Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszą i najbardziej agresywną formą pierwotnego nowotworu złośliwego mózgu, na który nie ma lekarstwa. Bariera krew-mózg jest istotną przeszkodą w dostarczaniu terapii GBM. Opisano tutaj sterowaną obrazem, opartą na tlenku żelaza nano platformę terapeutyczną, zdolną do ominięcia tej fizjologicznej bariery ze względu na rozmiar i akumulacji w regionie guza, dostarczając swój ładunek. Ta nanoplatforma o długości fali 25 nm składa się z usieciowanych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych dekstranem, znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym Cy5.5 i zawierających oligonukleotyd antysensowny jako ładunek. Magnetyczny rdzeń z tlenku żelaza umożliwia śledzenie nanocząstek za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo, podczas gdy barwnik Cy5.5 umożliwia śledzenie za pomocą obrazowania optycznego. Niniejszy raport szczegółowo opisuje monitorowanie akumulacji tej platformy nanocząstek (określanej jako MN-anty-miR10b) w ortotopowo zagnieżdżonych guzach glejaka po wstrzyknięciu dożylnym. Ponadto zapewnia wgląd w dostarczanie oligonukleotydów RNA in vivo, problem, który utrudnia translację terapii RNA do praktyki klinicznej.
Wprowadzenie
Glejak wielopostaciowy (GBM) to gwiaździak o najwyższym stopniu złośliwości, na który praktycznie nie ma lekarstwa. Rocznie u około 15 000 osób diagnozuje się glejaka, którego mediana przeżycia wynosi około 15 miesięcy, a 5-letni wskaźnik przeżycia wynosi 5%1. W ciągu ostatnich dziesięcioleci nastąpiła marginalna poprawa rokowania, pomimo wielu wysiłków zmierzających do rozwoju opcji terapeutycznych. Obecny standard opieki nad GBM obejmuje maksymalną resekcję chirurgiczną, jeśli jest to możliwe, a następnie radioterapię i chemioterapię2. Temozolomid (TMZ), chemioterapia z wyboru, była najnowszą terapią glejaka, która wykazała znaczną skuteczność kliniczną; jednak co najmniej 50% guzów GBM wykazuje oporność na TMZ3. Pomimo tego rygorystycznego schematu terapeutycznego, nadal istnieje znacząca kliniczna potrzeba poprawy terapii glejaka.
Rozwój terapii GBM i innych chorób związanych z mózgiem jest znacznie utrudniony przez selektywną naturę bariery krew-mózg (BBB). Bariera krew-mózg to fizjologiczna bariera składająca się z komórek śródbłonka, perycytów i końców stóp astrocytów, która tworzy półprzepuszczalną błonę między układem krążenia a mózgiem, ograniczając swobodny przepływ cząsteczek i komórek do mózgu4. Chociaż chroni w normalnej fizjologii i ma kluczowe znaczenie dla homeostazy mózgu, bariera krew-mózg zapobiega wielu terapiom przed dotarciem do mózgu, komplikując leczenie GBM. Wysiłki mające na celu usprawnienie dostarczania środków terapeutycznych do GBM doprowadziły do opracowania pojazdów dostarczających opartych na nanocząsteczkach, ukierunkowanego ulepszenia dostarczania leków za pośrednictwem ultradźwięków oraz dostarczania leków za pośrednictwem receptorów5,6.
Nanocząsteczki okazały się obiecującym medium do opracowywania terapii dla niezliczonych chorób, w tym nowotworów. Podjęto próbę zastosowania nanocząstek do celów obrazowania i terapeutycznych w GBM przy użyciu różnych konstruktów nanocząstek7,8. Koncentrując się na dostarczaniu leków do GBM w połączeniu z obrazowaniem in vivo dostawy, proponowane podejście wykorzystuje nanocząstki magnetyczne (MN) składające się z rdzenia z tlenku żelaza i pokryte dekstranem w celu zapewnienia stabilności. Właściwości magnetyczne tych nanocząstek pozwalają na ich wykrycie za pomocą rezonansu magnetycznego (MR), podczas gdy prosta chemia koniugacji z aminowaną powłoką dekstranu pozwala na koniugację terapeutycznych ugrupowań, takich jak cząsteczki RNA, dodatkowe ugrupowania celujące lub ugrupowania obrazowania (takie jak barwnik optyczny bliskiej podczerwieni Cy5.5)9,10. Oprócz możliwości obrazowania, nanoplatforma jest w stanie wydłużyć okres półtrwania terapii RNA poprzez ochronę oligonukleotydu przed endogennymi nukleazami, poprawiając dostarczanie terapeutyczne. W artykule przedstawiono zastosowanie tej nanoplatformy do dostarczania in vivo terapeutycznych oligonukleotydów (określanych jako MN-anty-miR10b) do GBM, monitorowanych za pomocą obrazowania in vivo. Wcześniej zdolność tej nanoplatformy do akumulacji została zademonstrowana w komórkach GBM in vitro, powodując znaczną utratę żywotności komórek nowotworowych11. Przed przeprowadzeniem terapeutycznych badań in vivo konieczne jest zademonstrowanie in vivo dostarczania tej nanoplatformy do guzów GBM na modelach zwierzęcych. Aby to osiągnąć, stworzono ortotopowe modele zwierzęce GBM, a następnie przeprowadzono dożylne podanie konstruktu, a następnie obrazowanie in vivo. Poniżej przedstawiono protokoły tych badań wykazujące akumulację w regionie nowotworu potwierdzoną obrazowaniem in vivo i mikroskopią ex vivo.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Michigan (IACUC). Samice niekrewniaczych nagich myszy atymicznych zakupiono w Jackson Labs (szczep #007850) w wieku 7 tygodni i pozwolono im zaaklimatyzować się przez 1 tydzień przed zabiegiem implantacji. Myszy ważyły około 21-25 g w momencie implantacji. Komórki U251 eksprymujące lucyferazy świetlika zostały wygenerowane i dostarczone przez dr Anę deCarvalho12.
