Artykuł metodologiczny

Zebra II jako nowatorski system do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych u danio pręgowanego

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67066

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, UC Irvine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, UC Irvine, 3Sensoriis Inc., 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie przedstawia Zebra II, zaawansowany system do przedłużonej akwizycji i analizy EKG u danio pręgowanego. System ten posiada niezależny system perfuzyjny i wielopunktowe elektrody do obsługi wielu ryb w kontrolowanych środowiskach. Ostre skutki stosowania amiodaronu oceniano i analizowano na danio pręgowanym typu dzikiego.

Streszczenie

Danio pręgowany i jego zmutowane linie były szeroko wykorzystywane w badaniach biomedycznych, badaniach sercowo-naczyniowych i badaniach przesiewowych leków. W niniejszym badaniu zaprezentowano komercyjną wersję nowatorskiego systemu Zebra II. Protokół demonstruje akwizycję i analizę elektrokardiogramu (EKG) od wielu danio pręgowanych w kontrolowanych środowiskach pracy. Urządzenie składa się z zewnętrznego i niezależnego systemu perfuzyjnego, elektrody 4-punktowej, czujników temperatury oraz wbudowanego układu elektronicznego. W poprzednich badaniach prototyp urządzenia został poddany walidacji pod kątem sprawdzonego systemu iWORX w kilku testach, wykazując podobną jakość danych i reakcję EKG na interwencje lekowe. Następnie w badaniu skupiono się na zbadaniu wpływu leków znieczulających i wahań temperatury na EKG danio pręgowanego, co wymagało natychmiastowej oceny danych. Dzięki zdolności aparatu do konsekwentnego dostarczania środków znieczulających i leków, możliwe było wydłużenie zbierania danych EKG do 1 godziny, czyli znacznie dłużej niż 5 minut czasu obsługiwanego przez obecne systemy. W tym artykule przedstawiono pionierską, opartą na chmurze, zautomatyzowaną analizę wykorzystującą dane z czterech danio pręgowanego, oferując skuteczną metodę przeprowadzania eksperymentów łączonych oraz znacznie skracając czas i wysiłek. System okazał się skuteczny w rejestrowaniu i analizowaniu EKG, zwłaszcza w wykrywaniu arytmii wywołanych lekami u danio pręgowanego typu dzikiego. Ponadto możliwość gromadzenia danych z wielu kanałów ułatwiła przeprowadzenie randomizowanych, kontrolowanych badań z wykorzystaniem modeli danio pręgowanego. Opracowany system EKG pozwala przezwyciężyć istniejące ograniczenia, wykazując potencjał znacznego przyspieszenia odkrywania leków i badań sercowo-naczyniowych z udziałem danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Według raportu aktualizacyjnego AHA z 2024 r., każdego dnia w USA umiera około 2552 osób z powodu CVD, a średni bezpośredni i pośredni koszt CVD oszacowano na 378,0 mld USD w latach 2017-20181. Migotanie przedsionków (AF) jest jedną z najczęstszych zaburzeń rytmu serca w Stanach Zjednoczonych2 i wiąże się z niekorzystnym rokowaniem, zwiększając ryzyko udaru mózgu i zgonu zarówno w scenariuszach chorób sercowo-naczyniowych, jak i niesercowo-naczyniowych, co prowadzi do zwiększonego ryzyka wystąpienia działań niepożądanych3. Ten typ arytmii wyróżnia się szybką i nieregularną aktywnością elektryczną w przedsionkach, co zwykle skutkuje szybkim i nieregularnym rytmem komorowym4. Ponadto, biorąc pod uwagę ostatnie wydarzenia związane z COVID-19, wzrosła liczba badań i dowodów, które wskazują na zwiększone pojawianie się arytmii w odniesieniu do COVID-19, głównie do bradykardii zatokowej5. Po przeciwnej stronie migotania przedsionków, bradykardia zatokowa objawia się obniżonym i wolniejszym rytmem serca, z częstością akcji serca niższą niż 60 uderzeń na minutę (bpm). Diagnoza ta wymaga elektrokardiogramu (EKG) wykazującego prawidłowy rytm zatokowy z częstotliwością niższą niż 60 uderzeń na minutę.

