Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca²⁺, znanych jako mikrodomeny Ca²⁺, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca²⁺ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Streszczenie

Lokalne, subsekundowe sygnały Ca²⁺, określane jako mikrodomeny Ca²⁺, są wysoce dynamicznymi i krótkotrwałymi sygnałami Ca²⁺, które skutkują globalnym wzrostem [Ca²⁺]_i i mogą już zadecydować o losie limfocytu T. Po aktywacji receptora limfocytów T NAADP powstaje szybko, wiążąc się z białkami wiążącymi NAADP (HN1L / JPT2, LSM12) i ich odpowiednimi receptorami (RyR1, TPC2) znajdującymi się na wewnątrzkomórkowych magazynach Ca^{2 +}, takich jak ER i lizosomy, i prowadząc do późniejszego uwolnienia i podniesienia [Ca^{2 +}] _i. Aby uchwycić te szybkie i dynamicznie występujące sygnały Ca²⁺, opracowaliśmy technikę obrazowania o wysokiej rozdzielczości wykorzystującą kombinację dwóch wskaźników Ca²⁺, Fluo-4 AM i FuraRed AM. Na potrzeby przetwarzania końcowego opracowano półautomatyczne podejście do wykrywania mikrodomen Ca²⁺ o otwartym kodzie źródłowym w oparciu o język programowania Python. Korzystając z tego przepływu pracy, jesteśmy w stanie niezawodnie wykryć mikrodomeny Ca²⁺ na poziomie subkomórkowym w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T w filmach fluorescencyjnych o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej. Metodę tę można również zastosować do innych typów komórek, takich jak komórki NK i mysie linie komórek neuronalnych.

Wprowadzenie

Prezentowana technika mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację lokalnych, czasowych początkowych sygnałów wapnia (Ca²⁺) w pierwotnych mysich limfocytach T, zwanych mikrodomenami Ca²⁺. Mikrodomeny Ca²⁺ reprezentują wysoce dynamiczne i krótkotrwałe zdarzenia sygnalizacyjne Ca²⁺, stanowiąc wyzwanie dla skutecznego obrazowania i analizy żywych komórek¹.

T limfocyty T są trudne do obrazowania żywych komórek ze względu na względne różnice w intensywności fluorescencji centralnej i obwodowej, które można przypisać ich sferycznemu kształtowi i małej średnicy ~6-8 μm. Po stymulacji i tworzeniu synaps immunologicznych limfocyty T ulegają zmianom morfologicznym, co dodatkowo komplikuje obrazowanie limfocytów T¹. Dlatego konieczne staje się zastosowanie analizy ratiometrycznej, osiągniętej poprzez zarejestrowanie dwóch obrazów reprezentujących różne właściwości barwnika Ca^{2 +} lub zastosowanie kombinacji dwóch barwników Ca^{2 +}. Wymagające cechy mikrodomen Ca²⁺ obejmują ich szybki, ograniczony czasowo i przestrzennie charakter. Aby to uchwycić, stosowane barwniki Ca²⁺ muszą charakteryzować się zarówno wysoką jasnością podstawową, jak i wysokim stosunkiem sygnału do szumu (SNR), aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość czasową i przestrzenną. Optymalne wyniki osiągnięto dzięki połączeniu barwnika Fura Red o podwójnej długości fali i barwnika Fluo-4 o pojedynczej długości fali. Jednoczesne obciążenie ogniw Fluo-4 i Fura Red łagodzi wyzwania związane z silnym fotowybielaniem barwników o podwójnej długości fali i opóźnieniem czasowym związanym z barwnikami o podwójnej ekscytacji, zapewniając przydatność do szybkiej akwizycji obrazu. Takie podejście dodatkowo ułatwia wizualizację zmian kształtu i subtelnych ruchów. Specjalne wymagania stawiane są również systemowi obrazowania w zakresie rozdzielczości przestrzennej, aby umożliwić wizualizację sygnałów Ca²⁺ pochodzących z otwarcia małych klastrów kanałów lub nawet pojedynczych kanałów¹.

