Ten protokół zawiera przewodnik do impregnacji skóry cyjanoakrylem, aby zapobiec wchłanianiu moczu przez sierść i skórę. Zawiera instrukcję nakładania kleju na skórę, wszczepiania cewnika do pęcherza moczowego oraz elektrody do cystometrii i zapisy elektromiografii zewnętrznego zwieracza cewki moczowej u obudzonych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja technik urodynamicznych myszy w celu zwiększenia dokładności
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dokładny pomiar parametrów moczu u obudzonych myszy jest kluczowy dla zrozumienia dysfunkcji dolnych dróg moczowych (LUT), szczególnie w stanach takich jak neurogenny pęcherz moczowy po urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego (SCI). Jednak prowadzenie zapisów cystometrycznych u myszy stanowi poważne wyzwanie. Kiedy myszy znajdują się w pozycji leżącej i ograniczonej podczas sesji nagraniowych, mocz ma tendencję do wchłaniania przez sierść i skórę, co prowadzi do niedoszacowania objętości mikcji (VV). Celem tego badania było zwiększenie dokładności zapisów cystometrii i elektromiografii zwieracza cewki moczowej zewnętrznej (EUS-EMG) u wybudzonych myszy. Opracowaliśmy unikalną metodę wykorzystującą klej cyjanoakrylowy do stworzenia wodoodpornej bariery skórnej wokół ujścia cewki moczowej i brzucha, zapobiegając wchłanianiu moczu i zapewniając precyzyjne pomiary. Wyniki pokazują, że po zastosowaniu cyjanoakrylanu suma VV i RV pozostała zgodna z objętością podawanej soli fizjologicznej, a po eksperymencie nie zaobserwowano żadnych mokrych obszarów, co wskazuje na skuteczne zapobieganie wchłanianiu moczu. Dodatkowo metoda jednocześnie ustabilizowała elektrody połączone ze zwieraczem zewnętrznym cewki moczowej (EUS), zapewniła stabilne sygnały elektromiografii (EMG) oraz zminimalizowała artefakty spowodowane ruchem obudzonej myszy i manipulacją eksperymentatora. Omówiono szczegóły metodologiczne, wyniki i implikacje, podkreślając znaczenie doskonalenia technik urodynamicznych w badaniach przedklinicznych.
Wprowadzenie
Przechowywanie i uwalnianie moczu zależy od skoordynowanej aktywności pęcherza moczowego i zewnętrznego zwieracza cewki moczowej (EUS). W niektórych patologiach, takich jak pęcherz neurogenny, zarówno mięśnie wypieracza pęcherza, jak i zwieracz mogą stać się dysfunkcyjne, co prowadzi do poważnych problemów z pęcherzem, zwłaszcza po urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego (SCI)1.
Małe gryzonie są powszechnie używane jako model eksperymentalny do badania przedklinicznej funkcji dolnych dróg moczowych (LUT)2. Techniki rejestracji cystometrii wypełniającej (FC) i elektromiografii EUS (EUS-EMG) mogą dostarczyć precyzyjnych, obiektywnych informacji w zależności od wyboru metod, dokładnego pomiaru i interpretacji wyników3. Testy urodynamiczne są powszechnie stosowane do oceny objętości mikcji (VV), skuteczności mikcji (VE) i pojemności pęcherza4. VE mierzy, jak skutecznie pęcherz może się opróżnić. Oblicza się go, dzieląc objętość opróżnioną przez sumę objętości opróżnionej i pozostałej (VV+RV). Z drugiej strony, pojemność pęcherza oblicza się, dodając VV (ilość moczu wydalanego podczas oddawania moczu) do RV (ilość moczu pozostałego w pęcherzu po oddaniu moczu)5. Dlatego pomiar VV i RV jest kluczem do wydedukowania innych parametrów.
Precyzyjny pomiar VV u myszy podczas testów urodynamicznych stanowi różne wyzwania. Mocz gryzoni, gdy jest fizycznie skrępowany w pozycji leżącej, ma tendencję do wciągania w dół przez brzuszną ścianę brzucha pod wpływem grawitacji6. Zjawisko to może prowadzić do wchłaniania moczu przez sierść i skórę brzucha, co z kolei zaniża objętość wydalanego moczu. Biorąc pod uwagę niewielką ilość moczu wytwarzanego przez mysz, wpływ tej absorbancji na dokładność wyników jest jeszcze wyraźniejszy7. Co więcej, w modelach SCI VV jest często niższe niż u normalnych myszy ze względu na wpływ dyssynergii zwieracza wypieracza (DSD), która zwiększa ryzyko ciśnienia w punkcie przecieku i wchłaniania moczu przez für8. Czynniki te mają znaczący wpływ na wyniki. Dlatego dokładny pomiar VV i RV podczas końcowych badań urodynamicznych u myszy ma kluczowe znaczenie9. Obecnie brakuje szczegółów w metodologiach podawanych w opublikowanej literaturze na temat dokładnego pomiaru objętości moczu w modelach mysich.