Danio rerio, danio pręgowany, okazał się idealnym modelem do badań nad układem krążenia i rozwojem leków, ze względu na jego homologię do ludzi zarówno pod względem morfologii, fizjologii jak i genetyki6,7. Pomimo tego, że ma tylko dwie dostrzegalne komory w porównaniu z czterokomorowym sercem u ludzi, danio pręgowany ma podobną strukturę skurczową z analogicznym systemem przewodzenia8,9. W związku z tym model danio pręgowanego nadaje się do badania arytmii serca i badania związku między powiązanymi szlakami genetycznymi a cechami elektrofizjologicznymi poprzez analizę EKG. Jeśli chodzi o konstrukcję czujnika do zapisu EKG u danio pręgowanego, powszechnie stosuje się konwencjonalne elektrody igłowe10. Inne badania przedstawiały alternatywy dla konwencjonalnych igieł poprzez zaprojektowanie innego rodzaju igły wykonanej z różnych materiałów11, które zawierały materiały takie jak włókno wolframowe, stal nierdzewna i srebrny drut w celu oceny jakości zarejestrowanych danych. Wraz z przenośnym zestawem EKG starali się stworzyć uniwersalną platformę zarówno dla laboratoriów badawczych, jak i edukacyjnych.

System igieł został również wdrożony w innych badaniach11,12,13,14 do prowadzenia badań nad efektami biologicznymi i/lub lekami, w których wykazał zachęcające wyniki. Jednak, aby uzyskać optymalne sygnały, konieczne było ostrożne wprowadzenie igieł przez skórę właściwą danio pręgowanego. Ta inwazyjna procedura może spowodować uszkodzenie serca ryby z powodu ostrości igieł, co może spowodować zmianę morfologii sygnału13. Co więcej, dokładne umieszczenie elektrody na małym sercu bez powodowania szkód w celu zapewnienia wyraźnego uchwycenia EKG wymaga znacznej krzywej uczenia się. W związku z tym wprowadzono różne zastępcze systemy sond, takie jak matryce mikroelektrod (MEA) i czujniki drukowane w 3D. Zarówno nasz zespół, jak i inni badacze z powodzeniem wykorzystali MEA do pozyskiwania danych, uzyskując dane, które oferują dobry stosunek sygnału do szumu (SNR) wraz z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową15,16,17. Na przykład wprowadziliśmy MEA, który otacza serce ryby, umożliwiając uchwycenie specyficznych dla miejsca sygnałów EKG15,16. W przeciwieństwie do tego, inny zespół opracował inny rodzaj MEA oparty na elastycznej płytce drukowanej (FPCB) wykonanej z folii poliimidowej, której celem jest rejestrowanie wielu elektroencefalogramów (EEG) do badań nad padaczką18. Podczas gdy MEA umożliwiają rejestrację wielu sygnałów, są one ograniczone przez zdolność do oceny tylko jednej ryby na raz ze względu na ograniczoną liczbę kanałów elektrodowych. W odpowiedzi na to ograniczenie, niedawno zaprezentowaliśmy zaawansowany system zdolny do jednoczesnego zapisu EKG z wielu fish19. System ten wykorzystuje dwie elektrody, każda o grubości 125 μm i wykonane z poliimidu, z elektrodami napylanymi złotem umieszczonymi na dole ich obudowy, aby ułatwić pozyskiwanie danych. Jednak włączenie pompy obiegowej wody wprowadziło szum, wpływając na jakość sygnału do szumu (SNR) sygnałów EKG. Dodatkowo konieczne było użycie nieporęcznych i kosztownych narzędzi do zbierania danych, które wymagały przewodowego połączenia z komputerem. Na rynku systemy takie jak iWORX oferują lepszą przenośność dzięki kompaktowemu wzmacniaczowi, ale napotykają nierozwiązane problemy: (i) ich czas nagrywania jest zbyt krótki (3-5 minut) dla eksperymentów wymagających dłuższego czasu trwania, takich jak te dotyczące ostrych skutków działania leków; (ii) wymóg znieczulenia zwierząt, co może je stresować i zniekształcać wrodzone dane elektrofizjologiczne serca; (iii) ręczne, sekwencyjne pomiary utrudniają badania z dużą liczbą ryb; oraz (iv) konieczność pracochłonnego przetwarzania danych EKG w trybie offline. Co ważne, nie pojawiły się jeszcze żadne wysokoprzepustowe systemy wykorzystujące mikroelektronikę do analizy zmutowanych fenotypów. W związku z tym stworzenie wysokoprzepustowych systemów, które umożliwiają rozszerzony zapis EKG, ma kluczowe znaczenie dla odkrycia powiązań między fenotypami arytmicznymi a zmutowanymi genotypami, identyfikacji wielu fenotypów arytmicznych związanych z pojedynczymi zmutowanymi genotypami oraz przetestowania skuteczności leków nasercowych przy użyciu modelu danio pręgowanego. W związku z tym wprowadziliśmy do obrotu, w 2022 roku, przełomowy prototyp systemu Zebra II. Ten nowatorski system jest przystosowany do wykonywania rozszerzonych zapisów EKG od kilku ryb jednocześnie. Aby to osiągnąć, stworzono własny system elektroniczny, wykorzystujący technologię Internetu Rzeczy (IoT) do bezprzewodowej transmisji danych i umożliwiający analizę danych za pomocą aplikacji mobilnej. Zastosowanie technologii IoT nie tylko zwiększyło elastyczność i przenośność systemu, ale także ułatwiło zdalną współpracę w zakresie badań nad modelami danio pręgowanego. We wcześniejszym badaniu potwierdziliśmy skuteczność systemu poprzez szeroko zakrojone testy, wykazując jego zdolność do 1) jednoczesnego pozyskiwania danych EKG od czterech ryb; 2) wykonywanie ciągłych zapisów EKG przez okres do 1 godziny, co znacznie przekracza możliwości istniejących systemów, które rejestrują tylko kilka minut; 3) zminimalizuj mylące skutki znieczulenia, stosując o 50% zmniejszone stężenie trikainy. Co więcej, system wykazał dużą zdolność do długotrwałych zapisów EKG w różnych eksperymentach, takich jak te obejmujące blok zatokowo-przedsionkowy (SA) wywołany sodem, zmiany rytmu serca wywołane temperaturą oraz arytmie wywołane lekiem zarówno u ryb z mutacją Tg(SCN5A-D1275N), jak i dzikich ryb w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Zastosowanie w systemie wielu kanałów elektrod do rozszerzonego zapisu EKG umożliwia dodatkowo wykonywanie randomizowanych, kontrolowanych prób, co pozwala na badanie dwóch ryb w grupie eksperymentalnej w identycznych warunkach20. W tym artykule przedstawiamy ulepszoną wersję systemu, wyposażoną w elektrodę 4-punktową. To ulepszenie umożliwia użytkownikom rejestrowanie odczytów EKG z różnych miejsc na rybach, znacznie zmniejszając szansę na uzyskanie sygnałów EKG o niskiej jakości. Co więcej, ta iteracja opiera się na większości funkcji opisanych w poprzednich badaniach><, a także je udoskonala. Ten rozwinięty system EKG jest bardzo obiecujący, jeśli chodzi o rozwiązanie istniejących ograniczeń, co znacznie ułatwia analizę fenotypów arytmicznych i badania przesiewowe leków u danio pręgowanego. Innowacyjny dodatek 4-punktowej elektrody został rygorystycznie przetestowany w ramach krótkiego badania nad arytmią wywołaną przez leki u danio pręgowanego typu dzikiego, co dodatkowo potwierdziło jego skuteczność.

