Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66989

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioscience Division, Los Alamos National Laboratory, 2University of Neuchâtel

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące konstruowania, sterylizacji, montażu, utylizacji i ponownego wykorzystania kolumn autostradowych grzybów w celu wzbogacenia par bakteryjno-grzybowych oddziałujących przez autostrady grzybowe z różnych podłoży środowiskowych.

Streszczenie

Interakcje bakteryjno-grzybowe (BFI) odgrywają integralną rolę w kształtowaniu składu społeczności drobnoustrojów, funkcji biogeochemicznych, dynamiki przestrzennej i rozprzestrzeniania się drobnoustrojów. Sieci grzybni utworzone przez grzyby strzępkowe lub inne mikroorganizmy nitkowate (np. Lęgniowce) działają jak "autostrady grzybów", które mogą być wykorzystywane przez bakterie do transportu w heterogenicznych środowiskach, znacznie ułatwiając ich mobilność i zapewniając im dostęp do regionów, które mogą być trudne lub niemożliwe do samodzielnego dotarcia (np. z powodu kieszeni powietrznych w glebie). Stworzono kilka urządzeń i protokołów eksperymentalnych do badania tych grzybowych autostrad, w tym kolumn grzybowych autostrad. Kolumna autostradowa grzybów zaprojektowana przez naszą grupę może być używana do różnych zastosowań in situ lub in vitro , a także do różnych typów próbek środowiskowych i związanych z gospodarzem. W niniejszym artykule opisujemy metody przeprowadzania eksperymentów z tymi kolumnami, w tym projektowania, drukowania, sterylizacji i przygotowania urządzeń. Omówiono tu również możliwości analizy danych uzyskanych przy użyciu tych urządzeń, a także zaoferowano porady dotyczące rozwiązywania problemów dotyczących potencjalnych pułapek związanych z eksperymentami z użyciem kolumn drogowych grzybów. Urządzenia te mogą być wykorzystane do uzyskania bardziej wszechstronnego zrozumienia różnorodności, mechanizmów i dynamiki BFI na autostradach grzybów, aby dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej w złożonych środowiskach (np. glebach) oraz w różnych siedliskach, w których współistnieją bakterie i grzyby.

Wprowadzenie

Interakcje bakteryjno-grzybowe (BFI) są niezwykle ważne w kształtowaniu strukturalnych, przestrzennych i funkcjonalnych właściwości mikrobiomów środowiskowych. Na przykład wzrost i ekspansja grzybów strzępkowych lub innych mikroorganizmów strzępkowych podobnych do grzybów generuje sieć biologiczną, która może funkcjonować jako "autostrada" ułatwiająca przemieszczanie się innych mikroorganizmów, takich jak bakterie. Niejednorodność i niespójne nasycenie w podłożach środowiskowych mogą utrudniać ruchliwość bakterii; Bakterie mogą jednak korzystać z tych autostrad, aby ułatwić dostęp do dodatkowych obszarów środowiska 1,2. Interakcje te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki przestrzennej społeczności drobnoustrojów. Do badania autostrad grzybowych zastosowano kilka technik i metod, jednak są one w dużej mierze ograniczone do badań laboratoryjnych 3,4.

W jednej metodzie opartej na płytkach duża część agaru jest usuwana ze środka szalki Petriego, tworząc szczelinę między dwiema wyspami agarowymi. Strzępki grzybów mogą pokonywać tę lukę, zapewniając kompatybilnym bakteriom możliwość przejścia z jednej wyspy agarowej na drugą5. Inne zmodyfikowane metody szalki Petriego obejmują odwrócone płytki, na których gleba jest umieszczana w pokrywie, dzięki czemu strzępki grzybów mogą rosnąć pionowo i kolonizować pożywkę bez bezpośredniego kontaktu, zapewniając środki do transportu bakterii 5,6. Niedawno opracowana metoda oparta na kropelkach pożywki wzrostowej może być stosowana do oceny selektywnego transportu strzępek bakterii w kierunku określonych profili składników odżywczych7. Mosty bakteryjne i urządzenia do szlaków zostały również wykorzystane do zbadania wpływu czynników abiotycznych na przemieszczanie się bakterii8. Chociaż do badania autostrad grzybowych wykorzystano kilka metod i technik, nadal istnieje zapotrzebowanie na znormalizowane urządzenia, które utrzymują sterylne mikrośrodowisko, jednocześnie promując tworzenie autostrad grzybowych ze złożonych substratów środowiskowych, takich jak obornik, gleba i ryzosfery.

Nasza grupa zaprojektowała wydrukowaną w 3D wersję kolumn drogowych z grzybami, w których grzyby mogą transportować bakterie z jednego końca na drugi9. Urządzenia te składają się z czterech drukowanych elementów: samej kolumny w kształcie klepsydry i złożonej wewnętrznej struktury kratowej, gwintowanego pierścienia i dwóch nasadek (dużej nasadki i małej nasadki), a także kawałka wysterylizowanej siatki nylonowej (rysunek 1). Zmontowana kolumna jest dodawana bezpośrednio do żądanego podłoża środowiskowego. Kolumna następnie umożliwia mikroorganizmom kolonizację pożywki agarowej, znanej jako korek pożywki "przynęta", która znajduje się na dnie kolumny i styka się z podłożem środowiskowym przez siatkę. Ten rozmiar siatki nylonowej wyklucza innych mieszkańców gleby, którzy mogą przenosić bakterie, ograniczając w ten sposób ruch bakterii w kolumnach do autostrad grzybów. Gdy ta zatyczka przynęty zostanie skolonizowana, grzyby strzępkowe mogą rozciągać się i rosnąć przez wewnętrzną siatkę w środku kolumny, która została zaprojektowana w celu stworzenia nienasyconego systemu przypominającego glebę (lub inne nienasycone media) i zminimalizowania potencjalnego zanieczyszczenia z pożywki przynętowej. Grzyby następnie rosną w kierunku i kolonizują docelową pożywkę na szczycie kolumny. Kolumny mogą być albo zaszczepione określonymi izolatami grzybów w celu przetestowania ich zdolności do transportu bakterii, albo mogą pozostać niezaszczepione, aby zidentyfikować, które grzyby z podłoża są zdolne do transportu bakterii. Organizmy, które dotrą do pożywki docelowej, mogą być dalej hodowane, izolowane i poddawane analizom sekwencjonowania (zarówno z czystych kultur, jak i ze społeczności mieszanych przy użyciu metod sekwencjonowania amplikonowego lub metagenomicznego). Ogólnie rzecz biorąc, kolumny zapewniają ustandaryzowaną, powtarzalną, wielokrotnego użytku i intuicyjną metodę badania autostrad grzybowych na różnych podłożach. Urządzenia te mogą być wykorzystywane do badań i jako narzędzie dydaktyczne w klasie, a w niniejszym dokumencie przedstawiamy instrukcje dotyczące korzystania z nich w oparciu o eksperymenty, które zostały przeprowadzone w przeszłości. Chociaż metoda ta ułatwia standaryzację protokołów, konstrukcja i konstrukcja urządzeń może być modyfikowana pod kątem innych zastosowań i dodatkowych podłoży.

