Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67072

⸱

2 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Campinas, 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS) Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Streszczenie

Odpowiedź na uszkodzenie DNA to zabezpieczenie informacji genetycznej, które chroni komórki przed utrwalaniem uszkodzonego DNA. Charakterystyka białek, które współpracują w tym procesie, pozwala na identyfikację alternatywnych celów interwencji terapeutycznej w wielu chorobach, takich jak nowotwory, choroby związane ze starzeniem się i przewlekłe stany zapalne. Test ligandów zbliżeniowych (PLA) pojawił się jako narzędzie do szacowania interakcji między białkami, a także bliskości przestrzennej między organellami lub strukturami komórkowymi i umożliwia na przykład analizę lokalizacji czasowej i kolokalizacji w warunkach stresowych. Metoda jest prosta, ponieważ jest podobna do konwencjonalnej immunofluorescencji i umożliwia jednoczesne barwienie organelli, struktury komórkowej lub określonego markera, takiego jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne, ciała PML lub marker dwuniciowy DNA, yH2AX. Fosforylacja S139 w wariancie histonu 2A, H2AX, określanym wówczas jako yH2AX, jest szeroko stosowana jako bardzo czuły i specyficzny marker pęknięć dwuniciowych DNA. Każde ognisko barwienia yH2AX odpowiada jednemu pęknięciu w DNA, które następuje kilka minut po uszkodzeniu. Analiza zmian w ogniskach yH2AX jest najczęstszym testem do badania, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest zaangażowane w odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR). Niezależnie od tego, czy spodziewana jest bezpośrednia rola w miejscu uszkodzenia DNA, mikroskopia fluorescencyjna służy do weryfikacji kolokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z ogniskami yH2AX. Jednakże, z wyjątkiem nowych metod fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, podsumowując, lokalna interakcja z miejscami uszkodzenia DNA może być nieco subiektywna. Tutaj pokazujemy test do oceny lokalizacji białek w szlaku DDR przy użyciu yH2AX jako markera miejsca uszkodzenia. Ten test może być wykorzystany do scharakteryzowania lokalizacji czasowej pod różnymi zniewagami, które powodują uszkodzenie DNA.

Wprowadzenie

Uszkodzenia DNA komórkowego występują codziennie z powodu spontanicznych reakcji chemicznych i są również zwiększane przez czynniki egzogenne, takie jak czynniki genotoksyczne (promieniowanie i chemikalia, takie jak etopozyd) oraz stres oksydacyjny1,2,3. Komórki mają złożoną maszynerię, która koryguje niezliczone różne rodzaje uszkodzeń DNA, od usuwania zasad, przez replikacyjne skręcanie widełek lub przerwanie, aż po najbardziej szkodliwą zmianę: złamanie dwuniciowej DNA4,5.

Kilka białek biorących udział w DDR zostało już scharakteryzowanych, a doskonałe wersje badają szlaki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i rekombinacji homologicznej (HR), głównych ścieżek implikowanych w naprawie pęknięć dwuniciowych (DSB)5,6. Fosforylacja wariantu histonu H2A, H2AX, w serynie 139 (później nazwanej y-H2AX) jest stosowana od wielu lat jako czuły i wiarygodny marker pęknięcia dwuniciowego. Fosforylacja H2AX jest obserwowana w pierwszych minutach po uszkodzeniu i może utrzymywać się przez wiele godzin7.

Zaletą korzystania z detekcji immunofluorescencyjnej ognisk γ-H2AX jest charakterystyka czasowego i przestrzennego rozkładu ognisk, a także jego współbarwienia z innymi białkami. Co więcej, immunofluorescencja nie wymaga lizy, co zachowuje informacje o kontekście komórkowym i sprawia, że są one bardziej informacyjne. Poza tym, ponieważ γ-H2AX powstaje de novo, nie występuje obficie przy braku uszkodzenia DNA, co czyni go specyficznym markerem7.

H2AX jest głównie fosforylowany przez kinazę białkową zmutowaną ataksję-teleangiektazję (ATM) i kinazę białkową zależną od DNA (DNA-PK), czujniki DSB. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6 / XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) i podjednostka katalityczna kinazy białkowej DNA (DNA-PKcs) są odpowiedzialne za identyfikację DSB i ochronę końców DNA, podczas gdy Artemis przeprowadza przetwarzanie końcowe w celu ułatwienia ligacji przez kompleks XRCC4-Ligaza IV. Fosforylacja H2AX w miejscach po bokach DSB działa jak sygnał do rekrutacji kilku białek naprawczych i sygnalizacji zatrzymania cyklu komórkowego, śmierci lub przeżycia8.