1. Hodowla komórkowa i przygotowanie do implantacji
- Hodowla znakowanych lucyferazy, ludzkich komórek glejaka, U251 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) zawierającej D-glukozę, L-glutaminę i pirogronian sodu i uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, trypsynizuj 0,25% trypsyny/EDTA przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C. Użyj 2-4 ml dla kolby T-75 lub 4-6 ml dla kolby T-175.
- Po odłączeniu komórek od kolby, wygasić reakcję w stosunku 2:1 uzupełnionego DMEM i delikatnie wymieszać przez pipetowanie w celu dysocjacji komórek do zawiesiny jednokomórkowej. Przenieść komórki do stożkowej probówki i granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
- Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Policz komórki za pomocą hemocytometru, używając barwienia błękitem trypanowym, aby wykluczyć martwe komórki i obliczyć całkowitą liczbę żywych komórek. Ponownie zagnieźdź komórki, jak opisano powyżej.
- Zawiesić osad komórkowy do stężenia 1 x 108 komórek/ml w PBS i przechowywać zawiesinę komórek na lodzie w celu implantacji wewnątrzczaszkowej.
2. Bezpośrednia ortotopowa implantacja guza
UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Irtenkauf et al. (procedura dr Any deCarvalho; Henry Ford Health Hermelin Centrum Nowotworów Mózgu)12. Wszystkie kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić bezpieczeństwo zarówno uczestnikom, jak i badaczom. Metoda implantacji z wolnej ręki pozwala na szybszy zabieg w celu uzyskania większych rozmiarów próbek przy zachowaniu jakości implantacji wewnątrzczaszkowej. Alternatywnie, urządzenie stereotaktyczne może być użyte do wszczepienia guza w tych samych współrzędnych, które opisano poniżej.
- Zważyć nagą, atymiczną mysz i podać znieczulający roztwór ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg/10mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki 28G. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Potwierdź znieczulenie, sprawdzając odruch pedału.
- Nałożyć maść okulistyczną do oczu, podać ketoprofen (5 mg/kg) podskórnie za pomocą strzykawki 28G i zadać identyfikacyjne uderzenia w ucho.
- Wysterylizuj miejsce operowane na czubku głowy 70% etanolem, a następnie wykonaj peeling betadynowy i powtórz 3 razy. Następnie wykonaj nacięcie o długości 5-7 mm małymi nożyczkami chirurgicznymi po prawej stronie linii środkowej głowy i cofnij skórę drobnymi kleszczami, aby odsłonić czaszkę i linie szwów czaszki.
- Wyszoruj czaszkę bawełnianym wacikiem, aby usunąć okostną, umożliwiając dostęp do kości. Zastosuj roztwór 3% nadtlenku wodoru za pomocą nowego bawełnianego wacika, aby wysuszyć kość. Za pomocą nowego bawełnianego wacika zetrzyj nadmiar nadtlenku wodoru i pianę, która może się utworzyć. Powtarzaj ten krok 3 razy, aż bregma będzie widoczna na czaszce, a kość będzie wystarczająco sucha do wiercenia. Wystarczająco sucha czaszka będzie miała wyraźnie wybielone linie szwów i zmniejszone zaczerwienienie od pierwszego wyglądu.
- W odniesieniu do bregmy zmierz linijką -2,5 mm przyśrodkowej/bocznej i -1 mm przedniej/tylnej i zaznacz miejsce wiercenia markerem. Zmierz ponownie przed wierceniem, aby upewnić się, że znak jest we właściwej pozycji.
- Weź elektryczną wiertarkę do mikrochirurgii (11 000 obr./min) z zadziorem 0,5 mm i ostrożnie wykonaj otwór w czaszce w miejscu wcześniej zaznaczonym. Wchłoń krew lub płyn, który może gromadzić się w miejscu wiercenia, za pomocą świeżego bawełnianego wacika.
- Przygotować strzykawkę o pojemności 33 g w mikrolitrach wyposażoną w tulejkę na igłę o długości 3 mm. Pobrać 5 μl wcześniej przygotowanej zawiesiny 1 x 108 komórek/ml komórek po krótkim ponownym zawieszeniu pipetą i upewnić się, że w roztworze do wstrzykiwań nie ma pęcherzyków powietrza. Ostrożnie zetrzeć nadmiar zawiesiny komórkowej pozostałej na zewnętrznej stronie igły i tulei igły chusteczką 10% izopropanolu.
- Włożyć igłę pionowo w miejsce wiercenia, aż tuleja igły przestanie dalej wkładać igłę. Ostrożnie cofnąć igłę na około 0,5 mm, aby zrobić miejsce na gromadzenie się wstrzykiwanych komórek.
