmidu) i 20 µL buforu 10x. Uzupełnić całkowitą objętość do 200 µL wodą ddH2O i inkubować w 37 °C przez 2 h lub przez noc w celu trawienia plazmidu.
      NOTE: Dla trawienia większych lub mniejszych ilości przeskalować reakcję proporcjonalnie.
    2. Inkubować reakcję trawienia w 65 °C przez 20 min, aby termicznie inaktywować enzym restrykcyjny.
    3. Do reakcji z kroku 1.2.2 dodać 50 µL 6x barwnika do nakładania próbek. Przeprowadzić elektroforezę wraz z markerem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w żelu 1,5% (w/v) agaroza-TAE zawierającym fluorescencyjny barwnik dsDNA przy 120 V przez 2 h lub do momentu wystarczającego rozdzielenia prążków.
    4. Wizualizować fluorescencję w systemie dokumentacji żeli (Rysunek 2D).
    5. Wyciąć substrat reporterowy (~1,7 kb) z żelu za pomocą czystego skalpela, uważając, aby nie zanieczyścić go szkieletem wektora (~2,6 kb).
    6. Wyekstrahować fragment rdzenia reporterowego za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, zgodnie z instrukcją producenta (Rysunek 2E).
    7. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (A260/280) za pomocą spektrofotometrii.
  3. Przygotowanie substratów reporterowych opartych na I-SceI (Rysunek 1)
    UWAGA: Substraty te obejmują zależne od resekcji MMEJ (Rysunek 2F), non-blunt NHEJ (Rysunek 2G), HR z długą matrycą (Rysunek 2H), HR z krótką matrycą (Rysunek 2I) oraz SSA (Rysunek 2J).
    1. Wymieszać 100 µg plazmidu rdzenia reporterowego z 50 µL I-SceI (5 U/µg plazmidu) i 60 µL buforu 10x. Uzupełnić całkowitą objętość do 600 µL wodą ddH2O i inkubować w 37 °C przez 2 h lub przez noc w celu trawienia plazmidu.
      UWAGA: Dla trawienia większych lub mniejszych ilości przeskalować reakcję proporcjonalnie. Plazmidy dla non-blunt NHEJ, zależnego od resekcji MMEJ, HR z długą matrycą i SSA mogą być również trawione HindIII, co wygeneruje komplementarne końce lepkie.
    2. Inkubować reakcję trawienia w 65 °C przez 20 min, aby termicznie inaktywować I-SceI. W tym kroku ustawić temperaturę 80 °C, jeśli do trawienia użyto HindIII.
    3. Oczyścić DNA z inaktywowanej reakcji trawienia w kroku 1.3.2 za pomocą preferowanej metody (np. metody opartej na kuleczkach lub kolumnie), zgodnie z instrukcją producenta.
    4. Zmierzyć stężenie i czystość DNA (A260/280) za pomocą spektrofotometrii.
  4. Kontrola jakości substratów reporterowych
    1. Przeprowadzić elektroforezę 200 ng substratu reporterowego wraz z markerem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w żelu 0,7% (w/v) agaroza-TAE zawierającym fluorescencyjny barwnik dsDNA przy 120 V przez 2 h lub do momentu wystarczającego rozdzielenia prążków. Jako kontrolę nałożyć oryginalny, nietrawiony plazmid reporterowy.
    2. Zweryfikować, czy dla każdego substratu reporterowego obserwuje się zdefiniowane prążki o prawidłowej wielkości (patrz Tabela 1 oraz Rysunek 2F-J).

Ścieżki naprawy DNA z diagramami elektroforezy żelowej przedstawiającymi procesy MMEJ, NHEJ i HR.
Rysunek 2: Analizy elektroforetyczne w żelu generacji substratu reporterowego DSBR. (A-C) Reprezentatywne obrazy z analizy elektroforetycznej w żelu produktów pośrednich i końcowej konstrukcji wymaganej do generowania substratu reporterowego MMEJ niezależnego od resekcji. Sąsiadujące obrazy w panelach (A) i (C) pochodzą z tych samych żeli; pominięto nieistotne ścieżki. (D,E) Reprezentatywne obrazy z analizy elektroforetycznej w żelu dla plazmidu źródłowego, produktów trawienia enzymem EcoRV oraz wyekstrahowanej z żelu końcowej konstrukcji wymaganej do generowania substratu reporterowego NHEJ dla końców tępych. (F-J) Reprezentatywne obrazy z analizy elektroforetycznej w żelu plazmidów źródłowych i linearyzowanych konstrukcji DSBR dla substratów reporterowych trawionych enzymem I-SceI: MMEJ zależny od resekcji, NHEJ dla końców nietępych, HR z długą matrycą, HR z krótką matrycą, SSA. Skróty: DSBR = naprawa pęknięć dwuniciowych; MMEJ = łączenie końców zapośredniczone przez mikrohomologię; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przejściowa transfekcja substratów reporterowych DSBR

