CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Podsumowanie

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

Streszczenie

Circularization for In Vitro Reporting of Cutavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) to nowatorska technika opracowana do bezstronnej identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia CRISPR-Cas9 poprzez ukierunkowane sekwencjonowanie DNA rozszczepionego CRISPR-Cas9. Protokół obejmuje krążenie genomowego DNA (gDNA), które jest następnie traktowane białkiem Cas9 i przewodnikiem RNA (gRNA) będącym przedmiotem zainteresowania. Po poddaniu działaniu substancji rozszczepione DNA jest oczyszczane i przygotowywane jako biblioteka do sekwencjonowania Illumina. Proces sekwencjonowania generuje odczyty sparowanych końców, oferując kompleksowe dane na temat każdego miejsca rozszczepienia. CIRCLE-seq zapewnia kilka zalet w porównaniu z innymi metodami in vitro, w tym minimalne wymagania dotyczące głębokości sekwencjonowania, niskie tło i wysokie wzbogacenie gDNA rozszczepionego Cas9. Te zalety zwiększają czułość w identyfikowaniu zarówno zamierzonych, jak i niezamierzonych zdarzeń związanych z dekoltem. Badanie to zapewnia kompleksową, krok po kroku procedurę badania niezamierzonej aktywności CRISPR-Cas9 przy użyciu CIRCLE-seq. Na przykład protokół ten jest weryfikowany poprzez mapowanie niezamierzonych miejsc rozszczepienia CRISPR-Cas9 w całym genomie podczas modyfikacji locus AAVS1. Cały proces CIRCLE-seq można zakończyć w ciągu dwóch tygodni, co daje wystarczająco dużo czasu na wzrost komórek, oczyszczenie DNA, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie Illumina. Wprowadzanie danych sekwencjonowania do potoku CIRCLE-seq ułatwia usprawnioną interpretację i analizę miejsc rozszczepienia.

Wprowadzenie

Inżynieria genomu odnotowała znaczący postęp w ciągu ostatnich dwudziestu lat, z głównym kamieniem milowym jakim było odkrycie w 2012 roku zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-Cas9¹. Wykorzystując programowalny charakter endonukleaz bakteryjnego DNA, technologia CRISPR-Cas9 umożliwia precyzyjne celowanie i modyfikację niemal każdej sekwencji DNA. Od samego początku system został zoptymalizowany tak, aby opierał się wyłącznie na endonukleazie Cas9 i przewodnikowym RNA (gRNA) do edycji określonych regionów genomu. Potencjał CRISPR-Cas9 jako terapii leczniczej został wykazany w badaniach klinicznych dotyczących różnych schorzeń, takich jak między innymi wrodzona ślepota Lebera, amyloidoza transtyretynowa i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa^2,3,4.

CRISPR-Cas9 indukuje dwuniciowe przerwy (DSB), które zazwyczaj są rozwiązywane przez jeden z dwóch mechanizmów: podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub bardziej precyzyjną naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), pod warunkiem, że dostępna jest matryca DNA. Tendencja CRISPR-Cas9 do powodowania insercji i delecji (indelii) związanych z NHEJ, wraz z rozszczepieniem w niezamierzonych miejscach genomu, ogranicza jego zastosowanie w warunkach klinicznych^5,6,7,8,9,10. Dodatkowo, niezamierzone modyfikacje genomu mogą tworzyć tajemnicze miejsca splicingu, mutacje nonsensowne lub missense, indukować chromothripsis lub nadawać potencjał onkogenny komórkom - wyniki, które zaobserwowano w kilku próbach edycji genomu^{11,12,13,14,15}. Podsumowując, dokładna identyfikacja niezamierzonej aktywności CRISPR-Cas9 ma kluczowe znaczenie dla jego zastosowań klinicznych, szczególnie w ogólnoustrojowych terapiach genowych, które mogą zmienić miliardy komórek.

Różne metody mogą być stosowane do identyfikacji miejsc cięcia CRISPR-Cas9 poza celem, w tym Genome-wide Unbiased Identification of Double-stranded breaks (GUIDE)-seq¹⁶, który wykorzystuje dwuniciowe oligodeoksynukleotydy do oznaczania DSB w żywych komórkach. Niemniej jednak krytyka tej metody polega na tym, że fałszywe alarmy mogą wynikać z losowych DSB lub artefaktów PCR, które należy odrzucić, wykluczając przechwycone witryny, które wykazują słabe podobieństwo do witryn docelowych. Metoda oparta na użyciu wektora lentiwirusowego z wadą integrazy (IDLV) jest mniej czuła i prawdopodobnie pominie wiele miejsc poza celem¹⁷. Inne metody in situ, takie jak DSBCapture, BLESS i BLISS^18,19,20 obejmują stałe komórki i bezpośrednio oznaczają DSB, jednak są ograniczone przez ich zależność od natychmiastowego wychwytywania DSB i brak egzogennego DNA. Digenome-seq²¹, metoda in vitro, oraz Selektywne wzbogacanie i identyfikacja oznaczonego genomowego DNA kończy się sekwencjonowaniem (SITE-seq)²² zapewniają rozwiązania do sekwencjonowania, ale mają swoje ograniczenia odpowiednio w szumie tła i analizie pojedynczego końca. Wykrywanie in situ Cas off-targets i weryfikacja za pomocą sekwencjonowania (Discover-Seq)²³ oferuje identyfikację in vivo i in situ aktywności Cas9 poprzez wiązanie MRE11, ale wykrywa tylko DSB, które istnieją w momencie przygotowania próbki²⁴. Wreszcie, Wnioskowanie o edycjach CRISPR (ICE) wykorzystuje podejście bioinformatyczne do solidnej analizy edycji CRISPR przy użyciu danych Sangera²⁵.

Ten artykuł opisuje szczegółową procedurę cyrkularyzacji dla In Vitro Reporting of Cutavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq): technika in vitro, która z wyczuciem i bezstronnością mapuje aktywność nukleazy Cas9 w całym genomie poza celem w kompleksie z interesującym gRNA²⁶. Podejście to rozpoczyna się od hodowli komórek będących przedmiotem zainteresowania i wyizolowania DNA, po czym następuje losowe ścinanie za pomocą zogniskowanych ultradźwięków, a następnie leczenie egzonukleazą i ligazą. Proces ten ostatecznie wytwarza koliste dwuniciowe cząsteczki DNA, które są następnie oczyszczane poprzez bezpieczne dla plazmidu traktowanie DNazą. To koliste DNA jest następnie wystawiane na działanie kompleksu Cas9-gRNA, który rozszczepia się zarówno w zamierzonych, jak i niezamierzonych miejscach cięcia, pozostawiając odsłonięte końce DNA, które działają jako substraty do ligacji adaptera Illumina. W wyniku tego procesu powstaje zróżnicowana biblioteka genomowego DNA (gDNA) zawierająca oba końce każdego DSB indukowanego nukleazą, zapewniając, że każdy odczyt zawiera wszystkie informacje niezbędne dla każdego miejsca rozszczepienia. Pozwala to na zastosowanie sekwencjonowania Illumina z niższymi wymaganiami dotyczącymi pokrycia sekwencjonowania, co odróżnia CIRCLE-seq od innych podobnych metod wymienionych powyżej. Należy zauważyć, że chociaż CIRCLE-seq ma wyższą czułość poza celem niż inne protokoły jako metoda in vitro, odbywa się to kosztem większej liczby wyników fałszywie dodatnich ze względu na brak krajobrazu epigenetycznego, który jest obecny w innych metodach, takich jak GUIDE-seq¹⁶. Dodatkowo, naprawa DNA DSB i związana z nią maszyneria nie są obecne w CIRCLE-seq, znosząc indele lub prawidłową naprawę, która w przeciwnym razie zostałaby zaobserwowana.