- Zawiesinę komórkową należy wstrzykiwać powoli przez 1 minutę. Po wstrzyknięciu całej objętości należy przytrzymać igłę na głębokości przez dodatkową minutę, aby zmniejszyć wypływ roztworu do wstrzykiwań. Następnie ostrożnie wycofać igłę.
- Czystym bawełnianym wacikiem zetrzyj płyn, który gromadzi się w miejscu wstrzyknięcia, a następnie nałóż wosk kostny, aby uszczelnić otwór.
- Zamknij nacięcie wiązaniem weterynaryjnym i pozwól mu wyschnąć. Za pomocą czystego bawełnianego wacika nałóż miejscowo lidokainę jako środek przeciwbólowy.
- Monitoruj mysz do momentu całkowitego wyzdrowienia i chodzenia. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie przez 2 dni po implantacji w celu leczenia bólu.
3. Synteza platformy nanocząstek
- Zsyntetyzuj i sprzęgnij nanocząstki z Cy5.5 i oligonukleotydem (anty-miR10b), jak opisano wcześniej11.
4. Administracja MN-anty-miR10b
UWAGA: W tym badaniu, zastrzyki były wykonywane raz w tygodniu przez 6 tygodni, począwszy od 7 dni po implantacji, ale ten sam protokół może być stosowany dla różnych częstotliwości iniekcji.
- Zważ mysz i oblicz objętość MN-anty-miR10b, którą należy podać myszy. Dawki MN-anty-miR10b podaje się w dawce 20 mg Fe/kg w mysich modelach GBM. Na przykład mysz o wadze 20 g otrzymuje dawkę 80 μl 5 mg Fe/ml MN-anty-miR10b. Myszy kontrolne otrzymują równą objętość PBS zgodną z tym schematem dawkowania.
- Przygotować strzykawkę 28G z dawką MN-anti-miR10b i upewnić się, że w roztworze do wstrzykiwań nie ma pęcherzyków powietrza.
- Znieczulij mysz poniżej 2%-4% izofluranu do indukcji i 1,5%-2% do konserwacji z natężeniem przepływu 1,5 l/min w pudełku indukcyjnym. Przesuń mysz do stożka nosowego i kontynuuj podawanie znieczulenia. Sprawdź głębokość znieczulenia i nałóż maść weterynaryjną.
- Wysterylizuj ogon chusteczką z 70% izopropanolem i pozostaw nadmiar alkoholu do wyschnięcia.
- Obróć ogon, aby ustawić boczne żyły ogonowe na szczycie ogona. Następnie, kierując się w stronę żyły, wbij igłę w ogon i wytwórz podciśnienie, odciągając tłok.
- Wprowadzić igłę, aż krew dostanie się do strzykawki, co oznacza pomyślne wejście do żyły.
- Powoli wstrzyknąć MN-anty-miR10b i wycofać igłę po całkowitym podaniu. Uciskać miejsce wstrzyknięcia gazą, aż do ustania krwawienia.
- Zdejmij mysz ze stożka nosowego. Monitoruj mysz do czasu całkowitego wyzdrowienia i chodzenia.
UWAGA: Podanie nanocząstek w bolusie może spowodować niewydolność oddechową. Uważnie monitoruj mysz i natychmiast stosuj lekkie uciskanie klatki piersiowej, jeśli występują oznaki niewydolności oddechowej.
5. Bioluminescencja in vivo i obrazowanie fluorescencyjne
UWAGA: Obrazowanie bioluminescencyjne i fluorescencyjne in vivo przeprowadza się w systemie obrazowania in vivo (IVIS) przed i 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstki.
- Przygotować sterylnie przefiltrowaną D-lucyferynę w stężeniu 30 mg/ml w PBS bezMg2+ iCa2+.
- Otwórz oprogramowanie operacyjne IVIS i rozpocznij inicjalizację, aby przygotować maszynę. Podczas inicjalizacji systemu wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy, wybierając opcję Pobieranie > opcję Automatyczne zapisywanie w, a następnie zdefiniuj folder, w którym mają zostać zapisane pliki.
- W punktach czasowych obrazowania zważ mysz i oblicz objętość D-lucyferyny do podania w dawce 150 mg / kg. Przygotować strzykawkę 28G z objętością, chroniąc roztwór przed bezpośrednim światłem. Badanie to obejmowało obrazowanie 2 dni po operacji implantacji w celu potwierdzenia wysiewu oraz cotygodniowe obrazowanie rozpoczęte w 7 dniu po implantacji, bezpośrednio przed cotygodniowymi zabiegami.
- Znieczulij mysz poniżej 2%-4% izofluranu do indukcji i 1,5%-2% do konserwacji z natężeniem przepływu 1,5 l/min w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu delikatnie potrząśnij myszą, aby uniknąć dalszego uszkodzenia pola operacyjnego i wstrzyknij dawkę D-lucyferyny dootrzewnowo. Pozwól myszy dojść do siebie i odczekaj 10 minut przed obrazowaniem, aby sygnał bioluminescencji mógł się rozwinąć i ustabilizować.
- Podczas rozwoju sygnału bioluminescencji przygotuj skaner IVIS do obrazowania bioluminescencyjnego. Umieść czarną matę o niskiej fluorescencji na stoliku do obrazowania i skonfiguruj matrycę stożka nosowego dla liczby obiektów, które mają być obrazowane.