UWAGA: Przegląd schematu doświadczalnego analiz oraz niektóre potencjalne permutacje przedstawiono na Rysunku 3. Poniższy protokół opisuje eksperyment z użyciem komórek HEK-293, w którym przeprowadzono odwrotną transfekcję substratem reporterowym. Poniższe ilości mogą być zwiększone lub zmniejszone w zależności od liczby dołków używanych na płytkę. Następujące kroki są obliczone dla analizy wykonanej na jednej płytce 96-dołkowej; dodatkowe uwagi znajdują się w sekcji Dyskusja.

Schemat procesu transfekcji komórek z edycją genów i detekcją lucyferazy do analizy luminescencji.
Rycina 3: Schemat eksperymentalny dla testów reporterowych DSBR. Komórki docelowe są transfekowane zlinearyzowanym substratem DSBR (kodującym ORF NanoLuc, który wymaga naprawy poprzez specyficzne zdarzenie naprawy DNA) oraz plazmidem Firefly (kontrola transfekcji). Następnie, 6–24 h po transfekcji, luminescencję Firefly i luminescencję NanoLuc można odczytać sekwencyjnie po dodaniu odczynników Nano-Glo Dual-Luciferase. Przykładowe modyfikacje kroków podstawowych (pokazane w jasnoniebieskich polach) mogą być wykorzystane do zbadania, w jaki sposób modulacja genetyczna (knockout, knockdown lub nadekspresja) lub leczenie farmakologiczne wpływa na wydajność szlaku DSBR w komórkach. Skróty: DSBR = double strand break repair (naprawa pęknięć dwuniciowych); NanoLuc = nanolucyferaza; WT = wild type (typ dziki); KO = knockout. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. (Opcjonalnie) W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, nanieść związki rozpuszczone w rozpuszczalniku (np. siarczanie dimetylu [DMSO]) do studzienek płytki 96-dołkowej zgodnie z wcześniej określonym układem doświadczalnym. Ujednolicić stężenie rozpuszczalnika we wszystkich studzienkach.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie powtórzeń technicznych. Należy uwzględnić studzienki kontrolne (np. z samym nośnikiem).
  2. W probówce o pojemności 1,5 ml należy rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly (lucyferaza kontrolna) oraz podłoże reporterowe NanoLuc DSBR (lucyferaza reporterowa) otrzymane w krokach 1.1, 1.2 lub 1.3, w 500 µL buforu do transfekcji. Należy użyć 0.66 µg plazmidu kontrolnego lucyferazy na 1 × 106 komórki. Patrz Tabela 3 dotyczących ilości substratu reporterowego NanoLuc DSBR do wykorzystania.
    UWAGA: Plazmid kontrolny dodatni, konstytutywnie wykazujący ekspresję lucyferazy reporterowej, może zostać użyty do walidacji konfiguracji urządzenia i warunków transfekcji lub do sprawdzenia nieswoistych efektów wpływających na samą lucyferazę reporterową. Jako punkt wyjścia zalecamy 0.1 µg plazmidu reporterowego lucyferazy i 0.66 µg plazmidu kontrolnego lucyferazy na 1 × 106 komórki
  3. Do rozcieńczonego DNA z kroku 2.2 dodać odczynnik do transfekcji opartej na lipidach w proporcji zalecanej przez producenta (np. 1:2, µg Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA):µL odczynnik dla odczynnika opisanego w Tabela materiałów), wymieszać dokładnie, krótko wierteksując, a następnie inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  4. Zebrać komórki poprzez trypsynizację, resuspendować je w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i policzyć.
  5. Przenieś 3 × 106 przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i resuspendować w 8,5 ml pożywki.
  6. Dodaj mieszaninę do transfekcji DNA z kroku 2.3 do zawiesiny komórkowej i wymieszaj kilka razy poprzez odwracanie probówki.
  7. Płytka 80 µL zawiesiny komórkowej (około 2,7 × 104 komórek) na dołek.
    UWAGA: Zawiesinę zawierającą komórki i mieszaninę do transfekcji DNA można nanieść na płytkę za pomocą pipetowania ręcznego lub z wykorzystaniem automatycznego systemu do dozowania cieczy w przypadku eksperymentów o wysokiej przepustowości.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 h.