Protokół

Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Modyfikacja konstrukcji kolumny, materiałów i parametrów

  1. Pobrać publicznie dostępne projekty kolumn9 i wykorzystać je w aktualnej formie lub zmodyfikować w kompatybilnym oprogramowaniu do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD).
  2. Pozyskać żywicę do chirurgicznych szablonów stomatologicznych lub wybrać alternatywny materiał do druku 3D, taki jak inne światłoczułe żywice transparentne.
  3. W razie zmiany drukarki 3D, technologii druku 3D lub materiału do druku 3D w stosunku do wcześniej stosowanych9, dostosować specyfikacje kolumny w razie potrzeby.

2. Druk 3D kolumn

  1. Ustaw parametry drukowania na grubość warstwy 0,05 mm i czas ekspozycji 0,8 s lub dostosuj parametry drukowania w zależności od wybranej drukarki, materiału do druku oraz oprogramowania do drukowania.
  2. Wydrukuj kolumny autostrad grzybowych, gwintowane pierścienie oraz nakrętki, używając kompatybilnej drukarki 3D (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Elementy kolumny autostrady grzybowej. (A,B) Widok z góry i z boku małej nasadki, pierścienia z gwintem oraz dużej nasadki (od lewej do prawej). (C,D) Widok z góry i z boku małej nasadki. (E,F) Widok z góry i z boku pierścienia z gwintem. (G,H) Widok z góry i z boku dużej nasadki. (I) Kawałek nylonowego filtra siatkowego (25 µm) umieszczony na końcu kolumny i wstawiony w podłoże środowiskowe, aby zapobiec przedostawaniu się mikrofauny do wnętrza kolumny. (J) Nie złożona kolumna. (K) Złożona kolumna: koniec „Bait” (przynęta) jest wprowadzany do podłoża, a koniec „Target” (cel) pozostaje odsłonięty i znajduje się poza podłożem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Czyszczenie wydrukowanych w 3D elementów kolumny

  1. Zanurzyć wydrukowane kolumny, nakrętki i pierścienie gwintowane w 99% alkoholu izopropylowym w temperaturze pokojowej na 15 min, a następnie mieszać, poruszając ręcznie kąpielą w przód i w tył przez 10-15 s w każdej minucie, aby usunąć nadmiar żywicy.
  2. Przenieść elementy do nowej kąpieli z 99% alkoholu izopropylowego. Zanurzyć na 5 min i mieszać ręcznie w ten sam sposób, co w kroku 3.1.
  3. Przenieść elementy do myjki ultradźwiękowej wypełnionej czystą wodą, zanurzyć je i poddać działaniu ultradźwięków przez 2 min przy średniej prędkości. Nie podgrzewać wody. Wyjąć elementy.
  4. Pozostawić wszystkie elementy do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 min.
  5. Aby przeprowadzić dotwardzanie żywicy, naświetlać wszystkie wydrukowane w technologii 3D elementy światłem o długości fali 405 nm przez 30 min w temperaturze 60 °C.

4. Sterylizacja kolumn

  1. Jeśli wybrany materiał nadaje się do autoklawowania, należy wysterylizować w autoklawie kolumny, pierścienie z gwintem, nakrętki oraz arkusze nylonowej siatki filtracyjnej o wielkości oczek 25 µm – oddzielnie lub w większym zlewce – przez 20-30 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 1 atm.
    UWAGA: Komponenty kolumny mogą zmienić kształt i kolor po autoklawowaniu, jednak zachowają wymagane właściwości materiałowe. Końcowy rozmiar, kształt i kolor elementów kolumny po autoklawowaniu przedstawiono na Rysunku 1.

5. Przygotowanie mediów do kolumn

  1. Przygotować 90 mm szalki Petri z wysterylizowaną pożywką na bazie agaru: pożywką z karboksymetylocelulozą sodu (CMC), agarem z ekstraktem słodowym (MEA), agarem ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) lub agarem Reasoner’s 2A (R2A)9,10. Pożywki przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Wysterylizować pożywki w autoklawie przez 21 min lub przez czas zalecany przez producenta w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1 atm, a następnie przelać do 90 mm szalek Petri tak, aby agar znajdował się blisko górnej krawędzi ścianek szalek (Rysunek 2). Krok ten należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zwiększenia sterylności.
    2. Pozostawić agar do stężenia i wysuszenia zgodnie z instrukcjami producenta.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Proces montażu kolumn do grzybowych autostrad. Wykorzystując otwarty koniec samej kolumny, wycina się i wstawia zatyczkę, a następnie badacz obraca kolumnę podczas wyjmowania jej z pożywki, aby upewnić się, że zatyczka pozostaje wewnątrz końca kolumny. Koniec ten zostaje zamknięty małą nakrętką. W analogiczny sposób do drugiego końca kolumny dodaje się zatyczkę z pożywką. Następnie na tym końcu umieszcza się element siatkowy i mocuje go pierścieniem z gwintem. Na tym końcu typu „przynęta” (Bait), powyżej pierścienia z gwintem, stosuje się dużą nakrętkę. Strona z siatką zostanie umieszczona w podłożu środowiskowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

6. Przygotowanie kolumn z grzybniową autostradą

UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność komponentów kolumny oraz mediów. Rycina 2 ilustruje proces montażu kolumny do tworzenia grzybowych autostrad.