- W oprogramowaniu kliknij opcję Imaging Wizard (Kreator obrazowania). Wybierz opcję Obrazowanie bioluminescencyjne, a następnie wybierz opcję Otwórz filtr. Na następnym ekranie wybierz opcję Obrazowanie obiektu i pola widzenia. IVIS jest teraz ustawiony na obrazowanie bioluminescencyjne.
- Na 3 minuty przed obrazowaniem należy rozpocząć zalewanie skrzynki indukcyjnej, pozwalając, aby mieszanina izofluranu i tlenu wypełniła pudełko. Na 2 minuty przed obrazowaniem umieść myszy w pudełku indukcyjnym w celu znieczulenia.
- Po znieczuleniu przenieś myszy z pudełka indukcyjnego do IVIS w celu obrazowania i połóż każdą w pozycji leżącej. Zapewnij znieczulenie podtrzymujące przy użyciu 2% izofluranu podczas obrazowania.
- Po umieszczeniu myszy w skanerze IVIS kliknij przycisk Pobierz sekwencję. Zrób zdjęcie przy użyciu ustawień automatycznej ekspozycji z minimalnym progiem sygnału wynoszącym 3 000 zliczeń. Obrazowanie bioluminescencyjne wizualizuje lokalizację komórek glejaka U251 znakowanych lucyferazą. Automatyczna ekspozycja spowoduje zarejestrowanie obrazu o długości ekspozycji obliczonej na podstawie najjaśniejszego sygnału w polu widzenia, do zdefiniowanej przez użytkownika maksymalnej długości 5 min.
UWAGA: Typowa klatka myszy wymaga pojedynczego obrazu, ponieważ wysiew jest na ogół jednolity. W przypadku jednej lub więcej jasnych myszy myszy można usunąć, a powtórne przejęcie można wykonać, aby lepiej uchwycić sygnały od ciemnych myszy. - Po obrazowaniu bioluminescencyjnym zmień ustawienia IVIS, aby przygotować obrazowanie epi-fluorescencyjne i wykonać skany fluorescencyjne.
- W Kreatorze obrazowania wybierz opcję Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination (Fluorescencja) filtered pair with epi-illumination. Na następnym ekranie wybierz sondy, które mają być obrazowane, takie jak Cy5.5. Wybierz obiekt obrazowania i pole view. Skaner IVIS jest teraz ustawiony na obrazowanie fluorescencyjne sond wybranych na poprzednim ekranie.
- Zrób zdjęcie przy użyciu ustawień automatycznej ekspozycji z minimalnym progiem sygnału wynoszącym 6 000 zliczeń. Obrazowanie fluorescencyjne Cy5.5 wizualizuje lokalizację MN-anty-miR10b. Automatyczna ekspozycja spowoduje zarejestrowanie obrazu o długości ekspozycji obliczonej na podstawie najjaśniejszego sygnału w polu widzenia, do zdefiniowanej przez użytkownika maksymalnej długości 5 min.
UWAGA: Obrazowanie fluorescencyjne rzadko trwa dłużej niż 1 minutę, nawet u myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto PBS. Pojedynczy obraz jest zawsze wystarczający, ponieważ odchylenie sygnału między leczonymi myszami jest niewielkie. - Usuń mysz z IVIS po obrazowaniu. Monitoruj do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia i ambulatoryjnego.
6. Rezonans magnetyczny in vivo
UWAGA: Obrazowanie MR jest wykonywane przed i 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstek i może być wykonane u tych samych zwierząt, które są poddawane obrazowaniu optycznemu i bioluminescencyjnemu.
- Znieczulij badaną mysz w pudełku indukcyjnym pod ciśnieniem 2%-4% izofluranu do indukcji i 1,5%-2% do konserwacji przy natężeniu przepływu 1,5 l/min. Po znieczuleniu umieść mysz leżącą na łóżku MRI na balonie do monitorowania oddechu. Dopasuj stożek nosowy ściśle do pyska, aby dostarczyć znieczulenie podczas obrazowania i nałóż maść okulistyczną do oczu.
- Unieruchom i ustaw głowę do skanowania za pomocą paska do gryzienia i nauszników.
- Zainstaluj nasmarowaną sondę temperatury doodbytniczej i upewnij się, że działa monitorowanie oddychania i temperatury. Umieść cewkę mózgu myszy nad głową, dopasowując kołki na łożu myszy do otworów w cewce i przyklej cewkę taśmą na miejscu, aby zmniejszyć ruch podczas skanowania.
- Umieść małą podkładkę do cyrkulacji ciepłej wody na górze myszy, aby utrzymać temperaturę ciała podczas znieczulenia. Uważaj, aby zachować pewną odległość między cewką a kocem grzewczym, aby ograniczyć zniekształcenia obrazu spowodowane zakłóceniami wody.
- Przesuń mysz i stół obrazowania w odpowiednie miejsce do skanowania.
- Dostrój i dopasuj cewki MRI, rozpoczynając krok konfiguracji Wobble w oprogramowaniu do akwizycji. Po zakończeniu serwisowym rezonansu magnetycznego użyj pokręteł strojenia i zapałki na cewce, aby upewnić się, że ścieżka jest wyśrodkowana (strojenie) i tak głęboko, jak to możliwe (dopasowanie).
- Uzyskaj skan lokalizatora w trzech płaszczyznach i dostosuj łóżko obrazowania, aby ustawić mózg w izocentrum magnesu, jeśli to konieczne.