3. Detekcja luminescencji

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania i dodawania odczynników lucyferazy reporterowej (NanoLuc) i kontrolnej (Firefly), które dostarczają substratów dla obu lucyferaz (odpowiednio Furimazyny i 5´-fluorolucyferyny):
    2. Przygotuj odczynnik lucyferazy kontrolnej. Zrekonstytuuj zgodnie z instrukcjami producenta i mieszaj przez odwracanie do całkowitego rozpuszczenia substratu lucyferazy.
    3. Przygotuj świeży odczynnik lucyferazy reporterowej zgodnie z instrukcjami producenta. Oblicz ilość odczynnika potrzebną do dodania 80 µL/studzienkę i dodaj substrat do odpowiedniej objętości buforu do analizy w stosunku 1:100 (substrat lucyferazy:bufor). Dla jednej płytki 96-dołkowej rozcieńcz 88 µL substratu lucyferazy w 8 800 µL buforu i wymieszaj przez odwracanie.
      UWAGA: Ilości te obejmują około 10% nadmiaru. Po rekonstytucji odczynnik lucyferazy kontrolnej można przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta do późniejszego użycia. Odczynnik lucyferazy reporterowej musi być przygotowywany świeżo przed każdym użyciem.
  2. Sekwencyjne wykrywanie luminescencji z lucyferaz kontrolnej i reporterowej (płytka 96-dołkowa)
    1. Pozostaw płytkę i odczynniki lucyferazy do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    2. Dodaj 80 µL odczynnika lucyferazy kontrolnej na studzienkę.
    3. Wstrząsaj płytką przez 3 min na wstrząsarce orbitalnej przy 450 rpm.
    4. Zmierz sygnał luminescencji lucyferazy kontrolnej za pomocą czytnika płytek do luminescencji.
      UWAGA: Odczytaj emisję przy 580 nm (filtr przepustowy 80 nm) lub całkowitą luminescencję na studzienkę. Luminescencja ta służy jako miara wydajności transfekcji i gęstości komórek, a także może informować o toksyczności komórkowej wywołanej badanymi zabiegami.
    5. Dodaj 80 µL odczynnika lucyferazy reporterowej na studzienkę.
      UWAGA: Odczynnik ten zablokuje lucyferazę kontrolną; zawiera on również substrat dla lucyferazy reporterowej.
    6. Wstrząsaj płytką przez 3 min na wstrząsarce orbitalnej przy 450 rpm.
    7. Pozostaw płytkę na 7 min w temperaturze pokojowej.
    8. Zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej za pomocą czytnika płytek do luminescencji.
      UWAGA: Odczytaj emisję przy 470 nm (filtr przepustowy 80 nm) lub alternatywnie całkowitą luminescencję na studzienkę. Luminescencja ta dostarcza informacji o ilości substratu reporterowego, który został naprawiony przez badaną ścieżkę DSBR.
    9. Wyeksportuj odczyty luminescencji do dalszej analizy.

4. Analiza danych

  1. Sygnał luminescencji lucyferazy raportującej (NanoLuc) podzielić przez sygnał luminescencji lucyferazy kontrolnej (Firefly) pochodzący z tej samej studni, aby obliczyć sygnał testowy. Obliczenie to należy zastosować do wszystkich studni, zgodnie z równaniem (1).
    Wzór na sygnał testowy, stosunek luminescencji Nanoluc do Firefly, wyrażenie matematyczne.     (1)
  2. Obliczyć średnią sygnałów testowych dla studni kontrolnych (np. z samym nośnikiem).
  3. Znormalizować sygnały testowe dla studni badawczych względem średniej ze studni kontrolnych, korzystając z równania (2), aby obliczyć procent naprawy (Repair (%)) dla każdej studni.
    Obliczanie wydajności naprawy, wzór: Repair (%) na studnię = (Sygnał testowy/Średnia kontrolna) × 100, schemat. (2)
  4. (Opcjonalnie, dopasowanie krzywej) W przypadku testowania wielu dawek związku, należy nanieść obliczony procent naprawy (Repair (%)) w funkcji stężenia związku i dopasować krzywą odpowiedź-dawka za pomocą modelu regresji nieliniowej. Krzywą tę należy wykorzystać do późniejszej interpolacji EC50.