Protokół

Ścisłe przestrzeganie wytycznych etycznych zapewnia dobre samopoczucie i właściwe obchodzenie się z danio pręgowanym biorącym udział w naszych eksperymentach. Wszystkie działania eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami określonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC). Eksperymenty i wyniki opisane tutaj zostały przeprowadzone za zgodą IACUC zgodnie z autoryzowanym protokołem AUP-21-066.

1. Przygotowanie i przechowywanie roztworów podstawowych

UWAGA: Przygotuj podstawowy roztwór trikainy w dygestorium, używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE).

  1. Odmierz 400 mg trikainy w proszku i rozpuść ją w 97,9 ml wody dejonizowanej (DI). Umieść mieszadło magnetyczne w pojemniku i stopniowo mieszaj roztwór.
  2. Dostosuj pH, stopniowo dodając mniej niż 17 ml roztworu NaOH. Kontynuuj dodawanie kropli NaOH, aż pH osiągnie zakres 6,8.-7,2.
  3. Oznaczyć końcowe stężenie roztworu trikainy, uwzględniając dodany NaOH niezbędny do dostosowania pH i przechowywania.
    UWAGA: Roztwór trikainy jest wrażliwy na światło i powinien być przechowywany w bursztynowym pojemniku w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany.
  4. Odmierz 258,13 mg amiodaronu i rozpuść go w 1 l wody demineralizowanej. Włóż mieszadło magnetyczne do pojemnika i mieszaj przez kilka minut, aż roztwór całkowicie się rozpuści i oczyści z proszku. Roztwór należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C, gdy nie jest używany.
    UWAGA: Amiodaron musi być przygotowany w dygestorium i przechowywany w lodówce w temperaturze 4 °C. Zawsze należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

2. Hodowla ryb

  1. Utrzymuj ryby w indywidualnych zbiornikach połączonych z systemem cyrkulacji wody, utrzymując temperaturę w zakresie 28-29°C.
  2. Zapewnij ciągłe monitorowanie jakości wody i przestrzegaj cyklu dzień-noc 14 h/10 h.
  3. Podziel 40 ryb na cztery grupy, z których każda składa się z 10 ryb, i umieść je w oddzielnych zbiornikach.