Ca²⁺ sygnalizacja odgrywa kluczową rolę w aktywacji funkcji immunologicznych w komórkach T, w tym tworzenia synaps oraz produkcji i uwalniania cytokin^2,3. Specyficzny los komórki jest regulowany przez różnie wyraźne i lokalnie rozmieszczone sygnały Ca^{2 +}, mikrodomeny Ca^{2 +} sup class<="xref">3. Warto zauważyć, że te lokalne sygnały Ca^{2 +} poprzedzają powszechny wzrost wewnątrzkomórkowych poziomów Ca^{2 +} w komórkach T, a tworzenie mikrodomen Ca^{2 +} zależy zarówno od wejścia, jak i ^{2 +} sup class="xref">^1,4,5. Po stymulacji receptora limfocytów T (TCR)/CD3 wyzwalane jest tworzenie Ca^{2 +} uwalniających drugich przekaźników, takich jak fosforan dinukleotydu adeniny kwasu nikotynowego (NAADP), 1,4,5-trifosforan D-mio-inozytolu (IP₃) i cykliczna ryboza ADP (cADPR), co prowadzi do wzrostu wewnątrzkomórkowego poziomu Ca²⁺ do 1 μM^6,7. Wczesne zdarzenia sygnalizacyjne Ca^{2 +} są związane z uwalnianiem Ca^{2 +} z wewnątrzkomórkowych magazynów Ca^{2 +}, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER), przy czym kanały takie jak receptor ryanodine 1 (RyR1) i receptor IP₃ (IP₃R) są głównie odpowiedzialne za tę sygnalizację. To z kolei wyzwala zewnątrzkomórkowy napływ Ca^{2 +} i powoduje globalny sygnał Ca^{2 +} za pośrednictwem przechowywanego wejścia Ca^{2 +} (SOCE) ⁸. Ponadto istnieją inne kanały zaangażowane w sygnalizację Ca^{2 +} podczas aktywacji limfocytów T ⁹, np. kanały P2X4 i P2X7 zapewniają napływ kationów zależny od trifosforanu adenozyny (ATP), przyczyniając się do wzrostu wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +}. Co ciekawe, początkowe zależne od adhezji mikrodomeny Ca²⁺ (ADCM) powstają już przed stymulacją TCR, ale z niższymi amplitudami i częstotliwościami^Ca2+. Te początkowe, niezależne od TCR sygnały Ca^{2 +} najprawdopodobniej służą migracji limfocytów T do miejsca zapalenia i przygotowują limfocyty T do ponownej stymulacji w miejscu infekcji^10,11.

Rozwijając opisaną metodę lokalnego obrazowania Ca²⁺, zyskaliśmy dodatkowe narzędzie do badania pochodzenia i znaczenia wczesnych sygnałów Ca²⁺ w aktywacji limfocytów T. Ta metoda umożliwia użytkownikowi wykrywanie mniejszych, krótkotrwałych i szybciej występujących sygnałów Ca²⁺ niż było to wcześniej możliwe. Co więcej, Deconvolution, Analysis, Registration, Tracking, and Shape normalization (DARTS), potok analizy oparty na języku Python, umożliwia udostępnianie narzędzi analitycznych szerszemu gronu odbiorców¹².

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Uniwersyteckim Centrum Medycznym Hamburg-Eppendorf.

1. Izolacja pierwotnych mysich limfocytów T z węzłów chłonnych i śledziony

1. Zbierz śledziony/węzły chłonne w sterylnych warunkach zgodnie z wytycznymi etycznymi i umieść je w probówce z lodowatym podłożem Clicks (10% płodowa surowica cielęca (FCS), 2 mM L-glutamina, penicylina/streptomycyna (P/S) 100 U/ml, 50 nM β-merkaptoetanol).
   UWAGA: Limfocyty T myszy typu dzikiego i KO są izolowane w ten sam sposób.
2. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
3. Umieścić śledzionę i węzły chłonne w sitku do komórek o wielkości 70 μm na sterylnej szalce Petriego i dodać pożywkę do izolacji śledziony (pożywka RPMI + 7,5 % NCS + 1% P/S) do całkowitej objętości 20 ml.
4. Dokładnie, ale delikatnie rozerwij śledzionę za pomocą plastikowego moździerza. Następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Całkowita objętość 20 ml powinna teraz znajdować się w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Śledziona i węzły chłonne powinny być całkowicie przerwane. Od tego momentu pracuj na lodzie. Utrzymywanie komórek na lodzie spowalnia ich metabolizm i zapobiega śmierci komórek, zapewniając, że pozostają one żywotne i funkcjonalnie nienaruszone. Pomaga to zachować ich stan fizjologiczny przez dłuższy czas, co jest szczególnie ważne w przypadku dokładnych eksperymentów na dalszych etapach.
5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odrzucić supernatant i zapewnić ponowne zawieszenie powstałego osadu w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco (bez Ca²⁺ i Mg²⁺). Przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 12 ml.

2. Negatywny wybór limfocytów T CD4+

UWAGA: Do negatywnej selekcji limfocytów T CD4⁺ stosuje się zestaw do izolacji limfocytów T zawierający bloker FcR, biotynylowane przeciwciała przeciwko limfocytom T innym niż CD4⁺ oraz cząstki magnetyczne pokryte streptawidyną.

1. Dodać 20 μl/ml mysiego blokera FcR z zestawu do izolacji limfocytów T do zawiesiny komórek.
2. Następnie dodać 100 μl koktajli izolacyjnych mysich limfocytów T CD4 ⁺ o stężeniu 50 μl / ml, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Wirować cząstki magnetyczne pokryte streptawidyną przez 30 s, dodać 150 μl do zawiesiny komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 2 minuty 30 s w temperaturze pokojowej.
4. Dodać DPBS do zawiesiny komórek, wypełniając ją do całkowitej objętości 7 ml. Upewnij się, że delikatnie pipetujesz w górę i w dół, a następnie inkubuj w magnesie przez 2 minuty 30 s w temperaturze pokojowej.
5. Następnie delikatnie zebrać wzbogacone limfocyty T w supernatancie i przenieść je do nowej probówki wirówkowej o pojemności 12 ml.
6. Odwirować komórki przy 300 x g przy RT przez 5 min.
7. Odrzucić supernatant.
8. Ponownie zawiesić wyizolowane i wzbogacone limfocyty T CD4 ⁺ w 1 ml DPBS, dokładnie pipetując w górę iw dół. Inkubuj mieszaninę przez 2 minuty 30 s w magnesie w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia kulkami.
9. Zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki wirówkowej i policzyć wzbogacone limfocyty T.
10. Aby policzyć komórki, zabarwić je błękitem trypanowym i policzyć za pomocą automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Najlepiej jest bezpośrednio załadować izolowane limfocyty T CD4 ⁺ i zobrazować je w tym samym dniu izolacji. Jednak pierwotne mysie limfocyty T można hodować bez stymulacji przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5 % CO₂ w pożywce izolacyjnej (RPMI 1640 + 10% FCS + P/S).

3. Ładowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ myszy

UWAGA: Do pomiaru stężenia wolnego cytozolowego Ca²⁺, w eksperymentach obrazowania Ca²⁺ stosuje się barwniki fluorescencyjne i przepuszczalne dla błony. Połączenie estru fluo-4-acetoksymetylowego (AM) i barwnika ratiometrycznego Fura Red-AM służy jako wskaźnik do szybkiego wykrywania lokalnych sygnałów Ca²⁺. Upewnij się, że pracujesz w ciemności podczas używania barwników fluorescencyjnych.

1. Wirować 2-5 x 10⁶ komórek przez 5 minut, 300 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 480 μl pożywki z limfocytów T (RPMI 1640, 10% FCS) z 10 μM Fluo-4-AM (Stock: [1 mM]) i 20 μM Fura Red-AM (Stand: [4 mM]).
2. Wysiaduj początkowo przez 20 minut w RT pod ławką w ciemności, przykrywając sokoła folią aluminiową.
   UWAGA: Nie należy przekraczać czasu pierwszej inkubacji, ponieważ wskaźniki Ca²⁺ są rozcieńczane w DMSO, co może być szkodliwe dla komórek przy dłuższym czasie ekspozycji w małej objętości całkowitej. Po załadowaniu utrzymuj ogniwa chronione przed światłem ze względu na wrażliwość barwników na światło.
3. Pod koniec początkowej 20-minutowej inkubacji dodaj 2 ml pożywki z limfocytów T do komórek i kontynuuj inkubację przez dodatkowe 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
4. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Odrzucić supernatant i oczyścić osad, przemłukując go 2 ml buforu miarowego Ca²⁺ (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂, 20 mM HEPES, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM glukozy, pH 7,4), a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Na koniec odrzucić supernatant i ponownie zawiesić go za pomocą buforu miarowego^Ca2+. Dostosuj liczbę komórek do ~100 000 komórek na 10 μL.
   UWAGA: Do jednego pomiaru używa się objętości 10 μl. Należy unikać nadmiernego rozcieńczania komórek, ponieważ może być konieczne dalsze dostosowanie liczby komórek pod mikroskopem, aby osiągnąć optimum dla warunków pomiaru.
7. Pozwól komórkom inkubować przez ~ 20 minut, aby zapewnić całkowitą infiltrację komórek i deestryfikację barwników. Przechowuj komórki na lodzie i w ciemności do momentu pomiaru.
   UWAGA: Załadowane pierwotne mysie limfocyty T mogą być używane do ~4 godzin po załadowaniu.