Wyniki

Naprawę każdego z testów reporterowych można wykryć i ilościowo określić, stosując tę samą procedurę. Prawidłowa naprawa substratu przez odpowiadający mu szlak naprawczy w komórkach przywróci nienaruszony, funkcjonalny ORF kodujący NanoLuc. Sygnał luminescencyjny ten można wykryć za pomocą czytnika płytek.

Współtransfekcja nienaruszonym plazmidem kodującym lucyferazę świetlikową służy jako kontrola transfekcji. Kontrola ta spełnia dwa cele. Po pierwsze, stanowi standard do normalizacji sygnału NanoLuc, ponieważ nie powinna być ona zaburzana przez modulację DSBR za pomocą środków genetycznych lub farmakologicznych. Po drugie, może ona wskazywać na poza-celowe zaburzenia komórkowe wpływające na sygnał lucyferazy, takie jak modulacja cyklu komórkowego, wpływ na transkrypcję/translację lub ogólna toksyczność.

Stosunek NanoLuc do Firefly służy jako zastępczy odczyt naprawy. Wartości luminescencji można wyeksportować i przeanalizować poprzez normalizację dwóch sygnałów lucyferazy z tej samej studzienki. W przypadku badań nad perturbacjami genetycznymi (np. porównywania typu dzikiego z KO lub siRNA nietargetującym z targetującym), naprawę zazwyczaj normalizuje się względem próbki rodzicielskiej (komórek typu dzikiego lub komórek traktowanych kontrolnym siRNA nietargetującym). W przypadku modulacji farmakologicznej wartości z próbki traktowanej związkiem są normalizowane względem wartości uzyskanej po traktowaniu nośnikiem.

Pełna walidacja opisanego zestawu reporterów została niedawno opublikowana7. Dane obrazujące charakterystykę genetycznej i farmakologicznej modulacji DSBR przedstawiono na Rysunku 4 (zaadaptowano z 7). Polθ jest kluczowym mediatorem MMEJ, a utrata lub inhibicja tego enzymu ma prowadzić do specyficznego zniesienia komórkowego MMEJ3,10. Wykorzystując linię komórkową, w której wyciszono gen POLQ kodujący Polθ11, test reporterowy MMEJ niezależny od resekcji wykazuje, że MMEJ jest rzeczywiście niemal całkowicie zahamowany. Ocena sygnałów luminescencji NanoLuc i Firefly pokazuje, że obserwowany defekt naprawy jest wynikiem zmniejszenia sygnału NanoLuc (kodowanego przez substrat reporterowy), podczas gdy sygnał Firefly (kontrola) pozostaje niezmieniony (Rysunek 4A-C). W przeciwieństwieństwie do tego, ocena wydajności NHEJ z wykorzystaniem reportera NHEJ dla końców tępych wykazuje, że nokaut POLQ nie hamuje naprawy substratu reporterowego (Rysunek 4D-F). Wspólnie te dane genetyczne potwierdzają specyficzną rolę Polθ w naprawie pośredniczonej przez MMEJ. Obserwacje te zostały w pełni powtórzone farmakologicznie przy użyciu ART55812,13, niedawno opisanego, silnego i specyficznego inhibitora domeny polimerazy Polθ (Rysunek 4G), gdzie zaobserwowano miareczkowalną inhibicję MMEJ, wynikającą ze specyficznego spadku sygnału NanoLuc, a nie sygnału Firefly (Rysunek 4H). Co więcej, zgodnie z danymi genetycznymi, nie stwierdzono wpływu na NHEJ (Rysunek 4I,J). Razem dane te podkreślają, w jaki sposób reportery te mogą być wykorzystywane do charakterystyki genetycznej modulacji szlaków DSBR oraz do wykazania komórkowej potencji i specyficzności względem celu/szlaku w przypadku małych cząsteczek.