3. Konfiguracja urządzenia

UWAGA: Procedura opisana w kroku 3.2 musi być wykonana dla każdej komory urządzenia (Rysunek 1). Chociaż każda komora może być skonfigurowana inaczej, aby zapewnić spójność eksperymentu, zaleca się utrzymanie jednolitych ustawień we wszystkich komorach.

  1. Podłącz urządzenie do źródła zasilania i rozpocznij pracę, naciskając czerwony przycisk znajdujący się na panelu przednim.
  2. Poruszaj się po ekranie dotykowym urządzenia, aby wybrać komorę do skonfigurowania.
    1. Dostosuj ustawienie filtra dolnoprzepustowego na 0.1 Hz, a ustawienie filtra górnoprzepustowego na 500 Hz. Dostosuj ustawienie wzmocnienia na 10 000.
  3. Podnieś przednią pokrywę, aby uzyskać dostęp do czterech komór. Przed rozpoczęciem eksperymentu zanurz gąbkę każdej komory (standardową gąbkę celulozową) w roztworze Trikainy, a następnie wyciśnij nadmiar płynu.
  4. Obróć układ czterech elektrod, aby upewnić się, że gąbka jest dostępna przed wprowadzeniem ryby.

4. Leczenie amiodaronem

UWAGA: Wykorzystaj wodę z akwariów (woda dla ryb) do przygotowania rozcieńczonych roztworów amiodaronu i trikainy. Kroki 4.3 i 4.4 należy powtórzyć dla każdej grupy oddzielonej w kroku 2.3 dla każdego roztworu przygotowanego w kroku 4.1.

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy amiodaronu.
    1. Rozcieńczyć 8,75 ml roztworu podstawowego w 41,25 ml wody dla ryb, aby uzyskać stężenie 70 μM.
    2. Rozcieńczyć 12,5 ml roztworu podstawowego w 37,5 ml wody dla ryb, aby uzyskać stężenie 100 μM.
    3. Rozcieńczyć 25 ml roztworu podstawowego w 25 ml wody dla ryb, aby uzyskać stężenie 200 μM.
  2. Przygotować roztwór znieczulający, rozcieńczając 4 ml roztworu podstawowego trikainy w 100 ml wody dla ryb, uzyskując stężenie trikainy 0,16 mg/ml
  3. Zanurz każdą rybę osobno w przygotowanym roztworze Amiodaronu na 5 minut. Użyj timerów, aby dokładnie monitorować czas zanurzenia.
  4. Przenieś rybę do roztworu Trikainy na 2-3 minuty w celu znieczulenia. Upewnij się, że zabieg nie spowoduje śmierci ryby. Jeśli ryba wykazuje nienormalne zachowanie, takie jak utrata koloru lub znaczne zmniejszenie ruchu skrzeli, należy natychmiast usunąć ją z roztworu i umieścić z powrotem w czystej wodzie dla ryb.

5. Zbieranie danych EKG

UWAGA: Natychmiast postępuj zgodnie z tymi instrukcjami po zakończeniu kroku 4.4. Powtórz proces dla każdej komory przed uszczelnieniem urządzenia. Komory są przystosowane do przyjmowania ryb o szerokości od 4 do 10 mm i długości od 25 do 50 mm.

  1. Wyjmij rybę z roztworu Trikainy i umieść ją na gąbce, upewniając się, że jej brzuszną stroną jest skierowana do góry.
  2. Umieść układ elektrod w kształcie rombu nad obszarem klatki piersiowej ryby, aby uchwycić sygnały EKG z czterech różnych punktów jednocześnie (Rysunek 2A,B). Upewnij się, że dokładnie wyregulujesz każdą elektrodę, aby każda szpilka stykała się ze skórą ryby.
    1. Obróć każdą elektrodę, opuszczając szpilkę, aż zetknie się ze spodem ryby. Jeśli kołek jest zbyt wysoki, przekręć odpowiednią skrzydełkową zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ją obniżyć, aż dotknie ryby.
    2. Wykonaj opisaną powyżej regulację dla elektrod we wszystkich komorach.
  3. Zamknij pokrywę komór, gdy wszystkie układy elektrod zostaną prawidłowo umieszczone nad rybami w komorach operacyjnych.
  4. Oznacz każdą komorę do nagrywania, wybierając ją na ekranie dotykowym, a następnie rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Nagraj na ekranie.
  5. Kliknij przycisk Stop po 2 minutach, a następnie kliknij przycisk Zapisz w oknach monitu, które pojawiają się na ekranie po zatrzymaniu. Zapisz informacje na dysku lub w chmurze, w zależności od konkretnych potrzeb badawczych.

6. Rozwiązywanie problemów z systemem pozycjonowania czteroelektrodowego

UWAGA: Czasami jedna lub kilka elektrod może nie być w stanie uchwycić wyraźnego sygnału EKG, co wymaga zmiany położenia. Wykonaj poniższe czynności, aby w razie potrzeby rozwiązać problem z matrycą elektrod.

