Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67067

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Adaptowalny moduł klonowania molekularnego Gibson Assembly został wykorzystany w formacie kursu opartego na kursie licencjackim (CURE) dla studentów kursów laboratoryjnych biologii molekularnej. Ocena efektów uczenia się studentów wykazała lepsze zrozumienie i pewność siebie w klonowaniu molekularnym po ukończeniu CURE, a nowe plazmidy sklonowano do badań nad biosyntezą produktów naturalnych.

Streszczenie

Ciągły postęp technik biologii molekularnej wymaga, aby programy nauczania biologii molekularnej były regularnie udoskonalane, aby skutecznie przygotować uczniów do wejścia na rynek pracy z nowoczesnymi kompetencjami. W szczególności pojawienie się Gibson Assembly, wysoce konfigurowalnej i adaptacyjnej techniki klonowania molekularnego, posunęło naprzód krajobraz klonowania molekularnego w wielu środowiskach badawczych. W związku z tym stworzyliśmy moduł klonowania Gibson Assembly do wdrożenia w laboratorium biologii molekularnej na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo i oceniliśmy wyniki uczenia się studentów z tego modułu. W ciągu trzech iteracji kursu studenci uczestniczyli w niezależnym projekcie opartym na eksperymencie, który obejmował klonowanie trzech unikalnych bibliotek plazmidów w celu wsparcia projektów badawczych w zakresie biosyntezy produktów naturalnych. Studenci otrzymali kwestionariusze wstępne i końcowe, aby ocenić ich zrozumienie klonowania molekularnego i ich zaufanie do terminów i technik biologii molekularnej. Odpowiedzi studentów wykazały znaczny wzrost zarówno w poznawaniu koncepcji klonowania molekularnego, jak i w samoocenie pewności siebie w odniesieniu do terminów i technik klonowania molekularnego. Ten framework modułów można uogólnić, aby nauczać Gibson Assembly dla różnych zastosowań, zapewniając instruktorom zestaw narzędzi do nauczania elastycznej i pojawiającej się technologii klonowania podczas rozwijania ich projektów badawczych.

Wprowadzenie

Szkolenie studentów w zakresie podstawowych pojęć biologii molekularnej i technik laboratoryjnych jest kluczowe dla ich rozwoju naukowego i zawodowego, ponieważ te metodologie są powszechne w różnych środowiskach badawczych, w tym w środowisku akademickim i przemyśle. W związku z tym studenci kierunków biologii (koncentracja biologii molekularnej i komórkowej) oraz biochemii na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo (Cal Poly) są zobowiązani do wzięcia udziału w kursie laboratoryjnym biologii molekularnej wyższego szczebla, aby poznać i zastosować te tematy (CHEM / BIO 475). Podstawowy program nauczania dla tego kursu został wcześniej opracowany, w którym studenci wykonują klonowanie na bazie topoizomerazy (TOPO) w celu złożenia plazmidu zawierającego aktynę, który jest przygotowany z szablonu komplementarnego DNA drożdży (cDNA) 1. Studenci projektują eksperymenty w oparciu o pytania, które naśladują autentyczne hipotezy badawcze, zwiększając swoją znajomość praktyk laboratoryjnych i uczenia się opartego na dociekaniu. Ciągły postęp w dziedzinie biologii molekularnej wymaga, aby odpowiednie programy nauczania były dostosowywane w celu przygotowania studentów z nowoczesnymi kompetencjami do pracy na rynku pracy. W szczególności użycie Gibson Assembly stało się bardziej dominujące w środowisku naukowym; Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana do syntezy sztucznych chromosomów2, ponad 5000 publikacji w czasie tego raportu odnosiło się do oryginalnej pracy Gibsona i wsp. Montaż Gibsona jest wyjątkowy w porównaniu z tradycyjnymi metodologiami klonowania: jest wysoce konfigurowalny i może łatwo liminować wiele liniowych fragmentów DNA bez potrzeby stosowania miejsc restrykcyjnych w celu wytworzenia połączeń. W związku z tym dostrzegliśmy możliwość reorganizacji programu nauczania CHEM/BIO 475 w celu uwzględnienia nowoczesnych technik klonowania molekularnego i ulepszenia modelu kursu opartego na dociekaniu.