Wydajność naprawy DNA, wyniki testu luminescencyjnego, NHEJ, MMEJ, komórki POLQ(-), efekt stężenia ART558.
Rysunek 4: Wpływ nokautu genetycznego i farmakologicznego hamowania Polθ na sygnały reporterowe MMEJ i NHEJ. Komórki eHAP1 WT oraz POLQ(-) przetransfekowano kontrolnym plazmidem Firefly oraz (A-C) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (D-F) reporterem NHEJ dla tępych końców. Procent naprawy MMEJ lub NHEJ stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany względem kontroli traktowanej DMSO, 24 h po transfekcji. Dane przedstawiają średnią ± SEM z trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 8 powtórzeń technicznych. Komórki HEK-293 przetransfekowano kontrolnym plazmidem Firefly oraz (G,H) niezależnym od resekcji reporterem MMEJ lub (I,J) reporterem NHEJ dla tępych końców i poddano działaniu inhibitora polimerazy Polθ ART558. Procent naprawy stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany względem kontroli traktowanej DMSO, 24 h po transfekcji. Procent hamowania poszczególnych sygnałów luminescencyjnych w (G) i (I) obliczono względem kontroli traktowanej DMSO i przedstawiono odpowiednio w (H) i (J). Dane przedstawiają średnią ± SEM z 2 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 4 powtórzeń technicznych. Rysunek opracowano na podstawie pracy Rajendra i wsp.7. Skróty: NanoLuc = nanolucyferaza; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; NHEJ = niespecyficzne łączenie końców; WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywa naprawy HR, test luminescencyjny IC50 dla CAM833; wykres porównania danych NanoLuc i Firefly.
Rycina 5: Hamowanie sygnału reportera HR przez inhibitor RAD51 CAM833. (A) Komórki HEK-293 przetransfekowano substratem reporterowym HR z długim matrycem oraz kontrolnym plazmidem lucyferazy Firefly, a następnie poddano działaniu inhibitora RAD51 CAM83314. Luminescencję NanoLuc i Firefly odczytano 16 h po transfekcji. Procent naprawy HR stanowi stosunek luminescencji NanoLuc do luminescencji Firefly, znormalizowany do kontroli traktowanej DMSO. Linie przerywane wskazują procent hamowania HR oraz stężenie CAM833 dla EC50 krzywej. Dane przedstawiają średnią ± SEM z 2 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało średnią z 4 powtórzeń technicznych. (B) Obliczono procentowe hamowanie poszczególnych sygnałów luminescencyjnych z (A) w stosunku do kontroli traktowanej DMSO. Linie przerywane wskazują procentowe hamowanie NanoLuc i Firefly przy stężeniu 3,33 µM CAM833 (EC50). Spadek sygnału Firefly przy stężeniach CAM833 ≥ 10 µM wskazuje na toksyczność związku przy wysokich dawkach; jednak redukcja sygnału NanoLuc jest obserwowana przy stężeniach, w których sygnał Firefly pozostaje niezmieniony, co sugeruje, że CAM833 indukuje celowane hamowanie HR. Rycina została zaadaptowana z Rajendra et al.7. Skróty: NanoLuc = nanolucyferaza; HR = rekombinacja homologiczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Podłoże reporterowePlazmid źródłowy
(rozmiar w kb, oporność)		Generowanie DSBPrzewidywana wielkość końcowego substratu reporterowego (kb)
MMEJ niezależna od resekcji4,0, KanWycięte końce 3' poprzez ligację czapeczek1.6
MMEJ zależny od resekcji6,5, KanI-SceI (nielepkich), HindIII (lepkich)6.5
Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) tępych4.3, KanKońce tępe po wycięciu z plazmidu za pomocą EcoRV1.7
Nienitko-końcowe NHEJ6,7, KanI-SceI (nielepkie), HindIII (lepkie)6.5
Długi szablon HR9,2, KanI-SceI (nielepkie), HindIII (lepkie)9.2
Krótki szablon HR9,3, AmpI-SceI (kohezyjne)9.3
SSA9,5, KanI-SceI (niekohezyjne), HindIII (kohezyjne)9.5

Tabela 1: Plazmidy substratowe reporterowe. Skróty: DSB = pęknięcie dwuniciowe; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici; Kan = kanamycyna; Amp = ampicylina.

Sekwencja (5’-3’)DostawcaOczyszczanieFunkcja
5’[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT
GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC
CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT		Sigmaelektroforeza w żelach poliakrylamidowychKaptur lewy, długi oligonukleotyd
5’[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCSigmaPAGEKaptur lewy, krótki oligonukleotyd
5’[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA
CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG
GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC
GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG		Sigmażel elektroforetyczny (PAGE)Prawy kapturek, długi oligonukleotyd
5’[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA
GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA		SigmaPAGEKapturek prawy, krótki oligonukleotyd

Tabela 2: Oligonukleotydy do końcówek (caps) w celu generowania podłoża reporterowego MMEJ niezależnego od resekcji. Skróty: ssDNA = jednoniciowy DNA; dsDNA = dwuniciowy DNA; MMEJ = łączenie końców zależne od mikrohomologii; PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Mikrohomologie są podkreślone.