Oprócz opisu krok po kroku protokołu do wykonania CIRCLE-seq, protokół jest weryfikowany poprzez identyfikację niezamierzonych miejsc cięcia CRISPR-Cas9 w całym genomie, które występują podczas modyfikacji locus AAVS1, jako przykład. Ten łatwy do naśladowania protokół zawiera szczegółowe instrukcje, od hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i izolacji gDNA po krążenie gDNA, szczepienie Cas9-gRNA, przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie i analizę rurociągu. Biorąc pod uwagę niskie wymagania dotyczące pokrycia sekwencjonowaniem, CIRCLE-seq jest dostępny dla każdego laboratorium z dostępem do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa (5 dni)

1. Uwzględnij kontrolę negatywną w całym tym protokole. Przygotuj wystarczającą ilość komórek na dodatkowe 25 μg gDNA (~2,0 i⁷ komórek na próbkę).
2. Hodowla iPSC zgodnie z ustalonym protokołem²⁷. Zebrać komórki i ponownie zawiesić je w 10 ml PBS. Pobrać pipetę próbki komórek o objętości 6 μl i ponownie zawiesić w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć próbkę.
3. Podwielokrotność 2 x 10⁷ komórek w probówce, następnie wirować w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C (temperatura pokojowa (RT)). Jest to wystarczające w przypadku wielu powtórzeń. Odpipetować i wyrzucić supernatant.

2. Izolacja genomowego DNA (1 dzień)

1. Użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA, aby wyizolować gDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta:
   1. Dodać 200 μl PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej osad komórkowy i ponownie zawiesić. Następnie odpipetować 3 ml buforu do lizy komórek i 15 μl proteinazy K do probówki. Odwróć probówkę 25 razy, aby dokładnie wymieszać. Umieść probówkę w wytrząsarce do łaźni wodnej ustawionej na 55 °C i 150 obr./min na 3 godziny lub na noc, aby uzyskać optymalną wydajność DNA.
   2. Odpipetować w 15 μl RNazy A. Odwrócić 25 razy. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
   3. Schładzać próbkę na lodzie przez 5 minut. Następnie dodać 1 ml roztworu do wytrącania białek, wirować z dużą prędkością przez 20 s i odwirować przy 2000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Białka powinny tworzyć widoczną, zwartą osadkę na dnie probówki. Jeżeli osad nie jest widoczny, należy inkubować próbkę na lodzie przez dodatkowe 5 minut i ponownie odwirować.
   4. Dodaj 3 ml 100% izopropanolu do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie odpipetować supernatant z kroku 2.1.3 do probówki. Odwróć probówkę 50 razy, aby wymieszać, a następnie odwirować w temperaturze 2000 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Nie naruszając osadu DNA, ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety Pasteura podłączonej do pułapki próżniowej i odwrócić probówkę na czystej, niestrzępiącej się chusteczce.
   5. Odpipetować 3 ml 70% (v/v) etanolu na osad DNA i odwrócić 10 razy w celu przepłukania. Wirować przy 2 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wylej supernatant.
   6. Trzymaj probówkę otwartą i pozwól powstałej osadce DNA wyschnąć przez 30 minut, upewniając się, że cały etanol całkowicie odparował. Odpipetować pipetą 50 μl roztworu do uwodnienia DNA i dokładnie wymieszać delikatnym pipetowaniem.
   7. Rozpuścić DNA, umieszczając próbkę w wytrząsarce do kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C na 1 godzinę, a następnie pozostawić próbkę na noc w temperaturze pokojowej. Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej i 2 000 x g przez 1 minutę i użyć zestawu do oznaczania próbek BR dsDNA z odpowiednimi probówkami do ilościowego oznaczenia wyizolowanego DNA za pomocą fluorometru.

3. Przygotowanie gRNA (7 dni)

1. Zamów interesujące Cię syntetyczne gRNA ze źródła komercyjnego (patrz Tabela materiałów). Protokół ten jest również kompatybilny z crRNA/tracrRNA.

4. Test rozszczepienia gRNA in vitro

UWAGA: Tutaj używany jest cel w genie AAVS1. Aby celować w inne interesujące geny, zaprojektuj startery (Tabela 1) w celu amplifikacji regionu docelowego i zastąp startery w kolejnych krokach niestandardowymi starterami.

1. Przygotuj reakcję PCR: Wymieszaj 25 μL Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix (Stężenie końcowe 1x), 0,5 μL AAVS1 F Primer (Stężenie końcowe 0,1 μM), 0,5 μL AAVS1 R Primer (Stężenie końcowe 0,1 μM), 5 μL gDNA (100 ng, 20 ng/μL, z kroku 2.1.6), i 19 μl H₂O wolnego od nukleaz (całkowita objętość: 50 μL).
2. Stosować następujące parametry termocyklera: Denaturacja: 98 °C przez 2 min (1 cykl), Denaturacja: 98 °C przez 10 s (10 cykli), Wyżarzanie: 72-62 °C (-1 °C/cykl) przez 15 s (10 cykli), Przedłużenie: 72 °C przez 30 s (10 cykli), Denaturacja, 98 °C przez 10 s (30 cykli). Wyżarzanie: 65 °C przez 15 s (30 cykli), Przedłużenie: 72 °C przez 30 s (30 cykli), Końcowe przedłużenie: 72 °C przez 5 minut (1 cykl), Utrzymanie: 4 °C na czas nieokreślony.
3. Użyj kulek AMPure XP do oczyszczenia produktu z reakcji PCR. Najpierw należy odpipetować 1,8 raza objętość (90 μl) kulek XP do produktu PCR. Odpipetować dziesięć razy, aby dokładnie wymieszać. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut do inkubacji.
4. Za pomocą stojaka magnetycznego oddziel kulki od roztworu, umieszczając płytkę reakcyjną PCR na magnesie na 3 minuty. Odpipetować oczyszczony roztwór i wyrzucić. Dodaj 200 μl 80% etanolu (v/v) do kulek, inkubuj przez 30 s, a następnie usuń etanol. Powtórz ten etap mycia dwukrotnie, aby zapewnić całkowite usunięcie etanolu.
5. Pozostaw próbki do naturalnego wyschnięcia na 3 minuty, umieszczając płytkę na magnesie. Zdejmij płytkę z magnesu i dodaj 40 μl buforu TE o pH 8,0. Mieszać, pipetując w górę i w dół dziesięć razy. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
6. Umieść płytkę reakcyjną PCR na magnesie na dodatkową minutę. Po upływie 1 minuty przenieść supernatant na nową płytkę. Zmierz wydajność oczyszczonego PCR za pomocą spektrofotometru i przeanalizuj go na TapeStation za pomocą paska tuby optycznej z nasadką paska tubusu optycznego, wraz z odczynnikami High Sensitivity D1000 ScreenTape i High Sensitivity D1000 (drabinka i bufor), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotowaną próbkę należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
7. Rozcieńczyć białko nukleazy Cas9 do 1 μM w następujący sposób: Wymieszać 2 μl 10x buforu Cas9 (stężenie końcowe 1x), 1 μl nukleazy Cas9, S. pyogenes (stężenie końcowe 1 μM) i 17 μl H_2Owolnego od nukleaz w całkowitej objętości 20 μL.
8. Wykonaj procedurę bez RNazy, aby zapobiec degradacji gRNA. Rozcieńczyć gRNA (od kroku 3.1) do 3 μM w H₂O do całkowitej objętości 10 μL.
   UWAGA: Użyj następującego wzoru, aby oszacować masę cząsteczkową gRNA: Masa cząsteczkowa ssRNA (g/mol) = (długość ssRNA (nt) x 321.47 g/mol) + 18.02 g/mol. Dla porównania, gRNA o długości 104 nt przy 3 μM wynosi około 100 ng / μL.