Ustalono, że doświadczenia badawcze studentów przyczyniają się do lepszego zrozumienia koncepcji, rozwoju umiejętności i wytrwałości w nauce3, jednak nie wszyscy studenci studiów licencjackich mają możliwość bezpośredniego uczestnictwa w laboratorium badawczym. Aby sprostać wyzwaniu, jakim jest ograniczona liczba studentów w laboratoriach badawczych, opracowano i zastosowano doświadczenia badawcze oparte na kursach licencjackich (CURE) w celu zwiększenia dostępności nauki poprzez autentyczne badania w klasie. Chociaż CURE różnią się pod względem wdrożenia, ustanowiono wspólne praktyki, które odnoszą się do pięciu założeń badań naukowych. W dobrze zaprojektowanym CURE uczniowie będą 1) korzystać z praktyk naukowych, 2) współpracować w projekcie badawczym, 3) próbować dokonywać nowych odkryć, 4) przyczyniać się do pracy istotnej poza klasą oraz 5) ponownie oceniać i korygować hipotezy i metody w przypadku niepowodzenia eksperymentalnego4. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych doświadczeń badawczych studentów w laboratorium, wykazano, że CURE wzmacniają zaufanie uczniów do nauk ścisłych, umiejętności naukowych, odpowiedzialności za projekt i wytrwałości w naukach ścisłych, technologii, inżynierii i matematyce (STEM)5. Chociaż CUREs obejmujące klonowanie molekularne zostały zgłoszone wcześniej6,7,8,9,10,11,12,13, nie znamy żadnych, które podkreślałyby zdolność adaptacji Gibson Assembly do stworzenia biblioteki autentycznych badań plazmidy.

Tutaj informujemy o rozszerzeniu obecnego programu nauczania CHEM/BIO 475 opartego na dociekaniach na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo z dwoma głównymi ulepszeniami: praktycznym doświadczeniem w korzystaniu z Gibson Assembly i udziałem studentów w CURE, który dostarczył oryginalne konstrukcje plazmidowe dla projektów badawczych finansowanych przez National Science Foundation (NSF-1708919 i NSF-2300890). W ciągu trzech wdrożeń tego programu nauczania studenci przyczynili się do dwóch odrębnych projektów badawczych skoncentrowanych na naturalnej biosyntezie produktów bioaktywnych cząsteczek wytwarzanych przez Actinomycetota. Produkty naturalne często zawierają farmakofory o działaniu antybiotycznym, przeciwgrzybiczym i/lub przeciwnowotworowym, co nadaje tym małym cząsteczkom znaczenie w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków i potencjalne znaczenie kliniczne14. Badania te wymagają stworzenia bibliotek plazmidowych, które umożliwią badanie zarówno funkcji, jak i potencjału inżynieryjnego bakteryjnych enzymów biosyntetycznych. W tym CURE studenci zaprojektowali i przeprowadzili eksperymenty z montażem Gibsona, aby sklonować unikalne biblioteki plazmidów związane z tymi projektami badawczymi (Rysunek 1). Ponadto format i konstrukcja modułu są charakterystyczne, ponieważ można go łatwo dostosować do generowania dowolnych plazmidów interesujących dla innych projektów badawczych.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd roli Gibson Assembly w naszym laboratorium badawczym. Actinomycetota wytwarza małocząsteczkowe naturalne produkty o klinicznie istotnej bioaktywności przy użyciu klastrów genów kodujących enzymy biosyntetyczne. W naszych badaniach plazmidy zawierające gen biosyntezy są składane za pomocą zespołu Gibsona w celu dalszych badań funkcji kodowanego enzymu. Ikony nauki z Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przegląd laboratorium

Laboratorium Biologii Molekularnej to kurs wyższej klasy wymagany dla kierunków biochemicznych i biologicznych z koncentracją biologii molekularnej i komórkowej. Inni studenci spełniający wymagania wstępne są mile widziani w kursie jako fakultatywnym kursie wyższej dywizji. Kurs jest współtworzony przez Wydział Chemii i Biochemii oraz Wydział Biologii w Cal Poly. Wykładowcy z obu wydziałów na zmianę prowadzą zajęcia w każdym semestrze (dwie ćwiartki biologii, jedna czwarta chemii i biochemii).

Klasa spotyka się w laboratorium dwa razy w tygodniu na 170 minut i raz w tygodniu na 50-minutowym wykładzie. Sekcje laboratoryjne zawierają maksymalnie 16 uczniów, a co kwartał oferowane są 2–3 sekcje laboratoryjne. Kurs trwa 10 tygodni, a egzamin końcowy przeprowadzany jest podczas ostatniego spotkania w 10 tygodniu. Czas wykładu poświęcany jest na omawianie teorii stojącej za wieloma technikami eksperymentalnymi przeprowadzanymi w laboratorium, a także aktualnych tematów z biologii molekularnej, które nie są omawiane w laboratorium. Podstawa programowa laboratorium obejmuje proces klonowania genu aktyny z drożdży1, który trwa około 7 tygodni (13–14 spotkań laboratoryjnych). Techniki obejmują mikropipetowanie, izolację RNA drożdży, amplifikację genu drożdży za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), klonowanie TOPO, badania przesiewowe niebiesko-białe, izolację plazmidu i weryfikację insercji przez trawienie restrykcyjne i PCR, analizę in silico klonów oraz analizę sekwencji DNA. Program nauczania na ostatnie 3 tygodnie kursu jest w gestii instruktora, ale obejmuje uczniów wykonujących "niezależny projekt" z nieokreślonymi wynikami.