Klej cyjanoakrylowy to rodzaj kleju, który jest powszechnie stosowany w zabiegach chirurgicznych na modelach ludzkich i zwierzęcych ze względu na jego szybkie i skuteczne właściwości wiążące10,11,12. Klej ten jest szczególnie przydatny do zamykania ran i ran szarpanych, ponieważ po nałożeniu na skórę tworzy mocne i elastyczne wiązanie13. Co więcej, może stanowić świetną barierę przed moczem i wilgocią, które mogą mieć kontakt z sierścią i ranami11.
W tym artykule opracowaliśmy nowatorską i opłacalną technikę, która wykorzystuje klej cyjanoakrylowy do uzyskania precyzyjnych wyników w cystometrii i zapisach EUS-EMG u obudzonych myszy. Metoda ta będzie korzystna w zrozumieniu podstawowych przyczyn dysfunkcji pęcherza moczowego i opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia zaburzeń LUT.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół badania na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szkoły Medycznej Uniwersytetu Indiana. Kod homologacji: 21098MD/R/MSS/HZ Data homologacji: 29 September 2021.
1. Przygotowanie cewnika
- Wytnij rurkę z polietylenu PE-30 o długości 30 cm (0,017 cala x 0,030 cala). Użyj zapalniczki, aby poszerzyć jeden koniec tuby, upewniając się, że nie dotyka płomienia i wyjmując zapalniczkę, gdy rurka utworzy odpowiednio okrągłą końcówkę w kształcie dzwonu. Wszelkie pozostałości po procedurze rozszerzania są następnie starannie oczyszczane lub usuwane przed przystąpieniem do zabiegu.
- Ostrożnie włóż około 3/4 igły 25G do drugiego końca probówki. Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml i napełnij ją sterylnym 0,9% NaCl. Podłączyć strzykawkę do igły 25 G.
- Delikatnie zaparz sól fizjologiczną, aby sprawdzić, czy końcówki igły są prawidłowo okrągłe i czy nie ma wycieków z końców igły. Upewnij się, że nie jest wyczuwalny ucisk, a sól fizjologiczna płynnie przepływa przez cewnik.
2. Przygotowanie elektrod
- Przygotuj 2 stalowe druty o długości 20 cm. Weź stalowe druty i nałóż piasek na oba końce strefy powlekania, aby usunąć 5 mm drutu.
- Weź igłę 25G i włóż ją po jednej stronie drutu. Upewnij się, że igła została włożona ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia drutu. Zegnij odizolowaną część drutu jak hak. Haczyk pomoże połączyć drut z mięśniem EUS.
- Użyj lutu, aby przymocować kołek do drugiego końca drutu w paski. pomoże przymocować pin do drutu i zapewni mocne połączenie. Upewnij się, że cynowo-ołowiowe jest podgrzewane, aż się stopi i zakryje drut i kołek.
3. Przygotowanie zwierzęcia
- Samica myszy domowej C57BL/6 (8 tygodni, 18-20 g masy ciała) w obiekcie dla zwierząt zgodnie z Institutional Animal Care z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i nieograniczonym dostępem do wody i standardowych granulek pokarmowych.
UWAGA: Przed procedurami eksperymentalnymi myszy aklimatyzowano się w aparacie krępującym przez okres trzech dni. W tym czasie każda mysz była umieszczana w układzie na 10-15 minut dziennie, co pozwoliło im zapoznać się z konfiguracją. Myszy były monitorowane pod kątem oznak niepokoju i wprowadzono poprawki, aby zapewnić spokojne doświadczenie. Aklimatyzacja ta miała na celu zmniejszenie lęku i poprawę dobrostanu zwierząt podczas eksperymentów
4. Znieczulenie podczas operacji
- Umieścić zwierzęta w komorze z 2% izofluranem i czystym tlenem (1 l/min). Potwierdź pełne znieczulenie zwierzęcia za pomocą ujemnego badania szczypania palców u nóg przed przeniesieniem go do maski. Po potwierdzeniu zmień stan gazu na maskę.
