Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jaskra jest główną przyczyną ślepoty na całym świecie, charakteryzującą się złożonym mechanizmem patogennym, który sprawia, że przywrócenie wzroku jest trudne. Myszy służą jako cenne modele zwierzęce do badania patogenezy i leczenia jaskry ze względu na ich stosunkowo jednorodne tło genetyczne i komórki zwojowe siatkówki (RGC), które strukturalnie przypominają te u ludzi. Dokładna ocena uszkodzeń RGC i wyników leczenia w modelach jaskry myszy wymaga określenia liczby RGC w całej siatkówce. Protokół ten przedstawia kompleksową metodę obejmującą izolację całej siatkówki, znakowanie RGC specyficznymi przeciwciałami oraz szybkie, dokładne automatyczne zliczanie RGC przy użyciu programu opartego na sztucznej inteligencji. Uproszczone podejście pozwala na skuteczne i precyzyjne określenie liczby RGC w siatkówkach myszy, ułatwiając ocenę zwyrodnienia RGC i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Umożliwiając naukowcom ocenę zakresu uszkodzeń RGC, protokół ten przyczynia się do głębszego zrozumienia patogenezy jaskry i pomaga w opracowaniu skutecznych strategii leczenia w celu radzenia sobie z utratą wzroku i zapobiegania jej.
Wprowadzenie
Jaskra charakteryzuje się postępującą śmiercią komórek zwojowych, co stanowi poważne wyzwanie dla przywrócenia wzroku1,2. Choroba ta jest głównym przedmiotem badań okulistycznych ze względu na jej rozpowszechnienie i wpływ na wzrok3. Modele mysie są niezbędne w jaskrze
Badania ze względu na ich jednorodne pochodzenie genetyczne, wysoką zdolność reprodukcyjną i podobieństwo właściwości ich komórek zwojowych do ludzi4. Głównym celem tej metody jest dokładne ilościowe określenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w modelach mysich, co jest niezbędne do zrozumienia patogenezy jaskry i opracowania odpowiednich metod leczenia.
Uzasadnienie dla rozwoju tej techniki wynika z potrzeby niezawodnej i efektywnej metody oceny degeneracji RGC w modelach mysich. Tradycyjne metody, takie jak znakowanie RGC w przekrojach siatkówki, często dają niewiarygodne wyniki ze względu na nierównomierny rozkład RGC w siatkówce5. Ilościowe określenie RGC w całej siatkówce lepiej odzwierciedla zmiany w ich liczbie i ma kluczowe znaczenie dla oceny postępu choroby i interwencji terapeutycznych.
Ta metoda oferuje kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi technikami. Na przykład ręczne liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w normalnej siatkówce dorosłej myszy, która zawiera od 40 000 do 60 000 RGC, może być czasochłonne i podatne na błędy6,7,8. Opracowane przez nas oprogramowanie do automatycznego liczenia RGC pozwala na dokładne liczenie w czasie krótszym niż 3 minuty, potencjalnie oszczędzając naukowcom znaczną ilość czasu. Ponadto oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji wykorzystywane do automatycznego liczenia minimalizuje odchylenia i zwiększa odtwarzalność.
Ponadto, ta technika zapewnia ustandaryzowane podejście do oceny degeneracji RGC w różnych modelach myszy i warunkach eksperymentalnych, dostarczając cennych danych do badań nad jaskrą. Metoda jest zgodna z innymi badaniami, które podkreślają znaczenie analizy całej siatkówki dla zrozumienia zmian siatkówki w chorobach9.
Aby pomóc czytelnikom określić, czy ta metoda jest odpowiednia dla ich zastosowania, ważne jest, aby zauważyć, że ta technika jest szczególnie korzystna dla badaczy badających zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) w mysich modelach jaskry lub innych chorób siatkówki. Metodę można dostosować do różnych konfiguracji eksperymentalnych i oferuje wysoki stopień dokładności i wydajności w zliczaniu RGC, dzięki czemu idealnie nadaje się zarówno do badań na małą, jak i dużą skalę. Ponadto prosta konstrukcja protokołu i dostępność przyjaznego dla użytkownika oprogramowania sprawiają, że jest on dostępny dla badaczy o różnym poziomie wiedzy specjalistycznej w zakresie analizy siatkówki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura była zgodna z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystywania zwierząt w badaniach i została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ludowego Prowincji Syczuan. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57Bl/6J (w wieku 2 miesięcy). Rysunek 1 ilustruje całą procedurę opisaną tutaj. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja całych siatek siatkówki
- Składanie ofiar ze zwierząt
- Złóż w ofierze myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) (Rysunek 2A). Przed zwichnięciem szyjki macicy,
Znieczulenie myszy należy poprzez wdychanie izofluranu (3% -5% tlenu) lub dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny.