Analiza zmian w ogniskach y-H2AX jest najczęstszym testem do badania, czy interesujące białko jest zaangażowane w odpowiedź na uszkodzenie DNA. Niezależnie od tego, czy spodziewana jest bezpośrednia rola w miejscu uszkodzenia DNA, mikroskopia fluorescencyjna służy do weryfikacji kolokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z ogniskami y-H2AX. Jednak z wyjątkiem nowych metod fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, stwierdzenie lokalnej interakcji z miejscami uszkodzenia DNA może być trudne. Co więcej, detekcja immunofluorescencji zwykle zależy od wielu cząsteczek białka w miejscu uszkodzenia DNA, co utrudnia identyfikację rzadkich białek9.

Tutaj pokazujemy test do oceny lokalizacji białek zaangażowanych w szlak DDR, używając y-H2AX jako markera miejsca uszkodzenia. Ten test może być wykorzystany do scharakteryzowania lokalizacji czasowej pod różnymi zniewagami, które powodują uszkodzenie DNA.

Test ligandów zbliżeniowych (PLA) pojawił się jako narzędzie do szacowania interakcji między białkami, jak również przestrzennej bliskości między organellami lub strukturami komórkowymi10,11i umożliwia na przykład analizę lokalizacji czasowej i kolokalizacji w warunkach stresu. Metoda jest prosta, ponieważ przypomina konwencjonalną immunofluorescencję i umożliwia jednoczesne barwienie organelli lub markerów specyficznych dla struktury komórkowej, takich jak mitochondria, retikulum endoplazmatyczne, ciała PML lub marker dwuniciowy DNA, yH2AX. Zastosowanie PLA pozwala na identyfikację interakcji białek podczas uszkodzenia DNA w czuły, specyficzny i niezawodny sposób, który może być wykorzystany do monitorowania interakcji podczas cyklu komórkowego, w odpowiedzi na różne bodźce i w różnym czasie po stresie genotoksycznym.

Pokazujemy tutaj użycie PLA równocześnie z konwencjonalną immunofluorescencją γ-H2AX do lokalizacji interakcji Nek4-Ku70 po uszkodzeniu DNA wywołanym przez etopozyd. Nek4, członek rodziny Nek (kinazy związane z NIMA), nie odgrywa jasnej roli w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W 2012 roku Nguyen i współpracownicy wykazali, że Nek4 oddziałuje z białkami Ku70/Ku80, a pod nieobecność Nek4 białka te nie są rekrutowane do miejsca uszkodzenia DNA, a fosforylacja H2AX jest upośledzona12. Komórkowa lokalizacja tej interakcji jest do tej pory nieznana. Zaobserwowaliśmy zmniejszenie fosforylacji Ku70 w komórkach eksprymujących mutanta kinazy Nek4 martwego 13, ale to, czy Nek4 fosforyluje bezpośrednio Ku70, pozostaje do wyjaśnienia. Biorąc pod uwagę, że interakcja Nek4 z Ku70 jest zwiększona po leczeniu etopozydem zgodnie z badaniami immunoprecypitacyjnymi12, próbujemy zlokalizować tę interakcję za pomocą PLA i markera γ-H2AX.

Zazwyczaj, badania interakcji opierają się na testach immunoprecypitacji, ale są one in vitro i nie dostarczają informacji o lokalizacji interakcji. Jeśli to możliwe, można przeprowadzić immunoprecypitację frakcjonowanych komórek (jądra, mitochondriów, błony komórkowej lub cytozolu), ale przeprowadzenie przebiegu interakcji w czasie jest kosztowne i pracochłonne. Immunofluorescencja może dostarczyć informacji o lokalizacji komórkowej białek, ale udowodnienie interakcji może być trudne i zależy od rozdzielczości mikroskopów. Tutaj pokazujemy zalety stosowania testu ligandów zbliżeniowych do monitorowania interakcji dwóch białek w kontekście uszkodzenia DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Poszycie komórek

UWAGA: Komórki mogą być umieszczane w mikroskopijnych szkiełkach fluorescencyjnych, komorach lub płytkach. Stosowanie małych szkiełek nakrywkowych lub płytek 96/384-dołkowych jest zalecane do testowania w wielu warunkach i zapasowych odczynników. Stosowanie szkiełek nakrywkowych jest wskazane w przypadku linii komórkowych, które łatwo się odłączają, takich jak komórki HEK293. Szkiełka nakrywkowe można wcześniej pokryć roztworem poli-L-lizyny, aby poprawić mocowanie.