- Uzyskaj skany ważone 2D T2 w celu wykrycia wstrzykniętego czynnika w guzie o następujących parametrach: czas powtarzania (TR) = 2500 ms, czas echa (TE) = 25 ms, pole widzenia (FOV) 20 x 20 mm, 18 plastrów koronalnych, odstęp warstwy 0,2 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie 150 x 150 μm, grubość warstwy 0,5 mm.
- Uzyskaj mapę B0 całego mózgu, aby obliczyć zlokalizowaną podkładkę za pomocą narzędzia Mapshim. Następnie użyj obrazów ważonych 3D T2 do wizualizacji nanocząstek o TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, rozdzielczości izotropowej 100 μm.
- Pozyskanie mapy T2* w celu dalszego obrazowania nanocząstek przy użyciu obrazu ważonego 2D T2 jako odniesienia do skanowania położenia nad guzem. Użyj TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 plastrów koronalnych, bez przerwy między warstwami. Rozdzielczość w płaszczyźnie 100 μm w płaszczyźnie. Uzyskuj 10 obrazów z dodatnim echem w odstępie 5 ms.
- Monitoruj oddech i temperaturę ciała podczas sekwencji obrazowania i w razie potrzeby dostosuj temperaturę izofluranu i wody.
- Po zobrazowaniu wyjmij mysz ze skanera MRI i umieść ją w podgrzewanej klatce do odzyskiwania. Monitoruj mysz, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia i ambulatoryjnego.
7. Bioluminescencja ex vivo i obrazowanie fluorescencyjne
- Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne i fluorescencyjne ex vivo w IVIS, podobnie jak w przypadku obrazowania in vivo. Wykonaj kroki inicjalizacji i ustawień skanowania IVIS zgodnie z powyższym opisem.
- W eksperymentalnym punkcie końcowym zważyć mysz i obliczyć objętość D-lucyferyny do podania w dawce 150 mg/kg. Wstrzyknąć dawkę D-lucyferyny i przeprowadzić obrazowanie na żywo 10 minut po wstrzyknięciu, jak opisano wcześniej.
- Po końcowym obrazowaniu bioluminescencyjnym i fluorescencyjnym in vivo, szybko poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, gdy jest jeszcze pod narkozą, przeprowadź sekcję myszy i zbierz główne narządy, w tym mózg, na szalce Petriego.
- Umieść szalkę Petriego z wyciętymi narządami w skanerze IVIS i zobrazuj narządy zarówno za pomocą modalności bioluminescencyjnej, jak i fluorescencji, używając tych samych ustawień akwizycji, co w przypadku obrazowania in vivo.
- Błyskawiczne zamrożenie wszelkich narządów niezbędnych do dalszej analizy w OCT poprzez powolne opuszczanie kriomoldu z próbką w OCT do płytkiego basenu ciekłego azotu za pomocą długich kleszczy, aż OCT zmieni kolor na całkowicie biały. Nie pozwól, aby ciekły azot dotykał ciekłego OCT lub zbyt szybko obniżał pleśń, ponieważ nastąpi bulgotanie OCT. Zamrożone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przechowuj mózg zawierający guz w OCT i błyskawicznym zamrożeniu w celu kriosekcji. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne do analizy.
8. Mikroskopia fluorescencyjna
- Przygotuj kriostat do kriosekcji. Ustawić temperaturę komory i głowicy próbki w zakresie od -15 °C do -20 °C.
- Wyjmij zamrożony mózg w OCT z magazynu w temperaturze -80 °C i umieść go w komorze kriostatu. Pozostawić próbki do ogrzania do temperatury komory (-20 °C) przed przystąpieniem do sekcji.
- Za pomocą jednosiecznej maszynki do golenia przecięto mózg w miejscu wstrzyknięcia. Jest to zwykle widoczne jako wgłębienie na powierzchni mózgu. Zamontuj próbkę na krążku próbki za pomocą niewielkiej ilości OCT, aby ustawić przeciętą stronę mózgu, która ma być podzielona na sekcje. Zastosuj wystarczający nacisk za pomocą schłodzonego ciężarka wewnątrz komory, aby zapewnić stabilne zamocowanie próbki.
- Przesunąć zamontowaną próbkę i krążek próbki na głowicę próbki w celu przygotowania do podziału. Przyciąć tkankę do żądanej głębokości, wykonując skrawki o grubości 20 μm, dostosowując kąt próbki tak, aby przeciąć tkankę jak najbliżej poziomu tkanki.
- Po osiągnięciu żądanej głębokości tkanki wyreguluj kriostat tak, aby pobierał 5 - 7 μm odcinków próbki. Zamontuj skrawki na szklanych szkiełkach wstępnie oznaczonych deskryptorami, takimi jak identyfikator myszy, przekrój tkanki i numer szkiełka, szybko opuszczając naładowaną stronę szkiełka mikroskopowego na sekcję.
- Wytwarzaj świeży 4% paraformaldehyd (PFA). Zanurz szkiełko z tkanką w roztworze PFA na 15 minut, aby utrwalić tkankę. Po utrwaleniu przepłukać szkiełko preparatem DPBS 3x.
- Do teraz utrwalonego przekroju tkanki na szkiełku podstawowym dodać 40 μl kropli podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), który barwi jądra komórkowe. Ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na podłożu montażowym i upewnij się, że cała chusteczka została zamknięta w podłożu montażowym.