Analiza reporterowaDNA substratu reporterowego NanoLuc (µg DNA/1x106 komórki)plazmid kontrolny lucyferazy świetlika (µg DNA/1x106 komórki)
MMEJ niezależny od resekcji0.50.66
MMEJ zależna od resekcji10.66
Niespecyficzne łączenie końców (Blunt NHEJ)0.50.66
Nieliniowe NHEJ (nie-tępe NHEJ)0.50.66
Długi szablon HR10.66
Krótki szablon HR20.66
SSA10.66

Tabela 3: Ilości DNA do przejściowej transfekcji substratów reportera NanoLuc oraz kontrolnego plazmidu lucyferazy Firefly (HEK-293, format płytki 96-dołkowej). Skróty: MMEJ = łączenie końców pośredniczone przez mikrohomologię; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; HR = rekombinacja homologiczna; SSA = wyżarzanie pojedynczej nici.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokoły generowania i wdrażania zestawu reporterów opartych na luminescencji pozachromosomalnej do pomiaru biegłości komórkowej czterech głównych szlaków DSBR (HR, NHEJ, MMEJ i SSA)7. Substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową i wykorzystywane do oceny aktywności DSBR przy użyciu czułego i solidnego odczytu luminescencji NanoLuc na płytce, która jest odtwarzana po zaangażowaniu w pokrewne szlaki komórkowe DSBR.

Kilka etapów generowania substratu reporterowego, transfekcji substratów do komórek i interpretacji danych ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia tych testów. Chociaż do generowania substratów reporterowych stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej, wizualizacja procesu za pomocą elektroforezy żelowej zapewnia najwyższą jakość i czystość substratów przed transfekcją. Ponieważ testy te opierają się na transfekcji przejściowej, zastosowanie mają wspólne względy dotyczące tych metod. Obejmują one optymalizację gęstości wysiewu, warunków transfekcji (w tym odczynników i ilości DNA) oraz ocenę przydatności w formatach transfekcji do przodu i do tyłu. Te testy reporterowe zostały z powodzeniem przeprowadzone przy użyciu szeregu protokołów elektroporacji i lipofekcji, a opcje powinny być w pełni zbadane przed wykonaniem tych testów. Należy również zwrócić uwagę na kontrolę składowych sygnałów NanoLuc i Firefly, a nie tylko kompozytowego sygnału naprawy uzyskanego przez normalizację sygnału NanoLuc (substrat reporterowy) do sygnału Firefly (kontrola). Artefakty mogą wynikać ze współczynnika napędzanego przez zmiany w sygnale Firefly. Na przykład, ocena inhibicji w trybie dawka-odpowiedź przy użyciu wysoce specyficznego związku powinna tłumić sygnał NanoLuc w sposób miareczkowany bez zakłócania sygnału Firefly, który powinien pozostać stabilny (Figura 4G,H). Jednak w przypadkach, gdy sygnały Firefly są zakłócone, użyteczny wpływ na naprawę można nadal określić, identyfikując okno dawki, w którym sygnał Firefly nie jest zakłócony (ryc. 5).

W porównaniu z najczęściej stosowanymi testami reporterowymi DSBR, te pozachromosomalne testy reporterowe oparte na luminescencji mają pewne wyraźne zalety. Ponieważ szlaki DSBR są wysoce konserwatywne, nawet jeśli maszyneria komórkowa różni się w zależności od modelu komórkowego, testy mogą nadal informować o biegłości DSBR i wyborze ścieżki. Otwiera to ocenę DSBR na dowolny model, który może być interesujący dla użytkownika, o ile z góry zostaną ustalone optymalne warunki transfekcji przejściowej.