4. Lokalne obrazowanie Ca²⁺

1. Przygotowanie preparatów
   1. Szkiełka nakrywkowe mikroskopu pokryć (24 mm x 46 mm) albuminą surowicy bydlęcej (BSA, 5 mg/ml) i poli-L-lizyną (PLL, 0,1 mg/ml) (Rysunek 1A). Pozwól BSA siedzieć przez ~ 20 minut przed nałożeniem PLL.
      UWAGA: Powłoka ułatwia adhezję komórek. Aby zapewnić prawidłową adhezję komórek, dokładnie rozprowadź zarówno BSA, jak i PLL, aż przestaną być widoczne smugi.
   2. Aby stworzyć komory reakcyjne, przyklej gumowe O-ringi wielokrotnego użytku do szkiełek za pomocą pasty silikonowej (Rysunek 1B,C).
      UWAGA: Do akwizycji obrazu można używać innych szkiełek/komór lub płytek, takich jak szkiełka 35 mm, metalowe komory wielokrotnego użytku lub płytki 8-, 24- lub 48-dołkowe.
2. Powlekanie kulek magnetycznych białka G (o średnicy 10 μm) przeciwciałami
   1. Delikatnie wymieszaj zawiesinę kulek magnetycznych białka i przenieś 12,5 μl do nowej probówki.
   2. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym, aby wyjąć bufor do przechowywania i pozwól koralikom migrować do magnesu. Delikatnie wyjmij bufor magazynujący, pipetując go po przeciwnej stronie magnesu.
   3. Aby usunąć pozostały bufor do przechowywania, umyj kulki, dodając 500 μl PBS-T (PBS, 0,1% Tween) i wirując przez 10 sekund. Ponownie umieść probówkę w podstawce magnetycznej i wyjmij bufor.
   4. Aby pokryć kulki przeciwciałami, zawieś je ponownie w 7,5 μl PBS-T i dodaj 5 μl odpowiednio anty-CD3 (0,5 mg/ml) i anty-CD28 (0,5 mg/ml). Inkubować przez 30-60 minut z ciągłym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj powlekane kulki trzykrotnie 500 μl PBS-T, a następnie przemyj raz 500 μl buforu pomiarowego Ca²⁺ za pomocą podstawki magnetycznej.
   6. Zawiesić kulki w 200-400 μl buforu miarowego Ca²⁺.
      UWAGA: Sprawdź gęstość ściegu podczas pomiarów, w razie potrzeby rozcieńczyć.
3. Miejscowa mikroskopia obrazowa^Ca2+
   UWAGA: Obrazowanie odbywa się za pomocą mikroskopu świetlnego jasnego pola o 100-krotnym powiększeniu, wyposażonego w ksenonową lampę łukową jako źródło światła. Klatki są rejestrowane w trybie 14-bitowym z podwójnym kategoryzacją za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunku zwielokrotnionym elektronami. Do rejestrowania i rozdzielania długości fal emisji obu barwników stosuje się moduł z podwójnym widokiem, wyposażony w następujące filtry w nm (np. 480/40; bs, 495; em1, 542/50; em2, 650/57). Konfiguracja obrazowania obejmuje koncentrator akwizycji i oprogramowanie do obrazowania do akwizycji obrazu.
   1. Umieść 10 μl załadowanych komórek na przygotowanym szkiełku podstawowym i pozwól im przymocować się do szkiełka na 3-5 minut.
   2. Delikatnie dodać 80 μl buforu miarowego Ca²⁺ do szkiełka.
   3. Wybierz soczewkę immersyjną z olejkiem 100x i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego. Umieść szkiełko na stole mikroskopu.
   4. Dostosuj ostrość w trybie jasnego pola, ostrożnie wybierz pole widzenia z maksymalnie 10 komórkami, które nie stykają się ze sobą, i uzyskaj obraz.
      UWAGA: Nakładające się i stykające się komórki będą później trudne do przeanalizowania.
      1. Włącz lampę, sprawdź fluorescencję i obciążenie limfocytów T i porównaj komórki w obu kanałach, aby sprawdzić, czy nie są wstępnie aktywowane.
      2. Upewnij się, że wykonałeś zdjęcia pola widzenia zarówno dla kanałów jasnego pola, jak i fluorescencji przed i po pomiarze, aby sprawdzić ruch i obciążenie komórki.
   5. Rozpocznij pomiar i uchwyć podstawową aktywność przez 1 minutę z szybkością akwizycji 1 klatka na 5 s.
   6. Po 1 minucie dodać 10 μl związku/stymulantu (kulki lub stymulatora/inhibitora) i mierzyć łącznie przez 3 minuty, używając 40 klatek na sekundę lub maksymalnej możliwej liczby klatek na sekundę.
      UWAGA: Dodanie koralików jest kluczowym krokiem; Upewnij się, że koraliki są dodane blisko światła wzbudzenia na szkiełku, nie przesuwając suwaka. Reprezentatywne przykłady mikrodomen Ca^{2 +} w pierwotnych limfocytach T CD4 ⁺ po kontakcie z koralikami z myszy WT i P2x4-/- i P2x7-/- pokazano w Rysunek 2.

5. Postprocessing/ analiza danych

UWAGA: Do przetwarzania obrazów i analizy danych używany jest oparty na Pythonie potok open source DARTS. Został opracowany przez Woelk et al.¹² na podstawie pracy Diercks et al.¹³.