  1. Wykorzystaj sam koniec kolumny (bez żadnych nakrętek), aby wyciąć korek z pożywki, który ściśle pasuje do jednego końca kolumny. Podczas wyciągania kolumny z pożywki wykonuj ruch obrotowy, tak aby agar pozostał wewnątrz końca kolumny. Alternatywnie można użyć końca kolumny jako szablonu, wyciąć fragment pożywki i przenieść go do kolumny za pomocą końcówki pipety.
  2. Po umieszczeniu pierwszego korka na końcu kolumny, załóż na ten koniec małą nakrętkę, aby zachować sterylne mikrootoczenie dla docelowej pożywki.
  3. Odwróć kolumnę i powtórz krok 6.1 dla drugiego końca kolumny.
  4. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek wytnij okrągły kawałek autoklawowanej siatki nylonowej (rozmiar porów 25 µm) o średnicy ok. 2 cm (Rysunek 1). Połóż siatkę na odsłoniętym końcu kolumny. Nakręć pierścień gwintowany na ten koniec kolumny z pożywką wabiącą, zabezpieczając siatkę wewnątrz gwintów.
  5. Umieść dużą nakrętkę na spodzie kolumny nad siatką i drugim końcem pierścienia gwintowanego; pozostaw tę nakrętkę podczas przechowywania lub transportu kolumny.

7. Wstępne zaszczepianie podłoża lub pożywki przynętowej wybranym grzybem

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.

  1. Zaszczep wybrany grzyb (np. grzyb znany z tworzenia autostrad grzybowych) na pożądanym podłożu, najpierw hodując go na stałym pożywce dla grzybów (np. MEA, PDA; przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 5) w czarce Petriego, a następnie przenosząc niewielki (~1 cm) fragment agaru z widocznym wzrostem grzyba na podłoże.
    UWAGA: W poprzednich eksperymentach9 stosowano podłoże z odchodów uprzednio kolonizowane przez Coprinopsis cinerea przez 10 dni przed dodaniem kolumn do tak przygotowanego podłoża.
  2. Zamiast uprzedniego kolonizowania podłoża, dodaj grzyba wabiącego do czarki Petriego lub bezpośrednio do dolnej części pożywki wabiącej w kolumnie, używając niewielkiej ilości grzybni (np. za pomocą sterylnej pętli).
    1. W przypadku czarki Petriego należy poczekać, aż widoczny wzrost pokryje znaczną część naczynia (około 50%-75% powierzchni płytki), a następnie wyciąć fragment pożywki wabiącej bezpośrednio z zkolonizowanej czarki Petriego, najbliżej zewnętrznej krawędzi wzrostu grzyba (zgodnie z opisem w kroku 6.1).
    2. Przy bezpośrednim kolonizowaniu pożywki wabiącej należy poczekać do wyraźnego wzrostu w całej pożywce przed dodaniem kolumny do podłoża (zajmie to prawdopodobnie kilka dni).
      UWAGA: W poprzednich eksperymentach9 jako pożywkę wabiącą stosowano pożywki 14-dniowe, uprzednio zkolonizowane przez C. cinerea; czas kolonizacji będzie się różnić w zależności od szybkości wzrostu grzyba, rodzaju pożywki i warunków inkubacji.

8. Przygotowanie prób kontrolnych i powtórzeń

  1. Przygotuj kolumny kontrolne negatywne (zgodnie z opisem w krokach 1-6), nie szczepiając ich i nie umieszczając w podłożu. Wykorzystaj je do wyznaczenia linii bazowej dla późniejszych analiz oraz do oceny ewentualnego zanieczyszczenia w procesie przygotowania.
  2. Dla każdego eksperymentu uwzględnij co najmniej trzy powtórzenia kolumn.

9. Mocowanie kolumny do podłoża

  1. Przygotuj laboratoryjny mikrokosmos (np. glebę w pudełku, doniczce lub probówce; Rysunek 3A) lub zabierz kolumny do wybranego miejsca w terenie.
  2. Zdejmij dużą nasadkę z dołu kolumny, aby odsłonić gwintowany pierścień i siatkę.
  3. Umieść kolumnę w badanym podłożu (Rysunek 3), stosując się do szczegółowych wytycznych dla każdego rodzaju podłoża opisanych poniżej. Jeśli jest to konieczne, a w celu zminimalizowania uszkodzeń siatki, przed włożeniem kolumny do podłoża wykonaj w nim wgłębienie za pomocą ręki w rękawiczce lub małego narzędzia (np. małej łopatki).
    1. Obornik: Kolumny były wcześniej z sukcesem stosowane w świeżym oborniku końskim. Przechowuj obornik w temperaturze 4 °C przed użyciem i dodaj go do komór, takich jak pudełka typu Magenta, przed wprowadzeniem kolumn. Włóż kolumnę w podłoże tak, aby zakryło 1-2 cm całkowitej wysokości kolumny.
    2. Gleba: Włóż kolumny tak, aby cała dolna sekcja znajdowała się w glebie (głębokość gleby ~1-2 cm) (Rysunek 3B). Kolumny mogą spoczywać na powierzchni gleby lub być zakopane aż do poziomu tuż poniżej małej nasadki po stronie docelowej.
    3. Ryzosfera: Włóż kolumny w glebę otaczającą korzenie roślin zgodnie z instrukcją w kroku 9.3.2, ustawiając kolumnę pod kątem i blisko konkretnych korzeni, aby zwiększyć szansę na przechwycenie mikroorganizmów ryzosferycznych (Rysunek 3C).
    4. Podłoża w probówkach: Dodaj ~10 mL badanego podłoża do stożkowej probówki 50 mL lub podobnego naczynia i w razie potrzeby zwilż podłoże (np. w środowiskach o bardzo niskiej wilgotności) za pomocą czystej wody. Włóż kolumnę do probówki tak, aby dół był zakopany, a części gwintowanego pierścienia lub siatki nie były widoczne (Rysunek 3A). Zakręć pokrywkę probówki 50 mL i umieść ją w statywie do probówek 50 mL, aby zachować pionową pozycję.

10. Pozostawienie kolumny w podłożu

  1. Pozostawić kolumny w podłożu na okres od 3 do 21 dni.
    UWAGA: Czas, przez który kolumny powinny pozostawać w podłożach, zależy od szybkości wzrostu użytych grzybów przynętowych, szybkości wzrostu grzybów kolonizujących pożywkę przynętową oraz od warunków środowiskowych (np. suche warunki prowadzą do szybszego wysychania pożywki, przez co nie można ich stosować przez tak długi czas).
  2. Ustanowić pożądany cykl światła/ciemności dla eksperymentu; w poprzednich badaniach kolumny w laboratorium przechowywano w ciemności, natomiast kolumny w terenie poddawano lokalnym warunkom dnia i nocy9.

11. Usuwanie kolumny z podłoża

  1. Po pozostawieniu kolumny w kontakcie z substratem przez pożądany czas, należy wyjąć kolumnę, ostrożnie strząsnąć nadmiar substratu, a następnie ponownie nałożyć dużą zakrętkę na dno kolumny poniżej siatki w celu transportu.
  2. Kolumnę należy umieścić w sterylnym zlewce lub probówce 50 mL na czas transportu. Podczas transportu kolumnę należy trzymać w pozycji pionowej.