  1. Naciśnij przycisk Stop na interfejsie urządzenia, aby zatrzymać proces nagrywania i zidentyfikować kanał lub kanały z niespójnymi sygnałami.
  2. Podnieś przednią pokrywę, aby uzyskać dostęp do komór elektrod. Zidentyfikuj, które komory i określone elektrody powodują problemy.
  3. Przekręć górną skrzydełkową zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyregulować odległość elektrody od ryby. To działanie obniży elektrodę bliżej ryby.
  4. W razie potrzeby powtórz krok 6.3. Jeśli samo zbliżenie się nie rozwiąże problemu, obróć elektrodę w inne miejsce na rybie, aż do uzyskania zadowalającego sygnału.

7. Wydobywanie i analizowanie danych

UWAGA: Wszystkie podstawowe analizy danych przedstawione w tym artykule wykorzystują technikę falkową21 do redukcji różnych rodzajów szumów i odchylenia standardowego prawidłowych uderzeń zatok (SDNN) w celu obliczenia wariancji tętna między uderzeniami w segmentach jednominutowych.

  1. Po zapisaniu danych na dysku lub w chmurze pobierz je do analizy lub wyślij bezpośrednio do serwera w chmurze w celu dalszego przetwarzania.
  2. Przejdź do zapisanych danych, klikając przycisk Przeglądaj na ekranie i wybierz zestawy danych, których chcesz użyć.
  3. Wybierz przycisk Wyodrębnij w opcjach na ekranie i podłącz dysk USB do tylnej części urządzenia, aby wyodrębnić dane.
  4. Postępuj zgodnie z instrukcjami urządzenia, aby zapisać wybrane zestawy danych na dysku zewnętrznym w celu późniejszego pobrania i analizy.

Wyniki

Zdolność do jednoczesnego rejestrowania sygnałów EKG z wielu ryb znacząco wyróżnia to urządzenie, oferując istotną przewagę w skracaniu czasu wymaganego do badań nad lekami lub kardiologicznymi u danio pręgowanego lub innych podobnych gatunków (Rycina 1). Rejestrowanie dokładnych sygnałów EKG może być trudne ze względu na różnice anatomiczne między rybami, szczególnie w kwestii rozmieszczenia elektrod. Tradycyjnie uzyskanie wyraźnego sygnału EKG polega na umieszczeniu elektrody aktywnej nad sercem, aby uniknąć rejestracji skurczów mechanicznych lub artefaktów ruchowych, podczas gdy elektrodę referencyjną umieszcza się w stronę dolnej części brzucha. Jednak precyzyjne zlokalizowanie serca może być utrudnione ze względu na jego głębokość w tkance lub nierówną powierzchnię ciała ryby. Czasami elektrody muszą być pozycjonowane za pomocą mikromanipulatorów w celu dokładnego rozmieszczenia, co może wymagać wielokrotnych prób przed uzyskaniem sygnału wysokiej jakości.

Aby przezwyciężyć te trudności, w systemie wprowadzono innowacyjne podejście polegające na zastosowaniu konfiguracji czterech elektrod zamiast konwencjonalnych pojedynczych elektrod roboczych. Każda elektroda działa niezależnie, co pozwala na regulacje w trzech wymiarach: w górę i w dół (pionowo), pochylenie do przodu i do tyłu (pochylenie) oraz obrót wokół osi pionowej (obrót). Taka elastyczność okazuje się szczególnie przydatna podczas pracy z rybami o różnych kształtach, ponieważ umożliwia precyzyjne pozycjonowanie elektrod w celu zarejestrowania optymalnego sygnału EKG lub zbadania, w jaki sposób odczyty EKG zmieniają się w zależności od różnych punktów kontaktu z rybą.

Ta cecha nie tylko zwiększa efektywność badań kardiologicznych i farmakologicznych, ale także poszerza możliwości technik EKG, a nawet rejestracji EKG. Biorąc pod uwagę, że metody te nie zostały jeszcze ustandaryzowane i są często dostosowywane do specyficznych warunków badanego obiektu, urządzenie to otwiera nowe ścieżki badawcze, oferując bardziej elastyczne i niezawodne metody gromadzenia danych (Rycina 2).