- Wizualizacja tkanki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej DAPI (em) przy 359 nm, wzbudzenie (ex) przy 457 nm) i Cy5,5 (ex 683 nm, em 703 nm).
Wyniki
Zsyntetyzowano i scharakteryzowano MN-anti-miR10b zgodnie z wcześniejszym opisem11Transmisyjna mikroskopia elektronowa MN-anti-miR10b obrazuje morfologię i polidyspersyjność nanoplatformy (Rycina 1B)Ta nanoplatforma ma średnią wielkość 25,12 ± 0,34 nm oraz potencjał zeta wynoszący 13,18 ± 1,47 mV. (Rysunek 1C,D)W badaniach tych myszy nude athymic poddano ortotopowej implantacji ludzkich komórek glejaka U251 zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Systemowe wstrzyknięcia dożylne MN-anti-miR10b wykonano w dawce 20 mg Fe/kg. Myszy uśmiercono, a tkanki pobrano 7 dni po podaniu ostatniej dawki nanoleku. Sygnały fluorescencji Cy5.5 oraz bioluminescencji u myszy, którym wstrzyknięto MN-anti-miR10b, wykazały wyraźną kolokalizację. (Rycina 2A,B), co wskazuje na dostarczenie nanocząsteczek do guza, podczas gdy u myszy kontrolnych nie zaobserwowano sygnału fluorescencji. Ex vivo obrazowanie fluorescencyjne wykazało lokalizację nanocząsteczek w głównych narządach wydalniczych, takich jak wątroba i nerki, co jest oczekiwane w przypadku tego typu nanocząsteczek (Rycina 2C)W oddzielnym badaniu myszom ortotopowo zaimplantowano komórki GBM, jak opisano powyżej, a następnie poddano je in vivo Obrazowanie MR. T2* obrazy ważone a T2* mapy uzyskano przed podaniem nanocząsteczek oraz 24 h po jednorazowej dawce 20 mg Fe/kg. Charakterystyczny spadek T2 sygnał MRI z odpowiednim ważeniem wykazuje potencjał MN-anti-miR10b jako środka kontrastowego w MRI do pokonywania bariery krew-mózg oraz jego akumulację w obszarze guza (Rycina 3)Następnie in vivo obrazowanie, w celu dalszej weryfikacji dostarczenia nanocząsteczek do guza przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną. Zgodnie z powyższym opisem, tkanki pocięto i przygotowano do mikroskopii z barwieniem DAPI. W obszarze guza zaobserwowano sygnał fluorescencji Cy5.5, co potwierdziło dostarczenie nanocząsteczek. (Rycina 4).
Rycina 1. Charakterystyka MN-anti-miR10b. (A) Schematyczna struktura MN-anti-miR10b. Nanoplatforma składa się z rdzenia z tlenku żelaza pokrytego dekstranem, znakowanego barwnikiem optycznym Cy5.5 i sprzężonego z terapeutycznym oligonukleotydem (anti-miR10b). Utworzone za pomocą BioRender.com. (B) Transmisyjna mikroskopia elektronowa MN-anti-miR10b. (C) Rozmiar hydrodynamiczny kompleksu wynosi 25.12 ± 0.34 nm. (D) Potencjał zeta MN-anti-miR10b wynosi 13.18 ± 1.47 mV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2. In vivo i ex vivo badania w modelu GBM. (A) In vivo obrazowanie bioluminescencyjne (po lewej) oraz obrazowanie fluorescencyjne (po prawej) wykazują ko-lokalizację sygnału nanocząstek magnetycznych w obszarze guza. (B) Ex vivo obrazowanie bioluminescencyjne i fluorescencyjne wyciętych mózgów potwierdza ko-lokalizację sygnału. (C) Biodystrybucja w narządach wykazuje akumulację w głównych narządach eliminacji. B: mózg; H: serce; Lu: płuca; Li: wątroba; S: śledziona; K: nerki; M: mięśnie; (n=6 dla wszystkich grup). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. In vivo MRI w modelu GBM. Obrazy ważone T2* (górny rząd) i mapy T2* (dolny rząd) uzyskane przed (lewo) i 24 h po wstrzyknięciu (prawo) MN-anti-miR10b. Spadek intensywności sygnału na obrazie po wstrzyknięciu wskazuje na akumulację tlenku żelaza (n=3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Ex vivo mikroskopia fluorescencyjna tkanek nowotworowych. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe pokazują akumulację nanocząsteczek. Niebieski - DAPI, purpurowy - Cy5.5. Pasek skali = 100 µm; (n=6 dla wszystkich grup). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Decydujące znaczenie dla powodzenia protokołu może mieć kilka kluczowych etapów w różnych metodach walidacji akumulacji nanocząstek w barierze krew-mózg. Począwszy od ortotopowej implantacji komórek GBM, ważne jest, aby linie szwów czaszki były widoczne po wysuszeniu kości; Pomaga to w dokładnym rozmieszczeniu komórek nowotworowych. Do wiercenia w czaszce najlepiej jest lekko docisnąć miejsce wiercenia i rozpocząć wiercenie, aby uzyskać płytki odcisk w kości. Po wykonaniu początkowego znaku i umieszczeniu go we właściwym miejscu łatwiej jest wiercić przy minimalnym poślizgu wiertła. Po przebiciu czaszki należy natychmiast przerwać wiercenie, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu. Podczas dożylnego wstrzykiwania nanocząstek i innych środków bardzo ważne jest, aby upewnić się, że w roztworze do wstrzykiwań nie ma pęcherzyków powietrza, aby uniknąć potencjalnie śmiertelnych zatorów powietrza żylnego. Niektóre wskaźniki pomyślnego wejścia do żyły ogonowej zgodnie z tym protokołem to krew pobierana do strzykawki i utrata koloru w żyle ogonowej wokół końcówki igły. W przypadku obrazowania bioluminescencji i fluorescencji ex vivo wyciętych tkanek najlepiej jest pracować szybko, ponieważ sygnał bioluminescencji zaczyna z czasem zanikać. Kinetyka sygnału bioluminescencji może się różnić w zależności od linii komórkowych, dlatego ważne jest, aby zrozumieć konkretne modele.