5. Ścinanie DNA (3 godziny)

1. Przygotuj ME220, najpierw bazując na wahaczu. Następnie napełnij zbiornik oczyszczonym dejonizowanym_H2O. Na laptopie stacji kontrolnej uzyskaj dostęp do wodociągów i kliknij Napełnij. Ustaw temperaturę na 4.5 °C.
2. Przenieś 25 μg gDNA do mikroprobówki (mikroprobówka-130 AFA Fiber Screw-Cap). Następnie napełnij probówkę do całkowitej objętości 130 μL 1x TE. Użyj następujących warunków, aby ścinać DNA do średniej długości ok. 300 pz: ustaw Czas trwania na 10 s; moc szczytowa do 70; współczynnik cła % do 20; Cykle/seria do 50; wszystko to automatycznie ustawi średnią moc na 14,0.

6. Oczyszczanie ściętego genomowego DNA (1 h)

1. Podzielić ścięte genomowe DNA na dwie porcje po 65 μl każda. Oczyść za pomocą 1,8-krotności objętości kulek XP (117 μl), postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.3-4.6. Przenieść supernatant na nową płytkę PCR i zmierzyć ilość za pomocą spektrofotometru.
2. Uruchom 1 μl wymywanego ściętego gDNA na TapeStation, zgodnie z instrukcjami producenta, aby upewnić się, że gDNA jest ścięte do szerokiej dystrybucji ok. 300 pz. W razie potrzeby należy przechowywać ścięte gDNA w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.