- Upewnij się, że maska anestezjologiczna jest zamocowana w
w odpowiedniej pozycji na sterylnym polu operacyjnym. Umieść zwierzę na wznak na poduszce grzewczej pokrytej sterylną serwetą z nosem w małej masce do inhalacji (0,8-1 l/min z 2% izofluranem), aby kontynuować podawanie znieczulenia.
5. Przygotowanie chirurgiczne
- Przymocuj kończyny zwierzęcia taśmą. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić sierść w dolnej części brzucha i wokół ujścia cewki moczowej (okolica narządów płciowych). Meloksykam (5 mg/ml) należy podawać podskórnie jako zapobiegawczy środek przeciwbólowy myszy przed zabiegiem chirurgicznym, aby zapewnić skuteczne leczenie bólu.
- Nałóż maść na oczy, aby zapobiec potencjalnej suchości oczu. Przygotuj ogolone miejsce za pomocą roztworu jodu powidonu i zetrzyj roztwór 70% etanolem. Umieść sterylną serwetę na obszarze operacyjnym.
- Wszystkie narzędzia chirurgiczne i druty elektrodowe należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15–20 minut, aby zapewnić sterylność przed zabiegiem. Namocz rurkę polietylenową w aldehydzie glutarowym lub tlenku etylenu na 20–30 minut, a następnie dokładnie spłucz sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie pozostałości
6. Zabieg chirurgiczny
- Implantacja cewnika do pęcherza moczowego
- Pod mikroskopem chirurgicznym, używając prostych, nożyczek Metzenbaum, wykonaj 1-2 cm nacięcie w linii środkowej skóry brzucha miednicy. Przystąp do nacinania powięzi i mięśni w linii środkowej, aby odsłonić pęcherz przez ranę po nacięciu.
- Gdy pęcherz jest widoczny przez ranę po nacięciu, przystąp do cofania otaczających narządów lub tkanek w razie potrzeby, aby uzyskać wyraźny widok pola operacyjnego. Uważaj, aby uniknąć niepotrzebnych manipulacji lub napięcia pęcherza, ponieważ może to prowadzić do powikłań, takich jak nietrzymanie moczu lub uszkodzenie otaczających struktur.
- Chwyć kopułę pęcherza moczowego i umieść sznurek torebki, używając niewchłanialnego szwu monofilamentowego 5-0 z igłą ze stożkową końcówką.
- Za pomocą mikronożyczek wykonaj małą cystostomię w sznurku torebki i zrób dziurę, aż mocz wypłynie.
- Chwyć okrągły koniec końcówki cewnika i włóż go przez otwór. Gdy końcówka rurki przejdzie przez otwór, zszyj sznurek torebki wokół rurki. Następnie delikatnie pociągnij rurkę na zewnątrz, aż końcówka zostanie wyczuwalna pod szwem.
- Powoli wlej 1 ml soli fizjologicznej z drugiego końca probówki, aby rozciągnąć pęcherz. Sprawdź, czy wokół cewnika nie ma wycieków. Jeśli występuje nieszczelność, załóż dodatkowy szew.
- Gdy sól fizjologiczna wydostanie się z cewki moczowej, wycofaj sól fizjologiczną, aby odbarczyć pęcherz.
- Implantacja elektrod EUS (Rysunek 1)
- Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przedłużyć nacięcie brzucha aż do dna miednicy.
- W linii z pęcherzem moczowym przenieś mięśnie i błony do kanałów sromowych i zlokalizuj cewkę moczową i mięsień zwieracza zewnętrznego. Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń biodrowych i środkowych ogonowych oraz nerwów sromowych.
- Nakłuć skórę obustronnie, w odległości 1 cm od ujścia cewki moczowej, za pomocą igły zawierającej elektrodę.
- Ostrożnie chwyć końcówkę haczyka kleszczami i delikatnie odciągnij igłę od skóry.
- Za pomocą końcówki elektrody ostrożnie zaczep mięsień EUS obustronnie. Unikaj uderzania zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić mięsień, co może prowadzić do możliwego wycieku moczu.
- Użyj niewchłanialnej żyłki 3-0 do zszycia mięśni miednicy i brzucha oraz skóry.
- Impregnacja skóry
- Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na skórę w miejscu, z którego wychodzą elektrody, aby zamocować elektrody na miejscu.