  1. Komórki tabliczkowe z uwzględnieniem pojazdu, kontroli technicznej i kontroli biologicznej. Stosować powtórzenia techniczne w dwóch lub trzech dołkach na warunek.
    UWAGA: Korzystanie z kontroli technicznej (zarówno wtórnej, jak i tylko jednej podstawowej) jest obowiązkowe. Jeśli to możliwe, należy również uwzględnić kontrolę biologiczną (np. nadekspresję lub knockdown jednego z docelowych białek lub stan, o którym wiadomo, że zmienia interakcję).
    1. Hodowla komórek U2OS w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 4,5 g / l glukozy i 4 mM L-glutaminy na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze zawierającej 90% powietrza. W zależności od liczby warunków, które mają być badane oraz w przypadku stosowania szkiełek podstawowych 384 lub szkiełek nakrywkowych na płytce 60 mm, należy zacząć odpowiednio od płytki 60 lub 100 mm.
    2. Gdy komórki osiągną konfluencję 60%-70%, podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA 14. Policz komórki za pomocą komory Neubauera lub automatycznego counter14. Płytka 4 x 105 komórek w 60 mm płytka zawierająca wiele okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 13 mm lub 4 x 105 komórek na basenie na 384-dołkowej płytce (płytkach) 384-dołkowej i inkubować przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

2. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Stężenie i czas leczenia zostały wybrane na podstawie wyników literatury, które wskazują na aktywację szlaków naprawy uszkodzeń DNA15,16.

  1. Przygotować roztwór podstawowy etopozydu o stężeniu 50 mM w DMSO. Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Rozcieńczyć roztwór etopozydu do użycia w kompletnej pożywce o końcowym stężeniu 25 μM. Użyć DMSO w 0,05% rozcieńczonym w kompletnej pożywce hodowlanej jako kontroli nośnika.
  2. Przygotować 20x sól fizjologiczną cytrynianu sodu (SSC; 3,0 M NaCl, 0,30 M cytrynian trisodowy pH 7,0). Roztwór ten można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C.

3. Leczenie i utrwalanie komórek

UWAGA: Nie pozwól, aby komórki wyschły w żadnym momencie; staraj się jak najbardziej korzystać z poprzednich rozwiązań. Należy wcześniej określić odpowiednią metodę utrwalania komórek (lodowaty metanol lub 4% paraformaldehyd (PFA)) oraz rozcieńczenie przeciwciał przy użyciu konwencjonalnego doświadczenia immunofluorescencyjnego.

UWAGA: Metanol musi być odpowiednio zutylizowany.

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną ze studzienek i dodać pożywkę zawierającą etopozyd lub DMSO odpowiednio w stężeniu 25 μM lub 0,05%. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze zawierającej 90% powietrza z etopozydem lub DMSO przez 3 różne okresy czasu: 20 min, 1 godzinę i 3 godziny. W przypadku korzystania z płyt 384 wszystkie warunki muszą być ustalone jednocześnie.
    1. W tym celu zacznij od leczenia schorzenia, w którym leczenie trwa najdłużej, np. 3 godziny. Po 2 godzinach potraktuj stan 1 godziny zabiegu, a gdy pozostało 20 minut na utrwalenie, potraktuj stan 20 minut. Następnie wszystkie warunki można ustalić w tym samym czasie.
  2. Usuń pożywkę z dołków i umyj komórki PBS 3x.
  3. Napraw komórki, dodając lodowaty metanol o objętości wystarczającej do pokrycia powierzchni studzienki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze -20 °C. Przemyć studzienki PBS 3x.
    UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.

4. Przepuszczalność i blokowanie

UWAGA: Jeśli używasz metody utrwalania PFA, przed przepuszczalnością musi zostać wykonany etap blokowania glicyną. Komorę wilgotnościową można przygotować, umieszczając miskę na wodę w inkubatorze, co daje wilgotność około 95%. Płytkę lub szkiełka 384 można inkubować w zamkniętym plastikowym pojemniku nad bibułą filtracyjną lub zwilżoną gąbką i przezroczystą folią.