7. Przygotowanie biblioteki CIRCLE-seq (3 dni)

1. Wyżarzanie adaptera spinki do włosów
   1. Ponownie zawiesić oSQT1288 (Tabela 1), adapter spinki do włosów, do końcowego stężenia 100 μM w 1x TE.
   2. Wyżarzanie adaptera należy wykonać w następujący sposób: zmieszać 40 μl oSQT1288 (stężenie końcowe 40 μM), 10 μl 10x STE (stężenie końcowe 1x) i 50 μl H_2Obez nukleaz na łączną objętość 100 μL.
   3. Stosować następujące parametry wyżarzania: 95 °C przez 5 min, -1 °C na minutę przez 70 cykli, utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
2. Wykonaj naprawę końcową . Skorzystaj z zestawu do przygotowania biblioteki HTP bez PCR i przygotuj End-Repair Master Mix.
   1. Wymieszać 8 μl H₂O bez nukleaz, 7 μl 10x buforu do naprawy końcówek (stężenie końcowe 1x) i 5 μl mieszanki enzymów do naprawy końcówek (końcowa objętość 20 μl całkowitej mieszanki głównej naprawy końca).
   2. Odpipetować 20 μl głównej mieszanki do naprawy końcówek do ściętej próbki gDNA z etapów 4.3-4.6. Zmieszać 20 μl End-Repair Master Mix z 50 μl ściętego gDNA, aby uzyskać końcową objętość 70 μl.
   3. Umieścić mieszaninę w termocyklerze w temperaturze 20 °C na 30 minut, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   4. Dodaj 1,7 raza objętość lub 120 μl kulek XP i postępuj zgodnie z krokami oczyszczania z kroków 4.3-4.6. Eluować za pomocą 42 μl TE, pH 8,0. Upewnij się, że koraliki pozostają w roztworze do następnego kroku.
3. Wykonaj A-tailing. Korzystając z zestawu do przygotowania biblioteki HTP (bez PCR), przygotuj A-tailing Master Mix.
   1. Zmieszać 5 μl 10x buforu A-tailing (stężenie końcowe 1x) i 3 μl enzymu A-tailing (całkowita końcowa objętość 8 μl A-tailing Master Mix).
   2. Odpipetować 8 μl A-tailing Master Mix do każdej próbki DNA zawierającej kulki z kroku 7.2.4, mieszając 8 μl A-tailing Master Mix z 42 μl DNA zawierającego kulki z naprawionym końcem (całkowita końcowa objętość 50 μl). Umieścić w termocyklerze w temperaturze 30 °C na 30 minut. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Odpipetować 1,8 objętości lub 90 μl roztworu PEG/NaCl SPRI (składnik zestawu do przygotowania biblioteki HTP (bez PCR; 96 reakcji)) do DNA z ogonem A. Oczyść DNA z ogonem A zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować DNA z ogonem A w 30 μl TE, pH 8,0. Trzymaj koraliki w roztworze do następnego kroku.
4. Wykonaj podwiązanie adaptera. Korzystając z zestawu do przygotowania biblioteki HTP (bez PCR), przygotuj Adapter Ligation Master Mix.
   1. Wymieszaj 10 μl 5x buforu ligacyjnego (stężenie końcowe 1x), 5 μl ligazy DNA i 5 μl wyżarzonego adaptera spinki do włosów (40 μM) z kroku 7.1.3. Upewnij się, że końcowe stężenie wynosi 4 μM, aby uzyskać całkowitą mieszankę główną ligacji adaptera wynoszącą 20 μl.
   2. Odpipetować 20 μl mieszanki wzorcowej ligacji za pomocą adaptera do każdej eluowanej próbki DNA zawierającej kulki z kroku 7.3.3 (całkowita końcowa objętość 50 μl na próbkę).
   3. Umieścić w termocyklerze w temperaturze 20 °C na 1 godzinę. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   4. Przenieść 1x objętość lub 50 μl roztworu PEG/NaCl SPRI do DNA ligowanego adapterem i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować za pomocą 30 μl TE o pH 8,0 i zdekantować supernatanty na nową płytkę PCR z półspódniczką. Połącz i określ ilościowo DNA za pomocą testu dsDNA BR. W razie potrzeby oczyszczone DNA podwiązane adapterem należy przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować mieszankę główną egzonukleazy lambda/egzonukleazy I (E. coli) (działa w eliminacji jedno- lub dwuniciowego DNA bez adapterów podwiązanych na obu końcach).
   1. Pobrać 1 μg ligowanego DNA z kroku 7.4.4, rozcieńczając go do 40 μl. Wymieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego egzonukleazy I (stężenie końcowe 1x), 4 μl egzonukleazy lambda (stężenie końcowe 0,4 U/μl) i 1 μl egzonukleazy I (E. coli) (stężenie końcowe 0,4 U/μl), aby uzyskać całkowitą objętość mieszaniny głównej egzonukleazy lambda/egzonukleazy I o objętości 10 μl.
   2. Odpipetować 10 μl egzonukleazy lambda/egzonukleazy I Master Mix do 40 μl (1 μg) DNA podwiązanego adapterowo (całkowita objętość 50 μl). Umieścić w termocyklerze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, a następnie w temperaturze 75 °C na 10 minut. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Odpipetować 1,8 raza objętość (90 μl) kulek XP do DNA poddanego działaniu egzonukleazy lambda/egzonukleazy I. Oczyść zgodnie z instrukcjami podanymi w krokach 4.3-4.6. Eluować w 40 μl TE, pH 8,0. Upewnij się, że kulki pozostają w roztworze do następnego kroku enzymatycznego.
6. Leczyć enzymem USER i kinazą polinukleotydową T4 (PNK). Przygotować USER/T4 PNK Master Mix (wymagany do uwolnienia nawisów 4 pz i przygotowania gotowych do ligacji końców DNA niezbędnych do późniejszej reakcji ligacji).
   1. Zmieszaj 5 μl 10x buforu ligazy DNA T4 (stężenie końcowe 1x), 3 μl enzymu USER (stężenie końcowe 0,05 U/μL) i 2 μl T4 PNK (stężenie końcowe 0,4 U/μL), aby uzyskać całkowitą objętość głównej mieszanki USER/PNK wynoszącą 10 μL.
   2. Odpipetować 10 μl USER Enzyme/T4 PNK Master Mix do 40 μl próbki DNA poddanej działaniu lambdy i egzonukleazy I, zawierającej kulki z kroku 7.5.3, uzyskać całkowitą objętość 50 μl. Umieścić w termocyklerze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Utrzymać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Odpipetować 1,8 raza objętość (90 μl) roztworu PEG/NaCl SPRI do DNA poddanego działaniu USER/T4 PNK i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 35 μl TE, pH 8,0. Zdekantować supernatant na nową płytkę do PCR z półspódniczką. Połączyć i określić ilościowo DNA za pomocą testu dsDNA HS.
7. Wykonaj cyrkularyzację wewnątrzcząsteczkową. Przygotuj mieszankę mistrzowską cyrkularyzacji.
   1. Wymieszać 8 μl H₂O bez nukleaz, 10 μl 10x buforu ligazy DNA T4 (stężenie końcowe 1x) i 2 μl ligazy DNA T4 (stężenie końcowe 8 U/μL), aby uzyskać całkowitą objętość cyrkularyzacji Master Mix 20 μL.
   2. Odpipetować 20 μl Circularization Master Mix do 500 ng DNA poddanego działaniu USER/PNK z kroku 7.6.3. Rozcieńczyć 500 ng DNA poddanego działaniu USER/PNK w 80 μl, a następnie dodać 20 μl Circularization Master Mix (całkowita objętość 100 μl). Inkubować w termocyklerze w temperaturze 16 °C przez 16 godzin (przez noc).
   3. Dodać 1x objętość lub 100 μl kulek XP do okrągłego DNA i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Elute w 38 μl TE, pH 8,0. Zdekantować supernatant na nową płytkę do PCR z półspódniczką.
8. Poddaj działaniu bezpiecznej dla plazmidu DNazy zależnej od ATP. Przygotuj bezpieczną dla plazmidu mieszankę główną DNazy zależną od ATP (wymaganą do degradacji resztkowego liniowego DNA).
   1. Wymieszaj 5 μl 10x bezpiecznego dla plazmidu buforu reakcyjnego (stężenie końcowe 1x), 2 μl ATP (stężenie końcowe 1 mM) i 5 μl bezpiecznej dla plazmidu DNazy zależnej od ATP (stężenie końcowe 1 U/μL), aby uzyskać całkowitą objętość bezpiecznej dla plazmidu mieszanki głównej 12 μl.
   2. Odpipetować 12 μl zależnej od ATP DNase Master Mix do 38 μl cyrkularyzowanego DNA z kroku 7.7.3 (całkowita objętość 50 μl). Inkubować w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 70 °C przez 30 minut. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Odpipetować 1 x objętość lub 50 μl kulek XP do DNA poddanego działaniu bezpiecznej plazmidowej DNazy zależnej od ATP i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 15 μl TE, pH 8,0. Zdekantować supernatant na nową płytkę do PCR z półspódniczką.
   4. Połącz DNA i określ ilościowo za pomocą testu dsDNA HS. W razie potrzeby należy przechowywać okrągłe DNA w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.

8. Rozszczepianie enzymatycznie oczyszczone, cyrkularyzowane gDNA in vitro (2 h)

1. Wykonaj rozszczepienie in vitro z kompleksem Cas9:gRNA. Przygotuj in vitro Cleavage Master Mix. Wymieszaj 5 μl 10x buforu Cas9 (stężenie końcowe 1x), 4,5 μl S. pyogenes Cas9 (stężenie końcowe 90 nM) i 1,5 μl gRNA (stężenie końcowe 90 nM), aby uzyskać całkowitą objętość Cleavage Master Mix wynoszącą 11 μl.
2. Utrzymuj główną mieszankę rozszczepienia w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utworzyć kompleksy Cas9:gRNA RNP.
3. Rozcieńczyć 125 ng bezpiecznego dla plazmidu DNA poddanego działaniu DNazy od kroku 7.8.3 do końcowej objętości 39 μl. Następnie dodaj 11 μl Cleavage Master Mix do 39 μl bezpiecznego plazmidowo DNA poddanego działaniu DNazy, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μL.
   UWAGA: Na tym etapie należy dołączyć próbkę kontroli ujemnej, która składa się z kolistego DNA zmieszanego z buforem Cas9, bez kompleksu Cas9: gRNA.
4. Inkubować w termocyklerze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. Dodać 50 μl (1x objętość) kulek XP do DNA rozszczepionego in vitro i oczyścić DNA zgodnie z krokami 4.3-4.6. Elute w 42 μl buforu TE, pH 8,0. Upewnij się, że kulki pozostają w roztworze do następnego kroku.

9. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (4 - 6 h)

1. Wykonaj A-tailing. Przygotuj mieszankę główną ogona.
   1. Wymieszać 5 μl 10x buforu ogoniastego A (stężenie końcowe 1x) i 3 μl enzymu ogoniastego A (całkowita objętość mieszanki głównej ogoniastej A wynosi 8 μl).
   2. Odpipetować 8 μl A-tailing Master Mix do 42 μl eluowanej próbki DNA zawierającej kulki z kroku 8.4 (całkowita objętość 50 μl). Umieścić w termocyklerze na 30 minut w temperaturze 30 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Pobrać pipetę 1,8 razy większą objętość roztworu PEG/NaCl SPRI lub 90 μl do DNA z ogonkiem A i oczyścić DNA zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 25 μl TE, pH 8,0. Upewnij się, że kulki są trzymane w roztworze do następnego kroku.
2. Wykonaj podwiązanie adaptera. Przygotuj adapter Ligation Master Mix.
   UWAGA: Jednorazowe porcje adapterów NEB muszą być przygotowane w celu zapobieżenia tworzeniu się dimerów adapterów spowodowanych hydrolizą 3' T wywołaną zamrażaniem i rozmrażaniem.
   1. Wymieszaj 10 μl 5x buforu ligacyjnego (stężenie końcowe 1x), 5 μl ligazy DNA i 10 μl adaptera do sekwencjonowania (końcowe stężenie wynosi 3 μM), aby uzyskać łącznie 25 μl.
   2. Odpipetować 25 μl adaptera Ligation Master wymieszać z 25 μl próbki DNA z ogonkiem A zawierającej kulki z kroku 9.1.3. Umieścić w termocyklerze na 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   3. Odpipetować 1 x objętość lub 50 μl roztworu PEG/NaCl SPRI do DNA podwiązanego adapterem i oczyścić DNA zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 47 μl TE, pH 8,0. Upewnij się, że kulki pozostają w roztworze do następnego kroku enzymatycznego.
3. Wykonaj leczenie enzymem USER (generuje pojedynczą lukę nukleotydową w resztach uracylu).
   1. Dodać 3 μl enzymu USER (zawartego w zestawie Dual Index Primers Kit) do próbki DNA podwiązanej adapterem zawierającej kulki z kroku 9.2.3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   2. Dodać 35 μl (0,7x objętość) roztworu PEG/NaCl SPRI do DNA poddanego działaniu enzymu USER i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 20 μl buforu TE, pH 8,0. Przenieść supernatant na nową płytkę PCR z półspódniczką i zmierzyć stężenie DNA za pomocą testu dsDNA HS. Przewidywane stężenie powinno wynosić ok. 2-5 ng/μL.
4. (Opcjonalnie) Przed przejściem do następnego kroku, wybór rozmiaru DNA można przeprowadzić za pomocą PippinHT. Użyj kasety 1,5% PippinHT o zakresie rozmiarów 250-850 pz. Otrzymane próbki można bezpośrednio wykorzystać w PCR w następnym kroku.
5. Wykonaj PCR w celu dodania kodu kreskowego
   UWAGA: Upewnij się, że wybrane kombinacje sekwencji starterów dla każdej próbki są unikalne. Jeśli to możliwe, każda próbka powinna mieć unikalne kody kreskowe i5 i i7.
   1. Przygotuj PCR Master Mix, aby dodać kody kreskowe o sparowanym indeksie. Wymieszaj 5 μl H₂O bez nukleaz, 25 μl 2x HotStart Ready Mix (stężenie końcowe 1x), 5 μl i5 Primer (stężenie końcowe 1 μM) i 5 μl i7 Primer (stężenie końcowe 1 μM) (całkowita objętość mieszanki głównej 40 μL).
   2. Odpipetować 40 μl PCR Master Mix do 10 μl oczyszczonego DNA poddanego działaniu enzymu USER (ok. 20 ng) z kroku 9.3.2 (całkowita objętość 50 μl).
   3. Wybierz następujące warunki termocyklingu PCR: Denaturacja: 98 °C przez 45 s przez 1 cykl, Denaturacja: 98 °C przez 15 s przez 20 cykli, Wyżarzanie: 65 °C przez 30 s przez 20 cykli, Przedłużenie: 72 °C przez 30 s przez 20 cykli, Końcowe przedłużenie: 72 °C przez 1 min przez 1 cykl, Utrzymywać: 4 °C w nieskończoność.
   4. Dodać 0,7 razy większą objętość lub 35 μl kulek XP do produktu PCR i oczyścić zgodnie z krokami 4.3-4.6. Eluować w 30 μl TE, pH 8,0. Zdekantować supernatant na nową płytkę do PCR z półspódniczką. W razie potrzeby należy przechowywać okrągłe DNA w temperaturze -20°C przez okres do kilku miesięcy.
      UWAGA: Uruchom próbkę PCR na Tapestation, aby sprawdzić jakość biblioteki i ocenić tworzenie się dimerów adaptera. Jeśli zostaną wykryte dimery adaptera, powtórz krok 9.5.4.

10. Kwantyfikacja bibliotek CIRCLE-seq metodą kropelkowego cyfrowego PCR (dd_PCR) (6 h)

UWAGA: Kwantyfikacja może być również przeprowadzona za pomocą qPCR, Tapestation lub podobnej metody.