Jedną z charakterystycznych cech tego systemu jest możliwość jednoczesnej oceny do czterech różnych leków u czterech oddzielnych ryb lub badania wpływu do czterech różnych dawek jednego leku u czterech różnych ryb. Układ eksperymentalny może obejmować zarówno krótką ekspozycję ostrą, jak i dłuższe sesje trwające 1 h, z zastosowaniem zmiennych dawek leków lub zmian warunków środowiskowych, takich jak temperatura i anestezja. W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy krótki eksperyment w celu wykazania skuteczności tej metody, ze szczególnym uwzględnieniem funkcjonalności macierzy czterech elektrod. Przetestowaliśmy trzy różne dawki amiodaronu, leku przeciwarytmicznego klasy III, znanego z wywoływania bradykardii i wydłużania odstępu QT u danio przebraniego, podczas 5 min ekspozycji, analogicznie do poprzedniego badania20 z wykorzystaniem pierwszego prototypu tego urządzenia.

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, u ryb zaobserwowano zarówno wydłużenie odstępu QTc, jak i zmniejszenie częstotliwości pracy serca w porównaniu z grupą kontrolną niepoddaną działaniu substancji. Pomimo krótkiego czasu ekspozycji, który jest krótszy niż w wielu porównywalnych badaniach trwających do 1 h, udało nam się zaobserwować istotne zmiany w sygnałach EKG i parametrach kardiologicznych (Rysunek 3).

Sposób, w jaki leczenie amiodaronem wywołało zauważalne zmiany w EKG, które nasilały się wraz ze wzrostem dawki, przedstawiono na Rysunku 3A,B. Warto zaznaczyć, że odstęp QTc wydłużał się przy każdym kolejnym zwiększeniu dawki w stosunku do grupy kontrolnej, w której odstęp QTc wynosił 330 ms. W grupach leczonych odstępy QTcs mierzono na poziomie 365 ms dla 70 µM amiodaronu, 480 ms dla 100 µM oraz 546 ms dla 200 µM. Odpowiadają temu znaczące spadki częstości akcji serca w reakcji na różne dawki amiodaronu oraz wydłużone odstępy QTcs. Częstość akcji serca spadła znacząco z poziomu średnio 120 ±5 BPM w grupie kontrolnej do 105 ±10 BPM przy 70 µM amiodaronu, 90 ± 5 BPM przy 100 µM oraz 84 ±5 BPM przy 200 µM (Rysunek 3C,D).

Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że nowo zaproponowana technika wykazuje jakość porównywalną do poprzednich badań17,18, wykorzystując podejście dwuelektrodowe (jedna elektroda robocza i jedna elektroda odniesienia). Pomyślnie zebrano dane z czterech elektrod roboczych, wybierając optymalną do analizy, aby następnie zaraportować przewidywane parametry kardiologiczne. Kryteria wyboru są zgodne z wcześniejszymi metodami, kładąc nacisk na potrzebę wyraźnej wizualizacji kompleksu PQRST oraz niskiego poziomu szumów linii bazowej w sygnale EKG. Umożliwia to obliczenie odstępów QT i QTc oraz ułatwia identyfikację wyraźnych różnic. Ponadto metodologia została poddana dalszej walidacji poprzez testy przeprowadzone przez trzech dodatkowych badaczy z naszej grupy, którzy nie uczestniczyli w opracowaniu obecnego urządzenia. Zaimplementowali oni najpierw wstępną metodologię zasugerowaną przez projektantów, a następnie zaproponowali modyfikacje na podstawie swoich uwag, co doprowadziło do udoskonalenia zaprezentowanego obecnie podejścia. Ten iteracyjny proces ulepszeń był kluczowy dla rozwoju urządzenia, wykorzystując spostrzeżenia zewnętrznych badaczy, aby uczynić je bardziej przyjaznym dla użytkownika i efektywnym w przyszłych zastosowaniach.

Niniejsze krótkie badanie odpowiedzi na lek podkreśla sprawność urządzenia nie tylko w jednoczesnym rejestrowaniu sygnałów ECG z czterech różnych ryb w różnych warunkach, ale także w przechwytywaniu wielu (czterech) sygnałów ECG z każdej ryby. Ta wieloczynnikowa funkcjonalność znacznie redukuje czas i wysiłek wymagany do umieszczenia elektrod oraz minimalizuje prawdopodobieństwo błędów ludzkich poprzez zapewnienie wyboru sygnałów. Taki wybór pozwala na wyselekcjonowanie najdokładniejszego sygnału lub możliwość agregacji danych z wielu sygnałów, w zależności od celu badania. Należy jednak wyjaśnić, że zastosowanie konfiguracji czteroelektrodowej nie gwarantuje automatycznie, że wszystkie cztery sygnały będą czyste i wysokiej jakości. Głównym celem wprowadzenia tej innowacyjnej funkcji jest ograniczenie błędów ludzkich i oszczędność czasu dzięki umożliwieniu czterech jednoczesnych rejestracji zamiast sekwencyjnych, co jest bardziej efektywne czasowo i mniej stresujące dla ryb, biorąc pod uwagę ich ograniczoną tolerancję na czas przebywania poza wodą i pod wpływem anestezji.