  1. Odczep PBS od próbek.
  2. Dodać 30-40 μl buforu permeabilacyjnego (0,2% Triton X-100 w PBS) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Mycie 3x z PBS
  3. Stuknąć PBS z próbek i dodać 30-40 μl 1x roztworu blokującego dostarczonego w zestawie PLA (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS) do każdej studzienki/szkiełka nakrywkowego.
  4. Inkubować płytkę w komorze wilgotnościowej podgrzanej do temperatury 37 °C przez 1 godzinę.

5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych (PLA)

UWAGA: Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych, ważne jest, aby upewnić się, że roztwór przeciwciała pokrywa wszystkie powierzchnie szkiełek nakrywkowych. Szczególną uwagę należy zwrócić na dobór przeciwciał. Przeciwciała muszą pochodzić od różnych gatunków zwierząt, a przeciwciało drugorzędowe stosowane do γ-H2AX nie może być skierowane przeciwko gatunkowi gospodarza produkcji sond PLA. Na przykład pierwotne przeciwciała stosowane do PLA hodowano u myszy i kóz. Sondy PLA, anty-mysie i anty-kozie zostały wyprodukowane w osle. Przeciwciało przeciwko γ-H2AX zostało wytworzone u królików, a wtórne wykorzystane przeciwciało to przeciwciało anty-królicze wytwarzane u osłów. W ten sposób wtórny nie rozpozna sond PLA.

  1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (mysie anty-Ku70 1:100 i kozie anty-Nek4 1:50; królicze anty-Nek5 1:25 i mysie anty-TOPIIβ 1:25) w rozcieńczalniku przeciwciał dostarczonym w zestawie (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS). Przygotować 30 μl roztworu przeciwciał na warunek w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl na dołek w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej.
  2. Stuknij rozwiązanie blokujące. Dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w komorze wilgotnościowej.

6. Inkubacja sondy PLA

UWAGA: Wybierz sondy, biorąc pod uwagę nie tylko podstawowe przeciwciała, ale także te przeznaczone do użycia w etapach immunofluorescencji. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do długiej inkubacji w temperaturze 37 °C, można zastosować powolną rotację w celu poprawy dystrybucji roztworu przeciwciała.

  1. Rozcieńczyć sondy minus i plus w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał. Przygotować 10 μl na studzienkę w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl na próbkę w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych. Wykorzystaj następujące kombinacje: Osioł anty-mysz minus z osiołkiem anty-kozioł plus; Osioł anty-mysz minus z osioł anty-królik plus.
  2. Stuknąć roztwór przeciwciała pierwotnego. Przemyć 1x TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20). Prać 3x po 5 min z TBS-T w temperaturze pokojowej. Wykonaj dodatkowe pranie za pomocą TBS-T.
  3. Odkręć i dodaj roztwór sondy PLA o objętości 10 μl na płytki i 20 μl na szkiełka nakrywkowe. Inkubować w podgrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.

7. Podwiązanie

UWAGA: Poczekaj z dodaniem Ligase do momentu bezpośrednio przed dodaniem jej do próbek. Ligaza musi być przechowywana w zamrażarce (-20 °C). Całkowicie usuń cały roztwór myjący przed dodaniem roztworu ligazy. Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do inkubacji w temperaturze 37 °C, można zastosować powolną rotację w celu poprawy dystrybucji roztworu przeciwciała.

  1. Rozcieńczyć 5-krotny bufor do podwiązywania w wodzie o wysokiej czystości. Przygotować 10 μl na basenik w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych.
  2. Odczep roztwór sondy PLA. Umyć 1x za pomocą TBS-T. Następnie wykonaj trzy dodatkowe prania, z których każde trwa 5 minut, przy użyciu TBS-T. Umyj po raz ostatni i stuknij TBS-T przed następnym krokiem.
  3. Dodaj ligazę do roztworu 1x ligacji w stosunku 1:40, bezpośrednio przed nałożeniem go na próbki. Inkubować w komorze wilgotnościowej podgrzanej do 37 °C przez 30 minut do 1 godziny.