1. Zacznij od 5 μl DNA z biblioteki (etap PCR 9.5.4) dobrze zmieszanego z 45 μl TE wolnego od nukleaz, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:10 każdej próbki w objętościach 50 μl, w zakresie od ^10-1 do ^10-8 rozcieńczeń.
   1. Skonfigurować roztwór podstawowy dd_PCR Master Mix. Wymieszaj 11 μL 2x dd_PCR mieszanki do sond (stężenie końcowe 1x), 0,055 μL sondy oSQT1310 (stężenie końcowe 250 nM), 0,055 μl sondy oSQT1311 (stężenie końcowe 250 nM), 0,099 μl podkładu oSQT1274 (stężenie końcowe 450 nM), 0,099 μl podkładu oSQT1275 (stężenie końcowe 450 nM) i 6,292 μl H₂ bez nukleazO, aby uzyskać całkowitą objętość dd_PCR Master Mix wynoszącą 17,6 μl. Przygotować mieszankę wzorcową dla wszystkich próbek, aby upewnić się, że objętości są wystarczające do dokładnego pipetowania.
   2. Oznaczyć trzy najniższe rozcieńczenia (10-6,10-7 i ^10-8) w dwóch powtórzeniach (na płytce 96-dołkowej). Należy użyć formantu innego niż szablon (NTC).
   3. Odpipetować 17,6 μl dd_PCR Master Mix do każdej próbki w następujący sposób: Zmieszać 17,6 μl z 4,4 μl próbki (dodając do dołka nieposiadającego nukleaz_H2Odo studzienki z NTC), uzyskując całkowitą objętość 22 μl. Uszczelnić płytkę, a następnie odwirować przy 2000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
2. Wykonuj generowanie kropel, termocykling i analizę. Korzystając z systemu Droplet Reader PCR, przenieś nabój DG8 (8-dołkowy) do uchwytu wkładu. W rzędzie olejowym wkładu dozuj 70 μl oleju do wytwarzania kropelek do sond.
   UWAGA: Pobrać 20 μl próbki z kroku 10.1.2. i dodaj go do rzędu próbek wkładu 8-dołkowego, przykrywając wkład gumową uszczelką DG8, umieszczając go w generatorze kropel, a następnie zamykając, aby rozpocząć proces (automatycznie). Po zakończeniu wyjmij wkład i przenieś 40 μl z rzędu kropel 8-dołkowego wkładu do częściowo spódniczkowej 96-dołkowej płytki PCR, upewniając się, że pipetujesz powoli.
   1. Umieść blok grzewczy w uszczelniarce do płytek PX1 PCR. Po włączeniu zgrzewarka zacznie nagrzewać się do 180 °C. Umieść folię termogrzewczą na talerzu, upewniając się, że czerwona linia znajduje się na górze. Umieść płytkę w PX1 i naciśnij Seal.
   2. Wybierz następujące warunki termocyklera: Aktywacja enzymu: 95 °C przez 10 minut przez 1 cykl, Denaturacja: 94 °C przez 30 s przez 40 cykli, Wyżarzanie/Przedłużanie: 60 °C przez 1 minutę przez 40 cykli, Dezaktywacja enzymu: 98 °C przez 10 minut przez 1 cykl, Utrzymywanie: 4 °C w nieskończoność.
   3. W czytniku kropelkowym otwórz kompatybilne oprogramowanie i wybierz, które studzienki mają zostać odczytane. Wybierz ABS jako typ eksperymentu i dd_PCR Supermix dla sond. Wybierz Ch1 Nieznany dla celu 1 i Ch2 Nieznany dla celu 2. Wybierz pozycję Zastosuj, a następnie przycisk OK. Umieścić płytkę w czytniku kropelkowym. Dla zestawu barwników wybierz FAM/HEX i kliknij Uruchom.
3. Przeanalizuj wyniki dd_PCR. Bramka dla podwójnie dodatniej populacji kropel, używając kontroli ujemnej jako odniesienia. Obliczyć średnią z podwójnych wartości, a następnie pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia i 5-krotny współczynnik rozcieńczenia dd_PCR,
   UWAGA: Łączna liczba kopii na mikrolitr jest obliczana w następujący sposób: całkowita liczba kopii na mikrolitr = wartość średnia × 5 × współczynnik rozcieńczenia, gdzie "wartość średnia" oznacza średnią wartość ilościową z Ch1 i Ch2.
4. Połącz wszystkie próbki w jedną bibliotekę przy stężeniach równomolowych. Biblioteka 1x pooled powinna zawierać ok. 4,5 x 10⁹ cząsteczek i mieć łączną objętość 5 μL.

11. Sekwencjonowanie nowej generacji

1. Prześlij próbki do sekwencjonowania do agencji zewnętrznej, upewniając się, że zanotowano prawidłowe sekwencje adaptera.

12. Analiza danych CIRCLE-seq (1 - 3 h)

1. Zainstaluj język Python w wersji 2.7, Burrows-Wheeler Aligner (BWA) i SAMtools. Pobierz genom referencyjny (np. hg38) ze strony http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz.
   UWAGA: Jeśli genom gatunku docelowego jest niedostępny, obliczeniowy przepływ pracy CIRCLE-seq można uruchomić w trybie niezależnym od odniesienia. W takiej sytuacji ten krok można pominąć.
2. Pobierz i zainstaluj potok CIRCLE-seq za pomocą następujących poleceń: (1) git clone https://github.com/tsailabSJ/circleseq.git, (2) cd circleseq, (3) install -r requirements.txt.
3. Utwórz plik manifestu w formacie YAML (yaml). Poniżej znajduje się przykładowy manifest, którego można użyć z przykładowym zestawem danych dostarczonym w oprogramowaniu CIRCLE-seq w celu przetestowania przepływu pracy.
   UWAGA: (1) genom referencyjny: data/input/CIRCLEseq_test_genome.fa; 2) analysis_folder: dane/wyjście; (3) bwa: bwa; (4) Samtools: Samtools; (5) read_threshold: ; (6) window_size: ; (7) mapq_threshold: ; (8) start_threshold: ; (9) gap_threshold: ; (10) mismatch_threshold: ; (11) merged_analysis: Prawda; 12) próbki: U2OS_EMX1; 13) cel: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAANGG; (14) READ1: dane/dane wejściowe/EMX1.r1.fastq.gz; (15) READ2: dane/dane wejściowe/EMX1.r2.fastq.gz; (16) Controlread1: dane/wejście/EMX1_control.r1.fastq.gz; (17) Controlread2: dane/wejście/EMX1_control.r2.fastq.gz; (18) Opis: U2OS. Użyto następujących wartości manifestu: read_threshold: 4, window_size: 3, mapq_threshold: 50, start_threshold: 1, gap_threshold: 3, mismatch_threshold: 6
4. Zdefiniuj plik FASTA genomu referencyjnego, katalog wyjściowy do analizy oraz ścieżki do poleceń BWA i SAMtools. Zdefiniuj sekwencje docelowe i ścieżki do zdemultipleksowanych plików FASTQ zarówno dla próbek rozszczepionych nukleazą, jak i próbek kontrolnych. Wiele eksperymentów może być przetwarzanych jednocześnie w trybie wsadowym, dołączając je wszystkie do jednego pliku manifestu.
5. Wykonaj następujące polecenie dla standardowych analiz opartych na odwołaniach: (1) python /path/to/circleseq.py all - manifest; (2) /path/to/manifest.yaml.
6. Alternatywnie wykonaj następujące polecenie dla standardowych analiz nieopartych na odniesieniach: (1) Python /path/to/circleseq.py reference-free - manifest; (2) /ścieżka/do/manifestu.yaml.
7. Podczas wykonywania pełnego potoku znajdź wyniki wyjściowe każdego kroku w odrębnym output_folder wyznaczonym dla tego konkretnego kroku.

Wyniki

Tutaj CIRCLE-seq jest wykorzystywany do badania indukowanych nukleazą miejsc cięcia Cas9 w kompleksie z gRNA zaprojektowanym do celowania w miejsce integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1) przy użyciu DNA wyizolowanego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). To gRNA zostało już wcześniej opisane w naszej publikacji²⁷. Około 25 μg gDNA wyizolowano z iPSC, ścięto za pomocą zogniskowanej ultrasonizacji i wybrano rozmiar za pomocą oczyszczania kulek AMPure XP, aby uzyskać fragmenty o wielkości ok. 300 bps. Z tych 25 μg DNA udało się przeciąć ok. 2-5 ng DNA do rozszczepienia in vitro Cas9:gRNA. Cała procedura jest przedstawiona w Rysunek 1.

Po procedurze CIRCLE-seq i analizie przy użyciu naszego przepływu pracy, wizualizacja wszystkich wykrytych miejsc cięcia na miejscu i poza celem jest przedstawiona w Rysunek 2A. Potok CIRCLE-seq dostarczył również "scalone odczyty", przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego R w celu uzyskania wykresu Manhattan pokazującego wykryte miejsca cięcia wywołane nukleazą zmapowane wzdłuż każdego chromosomu (Rysunek 2B).