Niektóre kroki można zmodyfikować, aby pomóc w wykrywaniu lokalizacji nanocząstek. Podczas obrazowania bioluminescencyjnego in vivo zmiany w implantacji komórek nowotworowych i tempie wzrostu guza mogą prowadzić do różnic w sygnale bioluminescencji. W pewnych okolicznościach mysz z najwyższym sygnałem BLI może skrócić czas ekspozycji skanowania, co prowadzi do osłabienia sygnału wykrywanego u innych myszy. W takim przypadku zaleca się kontynuowanie skanowania fluorescencyjnego, aby myszy pozostały w tej samej pozycji do celów kolokalizacji BLI i FLI. Następnie odtwórz obraz pod kątem bioluminescencji po usunięciu myszy, które wykazały sygnał w początkowym skanie BLI. Spowoduje to, że obliczenia czasu ekspozycji będą oparte na tych myszach o niższym sygnale i ostatecznie wykryją guz. Podczas wykonywania obrazów fluorescencyjnych in vivo , lokalizacja nanocząstek w ciele może być lepiej ustalona, pokrywając ogon czarnym papierem, który może mieć wysoki sygnał fluorescencyjny wynikający z obecności resztkowych nanocząstek z iniekcji żyły ogonowej. Idąc podobnym tokiem rozumowania, podczas skanowania fluorescencyjnego ex vivo narządów, obrazowanie samego mózgu może lepiej pokazać lokalizację nanocząsteczki w mózgu i regionie guza, ponieważ nagromadzenie nanocząstki w narządach układu siateczkowo-śródbłonkowego może utrudniać wykrywanie sygnału.
Ograniczeniem tej metody terapeutycznego dostarczania RNA jest ogólnoustrojowa dystrybucja nanocząstek w organizmie. Podobnie jak w przypadku wszystkich innych wstrzyknięć ogólnoustrojowych, środek terapeutyczny jest usuwany z krwiobiegu przez narządy takie jak wątroba, nerki i śledziona, co ostatecznie skutkuje zmniejszonym dostarczaniem nanocząsteczki do obszaru zainteresowania. Aby rozwiązać ten problem, MN-anty-miR10b został zsyntetyzowany z powłoką z usieciowanego dekstranu w celu wydłużenia czasu krążenia w organizmie13. Pomimo wysiłków zmierzających do wydłużenia czasu krążenia i akumulacji poprzez optymalizację struktury nanocząstek, w zależności od konkretnego modelu i stanu choroby może być konieczne wielokrotne wstrzyknięcie nanocząstki w celu znacznej akumulacji w regionie guza.
Dostarczanie cząsteczek terapeutycznych do GBM stanowi poważne wyzwanie ze względu na wysoce selektywną barierę krew-mózg. W wielu badaniach przetestowano pojazdy transportowe oparte na nanocząsteczkach, które ostatecznie są nieskuteczne w penetracji BBB ze względu na swój rozmiar i ładunek 5,6,7. Opisany tutaj konstrukt nanocząstek o długości 25 nm, MN-anty-miR10b, jest w stanie przejść przez tę barierę fizjologiczną i gromadzić się w obszarze guza po wstrzyknięciu systemowym. Ta platforma nanocząstek ma potencjał, aby pośredniczyć w dostarczaniu cząsteczek RNA do GBM i umożliwia monitorowanie akumulacji nośnika za pomocą obrazowania. Biodystrybucja nanocząstek tlenku żelaza przebiega zgodnie z oczekiwanym wzorcem, w którym gromadzą się one w narządach układu siateczkowo-śródbłonkowego w celu ich usunięcia. Podobną biodystrybucję odnotowano w przypadku analogicznych nanocząstek stosowanych do celów obrazowych lub terapeutycznych. Co ważne, w tych poprzednich badaniach nie stwierdzono żadnych oznak powiązanej toksyczności poza celem w głównych narządach, nawet przy dawce 30 mg Fe/kg14,15.
Zaletą tego systemu platformy nanocząstek są możliwości obrazowania in vivo , które pozwalają na nieinwazyjne śledzenie ich akumulacji. Barwnik fluorescencyjny Cy5,5 w bliskiej podczerwieni sprzężony z powłoką dekstranową pozwala na szybkie obrazowanie optyczne w celu wykrycia jego obecności. Oprócz tej modalności, superparamagnetyczny rdzeń nanocząsteczkowy tlenku żelaza MN-anty-miR10b sprawia, że konstrukt ten nadaje się jako środek kontrastowy MRI i reprezentuje rozwijający się obszar teranostyki16. Anatomiczna rozdzielczość rezonansu magnetycznego w połączeniu z kontrastem nanocząstek tlenku żelaza może precyzyjnie pokazać, gdzie nanocząstki gromadzą się w mózgu. Te dwie metody razem umożliwiają przedkliniczne śledzenie platformy nano in vivo w celu monitorowania dostarczania RNA lub innych ładunków przez barierę krew-mózg.