8. Amplifikacja i mycie

UWAGA: Poczekaj z dodaniem polimerazy do momentu bezpośrednio przed dodaniem do próbki. Bufor wzmacniający jest wrażliwy na światło; Chronić wszystkie roztwory zawierające bufor przed światłem. Polimeraza musi być przechowywana w zamrażarce (-20 °C). Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych do inkubacji w temperaturze 37 °C, powolna rotacja może poprawić dystrybucję roztworu przeciwciała.

  1. Całkowicie usuń cały roztwór myjący przed dodaniem roztworu polimerazy. Unikaj pozostawiania komórek bez roztworu przez dłuższy czas. Rozcieńczyć 5-krotny bufor wzmacniający w wodzie o wysokiej czystości. Przygotować 10 μl na basenik w przypadku stosowania płytek 384-dołkowych lub 20 μl w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych.
  2. Stuknąć roztwór do podwiązywania. Umyć 1x za pomocą TBS-T. Następnie wykonaj trzy dodatkowe prania, z których każde trwa 5 minut, przy użyciu TBS-T. Umyj po raz ostatni i stuknij TBS-T przed następnym krokiem.
  3. Dodaj polimerazę do roztworu do amplifikacji 1x w rozcieńczeniu 1:80, bezpośrednio przed nałożeniem jej na próbki. Inkubować w podgrzanej komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 100 min.
    UWAGA: Od tego kroku unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło
  4. Wyłącz bufor amplifikacji. Myć 2x z 1x buforem SSC przez 10 min każdy. Myć 2x buforem SSC 0,01x przez 2 min każdy.

9. Barwienie γ-H2AX (immunofluorescencja - IF)

UWAGA: Etykietowanie γ-H2AX odbywa się po zakończeniu PLA.

  1. Inkubacja przeciwciał pierwotnych (IF)
    1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (króliczy anty yH2AX w stosunku 1:100) w roztworze blokującym (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X-100 0,1% w roztworze PBS). Przygotować 30 μl roztworu przeciwciała na basenik w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej.
    2. Skorzystaj z rozwiązania SSC 0,01x. Umyj 2x PBS.
    3. Dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał (IF)
    UWAGA: Upewnij się, że wybrane przeciwciała drugorzędowe nie rozpoznają przeciwciał lub sond PLA. Dodatkowo długość fali przeciwciała drugorzędowego musi być inna niż długość fali odczynnika wykrywającego PLA. Na przykład: nasz odczynnik do wykrywania PLA zawiera fluorofor 647, a wtórny, którego użyliśmy do wykrywania γ-H2AX, to 488.
    1. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) w roztworze blokującym (alternatywnie można użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej i Triton X - 100 0,1% w roztworze PBS) w rozcieńczeniu 1:300. Przygotować 30 μl roztworu przeciwciał na warunek w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych lub 20 μl na dołek w przypadku stosowania płytki 384-dołkowej. Dodać barwnik Hoechst 33342 o stężeniu końcowym 0,6 μg/ml.
    2. Stuknąć roztwór przeciwciała pierwotnego. Umyj 3x za pomocą TBS-T.
    3. Dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    4. Umyj 5x z TBS-T. Mycie 2x z 1x buforem SSC. Mycie 2x z buforem SSC 0,01x.
      UWAGA: W tym momencie płytki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C (w SSC 0,01X) w sposób chroniony przed światłem. W przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych można zamontować szkiełka, a po 1 dniu można je przechowywać w temperaturze -20 °C.

10. Akwizycja obrazu

  1. Użyj konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego i obiektywu 63x. Określ czas ekspozycji, porównując kontrole ujemne i pozytywne, aby uniknąć nasycenia i zapadania się kropek.
    UWAGA: Zastosowanie mikroskopów konfokalnych poprawia wykrywanie kropek PLA. Obiektyw 20x może być również używany do zwiększania liczby wykrywanych jąder.
  2. Po dostosowaniu czasu ekspozycji należy wykonać wszystkie akwizycje kropek PLA o tych samych parametrach. Staraj się pozyskiwać obrazy z różnych dołków lub regionów szkiełek nakrywkowych, aby uniknąć artefaktów spowodowanych niejednorodną inkubacją.
  3. Zapisz wszystkie kanały o tym samym wzorcu nazwy. Jeśli mikroskop wykonuje zdjęcia w kanałach oddzielnie, zapisz odpowiadające im obrazy o tej samej nazwie, dodając tylko PLA lub Nucleus na początku nazwy pliku, aby rozróżnić kanał.