Rysunek 1: Schematy przepływu pracy CIRCLE-seq. Wskazano główne etapy protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wizualizacja CIRCLE-seq i wykres Manhattanu. (A) Wyrównanie miejsc niedocelowych względem zamierzonego celu dla locus AAVS1. Sekwencja docelowa jest wyświetlana na górze, gdzie niedocelowe są uszeregowane według liczby odczytów w kolejności malejącej. Różnice w oryginalnych sekwencjach docelowych są pokazane przez kolorowe nukleotydy. Pokazano próbkę górnych niezamierzonych miejsc rozszczepienia locus AAVS1. (B) Wykres Manhattan ilustrujący wykryte niezamierzone miejsca rozszczepienia locus AAVS1. Wysokości słupków reprezentują liczbę odczytów dla każdej pozycji chromosomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

podkład	Sekwencja (5'-3')	Komentarze/Opis
AAVS1 Pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA)	GGGGCCACUAGGGACAGGAU	Do białka fluorescencyjnego AAVS1 locus knock-in
AAVS1 Podkład do przodu	GCTCTGGGCGGAGGAATATG	Do badania rozszczepienia gRNA in vitro
AAVS1 Podkład odwrotny	ATTCCCAGGGGGGGTTAATG	Do badania rozszczepienia gRNA in vitro
oSQT1288	/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT	Adapter spinki do włosów CIRCLE-seq
oSQT1274	AATGATACGGCGACCACCGAG	TruSeq F1
oSQT1275	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT	TruSeqF2
oSQT1310	/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/	Sonda TruSeq
oSQT1311	/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/	Sonda TruSeq

Tabela 1: Sekwencje gRNA i starterów używane do analizy CIRCLE-seq locus AAVS1.

Dyskusja

W tym przypadku wykazano, że CIRCLE-seq jest bezstronną i bardzo czułą techniką identyfikacji DSB indukowanych nukleazą w całym genomie, wynikającą z celowania w locus AAVS1 w gDNA pochodzącym z iPSC. Miejsce AAVS1 w iPSC jest dobrze znane jako locus bezpiecznej przystani, który jest często używany jako miejsce integracji genów egzogennych przy użyciu CRISPR-Cas9²⁸. W naszym ostatnim raporcie zbadaliśmy potencjał iPSC znakowanych EGFP, przeprowadzając integrację za pośrednictwem CRISPR konstytutywnie wyrażonego reportera EGFP z miejscem AAVS1 , co umożliwia znakowanie i śledzenie zarówno iPSC, jak i zróżnicowanych iPSC ze względu na utrzymywanie się EGFP w całej linii komórki²⁷. Ta linia iPSC może być stosowana in vivo do oceny rozmieszczenia komórek pochodzących z iPSC w organizmie po przeszczepie. Ponieważ ta linia komórkowa została zmodyfikowana za pomocą CRISPR i jest również wykorzystywana do testowania klinicznego zastosowania iPSC, konieczne jest, aby potencjalne miejsca poza miejscem docelowym AAVS1 zostały poznane i zbadane w celu zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności, co czyni ją idealnym miejscem do testowania CIRCLE-seq.

Zauważalną różnicą między Butterfieldem i wsp., wcześniej opublikowanym badaniem²⁷ a tym było zastosowanie zmodyfikowanego gRNA do celowania w locus AAVS1. GRNA można zaprojektować w celu poprawy dokładności edycji genomu²⁴. Sekwencja prowadząca jest najważniejszym czynnikiem, który wpływa na wydajność po osiągnięciu i poza celem. Dlatego wybrane gRNA zostało przetestowane w porównaniu z kilkoma innymi przewodnikami i stwierdzono, że ma lepszą wierność. Ponadto artykuł dotyczący metod przeprogramowania ludzkich fibroblastów potwierdził odkrycie, że syntetyczne mRNA z czapeczką zawierające zmodyfikowane zasady nukleinowe czerpią korzyści z niskiej aktywacji odpowiedzi przeciwwirusowych^29,30. Chociaż niska immunogenność może nie być istotna w teście in vitro, staje się kluczowa, gdy ostatecznym celem jest opracowanie klinicznie istotnej terapii, którą można zastosować w żywych komórkach.

CIRCLE-seq ma wiele zalet w porównaniu z podobnymi metodami. Na przykład, sekwencja Digenome-seq sekwencjonuje zarówno gDNA rozszczepione nukleazą, jak i nierozszczepione, używając ~ 400 milionów odczytów²¹. Powoduje to wysokie tło, co utrudnia odfiltrowanie miejsc cięcia o niskiej częstotliwości w dobrej wierze. CIRCLE-seq wykorzystuje tylko ~ 3-5 milionów odczytów ze względu na wzbogacenie gDNA rozszczepionego nukleazą, co skutkuje niskim tłem. Dodatkowo, Digenome-seq i podobna metoda, SITE-seq, opierają się na sekwencjonowaniu pojedynczego końca DNA rozszczepionego nukleazą. W przeciwieństwie do tego, odczyty CIRCLE-seq obejmują oba końce miejsca cięcia, umożliwiając identyfikację miejsc poza celem bez konieczności stosowania odniesienia 21,22,26.

Zaletą CIRCLE-seq jest jego większa czułość w porównaniu z metodami opartymi na hodowli komórkowej, takimi jak GUIDE-seq. Po porównaniu obu metod, zespół projektu CIRCLE-seq był w stanie uchwycić wszystkie miejsca wykryte przez GUIDE-seq poza celem i odkrył dodatkowe niezamierzone miejsca rozszczepienia, które zostały pominięte przez GUIDE-seq. Zauważalna różnica polega jednak na tym, że GUIDE-seq może być utrudniony przez krajobraz epigenetyczny, podczas gdy CIRCLE-seq może uzyskać dostęp do całego genomu.

Jako test in vitro , CIRCLE-seq ma kilka ograniczeń, z których pierwszym jest wykrywanie wyników fałszywie dodatnich. Podczas gdy epigenetyka będzie utrudniać aktywność nukleazy w niektórych miejscach in vivo, ultradźwięki usuwają te przeszkody in vitro, umożliwiając aktywność poza celem w miejscach, które normalnie mogą być niedostępne w kontekście komórkowym. Ponadto Cas9 jest obecny w wysokich stężeniach w tym teście in vitro , co pozwala na rozszczepienie, które w innym przypadku nie byłoby możliwe in vivo. Test ten wymaga również stosunkowo dużej ilości wyjściowego gDNA, co, w zależności od dostępnych zasobów, może zanegować użycie tego protokołu. Wreszcie, możliwe jest, że niektóre miejsca poza celem mogą być niewykrywalne ze względu na ograniczenia obecnych technologii sekwencjonowania nowej generacji.