- Złóż w ofierze myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) (Rysunek 2A). Przed zwichnięciem szyjki macicy,
- Wyłuszczenie i przetwarzanie gałek ocznych
- Zaznacz krawędź rogówki po grzbietowej stronie gałki ocznej niebieskim markerem, aby zapamiętać orientację podczas późniejszej sekcji.
- Usuń resztki tkanek mięśniowych przyczepionych do gałki ocznej za pomocą nożyczek. Przenieś wyłuszczoną gałkę oczną do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 1x PBS w celu krótkiego płukania (Rysunek 2C).
- Utrwalenie
- Przenieś gałkę oczną do innej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml z okrągłym dnem, zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd (PFA) w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 10 minut (Rysunek 2D).
- Wykonaj małe nacięcie (około 1-2 mm) na rogówce za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem preparacyjnym.
- Umieść gałkę oczną z powrotem w utrwalaczu w celu dalszego utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 3 godziny, aby zachować morfologię tkanki (Rysunek 2D).
- Usunięcie rogówki i soczewki1,9
- Wykonaj małe nacięcie o długości około 1 mm wokół rąbka rogówki, granicy między rogówką a twardówką, za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.
- Ostrożnie przeciąć na obwodzie rogówki, wycinając ją całkowicie, aby odsłonić leżące pod nią struktury.
- Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie chwycić i ostrożnie podnieść soczewkę z otaczających tkanek, aby zapobiec uszkodzeniu siatkówki. Utrzymuj integralność strukturalną siatkówki przy delikatnej operacji.
- Przenieś muszlę oczną do probówki mikrowirówkowej w celu dalszej obróbki.
UWAGA: Wytnij rogówkę i wyprowadź soczewkę bardziej efektywnie, stosując technikę "szczeliny krzyżowej"10. Wykonaj dwie prostopadłe szczeliny w poprzek rogówki i użyj kleszczy, aby wyjąć soczewkę.
- Nacięcie twardówki
- Wytnij precyzyjną szczelinę w twardówce za pomocą cienkich nożyczek okulistycznych, aby ułatwić kolejne etapy sekcji (Rysunek 2J).
- Separacja siatkówki
- Włóż kleszcze z zębami do nacięcia między twardówką a siatkówką. Delikatnie chwyć krawędź twardówki, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec rozerwaniu tkanki.
- Stopniowo powiększaj nacięcie, przesuwając kleszcze wzdłuż granicy między twardówką a siatkówką powolnymi, pewnymi ruchami ręki. Użyj ząbkowanej części kleszczy, aby ostrożnie oddzielić twardówkę od siatkówki, upewniając się, że siatkówka nie jest uszkodzona (Rysunek 2J).
- Przecięcie siatkówki
- Podziel siatkówkę na cztery mniej więcej równej wielkości płaty za pomocą ostrych nożyczek. Upewnij się, że nacięcia znajdują się mniej więcej w połowie drogi w kierunku nerwu wzrokowego i są zorientowane pod kątem 90° od siebie.
- Oczyszczanie siatkówki
- Delikatnie rozłóż wypreparowaną siatkówkę za pomocą szczotki o miękkim włosiu i skrupulatnie usuń zanieczyszczenia z jej powierzchni (Rysunek 2K).
- Ostateczne utrwalenie
- Przenieś izolowaną siatkówkę do probówki mikrowirówkowej zawierającej świeże 4% PFA za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Pozostaw do utrwalenia na lodzie przez dodatkowe 5 godzin do nocy w celu zachowania tkanek.
2. Barwienie immunologiczne
- mycie
- Przemyć izolowaną siatkówkę w całości w 1x PBS z delikatnym mieszaniem przez 5 minut. Wyrzuć roztwór PBS. Powtórz ten proces dwukrotnie, aby usunąć resztki utrwalacza i zanieczyszczenia.
- Blokowanie
- Zanurz przemytą siatkówkę w blokującym roztworze buforowym (1x PBS z 4% normalną surowicą osła (NDS) i 0,2% Triton X-100) na 30 minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał i zwiększyć przepuszczalność (Figura 3A).
- Inkubacja przeciwciał pierwotnych
- Zastąp bufor blokujący przeciwciałem pierwszorzędowym BRN3A (rozcieńczonym w stosunku 1:200 w buforze blokującym). Inkubować siatkówkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić specyficzne wiązanie antygen-przeciwciało (Figura 3B).
- mycie
- Przemyj siatkówkę trzy razy 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe i zmniejszyć barwienie tła (Rysunek 3C).
- Inkubacja przeciwciał wtórnych
- Inkubuj siatkówkę z drugorzędowym przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z Alexa594 lub Alexa488 (rozcieńczonym 1:300) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić docelowe antygeny (Rysunek 3D).
- mycie
- Wykonaj trzy kolejne płukania 1x PBS przez 5 minut każde, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych i zminimalizować niespecyficzne wiązanie.