1. Instalacja rurociągu DARTS
   1. Zainstaluj Pythona 3.10.0¹⁴, anaconda¹⁵ i git¹⁶, a następnie sklonuj repozytorium GitHub za pomocą polecenia terminala git clone: https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS.git
   2. Utwórz środowisko conda za pomocą polecenia conda create --name DARTS i zainstaluj wszystkie niezbędne pakiety języka Python za pomocą polecenia install <package>.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji w repozytorium DARTS GitHub^17,18, aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje.
   3. Przed użyciem Bioformats upewnij się, że środowisko uruchomieniowe Java jest poprawnie zainstalowane¹⁹.
2. Korzystanie z rurociągu DARTS
   UWAGA: Po zainstalowaniu DARTS można uruchomić z okna terminala.
   1. Przejdź do lokalnej kopii repozytorium DARTS (cd path/to/DARTS), która zawiera plik main.py. Upewnij się, że środowisko conda jest aktywowane (conda activate DARTS).
   2. Uruchom DARTS, wpisując python main.py w oknie terminala i naciskając Enter.
   3. W graficznym interfejsie użytkownika (GUI) określ katalog źródłowy i wynikowy, a także format obrazu w lewej górnej sekcji (patrz Rysunek 3).
   4. Zdefiniuj właściwości pomiaru, takie jak skala (piksele na mikrometr), liczba klatek na sekundę, typ komórki itp. Potok przetwarzania można skompletować na podstawie określonych danych obrazowych i pytania badawczego.
      UWAGA: Więcej informacji na temat parametrów dekonwolucji można znaleźć na przykład w odpowiedniej dokumentacji²⁰.
   5. Zapisz ustawienia na komputerze przed kliknięciem przycisku Start. Bardziej szczegółowy opis GUI można znaleźć w dokumentacji DARTS.
3. Obrazowanie mikrodomen Ca²⁺ i kontakty perełkowe
   UWAGA: W przypadku miejscowego obrazowania i stymulacji za pomocą kulek oraz późniejszej analizy obrazu, użytkownik musi zdefiniować specyficzne dla komórki kontakty kulkowe, aby zidentyfikować punkt początkowy (t = 0) interesującego go okresu pomiaru (patrz Rysunek 4). Kontakt koralika definiuje się jako miejsce kontaktu (stymulatora) koralika z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Składa się ze specyfikacji (1) czasu kontaktu koralika, np. ramki 300, oraz (2) pozycji styku koralika względem środka komórki, np. godziny 1 lub godziny 12. W obecnej wersji DARTS użytkownik musi ręcznie zdefiniować i wprowadzić informacje dla każdego kontaktu koralika. Aby zdefiniować styki ściegu, należy użyć następującej procedury:
   1. Użyj suwaka, aby wskazać czas kontaktu między koralikiem a komórką zainteresowania.
   2. W menu opcji po prawej stronie wybierz styk koralikowy: x, y, t.
   3. Zaznacz miejsce po lewej stronie obrazu, w którym komórka i koralik stykają się.
   4. Wybierz opcję Wybierz komórkę, klikając punkt w środku. Kliknij na komórkę stymulowaną przez ten koralik, najlepiej pośrodku.
   5. Kliknij DODAJ kontakt z koralikami.
   6. Powtórz kroki 5.3.1- 5.3.5 dla każdego dodatkowego styku ściegu w tym pliku. Po zdefiniowaniu wszystkich styków koralików kliknij przycisk Kontynuuj.
   7. Kontynuuj z dodatkowymi plikami. Po osiągnięciu ostatniego pliku skrypt automatycznie rozpocznie analizę wszystkich plików.
4. analiza danych
   1. Znajdź przetworzone obrazy proporcji, dane mikrodomenowe dla każdej komórki w czasie (w tym lokalizację, amplitudę, rozmiar), dane źródłowe dla rzutki na tarczy do rzutek i inne zasoby w folderze wyników.
   2. Aby utworzyć tarcze do rzutek, przejdź do folderu /src/analysis/ w folderze DARTS (wzorzec: ścieżka cd/do/DARTS/src/analysis) zawierającym DartboardPlotGUI.py skryptu. Następnie wpisz python DartboardPlotGUI.py i naciśnij enter.
   3. Upewnij się, że podano niezbędne informacje i że pliki arkuszy kalkulacyjnych z folderu wyników są dokładnie wybrane jako pliki źródłowe do generowania tarczy do rzutek.

Wyniki

W tym protokole przedstawiliśmy zaktualizowaną metodę obrazowania i analizy początkowych mikrodomen Ca²⁺ w pierwotnych mysich komórkach T w oparciu o poprzednie prace naszej grupy^1,13. Podejście to odegrało zasadniczą rolę w odkryciu udziału kanałów CRAC, takich jak ORAI1, STIM1 i STIM2, a także wewnątrzkomórkowych kanałów uwalniania Ca^{2 +}, takich jak RyR1 we wczesnych zdarzeniach sygnalizacyjnych Ca²⁺⁴.