11. Analiza obrazu

UWAGA: Makro zostało stworzone do analizy punktów na jądro w obrazie J/FIJI17 i do użytku z mikroskopami, w których informacje o skali muszą być dodawane ręcznie. Rozmiar piksela zastosowanej soczewki obiektywu musi być znany. Umieść obrazy dla każdego kanału w różnych folderach (Dodatkowy plik kodowania 1, Rysunek uzupełniający 1).
UWAGA: Makro uwzględnia kanały fluorescencji uzyskane oddzielnie. W takim przypadku ważne jest, aby zapisać wszystkie obrazy o tej samej nazwie.

  1. Makro pozwala na wybór konkretnego regionu w terenie. Użyj opcji Wybierz ROI, gdy region na obrazie pokazuje artefakty, które mogą być szkodliwe dla analizy. Wybierz ROI na początku analizy i użyj go dla wszystkich obrazów.
    UWAGA: Jest to funkcja opcjonalna. Jeśli ta opcja nie zostanie wybrana, w analizie zostanie uwzględniony cały obraz (rysunek uzupełniający 2).
  2. Plik ROI powinien zostać utworzony przed użyciem makra, jak opisano poniżej. Aby wybrać ROI, użyj narzędzia prostokąta, wybierz region do analizy i dodaj go do menedżera ROI, klikając Edytuj > Zaznaczenie> Dodaj do menedżera. Zapisz zwrot z inwestycji, klikając przycisk Więcej> Zapisz.
  3. W ImageJ 17 otwórz obrazy z różnych warunków, aby dostosować parametry do analizy. Parametry te muszą być określone przez użytkownika i określone, wraz z danymi, w programie makra (Uzupełniający plik kodowania 1)
    1. Korekcja tła: Aby usunąć tło, kliknij przycisk Proces> Odejmij tło. Przetestuj różne promienie toczącej się kulki za pomocą funkcji podglądu). Użyliśmy walcowania 10 dla kropek PLA i walcowania 100 dla jądra.
    2. Usuń szum, klikając Przetwarzaj > Szum > Usuń plamki. W przypadku jądra użyj funkcji smooth, aby poprawić wypełnienie jądra, klikając przycisk Process>Smooth.
    3. Regulacja progu: Przekonwertuj na obraz 8-bitowy i dostosuj próg, klikając Obraz > Wpisz > 8 bitów i Obraz > Dostosuj >Próg. Dostosuj odpowiednio próg, aby zobrazować wszystkie jądra lub kropki obecne na obrazie, unikając nadmiernego nasycenia i zapadania się struktur. Zanotuj wartości i przetestuj na różnych obrazach, aby sprawdzić, czy próg działa dla różnych obrazów.
    4. Konwertuj na maskę, klikając Przetwarzaj > Binarny > Konwertuj na maskę. W przypadku jądra kliknij Process > Binary > Fill holes, a następnie Process > Binary > Watershed. W przypadku kropek PLA kliknij pozycję Process > Binary > Watershed.
    5. Aby policzyć jądra, zmierz powierzchnię lub długość różnych jąder, aby oszacować średni rozmiar. Użyj przybliżonej wartości do analizy cząstek. Kliknij Analizuj > Analizuj cząstki, a następnie wybierz Ustaw rozmiar: 15-nieskończoność (wartości te zależą od wielkości jąder). Sprawdź następujące opcje: Pokaż: Maska; Wyświetlanie wyników; Przejrzyste wyniki; Podsumować; Dodaj do menedżera; Wyklucz na krawędziach.
    6. Aby policzyć kropki PLA, zmierz obszar lub promień kropek, aby oszacować średni rozmiar. Wybierz Zastosuj maskę jądra (zastosuj maskę to funkcja we wtyczce GDSC, sprawdź, czy jest zainstalowana), a następnie Analizuj > Analizuj cząstki i ustaw. 0,02-3 (wartości te zależą od wielkości jąder). Sprawdź następujące opcje: Pokaż: Maska; Wyświetlanie wyników; Przejrzyste wyniki; Podsumować; Dodaj do menedżera; Wyklucz na krawędziach.
  4. Wyniki pokazują liczbę kropek na jądro w każdym jądrze obecnym na obrazie. Zapisz te dane.