Przegląd eksperymentu

Jednym z celów naszej grupy badawczej są szlaki biosyntezy u Actinomycetota. Projektując niezależny projekt, przewidzieliśmy sobie, że studenci stworzą plazmidy za pomocą Gibson Assembly do wykorzystania w naszych projektach badawczych dotyczących biosyntezy produktów naturalnych. Podczas gdy iteracje modułu kursu, które są tutaj oceniane, były specyficzne dla plazmidów, które pozwalają na manipulowanie szlakami biosyntezy, przepływ pracy Gibson Assembly jest niezwykle elastyczny dla innych projektów klonowania molekularnego (Rysunek 2). Przepływ pracy został podzielony na trzy różne eksperymenty (A, B i C), które zostały przeprowadzone w dwóch okresach wykładów i sześciu okresach laboratoryjnych (łącznie 3 tygodnie) (patrz plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2). Eksperymenty zostały poprzedzone arkuszami roboczymi, które miały pomóc uczniom w przygotowaniu się i ocenić ich zrozumienie (Plik Uzupełniający 3, Plik Uzupełniający 4 i Plik Uzupełniający 5). Przepływ pracy jest prezentowany w formacie, który jest elastyczny w zależności od potrzeb i zainteresowań instruktora.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Przepływ pracy modułu montażowego Gibsona. Dzień 1 i Dzień 4 to okresy wykładowe, podczas których studenci przeprowadzają analizę sekwencji in silico i projekt eksperymentalny. Dni 2-3 i 5-8 to spotkania laboratoryjne, podczas których przeprowadzane są etapy klonowania nowych plazmidów za pomocą zespołu Gibsona, a następnie izolacja i badania przesiewowe. Obrazkowy schemat blokowy jest pogrupowany według trzech eksperymentów wykonywanych przez uczniów (A, B i C). Bardziej szczegółowe wskazówki i protokoły można znaleźć w Podręcznikach dla instruktorów i uczniów, które są dostarczane odpowiednio jako Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2. Ikony nauki z Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Moduł niezależnego projektu Gibson Assembly został po raz pierwszy pilotażowy w wiosennym kwartale 2019 roku w CHEM/BIO 475. W latach 2020 i 2021 kurs był prowadzony online ze względu na pandemię SARS-CoV-2. Kiedy wiosną 2022 i 2023 r. wznowiono nauczanie osobiste, studenci kursu zostali zaproszeni do udziału w badaniu oceniającym efekty uczenia się niezależnego projektu Gibson Assembly, w którym klonowane byłyby oryginalne, istotne dla badań plazmidy. W 2019 roku studenci stworzyli bibliotekę plazmidów składającą się z kaset genów z genomu Micromonospora echinospora ATCC 15837, które zostały sklonowane do pKC1132 (Rysunek 3). Ta biblioteka plazmidów jest wykorzystywana w naszym laboratorium badawczym do inaktywacji genów będących przedmiotem zainteresowania w przypuszczalnym klastrze genów biosyntetycznych dla produktu naturalnego TLN-0522015. Aby uzupełnić nasze badania nad inaktywacją genów, studenci w 2022 r. sklonowali niewielką bibliotekę genów z domniemanego klastra genów TLN-05220 do pUC19 (Figure 3); nasza grupa badawcza wykorzystała te plazmidy do subklonowania genów do wektorów ekspresyjnych, w tym pET28b, do nadekspresji i oczyszczania białek. Studenci z kohorty 2023 przyczynili się do trwających prac nad projektem inżynierii biosyntetycznej na syntetazie epoksomycyny16. W zespołach 3-4 osobowych studenci sklonowali zmodyfikowane domeny modułów syntetazy peptydów nierybosomalnych17 do różnych wektorów ekspresji białek, aby zoptymalizować nadekspresję i oczyszczanie tych enzymów w naszym laboratorium badawczym (ryc. 3). Nadmiarowość została wbudowana w plan klonowania dla każdej kohorty. Na przykład kohorta z 2019 r. składała się z 44 uczniów, a 15 plazmidów zostało przydzielonych do klasy do klonowania. W związku z tym próbowano sklonować każdy plazmid dwa lub trzy razy.