Schemat zestawu do elektrofizjologii z systemem Zebra II, uchwytem 4-elektrodowym i macierzą wieloelektrodową.
Rysunek 1: System Zebra II. (A) Widok izometryczny urządzenia Zebra II (model SolidWorks) z opisanymi elementami. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat wieloelektrodowego układu EKG i wyniki monitorowania serca ryby; przedstawiono dane z kanałów 1-4.
Rycina 2: Pozycjonowanie elektrod u Danio pręgowanego. (A) Stopnie swobody 4-punktowego uchwytu elektrod (obraz koncepcyjny). (B) Pozycjonowanie elektrod na klatce piersiowej ryby. (C) Sygnał EKG z 4-punktowego uchwytu elektrod (kanały 1-4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza elektrokardiogramu, odstęp QTc, analiza EKG przy dawkowaniu amiodaronu, wykresy częstotliwości akcji serca.
Rysunek 3: Efekty ostrej ekspozycji na amiodaron (sygnały EKG). (A) Reprezentatywne dane EKG uzyskane z systemu oraz zmiana parametrów EKG w zależności od różnych stężeń amiodaronu. (B) Zmiana EKG pod wpływem ekspozycji na amiodaron. (C) Wykres słupkowy opisujący rozbieżność HR. (D) Wykres słupkowy opisujący rozbieżność odstępu QTc w danych EKG przy różnych stężeniach amiodaronu. *p<0,05 (jednoczynnikowa analiza wariancji z testem Tukeya). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. Rysunek zmodyfikowany na podstawie źródła20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obecne kroki zostały zmodyfikowane i ulepszone zgodnie z tą nową wersją urządzenia z poprzedniego badania przeprowadzonego przez nasz zespół20. W tym przypadku dołączony jest również oznaczony projekt wspomagany komputerowo (CAD) urządzenia.

Jak podkreślono w przewodniku rozwiązywania problemów z protokołem, urządzenie wymaga od użytkownika wykonania pewnych krytycznych kroków z należytą starannością i precyzją, ponieważ kroki te mają decydujący wpływ na jakość sygnału EKG. Zgodnie z wynikami naszego wcześniejszego badania20, umiejscowienie elektrod odgrywa znaczącą rolę w uzyskiwaniu wysokiej jakości i wyraźnych odczytów EKG z próbek danio pręgowanego. Ze względu na to, że metoda ta zwiększa liczbę elektrod roboczych z jednej do czterech i wprowadza dodatkowe stopnie swobody, wymaga dodatkowych kroków rozwiązywania problemów i udoskonalonego umieszczenia elektrod w obszarze brzusznym ryby w celu uzyskania optymalnych wyników.

Zalety i nowatorskie funkcje urządzenia polegają na rozszerzonych pomiarach dla wieloetapowych eksperymentów, ograniczonych do godzinnych badań, wysokowydajnych badaniach przesiewowych z udziałem wielu danio pręgowanych (cztery równoległe badania), wysoce kontrolowanej konfiguracji eksperymentu, dodatkowych zapisach elektrofizjologicznych na próbkę (do czterech) oraz zautomatyzowanej analizie i przechowywaniu danych w chmurze. W związku z tym chcielibyśmy podkreślić, że głównym problemem, który jest poruszany, jest czas potrzebny na przeprowadzenie badań przesiewowych leków i badań kardiologicznych na danio pręgowanym, ponieważ tradycyjne metody wymagają badań przesiewowych jeden po drugim i wielu prób w celu zebrania wystarczającej ilości informacji22. Oferuje to również nowy sposób wykorzystania matryc wielokanałowych do rejestrowania EKG w prostszy sposób w porównaniu z tymi, które wykorzystują matryce mikroelektrod (MEA) lub elastyczne płytki obwodów drukowanych (FPCB)18 , które wymagały dodatkowych etapów produkcji wspomnianych elektrod oraz procedury potrzebnej do przymocowania ich do ryby, w porównaniu z proponowaną metodą, która również opiera się na kontakcie powierzchniowym, ale w mniej inwazyjny sposób.

Ograniczenia systemu nie różnią się od tych prezentowanych w tradycyjnych metodach19,20, ale są mniej intensywne, ponieważ zastosowano matrycę wielokanałową w celu zmniejszenia liczby prób nagraniowych potrzebnych do badania. Ograniczenia te opierają się na ustawieniu elektrody, ponieważ zaleca się przestrzeganie proponowanego położenia przedstawionego na rysunku 2B. Należy również wyjaśnić, że użytkownik nie może oczekiwać doskonałych nagrań podczas pierwszej próby na czterech kanałach, ponieważ różnice anatomiczne ryb i wstępne przetwarzanie próbki (usuwanie kamienia, procedury na otwartej klatce piersiowej itp.) będą miały bezpośredni wpływ na jakość i powodzenie testów.