12. Wizualizacja scalonych obrazów

  1. Otwórz kanały odpowiadające PLA, jądrze i γ-H2AX. Odejmij tło i usuń szum, jak wspomniano w krokach 11.4.1 i 11.4.2 dla wszystkich obrazów.
  2. Dostosuj jasność i kontrast automatycznie lub ręcznie, używając tej samej wartości dla wszystkich warunków z tego samego kanału. Wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/kontrast.
  3. Łączenie obrazów (scalanie), wybierając opcje Obraz > Kolor > Scal kanały. Dodaj podziałkę liniową, wybierając pozycję Analizuj > Narzędzia > Pasek skali. Zapisz jako. Plik TIFF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaobserwowano oddziaływanie Nek4-Ku70 w przypadku braku traktowania etoposydem. Oddziaływanie to może jednak zachodzić poza jądrem komórkowym (Rysunek 1A). Interakcja Nek4-Ku70 nasila się po uszkodzeniu DNA i koncentruje się w jądrze (Rysunek 1A). W przypadku oddziaływania Nek5-topoizomerazy II β (TOPIIβ), wykorzystanej w tym teście jako kontrola pozytywna w oparciu o wyniki literaturowe18, interakcja ta jest znacznie nasilona po traktowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dane pokazują, że stosowanie PLA w połączeniu z markerem uszkodzonym przez DNA może dostarczyć najwięcej informacji w profilowaniu odpowiedzi na uszkodzenie DNA, pokazując przestrzenne i czasowe zachowanie interakcji po zniewadze. PLA jest wszechstronną metodą, która została wykorzystana do identyfikacji dimeryzacji, oznaczania kontaktu organelli, interakcji białko-kwas nukleinowy, a głównie interakcji białko-białko 10,11,19,20. Krytycznymi etapami wykonywania PLA są określenie i walidacja przeciw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, poprzez Grant Temático 2022/15126-9 dla JK i fellowship 21/09439-1 dla LARM) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) za sfinansowanie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czarne płytki 384-dołkowePerkin Elmer Płytki
Osioł  anty- Królik Alexa Fluor 488InvitrogenA212061:300
Duo link Donkey anty Mouse MinusSigmaDUO92004
Duolink rozcieńczalnik przeciwciałSigmaDUO82008
Duolink roztwór blokujący 1XSigmaDUO82007
Odczynnik Duolink Detection Far redSigmaDUO92013
Duolink Donkey anti goat plusSigmaDUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plusSigmaDUO92002
EtoposideSigmaE1383
Goat anti Nek4Santa Cruz BiotechnologySC-5517koza anty Nek4 została użyta w rozcieńczeniu 1:50
Hoechst 33342ThermoH13990,6 &mikro; g / mL
Mikroskop Leica DMILeica
anti Ku70ThermoMA5-13110mysz anty Ku70 została użyta w rozcieńczeniu 1:100
Mysz anty TOPIIβSanta Cruz BiotechnologySC-3650711:25
Królik anty Nek5Santa Cruz BiotechnologySC-845271:25
Królik anty Y H2AXCell Signalling9718S1:100 rozcieńczenie
Linia komórkowa U2OSATCCHTB-96 
nośne komórek Mysz

Bibliografia

  1. Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
  2. Lindahl, T., Barnes, D. E. Repair of endogenous DNA damage. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).
  3. DNA damage, aging, and cancer. N Engl J Med. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).
  4. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).
  5. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: Making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  6. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  7. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
  8. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).
  9. Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks. Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).
  10. Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay. J Vis Exp. (140), (2018).
  11. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. J Vis Exp. (118), (2016).
  12. Nguyen, C. L., et al. Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts. Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).
  13. Basei, F. L., et al. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).
  14. Animal Cell Culture Guide. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).
  15. Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure. MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).
  16. Wei, F., et al. Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response. Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide. J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).
  19. George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines. STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).
  20. Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells. RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).
  21. Hegazy, M., et al. Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ. Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Odpowiedź na uszkodzenia DNAbarwienie gamma H2AXlokalizacja białekmikroskopia immunofluorescencyjnaoddziaływanie białektraktowanie etopozydemanaliza w programie ImageJpęknięcia dwunicioweoddziaływanie białek jądrowych
Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.