figure-introduction-3
Rysunek 3: Podsumowanie sklonowanych plazmidów i uczestników studenckich podczas niezależnych iteracji projektów w 2019, 2022 i 2023 roku. Projekt Gibson Assembly był wdrażany trzykrotnie. W każdej ofercie studenci klonowali inną bibliotekę plazmidów, które miały być wykorzystane w projektach badawczych badających szlaki biosyntezy. Projekty w 2019 i 2022 roku wsparły nasze trwające prace nad naturalnym produktem TLN-0522015 z dwoma fragmentami (jeden gen, kaseta lub gen i wektor) reakcjami Gibson Assembly. Projekt z 2023 r. obejmował zamianę domen w modułach 1 i 2 enzymu syntetazy peptydowej (NRPS) nierybosomalnej, który bierze udział w biosyntezie epoksomycyny16. Zakreskowane fragmenty reprezentują dwa różne mutanty zamienionej domeny, a jednolite kolory reprezentują domeny, które nie zostały zamienione. W sumie wygenerowano osiem różnych fragmentów genów (cztery dla modułu 1 i cztery dla modułu 2) z nawisami kompatybilnymi z montażem Gibsona. Dla każdego modułu, dwie różne kombinacje trzech fragmentów genów zostały połączone z jednym z dwóch różnych wektorów (pBAD33 i pET28, łącznie cztery fragmenty na zespół), co daje potencjał do wygenerowania ośmiu zmodyfikowanych plazmidów NRPS. Ikony nauki z Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przegląd oceny

Co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem niezależnego projektu Gibson Assembly, studenci z kohort 2022 i 2023 zostali zaproszeni do udziału w badaniu wyników uczenia się, zaprojektowanym podobnie do badania przeprowadzonego w ankiecie na kursie laboratoryjnym biochemii w Cal Poly18. Studenci-uczestnicy wypełnili kwestionariusz wielokrotnego wyboru na spotkaniu laboratoryjnym przed rozpoczęciem niezależnego projektu oraz kwestionariusz wielokrotnego wyboru po zakończeniu spotkania laboratoryjnego (tj. po ukończeniu modułu Gibson Assembly). Kwestionariusze wstępne i końcowe składały się z 28 identycznych pytań oraz dwóch dodatkowych pytań w kwestionariuszu końcowym (łącznie 30). Napisano dziesięć pytań merytorycznych, aby ocenić wiedzę uczniów na temat enzymów i mechanizmów związanych z klonowaniem molekularnym (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], montaż Gibsona, transformacja, badania przesiewowe niebiesko-białe). W kolejnych siedmiu pytaniach poproszono uczniów o samoocenę znajomości terminów związanych z klonowaniem molekularnym (np. polimeraza DNA, egzonukleaza, ligaza). Kolejne 10 pytań pozwoliło studentom na samoocenę swojej zdolności do wykonywania technik klonowania molekularnego (np. analiza sekwencji DNA, reakcje trawienia restrykcyjnego, elektroforeza w żelu agarozowym). Studenci stwierdzili również, czy czuliby się komfortowo, kontynuując karierę w biologii molekularnej w oparciu o swoją wiedzę na temat technik klonowania molekularnego. W kwestionariuszu zamieszczonym po zakończeniu kursu zawarto dwa dodatkowe pytania, aby umożliwić studentom samoocenę ich zaangażowania w naukę na kursie oraz to, czy kurs był wartościowym doświadczeniem edukacyjnym (Plik uzupełniający 6 i Plik uzupełniający 7). Wszystkie dane z odpowiedzi studentów przed i po kwestionariuszu z 2022 i 2023 roku zostały połączone do analizy i są dostępne w tabeli uzupełniającej S1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z udziałem uczestników zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez uczestników w Research Institutional Review Board w Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). Uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

Poniższy protokół opisuje przygotowanie instruktora (kroki 1.1–1.3), działania studentów w module nauczania składającym się z trzech eksperymentów, który obejmuje PCR w celu uzyskania fragmentów liniowych (kroki 2.1–2.7), montaż, transformację i selekcję klonów Gibsona (kroki 3.1–3.5), izolację i badania przesiewowe plazmidu (kroki 4.1–4.4) oraz ocenę efektów uczenia się (5.1–5.2). Przygotowanie instruktora opisuje jeden z reprezentatywnych przykładów projektowania podkładu i przygotowania pożądanej mapy plazmidowej in silico. Wszystkie sekcje protokołu można dostosować do innych pożądanych plazmidów. Każdy eksperyment studencki podzielony jest na dwa 3-godzinne spotkania laboratoryjne.