12. Hodowla izolatów z pożywki docelowej kolumny

  1. W środowisku sterylnym, takim jak komora bezpieczeństwa biologicznego, zdejmij dużą nasadkę podłoża przynętowego, pierścień gwintowany oraz siatkę. Siatkę wyrzuć.
    UWAGA: Jeśli badacza interesuje, jakie organizmy skolonizowały podłoże przynętowe, należy wykonać kroki 12.3-12.4 również dla krążka podłoża przynętowego, oprócz krążka podłoża docelowego.
  2. Zdejmij małą nasadkę z końca kolumny zawierającego podłoże docelowe.
  3. Wyjmij krążek podłoża docelowego, odwracając kolumnę tak, aby krążek wypadł, lub używając wysterylizowanej pęsety bądź końcówek do pipet. Umieść krążek podłoża docelowego bezpośrednio w centrum 90 mm szalki Petriego wypełnionej wybranym podłożem agarowym (przygotowanym zgodnie z krokiem 5).
    UWAGA: W celu przyspieszenia wzrostu przedstawicieli grzybów lub bakterii można zastosować podłoża specyficzne dla danej grupy organizmów; krążek można również podzielić na dwie lub więcej części za pomocą wysterylizowanych nożyczek lub końcówki do pipety, co umożliwia wysiew na różne rodzaje podłoży i/lub zachowanie podłoża docelowego do ekstrakcji DNA (patrz krok 14).
  4. Inkubuj szalkę Petriego zaszczepioną krążkiem podłoża docelowego przez co najmniej 72 h w temperaturze 25 °C w ciemności.

13. Przesiewanie w celu izolacji mikroorganizmów

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.

  1. W przypadku bakterii: Za pomocą sterylnej pętli do posiewu pobrać pojedynczą kolonię, minimalizując kontakt z innymi obszarami szalki Petriego. Wysiać kolonię na nową szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą odpowiednią pożywkę bakteryjną, np. R2A (przygotowaną w kroku 5), stosując dowolną metodę umożliwiającą powstanie pojedynczych kolonii (np. metodę pasową w czterech strefach). Inkubować szalkę Petriego przez 24-72 h w temperaturze 25-37 °C, kontrolując wzrost kolonii.
  2. W przypadku grzybów: Za pomocą sterylnej pętli do posiewu, sterylnej żyletki lub sterylnego końcówki pipety wyciąć minimalny fragment agaru (1 mm2) zawierający wzrost strzępek. Umieścić mały fragment agaru na nowej szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej odpowiednią pożywkę dla grzybów, np. MEA lub PDA, przygotowaną w kroku 5. Inkubować szalkę Petriego do jednego tygodnia w temperaturze 25 °C w ciemności, kontrolując codziennie, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi.
  3. Powtarzać krok 1 lub krok 2 w razie potrzeby, aż morfologia organizmów stanie się jednolita.

14. Izolacja DNA z płytki lub bezpośrednio z podłoża docelowego

  1. Zamrozić całe krążki agaru (docelowe i/lub przynętowe) lub wybrane fragmenty kolumn w probówkach do wirówki o pojemności 1,5 mL w temperaturze -20 °C lub, w przypadku gdy ekstrakcja nie odbędzie się natychmiast, zanurzyć fragmenty krążków w konserwancie w probówce do wirówki o pojemności 1,5 mL przed ekstrakcją.
  2. Jeśli przeprowadzono hodowlę z podłoży docelowych i/lub przynętowych oraz podjęto kolejne kroki subkultywacji, wyciąć lub wyciąć fragment agaru o rozmiarze ~1 cm z przerostem grzybowym lub bakteryjnym (lub mieszanką obu, jeśli nie wykonano kolejnych etapów izolacji).
    1. W przypadku ekstrakcji z izolowanych kolonii bakteryjnych, pobrać kolonię z płytki za pomocą sterylnej pętli do szczepienia i zawiesić ją bezpośrednio w buforze do ekstrakcji dołączonym do komercyjnego zestawu do izolacji DNA (krok 14.4).
  3. Zmielić fragmenty agaru oddzielnie w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie przenieść zmieloną tkankę do probówek do ekstrakcji.
  4. Użyć komercyjnego zestawu do izolacji DNA zoptymalizowanego dla gleby lub bakterii i grzybów, a następnie postępować zgodnie z instrukcją producentą w celu wyekstrahowania DNA (patrz Tabela materiałów).
  5. Oznaczyć ilość otrzymanego DNA za pomocą fluorometru lub porównywalnego systemu.

15. Ocena różnorodności taksonomicznej drobnoustrojów w mediach docelowych i/lub wabiących z wykorzystaniem sekwencjonowania amplikonowego lub metagenomicznego

  1. Przeprowadź sekwencjonowanie amplikonów (16S i/lub wewnętrzny odstęp transkrybowany [ITS]) lub sekwencjonowanie metagenomiczne zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Sekwencjonowanie amplikonów: Przeprowadź amplifikację regionu genu 16S rRNA V3-V4 przy użyciu starterów Bakt 341F (5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′) i Bakt 805R (5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3′). Przeprowadź amplifikację grzybiczego regionu ITS2 przy użyciu starterów ITS3 KYO2 (5′-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3′) i ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)9.
    2. Przygotuj biblioteki amplikonów, korzystając z komercyjnych zestawów do przygotowania bibliotek kompatybilnych z wybranym sekwenatorem. Wysekwencjonuj amplikony przy użyciu sekwenatora krótkich odczytów, aby uzyskać parne odczyty o długości 150 lub 250 par zasad z odpowiednim pokryciem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta platformy sekwencjonującej dotyczącymi stężenia ładunku.
    3. Sekwencjonowanie metagenomiczne: Stwórz bibliotekę metagenomiczną z wyizolowanego DNA, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do przygotowania bibliotek metagenomicznych kompatybilnego z wybranym sekwenatorem. Wysekwencjonuj bibliotekę metagenomową przy użyciu sekwenatora krótkich odczytów ustawionego na generowanie parnych odczytów o długości 150 lub 250 par zasad z odpowiednim pokryciem (~10-20 Gb na metagenom), postępując zgodnie z instrukcjami producenta platformy sekwencjonującej dotyczącymi stężenia ładunku.