Aby to zrobić, zbadaliśmy spontaniczne tworzenie mikrodomen Ca²⁺ poprzez obrazowanie niestymulowanych pierwotnych mysich komórek Orai1^-/-, Stim1^-/-, Stim2^{-/- i} Ryr1^-/- i porównaliśmy je z pierwotnymi mysimi limfocytami T WT. Analiza powstawania mikrodomen Ca²⁺ obejmowała prędkość początku sygnału, amplitudę Ca²⁺ oraz liczbę sygnałów na płaszczyznę konfokalną. Warto zauważyć, że z wyjątkiem limfocytów T Stim2^-/-, wszystkie limfocyty T KO wykazywały znaczny spadek lokalnych sygnałów Ca^{2 +} i zmniejszone podstawowe stężenie wolnego cytozolu Ca^{2 +} w porównaniu z komórkami WT. To doprowadziło nas do wniosku, że tworzenie mikrodomen Ca²⁺ jest ściśle związane z interakcją ORAI1, STIM1 i RyR1⁴. Ponadto udało nam się zidentyfikować i scharakteryzować spontaniczne mikrodomeny^Ca2+ w błonie plazmatycznej. Te mikrodomeny Ca²⁺ charakteryzowały się amplitudą Ca²⁺ 290 nm ± 12 nm. Wykorzystanie podejścia opartego na kodowaniu kolorami dla sygnałów Ca²⁺ pozwoliło na wizualizację mikrodomen Ca²⁺ w całej komórce. Wyniki dodatkowo podkreśliły szybki początek mikrodomen^Ca2+, widocznych w ciągu milisekund, oraz zdolność tej metody do wykrywania sygnałów Ca²⁺ z długowiecznością wynoszącą kilka milisekund⁴. Te spontaniczne mikrodomeny Ca²⁺ zostały później zidentyfikowane jako zależne od adhezji mikrodomeny Ca²⁺ (ADCM), zależne nie tylko od SOCE, ale także działające poprzez kaskadę sygnalizacyjną FAK/PLC-γ/IP₃¹⁰ i udział P2X4⁹. Co więcej, technika ta miała fundamentalne znaczenie dla potwierdzenia, że podwójne oksydazy 1 i 2 (DUOX1/2) są enzymami wytwarzającymi NAADP²¹ i HN1L/JPT2²² jako jedno z nowo odkrytych białek wiążących NAADP²³.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne przykłady mikrodomen Ca²⁺ w pierwotnych komórkach T CD4⁺ po kontakcie z koralikami z WT, jak również myszy P2x4^-/- i P2x7^-//-. Komórki załadowano barwnikami Ca²⁺ Fluo-4 AM i Fura Red AM i zobrazowano z szybkością akwizycji 25 ms (40 klatek / s). Aby naśladować tworzenie synaps limfocytów T, komórki stymulowano kulkami pokrytymi anty-CD3 / anty-CD28. Początkowe tworzenie mikrodomen Ca²⁺ analizowano 1 s przed i do 15 s po kontakcie z kulkami przy użyciu potoku DARTS. Po kontakcie z kulkami komórka WT wykazała szybkie tworzenie mikrodomen Ca²⁺ w pierwszej sekundzie po stymulacji w miejscu kontaktu z kulkami (Figura 2A). Te mikrodomeny Ca²⁺ dalej rozszerzały się w całej komórce w ciągu kolejnych 15 s po kontakcie z koralikami. W przeciwieństwie do komórki WT, komórki P2x4^-/- i P2x7^-/- (Figura 2B) wykazały zmniejszone tworzenie mikrodomeny Ca^{2 +} po stymulacji kulek, a także dla P2x4^-/- niższy poziom podstawowy przed kontaktem z koralikami. Te reprezentatywne odkrycia są zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami Brocka i wsp.⁹, wskazując na tworzenie mikrodomen Ca²⁺ w komórkach T WT bezpośrednio po kontakcie z koralikami przez 15 s i niższe sygnały na ramkę w komórkach P2x4^-/- i P2x7^-//-. Co więcej, amplituda w komórkach P2x4^-/- została znacznie zmniejszona, co dodatkowo ustala rolę sygnalizacji purynergicznej w zależnych od adhezji mikrodomenach^Ca2+.

Ponadto, ta metoda może być również użyta do wizualizacji początkowych mikrodomen Ca²⁺ w pierwotnych ludzkich limfocytach T CD4⁺ (Rysunek 3). Podobnie jak w przypadku pierwotnych mysich limfocytów T, początkowe mikrodomeny Ca^{2 +} są wywoływane w miejscu kontaktu z kulkami. Jednak ogólna odpowiedź Ca^{2 +} wydaje się zachodzić w innej skali czasowej w porównaniu z mysimi limfocytami T CD4 ⁺.

Ręczna analiza lokalnych sygnałów Ca²⁺ nie jest możliwa, ponieważ jest dość pracochłonna i subiektywna dla indywidualnego badacza. Dlatego wcześniej opracowaliśmy algorytm w MATLAB Simulink, wykorzystując jego zestawy narzędzi do przetwarzania i optymalizacji obrazu do postprocessingu¹³ do analizy lokalnych mikrodomen Ca²⁺.

Niedawno opracowaliśmy nowy, open-source, potok postprocessingu o nazwie DARTS do analizy mikrodomen Ca²⁺ w wysokiej rozdzielczości obrazowania żywych komórek przy użyciu platformy oprogramowania Python¹². W tym miejscu można wybrać różne algorytmy dekonwolucji, w zależności od preferencji użytkownika, normalizację kształtu komórki wykonywaną w celu skompensacji morfologicznych zmian kształtu komórki oraz zdefiniowane parametry specyficzne dla mikroskopu i pomiaru (np. skala, liczba klatek na sekundę, mierzony czas) (Rysunek 4).

Po wybraniu parametrów do analizy mikrodomeny Ca²⁺, dla każdego indywidualnego pomiaru otwiera się drugie wyskakujące okienko, które definiuje kontakt ściegu (Rysunek 5). Aby zdefiniować kontakt ściegu, użytkownik może ręcznie przewijać plik tiff za pomocą suwaka i indywidualnie wybierać ramkę styku ściegu. Kontakt koralika wybiera się, klikając na stronie kontaktu z koralikiem (Rysunek 5, kontakt koralików i koralików oznaczony żółtym pierścieniem i strzałką), a także wybór komórek. Ten krok należy powtórzyć dla każdej interesującej nas komórki. Na koniec stosowane jest automatyczne przetwarzanie końcowe obrazu, a dane wynikowe są podsumowywane i zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym.