1. Przygotowanie instruktora

  1. Projektowanie podkładu zespołu Gibson przy użyciu kreatora montażu ławkowego
    1. Określ źródło matrycy DNA dla wstawienia genu, takie jak genomowe DNA, plazmid i syntetyczne DNA.
      nuta: W przypadku genów, które będą amplifikowane ze złożonych matryc genomowego DNA, zaleca się najpierw określenie unikalnych miejsc wiązania starterów w szablonie genomowego DNA, które są specyficzne dla interesującego genu (genów), korzystając z narzędzia National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)21, zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1. W przypadku prostych szablonów, takich jak plazmidy lub syntetyczne DNA, przejdź do następnego kroku.
    2. Pobierz sekwencje DNA wstawki genu (wstawień) genu (wstawień) genu genu (sytuacji) genu hydroksylazy poliketydowej i sekwencji pUC19 dostarczonej jako pliki GenBank w pliku uzupełniającym 8). Zaimportuj żądaną sekwencję (sekwencje) wstawiania i żądaną sekwencję wektorową do Benchling, każdy jako nowy plik sekwencji DNA. Otwórz każdą zaimportowaną sekwencję, która ma zostać uwzględniona w reakcji zespołu Gibsona.
      nuta: Można importować pliki sekwencji DNA w kilku formatach, w tym GenBank i FASTA. Można również zaimportować sekwencję bezpośrednio z bazy danych z numerem dostępu lub wkleić sekwencję nukleotydową skopiowaną z innego pliku lub przeglądarki.
    3. U dołu ekranu znajdź narzędzie Kreator złożenia. Kliknij opcję Kreator złożeń, a następnie wybierz opcję Utwórz nowy zestaw. Z wyświetlonych opcji wybierz Gibson i kliknij Start, aby rozpocząć składanie.
    4. W oknie sekwencji wektorów wybierz wszystkie bazy z wektorowej sieci szkieletowej, które mają zostać uwzględnione w złożeniu. Rozpocznij selekcję od pozycji nukleotydu na końcu 3' wstawki genu (np. pozycja 657 pUC19) i wybierz wszystkie pozostałe nukleotydy do włączenia (np. przez pozycję 656, aby uwzględnić całą sekwencję pUC19). Po wybraniu kliknij kartę Szkielet u dołu ekranu| Ustaw Fragment.
      nuta: Przełączaj się między widokami Mapy sekwencji i Plazmidów wektora, aby wybrać wszystkie żądane podstawy okrągłego szablonu. Alternatywnie, jeśli planujesz przygotować fragment wektora za pomocą trawienia restrykcyjnego (zamiast PCR) dla montażu Gibsona, zlinearyzuj sekwencję szkieletową z miejscem cięcia enzymu restrykcyjnego (np. XbaI). Aby to zrobić, kliknij miejsce cięcia, przytrzymaj Shift i ponownie kliknij miejsce cięcia. Następnie kliknij Ustaw fragment, aby ustawić szkielet. Należy pamiętać, że startery specyficzne dla wektorów nie zostaną wygenerowane przez Benchlinga, jeśli szkielet zostanie zlinearyzowany za pomocą enzymu restrykcyjnego w Kreatorze złożeń.
    5. W oknie sekwencji wstawiania wybierz wszystkie podstawy wkładki, które mają zostać uwzględnione w zespole. Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu | Ustaw fragment.
    6. W przypadku wielu wstawek genów kliknij przycisk + po prawej stronie Kreatora zestawów. W oknie sekwencji wstawiania wybierz wszystkie podstawy wstawek, które mają zostać uwzględnione w zespole. Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu | Ustaw fragment.
    7. Po ustawieniu wszystkich fragmentów zmień nazwę zespołu na żądaną nazwę plazmidu i kliknij przycisk Złóż po prawej stronie Kreatora złożeń. Wybierz żądaną lokalizację folderu zarówno dla folderu sekwencji, jak i folderu podkładu. Kliknij przycisk Utwórz, aby złożyć sekwencję rekombinowanego plazmidu.
    8. Otwórz zmontowany plazmid i kliknij opcję Historia złożenia, aby wyświetlić podstawową mapę plazmidu i przegląd sekwencji, z których został on uzyskany. Upewnij się, że pozycje nukleotydów dla każdego fragmentu są zgodne z pożądanym projektem.
    9. Na karcie Parametry zespołu wyświetl nazwy podkładów zaprojektowanych dla zespołu. Zauważ, że dla każdej wkładki będą przeznaczone dwa startery (do przodu i do tyłu), a nazwy starterów będą pochodzić z tytułów plików sekwencji DNA. Upewnij się również, że temperatury topnienia podkładu i sugerowane temperatury wyżarzania są zgodne w tym oknie (patrz Plik uzupełniający 8, Reprezentatywne startery).
      1. Jeśli temperatury topnienia startera lub wyżarzania nie są idealne, ręcznie dostosuj sekwencje startera (np. usuwając nukleotydy w celu obniżenia temperatury topnienia) w plikach sekwencji starterów. Alternatywnie, kliknij Otwórz ponownie i dostosuj ustawienia startera, klikając przycisk Ustawienia enzymu/startera obok przycisku Złóż w Kreatorze montażu. Następnie powtórz krok montażu i ponownie sprawdź sekwencje starterów.
      2. Jeśli biblioteka plazmidów ma być sklonowana z wieloma różnymi genami sklonowanymi do tej samej sieci szkieletowej wektora,
      3. W każdym przypadku użyj tej samej pary starterów dla wektora. Aby to zrobić, ręcznie usuń wszystkie nukleotydy ze starterów wektorowych, które zainstalowałyby zwisy specyficzne dla insertu. Nukleotydy te znajdowałyby się na końcu 5' startera. Po usunięciu upewnij się, że temperatury topnienia podkładu i temperatury wyżarzania są zgodne (patrz plik uzupełniający 8, Reprezentatywne podkłady).
      4. Upewnij się, że wszystkie pary podkładów mają bardzo podobne temperatury topnienia i wyżarzania.
        nuta: Zmniejszy to potrzebę optymalizacji temperatury wyżarzania każdej pary i pozwoli na cykliczne przeprowadzanie wszystkich reakcji PCR uczniów w tym samym czasie przy użyciu tego samego programu termocyklera.
    10. Po zakończeniu projektowania startera dla żądanych plazmidów kliknij przycisk Finalizuj w Kreatorze złożeń. Zamów startery w firmie zajmującej się syntezą DNA i pobierz próbki matryc DNA do wstawienia (wstawień) i wektora.
    11. Przetestuj zarówno pary starterów specyficzne dla insertu, jak i wektora, aby uzyskać optymalne temperatury wyżarzania, korzystając z gradientowego eksperymentu PCR z matrycami DNA. Początkowo należy sprawdzić zalecane przez Benchlinga temperatury wyżarzania ± 3 °C.
    12. Po określeniu temperatur wyżarzania utwórz podwielokrotności roztworów starterów, matryce DNA i niezbędne odczynniki do reakcji PCR dla uczniów.
  2. Przed eksperymentami rozdaj uczniom arkusze robocze, które pomogą im się przygotować i ocenić zrozumienie (Plik Uzupełniający 4, Dodatek 5 i Dodatek 6).
  3. Gromadzenie danych o efektach uczenia się
    nuta: Jeśli jesteś zainteresowany zebraniem danych o wynikach uczenia się z modułu Gibson Assembly i opublikowaniem wyników, uzyskaj zgodę na badania z udziałem ludzi zgodnie z polityką instytucji.
    1. Zaproś uczniów do wzięcia udziału w badaniu efektów uczenia się co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem niezależnego projektu Gibson Assembly.
    2. Poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wstępnego wielokrotnego wyboru (Plik uzupełniający 6) na spotkaniu laboratoryjnym przed rozpoczęciem niezależnego projektu.