16. Analiza danych z sekwencjonowania

  1. Analiza danych amplikonowych: Wykorzystaj platformę QIIME2 11 z DADA212 do analizy danych amplikonowych przed wizualizacją wyników13. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby uruchomić QIIME2 w internetowej platformie bioinformatycznej Empowering the Development of Genomics Expertise (EDGE)14. QIIME2 można również uruchomić, korzystając z ogólnodostępnych samouczków, takich jak internetowy przewodnik „Moving Pictures” (https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/).
    1. Przejdź do strony https://edgebioinformatics.org/ i zaloguj się lub utwórz konto.
    2. Wybierz RUN QIIME2 na stronie głównej. Wybierz Upload Files w lewym pasku menu, aby przesłać pliki z sekwencjonowania amplikonów.
    3. Utwórz plik mapowania metadanych (Metadata Mapping file) zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi po najechaniu kursorem na ikonę „i” obok pola „Metadata Mapping File”.
    4. Wprowadź wszystkie wymagane informacje (Project/Run Name, Reads Type, Parameters itp.) i wybierz odpowiednie przesłane dane wejściowe. Upewnij się, że jako metoda kontroli jakości wybrano DADA212; pozostałe parametry można pozostawić w wartościach domyślnych, chyba że wymagane są inne modyfikacje.
    5. Wybierz typ amplikonu: 16S Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) dla amplikonów bakteryjnych lub Fungal ITS dla amplikonów grzybowych. Analizuj dane bakteryjne (16S) i grzybowe (ITS) niezależnie.
    6. Naciśnij submit i poczekaj na zakończenie procesu, aby wyświetlić wyniki.
  2. Generowanie wizualizacji danych amplikonowych (opcjonalnie): Przeprowadź dodatkowe analizy danych społeczności w środowisku R, korzystając z popularnych pakietów, takich jak phyloseq (https://github.com/joey711/phyloseq), VEGAN (https://github.com/vegandevs/vegan), oraz APE (https://emmanuelparadis.github.io/), postępując zgodnie z wytycznymi dostępnymi w serwisie GitHub oraz w pomocy pakietów R w programie R Studio poprzez przejście do menu  Packages, kliknięcie pobranego pakietu i wyświetlenie dokumentacji.
  3. Analiza danych metagenomicznych
    1. Przejdź do witryny NMDC EDGE15 (https://nmdc-edge.org/home) i zaloguj się za pomocą konta ORCiD (https://orcid.org/).
    2. Wybierz Upload Files w pasku menu po lewej stronie ekranu, a następnie przeciągnij i upuść lub wyszukaj odpowiednie pliki wejściowe FASTQ.
    3. Wybierz Metagenomics, a następnie opcję Run Multiple Workflows w pasku menu po lewej stronie ekranu i ustaw wszystkie przepływy pracy (workflows) na On. Dodaj nazwę projektu i opcjonalny opis.
    4. Wybierz przesłane pliki surowych odczytów (fastq) i wybierz odpowiedni format pliku (interleaved lub paired).
    5. Uruchom proces, klikając Submit; po zakończeniu analizy wyświetl tabele podsumowujące i wizualizacje, wybierając projekt w karcie My Projects u góry ekranu.

17. Tworzenie dodatkowych wizualizacji danych taksonomicznych z wyników amplikonowych i/lub metagenomicznych

  1. Wygeneruj koliste kladogramy za pomocą pakietu GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan), postępując zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w serwisie GitHub. 
    UWAGA: Identyfikatory taksonomiczne National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy) można uzyskać z przypisań sekwencji reprezentatywnych i przekazać do programu „eftech” z narzędzi Entrez Direct E-utilities, aby zebrać informacje o hierarchii taksonomicznej wymagane przez GraPhlAn16.

18. Ponowne wykorzystanie kolumn

  1. Jeśli kolumny są nadal złożone, odkręć i zdejmij nakrętki, pierścień gwintowany oraz siatkę. Wyrzuć siatkę. Usuń wszelkie pozostałe czopy agarowe, przemyj kolumny 99% alkoholem izopropylowym oraz wodą oczyszczoną, a następnie wyczyść i wysusz elementy zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.4.
  2. Przygotuj nowe arkusze siatki nylonowej do autoklawowania.
  3. Autoklawuj elementy zgodnie z wytycznymi podanymi w kroku 4.1.

Wyniki

W pełni zmontowana kolumna autostrady grzybowej ma około 5 cm długości (Rysunek 1). Kolumna nie powinna być pęknięta w żadnym miejscu, a nakrętki i pierścień z gwintem powinny łatwo i szczelnie do siebie pasować, aby stworzyć mikrośrodowiska wewnątrz kolumny. Siatka filtracyjna może wystawać poza pierścień z gwintem (jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 2) lub może zostać przycięta wysterylizowanymi nożyczkami. Czopy agarowe powinny ściśle przylegać do każdego końca kolumny. Po umieszczeniu w podłożu siatka filtracyjna powinna stykać się z podłożem, a kolumna nie powinna zostać całkowicie zakopana.

Kolumny były wcześniej testowane w odchodach końskich9Kolumny umieszczono również w glebie objętościowej oraz ryzosferycznej na polowym obszarze badawczym, a także w niewielkich objętościach gleby w probówkach o pojemności 50 ml w laboratorium (Rycina 3). Po usunięciu kolumn grzybowych autostrad z podłoża i ich rozmontowaniu, wzrost mikroorganizmów był widoczny zarówno na czopach pożywki z przynętą, jak i na czopach pożywki docelowej (przykłady przedstawiono w Rycina 4A). Bakterie i grzyby wyizolowano z podłoży docelowych i przynętowych poprzez techniki pasażowania (Rysunek 4B), a mikroby obecne na korkach mediów zidentyfikowano taksonomicznie za pomocą sekwencjonowania amplikonów (Rycina 4C,D). Rycina 4C,D przedstawić połączone wyniki sekwencjonowania amplikonów z wielu eksperymentów, wskazując, które mikroby były w stanie dotrzeć do docelowej wkładki z pożywką z kolumn uzupełnionych nawozem końskim9Wizualizacje tych danych bakteryjnych i grzybowych zostały wygenerowane zgodnie z opisem w kroku 17. Wyniki można również przedstawić w formie względnej liczebności taksonów.