Zastosowanie nanolucyferazy jako genu reporterowego ma również przewagę nad opcjami fluorescencyjnymi, które były tradycyjnie stosowane w testach reporterowych DSBR. NanoLuc szybko dojrzewa, a luminescencja jest wykrywana z dużą czułością za pomocą czytnika płytek8. W połączeniu z szybkością naprawy substratu (ponieważ substraty reporterowe są transfekowane do komórek z gotowymi do naprawy końcami DSB), ten format testu reporterowego DSBR jest idealny do szybkiej realizacji i odporności ilościowej wymaganej do badań przesiewowych małych cząsteczek w ramach kaskady odkrywania leków przemysłowych. Rzeczywiście, niedawno opisaliśmy implementację niezależnego od resekcji testu reporterowego MMEJ w kaskadzie odkryć wykorzystywanej do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów domeny polimerazy Polθ13.

Istnieje również elastyczność w realizacji testów reporterowych w celu odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące genetycznych i farmakologicznych zaburzeń DSBR (ryc. 3). Na przykład, przed transfekcją substratów reporterowych, komórki mogą być transfekowane siRNA przeciwko genowi będącemu przedmiotem zainteresowania przez 48-72 godziny. Alternatywnie, wpływ nadekspresji genów na szlaki DSBR można przetestować, wykonując transfekcję plazmidu 24-48 godzin przed transfekcją substratów reporterowych. W przypadku badań farmakologicznych niniejszy protokół opisuje już, w jaki sposób wykorzystanie małych cząsteczek może zostać włączone do standardowego przepływu pracy, ale alternatywne formaty mogą obejmować zmiany w schematach leczenia związkami, takie jak wstępna inkubacja lub wymłukiwanie.

Skalowalność transfekcji w stanach nieustalonych może również wspierać podejścia przesiewowe na dużą skalę, w których transfekcja partiowa substratów reporterowych jest przeprowadzana przed badaniem przesiewowym. Co więcej, czas trwania testu od transfekcji do odczytu może być również różny. Chociaż standardowy czas trwania może wynosić 16-24 godziny, niektóre testy można odczytać już w ciągu 6 godzin7. Przy określaniu czasu trwania testu należy również wziąć pod uwagę obawy dotyczące toksyczności małych cząsteczek lub siRNA, które mogą zagrozić żywotności komórek.

Podsumowując, testy przedstawione w tym badaniu i w pełni opisane w niedawnej publikacji7 zapewniają szybką i solidną ocenę biegłości w zakresie komórkowego DSBR. Są bardzo czułe i miareczkowane, dzięki czemu można je poddać badaniom genetycznym i farmakologicznym. Co najważniejsze, ponieważ substraty reporterowe mogą być wprowadzane do komórek przez transfekcję przejściową, mają one potencjał do wykorzystania w dowolnym modelu komórki transfekcyjnej, który jest przedmiotem zainteresowania, a nie ograniczają się do określonych linii komórkowych poprzez stabilną integrację, jak ma to miejsce w przypadku chromosomalnych reporterów DSBR. Jednak wyraźnym ograniczeniem tych reporterowych testów pozachromosomalnych jest to, że brak integracji z genomem może nie w pełni podsumować fizjologiczny, chromatynowy kontekst naprawy DNA i związanych z nim wskazówek regulacyjnych i orkiestracji15. W tym celu pozachromosomalne testy reporterowe stanowią uzupełnienie istniejących metod oceny DSBR i rozszerzają zestaw narzędzi odpowiednich zarówno do badań podstawowych, jak i odkrywania leków.

Oświadczenia

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S. i H.M.R.R. są pracownikami i akcjonariuszami Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. jest akcjonariuszem AstraZeneca PLC. S.J.B. jest założycielem, naukowcem i udziałowcem Artios Pharma Ltd. Złożono wniosek patentowy na niektóre z reporterów przedstawionych w tym badaniu (WO 2021/001647). Promega jest źródłem technologii NanoLuc® i zmodyfikowanych polinukleotydów NanoLuc®. Firma Artios Pharma uzyskała autoryzację firmy Promega do wytwarzania zmodyfikowanych polinukleotydów NanoLuc®.