Oświadczenia

Hung Cao i Michael Lau są założycielami firmy Sensoriis, Inc. System Zebra II firmy Sensoriis został opracowany w ramach wsparcia NIH, grantu SBIR Phase II #R44OD024874. Uniwersytet Kalifornijski w Irvine dokonał przeglądu i zatwierdził relacje Hung Cao z Sensoriis, Inc. zgodnie z zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony NIH SBIR Phase II #R44OD024874 dla H.C. i M.P.H.L. Autorzy pragną również podziękować za wsparcie finansowe udzielone przez Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) w Meksyku za pośrednictwem stypendium zatytułowanego Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek amiodaronuSigma-AldrichPHR1164-1GAmiodaron w proszku
Laboratoryjny miernik pH/mVSper Scientific10500308
Etylo3-aminobenzoesan, sól kwasu metanosulfonowego, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC118002500Trikaina w proszku
Mieszadło do płyty grzejnej IsotempFisher ScientificSP88854200
Zebra II SystemSensoriisN/AKomercyjny system rejestracji EKG danio pręgowanego
System EKG danio pręgowanegoiWorxZS-200Komercyjny system zapisu EKG danio pręgowanego

Bibliografia

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American heart association. Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).
  2. Zulkifly, H., Lip, G. Y. H., Lane, D. A. Epidemiology of atrial fibrillation. Int J Clin Pract. 72 (3), e13070(2018).
  3. Ferreira, C., Providência, R., Ferreira, M. J., Gonçalves, L. M. Atrial fibrillation and non-cardiovascular diseases: A systematic review. Arq Bras Cardiol. 105 (5), 519-526 (2015).
  4. Hu, Z., Ding, L., Yao, Y. Atrial fibrillation: mechanism and clinical management. Chin Med J. 136 (22), 2668-2676 (2023).
  5. Babapoor-Farrokhran, S., Rasekhi, R. T., Gill, D., Babapoor, S., Amanullah, A. Arrhythmia in COVID-19. SN Comp Clin Med. 2 (9), 1430-1435 (2020).
  6. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  7. Koopman, C. D., et al. The zebrafish grime mutant uncovers an evolutionarily conserved role for Tmem161b in the control of cardiac rhythm. Proc Natl Acad Sci. 118 (9), e2018220118(2021).
  8. Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. , Springer International Publishing. (2016).
  9. Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 161-171 (2010).
  10. Sun, P., et al. Micro-electrocardiograms to study post-ventricular amputation of Zebrafish heart. Ann Biomed Engg. 37 (5), 890-901 (2009).
  11. Lin, M. H., et al. Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish. Sci Rep. 8 (1), 15986(2018).
  12. Chaudhari, G. H., Chennubhotla, K. S., Chatti, K., Kulkarni, P. Optimization of the adult zebrafish ECG method for assessment of drug-induced QTc prolongation. J Pharmacol Toxicol Methods. 67 (2), 115-120 (2013).
  13. Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation. Sci Rep. 6, 25073(2016).
  14. Stoyek, M. R., Rog-Zielinska, E. A., Quinn, T. A. Age-associated changes in electrical function of the zebrafish heart. Prog Biophys Mol Biol. 138, 91-104 (2018).
  15. Cao, H., et al. Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium. Integ Biol. 6 (8), 789-795 (2014).
  16. Lenning, M., et al. Real-time monitoring and analysis of zebrafish electrocardiogram with anomaly detection. Sensors. 18 (1), 61(2018).
  17. Yu, F., et al. Flexible microelectrode arrays to interface epicardial electrical signals with intracardial calcium transients in zebrafish hearts. Biomed Microdev. 14 (2), 357-366 (2012).
  18. Cho, S. J., et al. Zebrafish as an animal model in epilepsy studies with multichannel EEG recordings. Sci Rep. 7 (1), 3099(2017).
  19. Continuous electrocardiogram monitoring in Zebrafish with prolonged mild anesthesia. Le, T., et al. 42nd Ann Int Conf IEEE Engg Med Biol Soc, , 2610-2613 (2020).
  20. Le, T., et al. A novel wireless ECG system for prolonged monitoring of multiple zebrafish for heart disease and drug screening studies. Biosensors Bioelectron. 197, 113808(2022).
  21. Kouzehgar, K., Eslamian, S. Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams. Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).
  22. Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (1), H269-H273 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektrofizjologia rybek zebrafishakwizycja EKGwielokanałowe EKGprzesiew farmakologicznypatologia sercaleczenie amiodaronemmatryca elektrodzautomatyzowana analiza EKGbadania układu sercowo-naczyniowegoprzedkliniczna analiza leków
Zebra II jako nowatorski system do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.