W niedawnym badaniu wykorzystano podejście in silico , w którym algorytm zidentyfikował szereg istotnych parametrów, z którymi można porównać różne metody charakteryzacji nukleaz, w tym CIRCLE-seq i GUIDE-seq³¹. Dwa z istotnych parametrów to "wzbogacenie miejsca cięcia" i "% wyników fałszywie dodatnich". Co ciekawe, odsetek wyników fałszywie dodatnich w przypadku CIRCLE-seq obliczono na poziomie 88%, ale wzbogacenie w miejsca cięcia było wielokrotnie wyższe niż w przypadku innych metod in vitro . Analizy porównawcze każdej z metod wykazały, że GUIDE-seq okazał się najskuteczniejszy, ponieważ wykazał największą swoistość w odniesieniu do celu przy zaledwie umiarkowanym odsetku wyników fałszywie dodatnich³². Nie unieważnia to CIRCLE-seq, ale raczej sugeruje możliwość wykorzystania CIRCLE-seq i GUIDE-seq w tandemie, potwierdzając wyniki CIRCLE-seq za pomocą GUIDE-seq, ponieważ pierwsza z nich ma wyższą czułość, podczas gdy druga jest metodą opartą na komórkach o wysokim wzbogaceniu miejsca cięcia. Dane wskazują również, że sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) oparte na amplikonach powinno być preferowaną metodą identyfikacji rzeczywistych modyfikacji niedocelowych w potencjalnych lokalizacjach^{kandydujących 31}. Dane te sugerują potencjalną strategię wykorzystania CIRCLE-seq, następnie GUIDE-seq, a następnie NGS opartego na amplikonie w celu zbadania efektów off-target.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki cienkościenne i płaskie 0,2 ml Kaseta	ThermoFisher Scientific	AB1114
1,5% PippinHT	Sage Science	HTC1510
10 ml Pipety serologiczne	FisherScientific	12567603
Rurka stożkowa 15 ml	FisherScientific	339651
Naczynie do hodowli tkankowych 150 x 25 mm	FisherScientific	877224
Zbiornik na odczynniki 25 mL	FisherScientific	2138127C
2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix	Kapa Biosystems	KK2602
5 ml pipety serologiczne	FisherScientific	170355
Rurka stożkowa 50 ml	FisherScientific	339653
50x bufor do elektroforezy TAE	ThermoFisher Scientific	B49
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Odczynnik Corning	3516
Agencourt AMPure XP, 60 ml	stołowa Beckman Coulter	A63881
	Eppendorf	5400002
BsaI-HF	New England BioLabs
Buffer QX1	Qiagen	20912
Nukleaza Cas9, Streptococcus Pyogenes	New England BioLabs	M0386M
CIRCLE-seq Przygotowanie biblioteki i NGS
Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC	Corning	354277	Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) do hodowli iPSC
ddPCR SuperMix do sond		Bio-Rad
DG8	Wkłady Bio-Rad	1863051
DG8	Uszczelki Bio-Rad	1864008
DG8	Bio-Rad	1863009
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	ThermoFisher Scientific	14190144	Made by Invitrogen
Olej do sond Droplet Generation	Bio-Rad	1863005
Olejek do czytnika kropelek	Bio-Rad	1863004
EDTA (0,5 m)	ThermoFisher Scientific	15575020
EDTA (0,5 M), pH 8,0, bez RNaz	ThermoFisher Scientific	AM9260G	Made by Invitrogen
Eppendorf  Mieszalnik termiczny	Eppendorf	5384000020
Equipment
Alkohol etylowy, czysta	Sigma-Aldrich	E7023
I	New England BioLabs	M0293L	E. coli
Jednostka filtrująca	FisherScientific	FB0875713
Sterylne końcówki
, skoncentrowane ultradźwięki	Covaris	ME220
			genomowego DNA
Genomowe ścinanie
Gentra Puregene Cell Core Kit	Qiagen	158043
gRNA	Synthego
HCl	ThermoFisher Scientific	A144500
Heracell VIOS Trójgazowy nawilżany inkubator kultur tkankowych	ThermoFisher Scientific	51030411	Potrzeba hodowli i ekspansji iPSC (37 ° C/5% CO2/5% O2)
Taśma do przesiewania DNA o wysokiej czułości D1000	Agilent	5067-5584
Odczynniki D1000 o wysokiej czułości	Agilent	5067-5585
Zestaw do przygotowania biblioteki HTP	Kapa Biosystems	KK8235
HyClone Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy	Cytiva	SV30079.01
IDTE pH 8,0 (1x roztwór TE)	Zintegrowane technologie DNA	11050204
mikroskop			Potrzeba obrazowania kolonii iPS w jasnym polu i kanałach fluorescencyjnych
Kultura
Izopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Lambda Egzonukleaza	New England BioLabs	M0262L
Końcówki do ładowania, 10 sztuk	Agilent	5067-5599
Magnum FLX Enhanced Uniwersalna płyta magnetyczna	Alpaqua	A00400
Probówka do mikrowirówek	Axygen	31104051
Mikroprobówka AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap	Covaris	520045
mTeSR-1 5x Suplement	StemCell Technology	85852
mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)	StemCell Technology	85851	Pożywka do utrzymania iPSC w hodowli
Spektrofotometr Nanodrop 8000	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
NEBNext Multipleks Oligos dla Illumina	New England BioLabs	E7600S	Zestaw podkładów Dual Index
Nasadki do tub optycznych, 8 pasków	Agilent	401425
Paski tub optycznych, 8 pasków	Agilent	401428
Inne odczynniki
Uszczelniacz do płytek PCR	Bio-Rad	PX1	Numer modelu PX1
Roztwór PEG/NaCl SPRI	Kapa Biosystems
Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix	New England BioLabs	M0536L
Folia przebijalna zgrzewana	Bio-Rad	1814040
Bezpieczna plazmidowa DNaza zależna od ATP	Epicentrum	E3110K
Startery, adaptery i sondy	Sekwencje IDT		są wymienione w Tabeli 1
Proteinaza K	Qiagen	19131
QIAquick	Qiagen	28704
QIAxcel	Qiagen	9001941
Probówki do oznaczania kubitów	ThermoFisher Scientific	Q32856
Zestaw testowy Qubit dsDNA BR	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit dsDNA BR	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit dsDNA HS	ThermoFisher Scientific	Q32854
	ThermoFisher Scientific	Q33226
QX200 Cyfrowy system PCR kropelkowy	Bio-Rad	1864001	Zawiera generator kropel QX200 i czytnik kropel QX200
RNase A	Qiagen	19101
Półspódniczkowa płytka PCR	ThermoFisher Scientific	14230244
SeqPlaque GTG Agaroza	Lonza	50110
SYBR Bezpieczny żel do barwienia DNA	Ligaza DNA ThermoFisher Scientific	S33102
T4	New England BioLabs	M0202L
Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)	New England BioLabs	M0201L
T-75 Kolby	FisherScientific	7202000
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Termocykler z programowalną funkcją krokowania temperatury	Bio-Rad C1000 Touch
Tris base	ThermoFisher Scientific	BP1521
Twin.tec PCR Plate	Eppendorf	E951020346	96 studzienek, częściowo listwowych, zielona
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz	Enzym użytkownika ThermoFisher	Scientific 10977015
	New England BioLabs	M5505L