Oświadczenia
Z.M. i A.M. są współzałożycielami i udziałowcami TransCode Therapeutics Inc. Pozostali autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
Finansowanie tego badania zostało częściowo zapewnione przez grant od Henry Ford Health Systems Michigan State University Health Sciences Alliance dla A.M. i A.dC. Dziękujemy dr Danielle R. Ferguson za nadzorowanie badań na zwierzętach na Uniwersytecie Stanowym Michigan i za zatwierdzenie tego filmu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Atymiczne nagie myszy "J:NU" | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:007850 | Model myszy z obniżoną odpornością |
| 0,25% Trypsyna | Gibco | 25200-056 | Odczynnik do hodowli komórkowych do U251 |
| 1,7 ml probówki mikrowirówkowej | DOT Scientific | RN1700-GMT | Do pobierania tkanek |
| 10 i mikro; L, Strzykawka do nerwicy, model 1701 RN, rozmiar 33, Point Style 4 | Hamilton | 65460-06 | Strzykawka do wewnątrzczaszkowej implantacji komórek nowotworowych |
| 3M Vetbond | 3M | 1469SB | Klej tkankowy do zamykania pola operacyjnego |
| 4% Paraformaldehyd | Thermo Scientific | J199943-K2 | Roztwór utrwalający tkanki |
| 70% chusteczka nasączona alkoholem izopropoylowym | Cardinal | MW-APL | Miejscowa chusteczka antyseptyczna do implantacji guza i iniekcji żyły ogonowej |
| Aperio Versa | Leica | Do skanowania poplamionych preparatów z wycinków tkanek | |
| Betadine Surgical Scrub | Purdue | 6761815101 | Miejscowy środek antyseptyczny do implantacji guza |
| BioSpec 70/30 | Bruker | Skaner rezonansu magnetycznego | |
| Wosk kostny | Medline | DYNJBW25 | Wosk kostny do uszczelniania miejsca implantacji |
| Zadziory do Micro drill | F.S.T. | 19007-05 | Frez wiertarski używany do wykonywania otworu w czaszce w celu implantacji guza |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | Pożywka do mocowania tkanek zawierająca barwnik DAPI |
| Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) | Gibco | 11995-065 | Pożywka do hodowli komórkowych do U251 |
| Extra Fine Graefe Kleszcze | FST | 11150-10 | Sugiczne narzędzie do implantacji guza |
| Surowica bydlęca płodu | Corning | 35-010-CV | Pożywka do hodowli komórkowych suplement do |
| cienkich nożyczek U251 - Sharp 10.5 cm | FST | 14060-10 | Sugical tool for nowotwór implantacji guza |
| Glydo (Lidocaine) | Sagent | 673-76 | Miejscowy środek przeciwbólowy do miejsca operowanego |
| Ideal Micro Drill | CellPoint Scientific | 67-1200A | Wiertło używane do wykonywania otworu w czaszce w celu implantacji guza |
| Strzykawka insulinowa 1CC 29G X 1/2 | Becton, Dickinson | 324704 | Strzykawka do wstrzykiwań D-Lucyferyny i wstrzykiwań do żyły ogonowej nanocząstki |
| Isoflurane | Covetrus | 11695067772 | Anethesia |
| Waporyzator izofluranowy | SOMNI Scientific | VS6002 | Aparat anestezjologiczny |
| IVIS SpectrumCT System obrazowania in vivo | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Skaner obrazowania bioluminescencyjnego i fluorescencyjnego |
| IVISbrite D-Lucyferin Sól potasowa | PerkinElmer/Revvity | 122799-100MG | Podłoże do obrazowania bioluminescencyjnego |
| Ketaset (Ketamina) | Zoetis | 10004027 | Znieczulenie do chirurgii implantacji guza |
| Ketofen (Ketoprofen) | Zoetis | 10004031 | Środek przeciwbólowy do chirurgii implantacji guza |
| Leica CM1950 | Leica | CM1950 | Do kriosekcji próbek osadzonych w OCT |
| PBS | Gibco | 14190-144 | Odczynnik do hodowli komórkowych i roztwór do zawieszania komórek do implantacji U251 |
| Penicylina-streptomycyna | Gibco | 15140-122 | Antybiotyk do pożywek do hodowli komórkowych U251 |
| Puralube maść weterynaryjna | MWI Veterinary | 27505 | Maść okulistyczna do oczu do ochrony podczas implantacji guza |
| Linijka | FST | 18000-30 | Służy do pomiaru miejsca wiercenia pod kątem implanacji |
| Tissue-Tek Cryomold Pośrednia 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | Forma do pobierania próbek tkanek |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Środek zamrażający do pobierania próbek tkanek |
| U-251 MG linia komórkowa ludzka | Millapore Sigma | 9063001 | Ludzka linia komórkowa |
| glejaka Ksylazyna Roztwór do wstrzykiwań, 100 mg / ml | Covetrus | 1XYL006 | Paralityk do operacji implantacji guza |
Bibliografia
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
- Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
- Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
- Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
- Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
- Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
- Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
- Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
- Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
- Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
- Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
- Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
- Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
- Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
- Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).
Przedruki i uprawnienia