- Nałóż klej cyjanoakrylowy w odległości 1 cm od ujścia cewki moczowej i 3 cm dalej, rozciągając się do brzucha i okolicy zszytej. Aby uniknąć kontaktu z klejem, ostrożnie przytrzymaj ujście kleszczami.
- Użyj mikropipety o pojemności 0,5-10 μl, aby pobrać płyn przyspieszający i wysuszyć klej.
UWAGA: Płyn przyspieszający jest cieczą palną. - Dodaj płyn przyspieszający, aby zapewnić prawidłową reakcję adhezyjną. Pomoże to szybciej wyschnąć klej i zapewni jego bezpieczne związanie.
- Preparat urodynamiczny
- Przygotuj odwróconą łódź do ważenia polistyrenu o długości, szerokości i głębokości 4,5 cm. Pokrój go w kształt trójkąta o podstawie 4 cm, aby umieścić ujście cewki moczowej myszy w tym miejscu. Umieść jednorazową formę bazową o wymiarach 37 mm x 24 mm x 5 mm pod miejscem do zbierania moczu.
- Ustaw mysz w pozycji leżącej i ostrożnie przenieś ją na specjalnie wykonaną płytę wyposażoną w maskę przeciwgazową.
- Upewnij się, że przewód moczowy jest prawidłowo umieszczony w rowku. Po delikatnym przytrzymaniu głowy i kończyn myszy taśmą, upewniając się, że klatka piersiowa i nos są niezakłócone do oddychania, usuń znieczulenie wziewne. Użyj pulsoksymetrii lub monitoruj ruch ściany klatki piersiowej, aby sprawdzić oddychanie. Umieść płytkę na poduszce grzewczej w celu wsparcia ciepła i pozwól myszy dojść do siebie, aż odzyska pełną świadomość (Rysunek 2).
- Cystometrię należy wykonywać tylko wtedy, gdy mysz jest w pełni przytomna, czyli co najmniej 40 minut po wyzdrowieniu ze znieczulenia.
7. Cystometria i przygotowanie zapisu EUS-EMG
- Ustawić i skalibrować pompę infuzyjną zgodnie z instrukcjami producenta.
- Weź strzykawkę o pojemności 20 ml i średnicy 19,05 mm i napełnij ją sterylnym 0,9% NaCl w temperaturze pokojowej. Przymocować strzykawkę do pompy infuzyjnej. Ustawić szybkość infuzji na 0,01 ml/min.
- Podłączyć strzykawkę za rurkę PE-30 z jednej strony złącza trójdrożnego. Podłącz cewnik pęcherza moczowego z drugiej strony do przetwornika ciśnienia. Przed podłączeniem cewnika do pęcherza moczowego należy usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
- Zamocuj przetwornik ciśnienia na tym samym poziomie co pęcherz myszy. Przetwornik ciśnienia jest podłączony za pomocą wzmacniacza do systemu akwizycji danych.
- Przymocuj jeden haczyk do linii uziemiającej do skóry, a drugi do miejsc złącza elektrody. Zapisz ciśnienie w oprogramowaniu.
- Po uruchomieniu oprogramowania należy sprawdzić ciśnienie śródpęcherzowe (IVP) oraz sygnały EUS-EMG. Zapisz nazwę próbki i ustaw czas.
- Rozpocząć infuzję z pompą. Nagrywaj sygnały przez 40 minut. Na końcu nagrania należy poddać zwierzę eutanazji, ponieważ jest to procedura końcowa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do analizy danych wykorzystano cystometrię oraz zapisy aktywności EUS-EMG. Metoda ciągłej cystometrii polega na infuzji soli fizjologicznej do pęcherza przy jednoczesnym pomiarze zmian ciśnienia i objętości w pęcherzu. Aby zmierzyć VV, podano 0,4 mL soli fizjologicznej z prędkością 0,01 mL/min, a mocz zbierano przez 40 min do nakrętki. Pozostałość po mikcji (PVR) można uzyskać poprzez aspirację soli fizjologicznej przez cewnik. U prawidłowych myszy bez zastosowania kleju suma VV i RV często wynosiła mniej niż 0,4 mL. Po ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta technika urodynamiczna opisuje ulepszoną procedurę pomiaru objętości moczu i sygnału EUS-EMG u przytomnych i powściągliwych myszy. Obecność sierści wokół ujścia cewki moczowej i okolicy brzucha może zakłócać dokładność pomiaru VV poprzez wchłanianie moczu. Chociaż futro otaczające ujście cewki moczowej i brzuch zostało starannie ogolone przed operacją, pozostałe małe futra w tych obszarach i skórze nadal wchłaniały mocz, zwykle pozostawiając mokry obszar na brzuchu po nagraniu. Problem ten jest szczególnie zauważalny ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez NIH-NINDS (R21NS130241), IND DEPT HLTH (55051, 74247, 74244) i US ARMY (HT94252310700).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Akcelerator | BOB SMITH INDUSTRIES | BSI-152 | |
| Cyjanoakrylan | TED PELLA, Inc | 14478 | |
| Jednorazowa forma bazowa | TED PELLA, Inc | 27147-4 | |
| Pompa infuzyjna | Aparat Harvard PHD ULTRA | 70-3006 | |
| Isoflurane | Henry Schein Inc | 1182097 | |
| PIN | World Precision Instruments | 5482 | |
| Rurki polietylenowe 30 | Braintree Scientific Inc | PE30 | |
| Sterylna łódź wagowa | HEATHROW SCIENTIFIC | 797CK2 | |
| Windaq/Lite | DATAQ INSTRUMENTS 249022 |
Bibliografia
- Leslie, S. W., Tadi, P., Tayyeb, M. Neurogenic bladder and neurogenic lower urinary tract dysfunction. Statpearls. , (2024).