- Montażu
- Delikatnie przenieś immunologicznie wybarwioną siatkówkę na szklane szkiełko mikroskopowe, ostrożnie je spłaszczając, aby zminimalizować fałdowanie lub zniekształcenie.
- Nałóż niewielką kroplę środka mocującego zapobiegającego blaknięciu na środek siatkówki, zapewniając równomierne rozprowadzenie w tkance.
- Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na zamontowanej siatkówce, unikając pęcherzyków powietrza (Rysunek 3E,F).
3. Przetwarzanie obrazu
UWAGA: Zaimportuj obraz do oprogramowania do automatycznego liczenia RGC i rozpocznij liczenie. Liczbę komórek BRN3A-dodatnich dla całej siatkówki można uzyskać w ciągu kilku minut. Pobierz oprogramowanie AutoCount z GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Postępuj zgodnie z poniższymi szczegółowymi krokami instalacji oprogramowania:
- Pobierz kod z linku GitHub. Otrzymasz plik o nazwie "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Rozpakuj ten plik.
- Pobierz niezbędne pliki z dysku w chmurze (patrz Spis materiałów) i rozpakuj je. Pobrany plik nosi nazwę "yolov5_cpu". Rozpakuj ten pakiet do bieżącego folderu, aby uniknąć nieoczekiwanych problemów.
- Znajdź plik konfiguracyjny z kroku 1 i zmodyfikuj jego zawartość tak, aby wskazywała ścieżkę "yolov5_cpu".
UWAGA: Na przykład, jeśli pobrany plik "yolov5_cpu" zostanie umieszczony w folderze "D:\1me\yolov5_cpu_", zmień plik "config.ini" w kroku 1 na "D:/1me/yolov5_cpu" (użyj / zamiast \). (Rysunek 4A). - Otwórz interfejs graficzny, klikając userinterface.exe. Początkowe ładowanie może być powolne (uruchom jako administrator) (Rysunek 4B).
- Po otwarciu oprogramowania sprawdź, czy plik modelu "pmse_plus.pt" znajduje się w katalogu głównym dysku C. Jeśli go nie ma, skopiuj go do tego katalogu.
UWAGA: Plik modelu "pmse_plus.pt" znajduje się w folderze weights folderu "yolov5", który znajduje się w wyodrębnionym folderze Intelligent-quantifying RGCs (Rysunek 4C). - Przygotuj obrazy do wykrycia.
UWAGA: Oprogramowanie pozwala na odczytanie tylko jednego lub pięciu zdjęć na raz. Przeczytanie więcej spowoduje błąd.
4. Automatyczne zliczanie komórek
- Otwórz oprogramowanie do liczenia (Rysunek 5A).
- Kliknij OTWÓRZ OBRAZ, aby zaimportować obraz (Rysunek 5B).
- Kliknij URUCHOM, aby oprogramowanie automatycznie zliczyło komórki (Rysunek 5C).
UWAGA: Oprogramowanie oznaczy zliczone komórki czerwonym kwadratowym polem i wyświetli liczbę komórek w prawym górnym rogu (Rysunek 5D).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodologię całego preparatu immunobarwienia siatkówek myszy, zapewniając staranne przygotowanie tkanki, precyzyjną inkubację przeciwciał oraz wiarygodne zautomatyzowane liczenie komórek. Procedura ta umożliwia skuteczne znakowanie i kwantyfikację komórek zwojowych siatkówki (RGCs), co pozwala na dokładną ocenę populacji komórkowych w różnych kontekstach eksperymentalnych. Metodę tę zastosowano do zliczenia RGCs u myszy typu dzikiego oraz myszy z modelem jaskry, uzyskując spójne wyn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten zapewnia metodę określania wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC) w siatkówce myszy, która może być wykorzystana do monitorowania postępu zwyrodnienia RGC w modelach mysich do badań jaskry. Siatkówka myszy jest delikatną tkanką nerwową5, a izolowanie całych siatkówek od oczu myszy wymaga wielokrotnej praktyki. Podczas eksperymentów stwierdzono, że czas fiksacji znacząco wpływa na morfologię siatkówki. W przypadku myszy w wieku około 2 tygodni czas utrwalenia wynoszący 20 minut j...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt badawczy był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82371059 (H.Z.)), Departament Nauki i Technologii Prowincji Sychuan, Chiny (2023JDZH0002 (H.Z.)), Biuro Nauki i Technologii Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)) oraz Szpital Ludowy Prowincji Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 i razy; PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594-sprzężony kozioł anty-królik IgG (H+L) | ThermoFisher | A-11012 | |
| Przeciwciało anty-BRN3A [EPR23257-285] | Oprogramowanie | ||
| AutoCount | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| Dysk w chmurze | Baidu | link Kod ekstrakcji: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Marker | Sharpie | ||
| Normal Donkey Serum | Biosharp, Labgic 25030081 | ||
| Paraformaldehyde | Macklin P804536 | ||
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sacharoza | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
Bibliografia
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