Nieoptymalne wyniki uzyskano w przypadkach, gdy kolumny umieszczono w środowiskach o ekstremalnie niskiej wilgotności, co doprowadziło do całkowitego wysuszenia czopów z pożywką w ciągu kilku dni i w konsekwencji do braku odzyskania skolonizowanych drobnoustrojów (Rycina 5A). Odnotowaliśmy również przypadki, w których drobnoustroje po prostu nie rosły z docelowego czopa z pożywką (Rycina 5B), a także sytuacje, w których z docelowego czopa nie udało się odzyskać wystarczającej ilości danych sekwencyjnych do przeprowadzenia wiarygodnych analiz. Inne przypadki, w których grzyby przerastały poza kolumny, również skutkowały koniecznością powtórzenia eksperymentów (Rycina 5C).

figure-results-1
Rysunek 3: Przykłady kolumn umieszczonych w próbkach środowiskowych w warunkach laboratoryjnych i terenowych. (A) Kolumna umieszczona w probówce 50 mL z wilgotną glebą w warunkach laboratoryjnych. Na zdjęciu widoczna jest również linijka dla zachowania skali. (B) Kolumna umieszczona w glebie w terenie. (C) Kolumna umieszczona w systemie korzeniowym rośliny w terenie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki pomyślnych eksperymentów kolumnowych. (A) Przykłady skolonizowanych krążków pożywki wyjętych z kolumn. (B) Przykłady izolatów grzybów przesianych z pożywek docelowych. Podłożem była gleba. Najwyższa tożsamość sekwencji ITS w NCBI BLAST od lewej do prawej: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii oraz Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Kołowe kladogramy przedstawiające różnorodność filogenetyczną (C) grzybowych sekwencji ITS oraz (D) bakteryjnych sekwencji 16S odzyskanych z pożywek docelowych po wielokrotnych eksperymentach z autostradami grzybowymi z wykorzystaniem obornika końskiego. Sekcje są pokolorowane i oznaczone według typów, a węzły końcowe reprezentują unikalne rodzaje. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 5. Nieoptymalne wyniki eksperymentów kolumnowych. (A) Przykład wysuszonej wkładki z pożywką spowodowany niską wilgotnością otoczenia. (B) Przykład braku wzrostu drobnoustrojów we wkładce z pożywką w kolumnie. (C) Przykład przerostu grzyba przez górną część (pożywkę docelową) kolumny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podczas generowania komponentów kolumny wybór drukarki 3D i materiału do druku może być modyfikowany w oparciu o dostępność i pożądane właściwości materiału17,18. Biokompatybilność, tekstura powierzchni, możliwość sterylizacji w autoklawie, zdolność do drukowania drobnych detali i względna przezroczystość zostały wzięte pod uwagę przy wyborze materiałów przez naszą grupę. Należy również wziąć pod uwagę inne cechy, takie jak porowatość, hydrofobowość, parametry druku itp. Różne żywice zostały przetestowane (patrz Tabela materiałów) przed ostatecznym wyborem, a wiele biokompatybilnych materiałów będzie działać do drukowania tych kolumn. Materiał wybrany do budowy elementów kolumny określi, jakie podejścia do czyszczenia, utwardzania i sterylizacji należy zastosować. Nie wszystkie materiały będą nadawały się do sterylizacji w autoklawie i może być wymagane światło ultrafioletowe, wybielacz lub inne techniki sterylizacji, w zależności od instrukcji producenta materiału. Niektóre techniki sterylizacji lub czyszczenia mogą również uszkodzić lub nie być kompatybilne z wybranym materiałem, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na te informacje od producenta materiału. W przypadku drukarek 3D niektóre kwestie obejmują czas drukowania, kompatybilność materiałów, rozmiar platformy roboczej, technologię drukowania i koszt19. Wydrukowane w 3D elementy kolumn mogą być delikatne i mogą pęknąć, jeśli będą obsługiwane zbyt mocno. Gwinty pierścienia i nasadek mogą nie zawsze być dokładnie wyrównane, dlatego zalecamy wydrukowanie i wysterylizowanie dodatkowych elementów przed etapem montażu lub wykonanie wstępnego drukowania w celu przetestowania, jak wybrane parametry i materiał wpływają na gwintowanie. Specyfikacje projektowe dotyczące gwintowania w nasadkach i pierścieniu mogą wymagać dostosowania w zależności od wybranego materiału do druku 3D. Wymiary, złożoność sieci i inne cechy fizyczne można modyfikować w oprogramowaniu do projektowania CAD przed drukowaniem. Zgodnie z projektem, sama kolumna ma 4 cm wysokości, a konstrukcja kratowa w środku kolumny ma komórkę elementarną o wielkości 2 mm, średnicę rozpórki 0,5 mm, a cała wysokość kraty wynosi 22 mm9. Parametry te można dostosować, jeśli badacz chce na przykład uzyskać większą lub bardziej złożoną strukturę kratową. Ogólnie rzecz biorąc, drukowana w 3D produkcja tych urządzeń umożliwia elastyczność projektowania, zapewniając jednocześnie, że pojedynczy projekt może być używany w ustandaryzowany sposób w różnych organizacjach i grupach, a nawet używanyjako narzędzia do nauczania w klasie.

Kilka kroków w protokole może wymagać rozwiązywania problemów w zależności od środowiska lub konfiguracji eksperymentalnej. Kolumny autostradowe grzybów nie są zbyt skuteczne w warunkach niskiej wilgotności, ponieważ korki pożywki szybko wysychają, zanim ułatwią rozwój grzybów, co może ograniczyć czas trwania eksperymentów w tych środowiskach (ryc. 5A). Techniki, które poprawiły skuteczność kolumn w środowiskach o niskiej wilgotności, obejmują sztuczne zwiększanie wilgotności poprzez dodawanie wilgoci do podłoża i/lub uszczelnianie kolumny i podłoża w wtórnym pojemniku ze źródłem wody (np. małym pojemnikiem z czystą wodą). Kształt klepsydry i struktura siatki zostały włączone, aby zapobiec samemu ruchowi bakterii (bez tworzenia autostrady grzybów), jeśli w środowiskach o wysokiej wilgotności miałaby powstać kondensacja. Szybko rosnące grzyby mogą przerastać powierzchnię celu i podłoża przynęty oraz wystawać poza górną lub dolną część kolumny (ryc. 5C). Skrócenie czasu inkubacji grzyba przynęty lub czasu trwania eksperymentu może zminimalizować lub wyeliminować ten przerost. Ponadto ograniczeniem tych urządzeń jest to, że szybko rosnące grzyby w podłożu będącym przedmiotem zainteresowania mogą ograniczać kolonizację przynęty i pożywki docelowej przez wolno rosnące grzyby, potencjalnie wpływając na to, które interakcje autostradowe są obserwowane. Niektóre grzyby, zwłaszcza wolniej rosnące grzyby, mogą nie kolonizować podłoża przynętowego w sposób, który pozwala im przerosnąć przez korek agarowy i do struktury sieciowej. Jeśli w otoczeniu jest wystarczająca wilgotność, można użyć cieńszych zatyczek agarowych, aby pobudzić wzrost w sieci po kolonizacji zatyczki agarowej na przynętę. Pożywki można wybrać w zależności od tego, czy badacz chce dokonać selekcji pod kątem wzrostu grzybów czy bakterii, ale może to również ograniczyć hodowlę do organizmów, które preferują ten typpożywki 20. Jeśli nie obserwuje się wzrostu w pożywce docelowej, może być konieczne zaszczepienie podłoża przynętowego lub substratu grzybem, o którym wiadomo, że tworzy autostrady grzybowe.