- Doelman, A. W., Streijger, F., Majerus, S. J., Damaser, M. S., Kwon, B. K. Assessing neurogenic lower urinary tract dysfunction after spinal cord injury: Animal models in preclinical neuro-urology research. Biomedicines. 11 (6), 1539(2023).
- Fraser, M. O., et al. Best practices for cystometric evaluation of lower urinary tract function in muriform rodents. Neurourol Urodyn. 39 (6), 1868-1884 (2020).
- Hashimoto, M., et al. Sex differences in lower urinary tract function in mice with or without spinal cord injury. Neurourol Urodyn. 43 (1), 267-275 (2024).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury-a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Lee, J., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. Int Urogynecol J. 14, 31-37 (2003).
- Mann-Gow, T. K., et al. Evaluating the procedure for performing awake cystometry in a mouse model. J Vis Exp. (123), e55588(2017).
- Saito, T., et al. Time-dependent progression of neurogenic lower urinary tract dysfunction after pinal cord injury in the mouse model. Am J Physiol Renal Physioly. 321 (1), F26-F32 (2021).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, 8-15 (2015).
- Habib, A., Mehanna, A., Medra, A. Cyanoacrylate: A handy tissue glue in maxillofacial surgery: Our experience in alexandria, egypt. J Maxillofac Oral Surg. 12, 243-247 (2013).
- Sunjic Roguljic, V., Roguljic, L., Jukic, I., Kovacic, V. The influence of wound closure techniques after surgical decompression in patients with carpal tunnel syndrome on sleep disturbance and life quality: A prospective comparison of surgical techniques. Clin Pract. 14 (2), 546-555 (2024).
- Sohn, J. J., Gruber, T. M., Zahorsky-Reeves, J. L., Lawson, G. W. Comparison of 2-ethyl-cyanoacrylate and 2-butyl-cyanoacrylate for use on the calvaria of cd1 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 55 (2), 199-203 (2016).
- Ren, H., et al. Injectable, self-healing hydrogel adhesives with firm tissue adhesion and on-demand biodegradation for sutureless wound closure. Sci Adv. 9 (33), 4327(2023).
- Ito, H., Pickering, A. E., Kanai, A., Fry, C. H., Drake, M. J. Muro-neuro-urodynamics; a review of the functional assessment of mouse lower urinary tract function. Front Physiol. 8, 240395(2017).
- Abdelkhalek, A. S., Youssef, H. A., Saleh, A. S., Bollen, P., Zvara, P. Anesthetic protocols for urodynamic studies of the lower urinary tract in small rodents-a systematic review. PloS One. 16 (6), e0253192(2021).
- Saab, B. J., et al. Short-term memory impairment after isoflurane in mice is prevented by the α5 γ-aminobutyric acid type a receptor inverse agonist l-655,708. J Am Soc Anesthesiol. 113 (5), 1061-1071 (2010).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69 (10), 1193-1202 (2001).
- Weiss, D. A., et al. Morphology of the external genitalia of the adult male and female mice as an endpoint of sex differentiation. Mol Cell Endocrinol. 354 (1-2), 94-102 (2012).
- Leggat, P. A., Kedjarune, U., Smith, D. R. Toxicity of cyanoacrylate adhesives and their occupational impacts for dental staff. Ind Health. 42 (2), 207-211 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