Rysunek 1: Przebieg pracy z przygotowaniem slajdów do obrazowania. (A) Dodać i rozprowadzić zarówno BSA, jak i PLL na szkiełku za pomocą drugiego szklanego szkiełka nakrywkowego. (B,C) Aby zbudować komorę, przyklej gumowe o-ringi za pomocą smaru silikonowego do suwaka. Upewnij się, że cały pierścień jest pokryty cienką warstwą smaru, aby mieć odpowiednią izolację komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne komórki mikrodomen Ca²⁺ zależnych od receptora limfocytów T w pierwotnym mysim limfocytie T CD4⁺ typu dzikiego (WT), P2x4^-/- lub P2x7^-/- (B). Limfocyty T CD4 ⁺ wyizolowano ujemnie i załadowano Fluo-4 AM i Fura Red, jak opisano powyżej. Limfocyty T analizowano przy użyciu potoku DARTS, co dało porównywalne obrazy komórek z poprzednio opublikowanymi wynikami⁹. (A) Pierwotna komórka T WT 1 s przed stymulacją kulkami pokrytymi anty-CD3 / anty-CD28 i do 15 s po stymulacji (podziałka 5 μm), a także wykres powierzchniowy 3D z powiększeniem od 0 s do 0,65 s w obszarze styku kulki (pasek skali 1 μm). (B) Górny pas: reprezentatywny pierwotny limfocyt T P2x4^-/- 1 s przed i do 15 s po stymulacji kulek. Dolny pas: reprezentatywny P2x7^-/- pierwotna limfocyt T 1 s przed i do 15 s po stymulacji kulek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mikrodomeny Ca²⁺ w reprezentatywnej pierwotnej ludzkiej limfocytacji T po stymulacji TCR. Pierwotne ludzkie limfocyty T CD4 ⁺ wyizolowano z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) z kożuchów i załadowano Fluo-4 AM i Fura Red, jak opisano powyżej. Rysunek przedstawia pierwotną ludzką komórkę T 1 s przed stymulacją kulkami pokrytymi anty-CD3 i do 15 s po stymulacji (podziałka 5 μm), a także wykres powierzchni 3D z powiększeniem od 6,25 s do 7,5 s w obszarze kontaktu z kulką (pasek skali 1 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Graficzny interfejs użytkownika (GUI) DARTS. Graficzny interfejs użytkownika jest podzielony na cztery obszary. W obszarze Wejście/Wyjście należy podać informacje o danych pierwotnych, w tym katalog źródłowy i konfigurację obrazu (dwa kanały na plik lub oddzielne kanały), a także katalog wyników. W obszarze Właściwości pomiaru eksperyment musi być opisany wraz ze wszystkimi istotnymi informacjami, takimi jak skala (mikrony na piksel), liczba klatek na sekundę i interwał pomiaru względem później ustalonego punktu początkowego. Następnie można zmontować potok przetwarzania składający się z etapów postprocessingu, normalizacji kształtu i właściwej analizy (wykrywanie mikrodomen i gromadzenie danych na tarczy do rzutek). Na koniec ustawienia można zapisać lub załadować z komputera. Po skonfigurowaniu analizy kliknij Start, aby kontynuować. Aby dowiedzieć się więcej o konfiguracji, odwiedź stronę https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ręczne definiowanie styków koralików. Jeśli koraliki są dodawane do komórek podczas eksperymentu, początkowy czas kontaktu koralików z komórką będącą przedmiotem zainteresowania oraz lokalizacja kontaktu muszą być zdefiniowane ręcznie. Odbywa się to poprzez przewijanie klatek za pomocą suwaka i znajdowanie pozycji (x,y) w punkcie czasowym t. Aby automatycznie wypełnić pole informacji kontaktowych ściegu, użytkownik klika lewą połowę obrazu mikroskopu w pozycji styku ściegu. Następnie, aby skojarzyć komórkę z kontaktem ściegu, użytkownik klika pozycję w komórce, która ma kontakt ściegu. Informacje należy potwierdzić, wybierając opcję Dodaj ścieg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisaliśmy obszerny protokół obrazowania żywych komórek o wysokiej rozdzielczości lokalnych mikrodomen Ca^{2 +} w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T wywołanych stymulacją TCR / CD3 za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami. Ponadto wdrożyliśmy przyjazny dla użytkownika algorytm oparty na Pythonie o otwartym kodzie źródłowym do identyfikacji i analizy lokalnych sygnałów Ca²⁺. Warto zauważyć, że protokół nie ogranicza się do wykrywania mikrodomen Ca²⁺ w kontekście stymulacji TCR/CD3, ale można go dostosować do innych (immunologicznych) typów komórek, takich jak linie komórkowe NK (KHYG-1)¹² lub niezależne od TCR mikrodomeny Ca^{2+ 10,11}.

Krytycznym krokiem w protokole jest rozmiar i liczba kulek stymulujących. Aby naśladować synapsę immunologiczną, koraliki powinny być podobnej wielkości do komórek. Stąd do pierwotnych mysich i ludzkich limfocytów T oraz linii komórkowych (Jurkat i KHYG1) stosujemy kulki magnetyczne o średnicy 10 μm. Co więcej, każda komórka powinna być stymulowana tylko przez jeden pojedynczy koralik. Dlatego liczba koralików dodawanych do każdego slajdu powinna być z jednej strony wystarczająca, ale jeśli w polu widzenia jest zbyt wiele koralików, tło zwiększa się i nie jest możliwe wykrycie pojedynczego punktu czasu aktywacji i strony kontaktu.