W ramach tych eksperymentów można przeprowadzić sekwencjonowanie metagenomiczne lub amplikonowe, a obie te strategie mają swoje własne ograniczenia i mocnestrony 21. Sekwencjonowanie metagenomiczne jest idealne do uzyskania dodatkowych informacji genomowych o drobnoustrojach. Jednak odzyskiwalna ilość kwasów nukleinowych bezpośrednio z pożywki docelowej może być bardzo niska, co może wymagać zastosowania sekwencjonowania amplikonów lub innych metod amplifikacji przed sekwencjonowaniem. Biblioteki sekwencjonowania amplikonów muszą być przygotowywane oddzielnie (16S i ITS), a metoda ta nie ma rozdzielczości taksonomicznej i ogranicza wszelkie oceny cech genomu lub potencjału funkcjonalnego, które można osiągnąć za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego. Metody sekwencjonowania bezpośredniego z wtyczek mogą być preferowane w przypadkach, gdy drobnoustroje nie są w stanie być hodowane. Zaleca się, aby wtyczki były podzielone na wiele sekcji, aby umożliwić zarówno podejście do hodowli, jak i sekwencjonowania.

Zaletą tych urządzeń jest to, że mogą być używane zarówno w laboratorium, jak i w terenie. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby kolumny na polu mogły pozostać w pozycji pionowej i były chronione przed zwierzętami i zakłóceniami środowiskowymi, które mogłyby zakłócić ich ustawienie. Kolumny nie zostały jeszcze przetestowane w pozycji poziomej, w pozycji, w której są całkowicie pokryte podłożem, i nie były testowane w środowiskach, które są narażone na znaczne opady deszczu lub śniegu. Jak wspomniano powyżej, struktura kratowa została zaprojektowana tak, aby zminimalizować prawdopodobieństwo przemieszczenia się bakterii na podłoże docelowe w środowiskach o wysokiej wilgotności. Możliwe jest jednak, że gdyby kolumna była wystawiona na działanie większych objętości wody i ta woda całkowicie nasyciła kolumnę, ruch bakterii byłby ułatwiony w całej kolumnie niezależnie od obecnych autostrad grzybów. W przypadku eksperymentów laboratoryjnych kolumny mogą być używane w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, małych mikrokosmosach substratów, w glebie otaczającej rośliny doniczkowe, w pudełkach lub w innych kontrolowanych systemach eksperymentalnych. Kolumny są z powodzeniem stosowane w glebie, ryzosferach i oborniku, a ich użyteczność można rozszerzyć na inne podłoża, w tym ściółkę z liści, szlam, piasek, śnieg, kompost itp.

Kolumny autostrad grzybów umożliwiają szereg porównań w celu zrozumienia tego fenotypu BFI w różnych typach próbek. Porównanie składu społeczności między przynętą a pożywką docelową może wskazać, które bakterie mogą wykorzystywać autostrady grzybów, a które grzyby mogą służyć jako potencjalne autostrady9. Jeśli stosuje się sekwencjonowanie metagenomu, można również zbadać cechy genomu, które odróżniają organizmy od przynęty od pożywki docelowej. Możliwe jest również porównanie pożywek docelowych z kolumn umieszczonych na różnych podłożach (np. gleba kontra obornik) lub umieszczonych na tym samym podłożu w różnych warunkach (np. temperatura lub wilgotność). Ogólnie rzecz biorąc, kolumny autostrad grzybów rozszerzają możliwości poprzednich metod badania tej formy BFI i umożliwiają szeroko zakrojone badania tych interakcji, które kształtują dynamikę przestrzenną złożonych mikrobiomów środowiskowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Science Focus Area Grant z Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE), Biological and Environmental Research (BER), Biological System Science Division (BSSD) w ramach grantu numer LANLF59T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 50 mlGreiner BIO-ONE5622-7261Probówki 50 ml do wykonywania eksperymentów kolumnowych w laboratorium
Szalki Petriego 90 mmThermo Scientific Nunc08-757-099Szalki Petriego do przygotowania agaru i do rozwoju mikroorganizmów
Drukarka 3D Asiga Freeform Pico Plus 39 z cyfrowym przetwarzaniem światła (DLP)Asiga NiemcyDowolny kształt Pico Plus 39Drukarka 3D służąca do generowania wsadów kolumn; możliwość użycia innych drukarek 3D
AutoklawFisher NaukowyLS40F20Autoklaw stołowy do sterylizacji elementów kolumny
ZlewkaFisher NaukowyFB100600Zlewka 600 ml do różnych zastosowań w całym protokole
Żywica bezbarwna Dental LT V2Laboratoria formoweRS-F2-DLCL-02Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana
Żywica dentystycznego przewodnika chirurgicznegoLaboratoria formoweRS-F2-SGAM-01Służył do generowania kolumn omówionych w rękopisie; Zamiast tego materiału można zastosować inne żywice światłoczułe
Probówki DNA Low Bind 1,5 mlEppendorf powiedział:13-698-791Probówki używane do różnych preparatów, w tym ekstrakcji kwasów nukleinowych
Środek konserwujący tarczę DNA/RNABadania ZymoCzynnik chłodniczy R1100-50Środek konserwujący stosowany przed ekstrakcją kwasami nukleinowymi
EDGE BioinformatykaOtwarte oprogramowanie; Opracowany przez Los Alamos National Laboratory (LANL)N/aPlatforma bioinformatyczna do przetwarzania danych amplikonowych
Zestaw wirowy FastDNA do glebyMP Biomedicals Sp. z o.o.116560200-CFOpcjonalny zestaw do ekstrakcji DNA do gleby
KleszczeFisher Naukowy10-300Kleszcze, które można sterylizować
Żywica bezbarwna Formlabs BioMedLaboratoria formowePrzekaźnik RS-F2-BMCL-01Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana
Drukarka 3D stereolitografia (SLA) Formlabs Form 3B+Laboratoria formoweFormularz 3B+Alternatywna drukarka 3D
Żywica IBT FormlabsLaboratoria formoweRS-F2-IBCL-01Alternatywna żywica do druku 3D, która została przetestowana
Pętle inokulacyjneFisher Naukowy22-363-598Służy do izolacji/przenoszenia drobnoustrojów
Agar z ekstraktem słodowym (MEA)Kryterium89405-654Typ nośnika używany w kolumnach
Sekwencer MiSeq + zestaw do sekwencjonowania MiSeqOświetlenieSY-410-1003Może korzystać z innych sekwencerów
Zaprawa murarska & TłuczekFisher NaukowyFB961K; FB961AMożna użyć dowolnej zwykłej zaprawy i tłuczek, który można sterylizować między użyciami
NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla IlluminaLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiE7805SZestaw do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania metagenomicznego
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (24 próbki)OświetlenieFC-131-1024Zestaw do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania amplikonów
KRAWĘDŹ NMDCOtwarte źródło: Opracowane przez National Microbiome Data Collaborative (NMDC)N/aPlatforma bioinformatyczna do przetwarzania danych metagenomicznych
Siatka nylonowaSefar powiedział:03-25/19Siatka zastosowana jako część konstrukcji słupa
Końcówki do pipetRainin30807966Może używać wielu różnych sterylizowanych końcówek pipet do etapów protokołu
Agar ziemniaczany dekstrozaCole'a ParmeraEW-14200-28Typ nośnika używany w kolumnach
QIIME2 powiedział:Otwarty kod źródłowyN/aOprogramowanie do przetwarzania danych amplikonowych
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HSThermo Fisher NaukowyPytanie Q32851 powiedział:Służy do ilościowego oznaczania DNA po ekstrakcjach
Fluorometr kubitowyThermo Fisher NaukowyPytanie Q33238 powiedział:Służy do ilościowego oznaczania DNA po ekstrakcjach
Quick-DNA Zestaw do miniprzygotowania grzybów/bakteriiBadania ZymoZobacz materiał D6005Opcjonalny zestaw do ekstrakcji DNA, który działa zarówno z bakteriami, jak i grzybami
Agar R2ABD Difco218263Typ podłoża stosowanego w kolumnach (pożywka bakteryjna)
Stojak na probówki 50 mlFisher Naukowy03-448-11Stojak do przechowywania probówek 50 ml w pozycji pionowej
NożyczkiFisher Naukowy12-000-155Precyzyjne nożyczki, które można sterylizować
Pożywka sodowa karboksymetylocelulozyAldrichNumer katalogowy: 419273-100GTyp nośnika używany w kolumnach
Oprogramowanie CAD SolidWorksSolidWorks (SolidWorks)N/aOprogramowanie wykorzystywane do projektowania kolumn
Szufelka do kielniFisher NaukowyNumer katalogowy S41701 powiedział:Aby wykonać wgłębienie w podłożu przed dodaniem kolumny
Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNazInvitrogen: ThermoFisher Scientific10977015Woda do kąpieli wodnej ultradźwięków
UltradźwiękiFisher NaukowyFB-11201 (Zobacz materiał FB-11201)Ultradźwiękowiec do czyszczenia kolumn