Podziękowania

Wszystkie prace zostały sfinansowane przez Artios Pharma Ltd. Rysunek 1 i Rysunek 3 zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Bufor TBEThermo FisherAM9863
20% żel akryloamidowy TBEInvitrogenEC6315BOX
50x Bufor TAEFisher ScientificBP13321
6x Gel Loading Dye, fioletowyNEBB7024S
(z przezroczystym dnem i pokrywką)Porvair204012
AgarozaTasak ScientificCSL-AG500
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63881Do oczyszczania DNA
z fosfatazy antarktycznej i bufora 10XNEBM0289L
CLARIOstarBMG Labtech430-101Czytnik płytek
Countess II Automatyczny licznik komórekThermo FisherAMQAX1000Licznik komórek
Niestandardowe oligonukleotydySigma-AldrichZamówienie niestandardoweDo niezależnego od resekcji substratu MMEJ. Patrz tabela 2.
Dozownik związków D300eTecan30100152na bazie DMSO
Kaseta D300e D4+ Tecan30097371Kaseta o dużej objętości do dozownika związków D300e
Kaseta D300e T8+Tecan30097370Kaseta o małej objętości do dozownika związków D300e
Sultlenek dimetylu, klasa hodowli komórkowychSigma-AldrichD2650-100MLNośnik dla związków, używany na rysunku 4 i Ryc. 5
Plazmidy źródłowe reportera DSBRArtiosDostępne dla społeczności akademickiej na żądanie 
EcoRV-HF i 10x bufor CutSmartNEBR3195M
Absolut etanoluVWR20821.365
Surowica bydlęcapłodu PAN-BiotechP30-3031 
GeneRuler Ultra Low Range DNA LadderThermo FisherSM1211Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej
Komórki HEK-293ATCCCRL-1573Przykładowa linia komórkowa używana w protokole
HindIII-HF i 10x bufor CutSmartNEBR3104M
HyClone Biologia molekularna klasa wodyFisher Scientific10275262
SceI i 10x Tango BufferInvitrogenER1771
IsopropanolVWR20842.33
JetPRIME odczynnik i buforPolyPlus114-15Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów
MegaStar 1.6VWR521-1749Wirówka do probówek 15 lub 50 ml
MEM EaglePAN-BiotechP04-08056Pożywka hodowlana do komórek HEK-293
Mikropłytka WytrząsarkaFisherbrand15504070Wytrząsarka orbitalna MicroStar
17RVWR521-1647Wirówka do probówek 1,5 lub 2 ml
MultiDropThermo Fisher5840300Dozownik odczynników na bazie komórek lub wody
MultiDrop Standard KasetaThermo Fisher24072670Kaseta do dozownika odczynników MultiDrop
NanoDLR Stop & Glo Buffer and SubstratePromegaN1630 lub N1650Reporter (NanoLuc) do gaszenia luminescencji Firefly i wykrywania luminescencji NanoLuc. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System
ONE-Glo EX Luciferazy Assay Buffer and SubstratePromegaN1630 lub N1650Control lucyferazy (Firefly) do wykrywania Firefly. Część zestawu Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System
PBS (bez wapnia i magnezu)PAN-BiotechP04-36500
pGL4 Plazmid Firefly (lub podobny)PromegaE1310 (lub równoważny)Plazmid kontrolny Firefly
pNL1.1 Plazmid NanoLuc (lub podobny)PromegaN1091 (lub równoważny)Plazmid kontrolny NanoLuc, do regulacji ustawień sprzętu/eksperymentów optymalizacyjnych
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28706
Quick-Load Purple 1 kb Drabinka DNANEBN0552SDrabinka DNA o wysokiej masie cząsteczkowej
Octan sodu (3 M), pH 5,5Thermo FisherAM9740Do regulacji pH podczas ekstrakcji żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick
SYBR Gold (10 000x)InvitrogenS11494Do wizualizacji ssDNA i dsDNA
SYBR Safe (10,000x)InvitrogenS33102Do wizualizacji dsDNA tylko
Ligaza DNA T4 i 10x bufor ligazyNEBM0202L
Barwienie błękitem trypanowym 0,4%InvitrogenT10282Do pomiaru żywotności podczas liczenia komórek
Roztwór trypsyny-EDTA; 0,25% trypsyna i 0,53 mM EDTASigma-AldrichT4049-100ML
XhoI oraz 10x bufor CutSmartNEBR0146M
96-dołkowa biała płytka na podstawie perełek Odczynnik lucyferazy

Bibliografia

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
  4. Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
  5. van de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832(2021).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
  7. Rajendra, E., et al. titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
  8. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  9. Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
  10. Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
  11. Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
  12. Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).
  13. Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
  14. Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).
  15. Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

p kni cia dwuniciowe DNAaktywno naprawy DNAluminescencyjne testy reporterowewysokoprzepustowe przesiewanierekombinacja homologicznaniehomologiczne czenie ko c wczenie ko c w zale ne od mikrohomologiiwy arzanie pojedynczej nicitransfekcja przej ciowalucyferaza NanoLuc
Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.