2. Eksperyment studencki A: PCR w celu uzyskania fragmentów liniowych

  1. Zdobądź startery i roztwory matryc DNA do PCR od instruktora.
  2. Pipeta 25 μl reakcji, w tym polimeraza DNA MasterMix, matryca DNA, startery do przodu i do tyłu oraz woda wolna od nukleaz zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku dla uczniów (patrz plik uzupełniający 2).
  3. Cyklicznie przeprowadź reakcję w termocyklerze zgodnie z podręcznikiem dla uczniów w pliku uzupełniającym 2. Upewnij się, że temperatura wyżarzania w reakcji jest odpowiednia dla starterów, a czas wydłużania jest odpowiedni dla długości pożądanego amplikonu. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 2 i Pliku Uzupełniającym 3.
  4. Przechowywać reakcje PCR w temperaturze 4 °C lub -20 °C do następnego okresu laboratoryjnego.
  5. Przeanalizować 5 μl każdej reakcji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Podczas pracy żelu dodaj 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI do każdej reakcji, która wykorzystywała plazmidowe DNA jako matrycę. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    nuta: DpnI zdegraduje pozostałą kolistą matrycę plazmidowego DNA, zmniejszając prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie dodatnich na etapie transformacji.
  6. Zobrazuj żel, aby potwierdzić, że PCR się powiódł i osiągnięto prawidłową amplifikację. Oczyść wszelkie udane reakcje PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Zmierz stężenie (ng/μl) oczyszczonego produktu PCR za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do wykorzystania w kolejnych obliczeniach zespołu Gibsona.
  7. Przed następnym spotkaniem klasowym zaprojektuj przepis na reakcję dla zespołu Gibsona (patrz Plik Uzupełniający 2 i Plik Uzupełniający 4).