Protokół wykorzystuje fluorescencyjne barwniki Ca²⁺ Fluo-4 AM i FuraRed AM w sposób ratiometryczny, co pozwala na kalibrację danych¹³. Dodatkowo protokół można dostosować do innych par wskaźników Ca^{2 +} , ale należy zachować ostrożność w procesie selekcji pod względem kinetyki wiązania Ca^{2 +} , dystrybucji subkomórkowej i fotowybielania¹. Ponadto warunki obciążenia muszą być opracowane i zoptymalizowane dla każdego typu ogniwa, ale wskazane tutaj stężenia są dobrym punktem wyjścia. Aby uwidocznić mikrodomeny^Ca2+ , Kd barwników Ca²⁺ powinno mieścić się w zakresie 300-1200 nM, a czas akwizycji na klatkę powinien wynosić ≤60 ms. Jeśli intensywność fluorescencji jest zbyt niska, należy sprawdzić zestaw filtrów, ale możliwe jest również załadowanie podwójnej ilości barwnika Ca²⁺ do limfocytów T. Jednak barwnik Ca^{2 +} może nieprawidłowo przemieszczać się do innych organelli lub sekwestrować do pęcherzyków, ale może również działać jako bufor Ca^{2 +} i wpływać na odpowiedzi Ca^{2 +} .

Jednym z ograniczeń algorytmu analizy jest to, że zakłada się kulisty kształt komórki; W związku z tym typy komórek o różnych morfologiach mogą wymagać dostosowania zestawu narzędzi do analizy. Algorytm został wykorzystany do analizy lokalnych mikrodomen Ca²⁺ w pierwotnych mysich limfocytach T, a także limfocytach T Jurkat i linii komórkowej NK (KHYG-1)¹² i odniósł sukces w analizie mikrodomen Ca²⁺ dla mysiej linii komórek neuronalnych (N2a, dane niepublikowane). Zasadniczo zestaw narzędzi do protokołu i analizy może być używany do analizy niesferycznych typów komórek, takich jak komórki HEK293 lub HeLa, ale w przypadku tych typów komórek projekcja tarczy do rzutek nie może być dostosowana, ponieważ opiera się na okrągłej strukturze i normalizacji kształtu komórek. Ponadto protokół wykrywania zlokalizowanych początkowych mikrodomen Ca²⁺ po stymulacji perełkowej można dostosować do analizy lokalnych sygnałów Ca²⁺ pochodzących z innych bodźców, takich jak rozpuszczalne związki aktywujące lub hamujące, a także zależne od adhezji i niezależne od TCR / CD3 mikrodomeny Ca^{2+ 10,11}. Warto zauważyć, że łatwiej jest zdefiniować kontakt z pojedynczą kulką pod względem czasu i lokalizacji, niż określić punkt początkowy aktywacji po rozpuszczalnych związkach.

Ogólnym ograniczeniem w wykrywaniu tworzenia się mikrodomen Ca²⁺ jest wymagana wysoka rozdzielczość czasowo-przestrzenna i niezbędny wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR). Obecnie rozdzielczość uzyskana z naszej konfiguracji osiąga obliczoną rozdzielczość przestrzenną ~0,368 μm i rozdzielczość czasową ~40 klatek na sekundę (fps)¹. Ostatnie postępy w rozwoju kamer i detektorów, a także udoskonalenie barwników fluorescencyjnych, mogą w przyszłości doprowadzić do uzyskania optycznych zapisów jednokanałowych, tak jak zostały one opisane w konstruktach ORAI-GECI (genetycznie wyrażone wskaźniki Ca²⁺ )²⁴ do obrazowania żywych komórek przy użyciu wskaźników Ca²⁺ o wyższej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podsumowując, opisany tutaj protokół i narzędzie analityczne do obrazowania mikrodomen Ca^{2 +} o wysokiej rozdzielczości mogą być wykorzystywane nie tylko do analizy początkowych lokalnych sygnałów Ca^{2 +} w limfocytach T, ale mogą być również dostosowywane do innych typów komórek w celu rozszyfrowania znaczenia lokalnej sygnalizacji Ca^{2 +} w tych komórkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
α-CD3	BD Pharmingen	553058
α-CD28	BD Pharmingen	553295
Anaconda	Anaconda	https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A2058
Sitko komórkowe	Biofil	CSS-013-070	70 µ m średnica
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	A49865
Szkiełka nakrywkowe	Paul Marienfeld GmbH	101202
DARTS	GitHub	https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco, Thermo Fisher	14190144
EasySep CD4+ Zestaw do izolacji komórek T	Stemcell	19852
EasySep Magnetyczny wielostojakowy	zestaw macierzysty	EasySep 18010
Fluo 4-AM	Invitrogen	F14201
Fura Red-AM	Invitrogen	F3020
Gibco RPMI 1640 średni	Gibco, Thermo Fisher
Git	GitHub	https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git
olejek immersyjny	Leica	11513859
Serum dla noworodków	Sigma-Aldrich	N4637
Oracle	Oracle	https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/
Penicylina/Streptamycyna	Gibco, Thermo Fisher	15240062
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P4707
Białko G Koraliki magnetyczne	Merck	LSKMAGG02	10 &; Średnica
M Python		Python https://www.python.org/downloads/
Smar silikonowy (basylon)	Bayer	291-1220
Dekonwolucja entropii zależnej od czasu	GitHub	https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters
Tween	q-biogene	TWEEN201