Bibliografia

  1. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review. Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).
  2. Kohlmeier, S., et al. Taking the fungal highway: Mobilization of pollutant-degrading bacteria by fungi. Environ Sci Technol. 39 (12), 4640-4646 (2005).
  3. Simon, A., Hervé, V., Al-Dourobi, A., Verrecchia, E., Junier, P. An in situ inventory of fungi and their associated migrating bacteria in forest soils using fungal highway columns. FEMS Microbiol Ecol. 93 (1), 217(2017).
  4. Wick, L. Y., et al. Effect of fungal hyphae on the access of bacteria to phenanthrene in soil. Environ Sci Technol. 41 (2), 500-505 (2007).
  5. Bravo, D., et al. Isolation of oxalotrophic bacteria able to disperse on fungal mycelium. FEMS Microbiol Lett. 348 (2), 157-166 (2013).
  6. Furuno, S., Remer, R., Chatzinotas, A., Harms, H., Wick, L. Y. Use of mycelia as paths for the isolation of contaminant-degrading bacteria from soil. Microb Biotechnol. 5 (1), 142-148 (2012).
  7. Buffi, M., et al. Fungal drops: A novel approach for macro- and microscopic analyses of fungal mycelial growth. Microlife. 4, 042(2023).
  8. Kuhn, T., et al. Design and construction of 3D printed devices to investigate active and passive bacterial dispersal on hydrated surfaces. BMC Biol. 20 (1), 203(2022).
  9. Junier, P., et al. Democratization of fungal highway columns as a tool to investigate bacteria associated with soil fungi. FEMS Microbiol Ecol. 97 (2), 003(2021).
  10. Reasoner, D. J., Geldreich, E. E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol. 49 (1), 1-7 (1985).
  11. Bolyen, E., et al. Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
  12. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  13. Vázquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. EMPeror: A tool for visualizing high-throughput microbial community data. Gigascience. 2 (1), 16(2013).
  14. Li, P. -E., et al. Enabling the democratization of the genomics revolution with a fully integrated web-based bioinformatics platform. Nucleic Acids Res. 45 (1), 67-80 (2017).
  15. Eloe-Fadrosh, E. A., et al. The National Microbiome Data Collaborative Data Portal: An integrated multi-omics microbiome data resource. Nucleic Acids Res. 50 (1), D828-D836 (2022).
  16. Kans, J. Entrez Direct: E-utilities on the Unix Command Line. Entrez Programming Utilities Help. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK179288/ (2024).
  17. Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3D printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
  18. Guttridge, C., Shannon, A., O'Sullivan, A., O'Sullivan, K. J., O'Sullivan, L. W. Biocompatible 3D printing resins for medical applications: A review of marketed intended use, biocompatibility certification, and post-processing guidance. Ann 3D Print Med. 5, 100044(2022).
  19. Yao, L., et al. Comparison of accuracy and precision of various types of photo-curing printing technology. J Phys Conf Ser. 1549 (3), 032151(2020).
  20. Basu, S., et al. Evolution of bacterial and fungal growth media. Bioinformation. 11 (4), 182-184 (2015).
  21. Liu, Y. -X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein Cell. 12 (5), 315-330 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sieci grzybniowedyspersja mikroorganizmówgrzyby nitkowatespołeczność mikrobiologicznafunkcje biogeochemicznedynamika przestrzennazastosowania in situmikrobiologia gleby
Badanie interakcji bakteryjno-grzybowych przy użyciu kolumn autostradowych grzybów w różnych środowiskach i podłożach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.