3. Eksperyment studencki B: Gibson Montaż, transformacja i selekcja klonów

  1. Odpipetować reakcję zespołu Gibsona zgodnie z opracowaną recepturą. Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 15 minut. Podczas inkubacji reakcji przygotuj się do transformacji, rozmrażając chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli na lodzie.
  2. Przekształć 2 μl zespołu Gibsona w chemicznie kompetentne ogniwa za pomocą szoku cieplnego. Odpipetować 100 μl przekształconych komórek na dwóch płytkach selekcyjnych i rozprowadzić za pomocą wysterylizowanych kulek. Przygotować 10-4, 10-5 i 10-6 rozcieńczeń pozostałych komórek na agarze Luria-Bertani (LB). Umieścić 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na LB (bez wyboru) i rozprowadzić sterylizowanymi kulkami.
    nuta: Ten krok pozwala na obliczenie wydajności transformacji.
  3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do następnego okresu lekcyjnego.
  4. Policz kolonie na wszystkich płytkach i oblicz wydajność transformacji zgodnie z instrukcjami w pliku uzupełniającym 2. Ponownie prążkować jedną selektywną płytkę czterema koloniami z każdej selektywnej płytki i inkubować tę płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    nuta: Służy to jako kultura zapasowa twoich pozytywnych klonów.
  5. Za pomocą markera wybierz, zakreśl i oznacz cztery odrębne kolonie na płytce selekcyjnej inicjałami ucznia i liczbą (np. ABC1). Pobrać nową płytkę LB-agar zawierającą antybiotyk do selekcji, użyć markera, aby podzielić płytkę na ćwiartki (tj. ćwiartki), a następnie użyć ~ 1/2 każdej kolonii do ponownego naniesienia smug na odpowiednio oznakowany kwadrant, a drugiej 1/2 do zaszczepienia 5 ml płynnej kultury LB dla każdej z czterech wybranych kolonii. Pamiętaj, aby oznaczyć probówki odpowiednią tożsamością kolonii (np. ABC1) i dodać odpowiednie stężenie antybiotyku do wyboru. Inkubować płynne kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc, a płytkę agarową w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C; Płynne kultury kultury i płytki przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego okresu lekcyjnego.

4. Eksperyment studencki C: Izolacja plazmidu i badania przesiewowe

  1. Wyizoluj plazmidowe DNA z płynnych kultur z eksperymentu B za pomocą zestawu do miniprzygotowania. Zmierzyć stężenie izolowanego plazmidu (w ng/μl).
  2. Zaprojektuj trawienie restrykcyjne lub przesiewowe badanie PCR w celu analizy izolowanych plazmidów (patrz szczegółowe instrukcje w pliku uzupełniającym 2 i oczekiwania dotyczące raportu w pliku uzupełniającym 5).
  3. Pipetować restrykcyjne reakcje trawienia lub reakcje zgodnie z opracowanymi recepturami i inkubować w temperaturach i czasie określonym wcześniej.
  4. Analizuj wyniki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

5. Ocena

  1. Poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wielokrotnego wyboru po spotkaniu laboratoryjnym (Plik uzupełniający 7) po ukończeniu modułu Gibson Assembly.
  2. Połącz wszystkie dane z odpowiedzi udzielonych przed i po kwestionariuszu w celu analizy.
    1. Zbadaj istotność statystyczną wzrostu średniego wyniku każdego pytania o treść między kwestionariuszami, używając dwustronnych sparowanych testów t i wielkości efektu d Cohena.
    2. Oceń wzrost pewności siebie uczniów dla każdego indywidualnego terminu i techniki, aby określić zakres zmiany i jej istotność statystyczną.
    3. Określ wpływ pochodzenia ucznia i czynników akademickich na uczenie się ucznia za pomocą znormalizowanych wyników uczenia się (NLG) i niesparowanych testów t.
    4. Oceń postawy uczniów wobec doświadczeń związanych z projektem i karierą w biologii molekularnej, oceniając średnie wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sukces ucznia w klonowaniu
W każdej iteracji modułu Gibson Assembly (2019, 2022 i 2023) uczniowie zostali poproszeni o przygotowanie raportu podsumowującego ich ustalenia. W 2019 r. 36 z 44 studentów (81,8%) zgłosiło, że udało im się sklonować swoje plazmidy na podstawie wyników badania przesiewowego, które zaprojektowali dla eksperymentu C. W sumie 14 z 20 studentów (70,0%) zgłosiło sukces w klonowaniu przypisanych im konstruktów w 2022 r., podczas gdy w projekcie zespołowym w 2023 r. 12 z 27 studen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj proponujemy regulowany projekt laboratoryjny w klasie licencjackiej, który uczy studentów klonowania molekularnego za pomocą Gibson Assembly w warunkach badawczych opartych na kursach. W sumie 28 nowych plazmidów zostało sklonowanych przez studentów studiów licencjackich w warunkach klasowych. Indywidualny sukces zgłaszany przez studentów wahał się od 44,4% do 81,8% w trzech kohortach, a ogólny sukces klonowania wyniósł 80% (28 z 35 wszystkich przypisanych plazmidów zostało pomyślnie sklonowanych). Mniejszy sukces ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Andrei Laubscher za wsparcie techniczne, a także Michaelowi Blackowi, Sandi Clement i Javinowi Ozie za pomocne dyskusje na temat wdrażania laboratorium nauczania i oceny efektów uczenia się. Autorzy z uznaniem dziękują wszystkim studentom, którzy wzięli udział w badaniu efektów uczenia się w kohortach 2019, 2022 i 2023, a także studentom Nathanowi Kuhnowi i Aayushi Adettiwarowi, którzy pomagali w przygotowaniu odczynników do wdrożenia w laboratorium dydaktycznym. Autorzy dziękują również za wsparcie finansowe ze strony William and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant oraz National Science Foundation (NSF-1708919 i NSF-2300890).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trifosforan dezoksyrybonukleotydu (dNTPs, 10  mM)Fisher ScientificFERR0191Homemade' MasterMix składnik
Ditiothreitol (DTT)Fisher ScientificFERR0861Homemade' MasterMix składnik
DpnI New England BiolabsR0176S1000 jednostek
Inkubator mikrobiologiczny Fisherbrand IsotempFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Kąpiel wodnaIsotemp Fisher ScientificS28124
GelRed Barwnik w żelu z kwasami nukleinowymiBiotiumNC959471910 000X
Ekstrakcja żelu GeneJET i mikrozestaw do oczyszczania DNAThermo ScientificFERK0831100 Preps
GeneRuler 1 kb Drabinka DNAFisher ScientificFERSM0314100 zastosowań
LB Broth, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 g
Chlorek magnezu sześciowodnyFisher ScientificBP214-500Domowy składnik MasterMix Mastercycler
nexus X2 Gradient ThermocyclerEppendorf6337000027
Wirówka Microfuge 16Beckman CoulterA46474
Bakterie Micromonospora echinosporaKolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC 15837
Kuchenka mikrofalowaGeneral Electric 
Klasa biologii molekularnej AgarozaFisher BioReagentsBP160-100100 g
Nanokropla Jeden spektrofotometr mikroobjętościowyThermo Scientific13-400-518
NEB 5-alfa Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2987H20 x 0,05 ml
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabsE2621S10 reakcji
Wytrząsarka orbitalna New Brunswick Innova 40New BrunswickM1299-0090
Odczynniki BioReagenty Fisherbez nukleazBP248450 50 ml
PEG-8000 Fisher ScientificBP233-100Domowy składnik MasterMix
Phusion DNA Polimeraza NewEngland BiolabsM0530Domowy składnik MasterMix
Przenośna wagaOhausSKX123
pUC19 wektor NewEngland BiolabsN3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England BiolabsM0492S100 reakcji
EpicentrumegzonukleazyT5E4111KDomowy składnik MasterMix
Taq DNA LigazaNew England BiolabsM0208Domowy składnik MasterMix
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Domowy składnik MasterMix
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)Thermo ScientificFERR11615 x 1 ml
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4019100 Preps
β-Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)New England BiolabsB9007SDomowy składnik MasterMix
2440640T5

Bibliografia

  1. Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory. Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Bell, J. K., et al. CUREs in biochemistry—where we are and where we should go. Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).
  4. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).
  5. Buchanan, A. J., Fisher, G. R. Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review. CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).
  6. Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).
  7. Li, G., et al. CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research. Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).
  8. Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry. Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).
  9. Li, C., et al. Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology. Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).
  10. Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes. Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).
  11. Dean, D. M., Wilder, J. A. The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods. Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).
  12. Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).
  13. Roberts, L. A., Shell, S. S. A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation. Front Microbiol. 13, 1025250(2023).
  14. Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects. Microbiol Res. 246, 126708(2021).
  15. Banskota, A. H., et al. TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins. J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).
  16. Schorn, M., et al. Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors. ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).
  17. Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).
  18. Williams, L. C., et al. The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education. Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).
  19. Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM. PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).
  20. Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors. CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).
  21. Camacho, C., et al. BLAST+: Architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  22. Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly (2024).
  23. Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Montaż Gibsonabadania oparte na kursachbiblioteki plazmidoweefekty uczenia się studentówprogram biologii molekularnejtechniki klonowaniabiosynteza produktów naturalnychmoduł kursu laboratoryjnego
Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.